JPWO2014142102A1

JPWO2014142102A1 - 液体水性組成物

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Publication number: JPWO2014142102A1
Application number: JP2015505482A
Authority: JP
Inventors: 朋美中谷; 晃一齋藤
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: EP2974734A4; ES2694328T3; EP2974734B1; HK1218619A1; CA2905588C; AU2014231816B2; KR20150126042A; CA2905588A1; AU2014231816A1; US20140271693A1; JP6294868B2; EP2974734A1; CN105142656B; WO2014142102A1; US9663563B2; CN105142656A

Abstract

ＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドおよび添加剤を含み、かつｐＨが３〜６である、該ペプチドが安定化された液体水性組成物：ここにおいて、該ペプチドは、以下の（Ａ）および（Ｂ）からなる群から選択され、（Ａ）Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加され、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド；かつ、該添加剤は、以下の（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群から１種以上選択される、（Ｃ）グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩、（Ｄ）マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩、（Ｅ）メチオニン。

Description

本発明は、癌免疫療法の分野に属し、細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有するＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドを含有する液体水性組成物に関するものであり、該組成物の薬物安定化に関する。

一般にＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドとは、４４９個のアミノ酸からなるヒトのＷＴ１タンパク質（配列番号：２）由来の部分ペプチドであり、具体的にはアミノ酸数８〜１２のペプチドまたはそのダイマーであり、主要組織適合抗原（ＭａｊｏｒＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）クラスＩ抗原に提示されかつ細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｃｅｌｌ。以下、ＣＴＬと称する）により抗原認識されるペプチドを含有するものである。ＭＨＣは、ヒトではヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。

ＷＴ１タンパク質由来の部分ペプチドの内、９つのアミノ酸からなるＷＴ１_{１２６−１３４}ペプチドArg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）の配列で表される部分ペプチドおよび該ペプチドの一部のアミノ酸が改変された改変体（改変型ペプチド）がＨＬＡに結合しＣＴＬを誘導するペプチドとして有用であることが報告されている（特許文献１〜３参照、非特許文献１参照）。

一般に癌ワクチンに用いられる癌抗原タンパク質や癌抗原ペプチドは、ＣＴＬをより効率的に誘導する目的で、多くの場合、アジュバント（免疫増強剤）と共に投与される。

しかし、これらのタンパク質やペプチドについては、製剤化した際の安定性、特に水中での安定性を保つことが困難である場合が多い。そのため、一般的には凍結乾燥等の水分を除去した製剤的工夫がなされるが、凍結乾燥製剤は製造面やコスト面でデメリットがある上、使用時に復水等の作業が必要となる。
そのため、癌抗原タンパク質や癌抗原ペプチドを目的に応じてさまざまなアジュバントと容易に組み合わせることが可能でありかつ安定な液体水性組成物を開発することは有意義である。

液剤の安定化としては、ゴナドトロピンの安定化剤としてクエン酸またはメチオニンを含有する凍結乾燥製剤（特許文献４参照）、Ｇ−ＣＳＦの安定化剤としてメチオニンを含有する製剤（特許文献５参照）、Ｇ−ＣＳＦの安定化剤としてコハク酸または酒石酸を含有するｐＨ４以下の製剤（特許文献６参照）が開示されている。

さらに、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体組成物の安定化剤として、（１）ｐＨを約４．０〜約８．０の範囲にする試薬、（２）酸化防止剤、（３）カルシウム塩、マグネシウム塩を含有する製剤（特許文献７参照）が開示されている。また、生理学的に活性な薬剤とメチオニンと新規の赤血球生産刺激たんぱく質とを含有する改善された安定性を含む製剤（特許文献８参照）が開示されている。

しかしながら、本発明が目的とする配列番号１で表される配列を持つ部分ペプチドおよび該ペプチドの改変型ペプチドを含有する安定な液体水性組成物については、これまで知られていなかった。

国際公開第００／０６６０２号国際公開第００／１８７９５号国際公開第２００９／０７２６１０号特開平１０−２０３９９７号公報特開２０００−２４７９０３号公報国際公開第２００５／３９６２０号国際公開第０３／５５５１１号国際公開第０３／２０２９９号

欧州特許１１２７０６８の審査における意見書

本発明の課題は、配列番号１で表される配列を持つ部分ペプチドおよび該ペプチドの改変型ペプチドを含有する癌ワクチン製剤の調製に用いることが可能な、上記ペプチドの安定性を改善した液体水性組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１で表される配列を持つ部分ペプチドおよび該ペプチドの改変型ペプチド（以下、単に本発明のペプチドということがある）を含有する液体水性組成物においては、主な分解物がペプチドに含まれるメチオニン残基の酸化であることを見出した。さらに、安定化剤として特定の添加剤を含有させることにより、本発明のペプチドのメチオニン残基の酸化が抑制され、また、特定のｐＨに調整することにより、製剤安定性に優れた液体水性組成物を得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものに関する。

項１．ペプチドおよび添加剤を含み、かつｐＨが３〜６である、液体水性組成物：
ここにおいて、
該ペプチドは、以下の（Ａ）および（Ｂ）からなる群から選択され、
（Ａ）Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加され、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド；かつ、
該添加剤は、以下の（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群から１種以上選択される、
（Ｃ）グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸、
（Ｄ）マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸、
（Ｅ）メチオニン。

項２．添加剤が、以下の（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群から１種以上選択される、項１に記載の液体水性組成物：
（Ｃ）グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸、
（Ｄ）コハク酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸、
（Ｅ）メチオニン。

項３．（Ｂ）がPhe-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：３）、Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＲＭＭＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：４）、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val（ＲＭＦＰＮＡＰＹＶ）（配列番号：５）、Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：６）またはAla-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：７）である、項１または２に記載の液体水性組成物。

項４．ペプチドが、（Ａ）Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、項１または２に記載の液体水性組成物。

項５．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有する、項１〜４のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項６．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｃ）が、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸である、項１〜５のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項７．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｃ）が、グリコール酸およびその薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸である、項１〜６のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項８．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｃ）が、乳酸およびその薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸である、項１〜６のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項９．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｃ）が、リンゴ酸およびその薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸である、項１〜６のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項１０．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｃ）が、酒石酸およびその薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸である、項１〜６のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項１１．添加剤として（Ｄ）および（Ｅ）の両者を含有する、項１〜４のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項１２．添加剤として（Ｄ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｄ）が、コハク酸およびその薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸である、項１、２、３、４または１１に記載の液体水性組成物。

項１３．添加剤として（Ｄ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｄ）が、マレイン酸、およびその薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸である、項１、２、３、４または１１に記載の液体水性組成物。

項１４．添加剤として（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のすべてを含有する、項１〜４のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項１５．添加剤として（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のすべてを含有し、ここにおいて（Ｃ）が、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸であり、（Ｄ）がコハク酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸である、項１、２、３、４または１４に記載の液体水性組成物。

項１６．アルファヒドロキシ酸の体積あたりの含有量が１〜１００ｍＭまたはジカルボン酸の体積あたりの含有量が１０〜１００ｍＭである、項１〜１５のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項１７．メチオニンの体積あたりの含有量が１〜３００ｍＭである、項１〜１６のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項１８．ｐＨが４〜５である、項１〜１７のいずれか一項に記載の液体水性組成物。

項１９．添加剤を添加することにより、液体水性組成物中におけるペプチドの安定性を向上させる方法：
ここにおいて、
該ペプチドは、以下の（Ａ）および（Ｂ）からなる群から選択され、
（Ａ）Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加され、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド；かつ、
該添加剤は、以下の（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群から１種以上選択される、
（Ｃ）グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸、
（Ｄ）マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸、
（Ｅ）メチオニン。

項２０．添加剤が、以下の（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群から１種以上選択される、項１９に記載の方法：
（Ｃ）グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸、
（Ｄ）コハク酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸、
（Ｅ）メチオニン。

項２１．（Ｂ）がPhe-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：３）、Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＲＭＭＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：４）、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val（ＲＭＦＰＮＡＰＹＶ）（配列番号：５）、Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：６）またはAla-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：７）である、項１９または２０に記載の方法。

項２２．ペプチドが、（Ａ）Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、項１９または２０に記載の方法。

項２３．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を添加する、項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。

項２４．添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を添加し、ここにおいて（Ｃ）が、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸である、項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。

項２５．添加剤として（Ｄ）および（Ｅ）の両者を添加する、項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。

項２６．添加剤として（Ｄ）および（Ｅ）の両者を添加し、ここにおいて（Ｄ）が、コハク酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸である、項１９、２０、２１、２２または２５に記載の方法。

項２７．添加剤として（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のすべてを含有する、項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。

項２８．添加剤として（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）のすべてを含有し、ここにおいて（Ｃ）が、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸であり、（Ｄ）がコハク酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸である、項１９、２０、２１、２２または２７に記載の方法。

本発明の液体水性組成物を用いることにより、細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有する本発明のペプチドを安定に含有する液体水性組成物を製造することができ、製剤安定性に優れた癌ワクチンを調製することができる。

図１は、試験例５においてＣＴＬ誘導活性を求めた試験結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。

本明細書において、各例示の好ましい態様は、他の例示の好ましい態様と組み合わせてもよく、上述の項１〜項２８に記載される対応する例示に組み込んでもよい。

本発明における「液体水性組成物」とは、主たる溶媒が水であり、さまざまなアジュバントと混合することが可能な、癌ワクチンを調製するための液剤である。溶媒は通常水を使用するが、発明の効果に影響されない範囲で、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の薬理学的に許容された溶媒を水に一部混合することができる。好ましくは水のみを溶媒とする。

本発明における「ペプチド」とは、癌ワクチンを調製するための癌抗原ペプチドであり、（Ａ）「Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）の配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」と（Ｂ）「配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加され、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド」からなる群より選択されるペプチドのことである。好ましくは（Ａ）のArg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。

「Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」とはウィルムス腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質であり、具体的には、４４９個のアミノ酸からなるヒトのＷＴ１タンパク質（配列番号：２）由来の部分ペプチドのうち、９個のアミノ酸からなるArg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）の配列で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＷＴ１_{１２６−１３４}ペプチド）である。当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ抗原に提示されかつＣＴＬにより抗原認識されるペプチドである。該ペプチドの製造方法は公知の方法で製造することができる（特許文献１、２、３等参照）。

「配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加され、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド」としては、前記の部分ペプチドのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＬＡに結合しＣＴＬを誘導する改変型ペプチドが挙げられる。置換されるアミノ酸の数は好ましくは１又は２であり、より好ましくは１である。好ましい置換位置としては１位、３位及び９位が挙げられる。付加（挿入も包含される）されるアミノ酸の数は好ましくは１又は２であり、より好ましくは１である。好ましい付加位置としては１位が挙げられる。欠失するアミノ酸の数は好ましくは１である。改変において、付加されるアミノ酸または置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。
改変型ペプチドにおいてシステイン残基が少なくとも１つ存在する場合には、２つのペプチド（モノマー）が相互にジスルフィド結合により結合してダイマーを形成していてもよい。
改変型ペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法によって製造され得る。例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; ペプチド合成、丸善（株）、１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５；医薬品の開発続第１４巻・ペプチド合成、廣川書店、１９９１などに記載されているペプチド合成方法によって合成することができる。
改変型ペプチドとして、例えば、次のような改変体が挙げられる。
Phe-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：３）、
Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＲＭＭＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：４）、
Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val（ＲＭＦＰＮＡＰＹＶ）（配列番号：５）、
Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：６）または
Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）（配列番号：７）。
これらの改変体については、ＨＬＡに結合しＣＴＬを誘導する改変型ペプチドであることが明らかであり、公知の方法で製造することができる（特許文献１〜３および非特許文献１参照）。

また、本発明において有効成分であるペプチドとして、配列番号１で示されるＷＴ１_{１２６−１３４}ペプチドまたはその改変型ペプチドの誘導体も用いることができる。例えば、各ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させたものなどが挙げられる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその改変型ペプチドにこのような物質が結合している場合、これらの物質が、例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドを生じ、ＷＴ１特異的ＣＴＬ反応を引き出すことができる。

本発明の液体水性組成物において、「ペプチド」の体積あたりの含有量は特に規定されず、薬理学的または物性的に許容される体積あたりの含有量であればよい。「ペプチド」のうち、例えば、配列番号１で示されるＷＴ１_{１２６−１３４}ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）の好ましい含量としては、液体水性組成物中０．０１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬを挙げることができ、目的に応じて選択すればよい。

本明細書において、上記のペプチドは左側がＮ末端であり、各アミノ酸記号はそれぞれ以下のアミノ酸残基であることを示している。
AlaまたはＡ：アラニン残基
ArgまたはＲ：アルギニン残基
AsnまたはＮ：アスパラギン残基
AspまたはＤ：アスパラギン酸残基
CysまたはＣ：システイン残基
GlnまたはＱ：グルタミン残基
GluまたはＥ：グルタミン酸残基
GlyまたはＧ：グリシン残基
HisまたはＨ：ヒスチジン残基
IleまたはＩ：イソロイシン残基
LeuまたはＬ：ロイシン残基
LysまたはＫ：リジン残基
MetまたはＭ：メチオニン残基
PheまたはＦ：フェニルアラニン残基
ProまたはＰ：プロリン残基
SerまたはＳ：セリン残基
ThrまたはＴ：スレオニン残基
TrpまたはＷ：トリプトファン残基
TyrまたはＹ：チロシン残基
ValまたはＶ：バリン残基
Abu：２−アミノ酪酸残基（α−アミノ酪酸残基とも言う）
Orn：オルニチン残基
Cit：シトルリン残基

一般に「添加剤」とは、製剤に用いられる有効成分以外の成分を表す。本発明における「添加剤」（以下、便宜上、「本発明の添加剤」と称することもある。）としては、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、フマル酸およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸、ならびにメチオニンが挙げられる。
一般に「アルファヒドロキシ酸」とは、カルボキシ基が結合している炭素にヒドロキシ基も結合しているカルボン酸を表す。本発明における「アルファヒドロキシ酸」としてはグリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩が挙げられる。薬理学的に許容し得る塩としては、塩基付加塩が挙げられる。塩基付加塩としてはアルミニウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。例えば、乳酸アルミニウム、乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸二ナトリウム、酒石酸水素カリウム、酒石酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられるが、これに限定されない。２つ以上カルボキシ基がある場合、カルボキシ基毎に異なる塩基が付加されても良い。例えば、酒石酸ナトリウムカリウム等が挙げられるが、これに限定されない。さらに、水和物であってもよい。例えば、乳酸カルシウム水和物、リンゴ酸ナトリウム１／２水和物、リンゴ酸二ナトリウム一水和物、酒石酸ナトリウム二水和物、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、クエン酸水和物、クエン酸ナトリウム水和物等が挙げられるが、これに限定されない。グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸を用いることにより、本発明のペプチドを含有する液体水性組成物が安定化する。これらは１種または２種以上を組み合わせ用いることができる。本発明で用いられるアルファヒドロキシ酸として、好ましくはグリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸またはそれらの薬理学的に許容し得る塩である。さらに好ましくは酒石酸またはその薬理学的に許容し得る塩である。また、乳酸、リンゴ酸、酒石酸には光学異性体があるが、光学活性体、ラセミ体であっても、本発明の効果に影響はない。酒石酸は医薬品に多くの添加物としての使用前例があり、かつ日本薬局方（第１６改正）に記載されているＬ−（＋）酒石酸が好ましい。

本発明の液体水性組成物において、「アルファヒドロキシ酸」の体積あたりの含有量は特に規定はないが、好ましくは１〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１〜５０ｍＭ、最も好ましくは１〜２５ｍＭである。

一般に「ジカルボン酸」とは、分子内にカルボキシ基を２個有するカルボン酸を表す。本発明における「ジカルボン酸」としてはマロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、フマル酸およびそれらの薬理学的に許容し得る塩が挙げられる。薬理学的に許容し得る塩としては、塩基付加塩が挙げられる。塩基付加塩としてはナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。例えば、マロン酸二ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウム、フマル酸二ナトリウム等が挙げられるが、これに限定されない。さらに、水和物であってもよい。例えば、マロン酸二ナトリウム一水和物、コハク酸ナトリウム六水和物、マレイン酸一ナトリウム三水和物等が挙げられるが、これに限定されない。マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、フマル酸を用いることにより、本発明のペプチドを含有する液体水性組成物が安定化する。これらは１種または２種以上を組み合わせ用いることができる。本発明で用いられるジカルボン酸として、好ましくはコハク酸、マレイン酸、フマル酸またはそれらの薬理学的に許容し得る塩である。

本発明の液体水性組成物において、「ジカルボン酸」の体積あたりの含有量は特に規定はないが、好ましくは１０〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは２５〜１００ｍＭ、最も好ましくは５０〜１００ｍＭである。

本発明の「メチオニン」は必須アミノ酸のひとつで、側鎖に硫黄原子を含んだ疎水性のアミノ酸である。「メチオニン」には光学異性体が存在し、Ｄ体、Ｌ体またはＤＬ体があるが、これらのうちのどれを使用しても本発明の効果に影響はない。医薬品に多くの添加物としての使用前例があり、日本薬局方（第１６改正）に記載されているＬ体が好ましい。本発明の液体水性組成物において、メチオニンの体積あたりの含有量は特に規定はないが、好ましくは１〜３００ｍＭである。

「アルファヒドロキシ酸」、「ジカルボン酸」および「メチオニン」はそれぞれ単独でも本発明の液体水性組成物を安定化させる効果は認められるが、「メチオニン」を「アルファヒドロキシ酸」および／または「ジカルボン酸」と組み合わせて含有することによりさらなる安定性を期待できる。このとき、「メチオニン」と組み合わせる酸は、好ましくはグリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸またはフマル酸であり、さらに好ましくはリンゴ酸または酒石酸であり、最も好ましくは酒石酸である。

本発明の液体水性組成物のｐＨは３〜６であるが、製造時に目的のｐＨでない場合は通常ｐＨ調整剤を使用し、調製することができる。安定性の観点から好ましいｐＨは３〜６であり、さらに好ましいのは４〜５である。ｐＨが３未満、または、ｐＨが６を超えると、製造中または保存中に本発明のペプチドのメチオニン残基の酸化体等の類縁物質が増えやすくなり、その結果、本発明のペプチドの液体水性組成物中における含量が低下するおそれがあるため、好ましくない。

ｐＨ調整剤としては、一般に医薬品製剤に用いられるｐＨ調整剤から適宜選択して使用する。具体的には、塩酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸三ナトリウム等が挙げられる。

また、本発明の液体水性組成物には、上記の添加剤のほか、本発明の効果に影響を与えない範囲で適宜、安定剤、可溶化剤、緩衝剤、等張化剤、溶解補助剤等、医薬品製剤に一般に用いられる添加剤を使用することができる。

本発明の液体水性組成物は、医薬品製造等で一般的に用いられる方法で製造することができる。具体的には、例えば、５〜２５℃の一定温度に維持された環境下で、適当な容器に注射用水を仕込み、緩やかに攪拌しながら、あらかじめ秤量されたペプチドおよび添加剤を加え、最終的に所望のｐＨに調整することにより調製することができ、調製後にフィルターろ過等により滅菌し、ガラス製バイアル等の容器に充填し、ゴム栓等で密封すればよい。

本発明の液体水性組成物を用いて癌ワクチンを調製する方法は特に限定されないが、例えば、適切なアジュバンドと混合し、癌ワクチンを調製する方法；予め適切なアジュバントと混合した後、さらに凍結乾燥等により癌ワクチン製剤を調製する方法；本発明の液体水性組成物を用時調製により種々のアジュバントと混合し、癌ワクチンとする方法等が挙げられる。アジュバントとしては、例えば、フロイントアジュバント；水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質；ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム−パルヴムのようなヒトアジュバント等が挙げられる。

本発明の液体水性組成物を用いて調製される癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。

本発明の液体水性組成物は、有効成分である癌抗原ペプチドを安定に保持できることから、種々の投与形態を選択することができる。具体的には、経口、経鼻、経肺、経皮、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等が挙げられ、上記の方法により、目的に応じて癌ワクチンを調製すればよい。一般に、癌ワクチンとして、免疫賦活するのに好ましい投与経路としては非経口投与が知られており、例えば、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与のほか、経鼻投与や経皮投与等が挙げられる。このうち、好ましくは皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与等の注射的投与が挙げられる。

以下に、実施例、比較例、試験例等を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、以下の実施例等において「％」とあるのは、特に記載のない限り「重量％」を意味する。

グリコール酸として「グリコール酸（結晶）（ナカライテスク社製）」を用い、乳酸として「乳酸（ナカライテスク社製）」を用い、リンゴ酸として「ＤＬ−りんご酸（ナカライテスク社製）」を用い、酒石酸として「Ｌ（＋）−Ｔａｒｔａｒｉｃａｃｉｄ，ｐｏｗｄｅｒ（メルク社製）」を用い、クエン酸として「くえん酸一水和物（ナカライテスク社製）」を用いた。マロン酸として、「マロン酸（ナカライテスク社製）」を用い、コハク酸として「こはく酸（ナカライテスク社製）」を用い、グルタル酸として「グルタル酸（ナカライテスク社製）」を用い、マレイン酸として「マレイン酸（ナカライテスク社製）」を用い、メチオニンとして「Ｌ−メチオニン（協和発酵バイオ社製）」を用いた。ｐＨ調整用として、塩酸としては「１ｍｏｌ／ｌ−塩酸（ナカライテスク社製）」を用い、水酸化ナトリウムとしては「１ｍｏｌ／ｌ−水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク社製）」を用いた。

比較例において、リン酸二水素ナトリウムとして「りん酸二水素ナトリウム二水和物（ナカライテスク社製）」を用い、酢酸ナトリウムとして「酢酸ナトリウム三水和物（ナカライテスク社製）」を用い、チオグリコール酸ナトリウムとして「チオグリコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）」を用い、ピロ亜硫酸ナトリウムとして「ピロ亜硫酸ナトリウム（ナカライテスク社製）」を用い、アスコルビン酸として「Ｌ（＋）−アスコルビン酸（ナカライテスク社製）」を用いた。アラニンとして「Ｌ−α−アラニン（ナカライテスク社製）」を用い、グリシンとして「グリシン（ナカライテスク社製）」を用い、アルギニンとして「Ｌ−アルギニン塩酸塩（ナカライテスク社製）」を用いた。

フロイント不完全アジュバントとして「ＩＦＡ（和光純薬工業社製）」を用い、オレイン酸エチルとして「ＮＯＦＡＢＬＥＥＯ−８５Ｓ（日油社製）」を用い、モノオレイン酸ソルビタンとして「ＮＯＦＡＢＬＥＳＯ−９９１（日油社製）」を用い、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０として「ＮＩＫＫＯＬＨＣＯ−１０（日光ケミカルズ社製）」を用い、濃グリセリンとして「日本薬局方濃グリセリン（日油社製）」を用いた。ミリスチン酸オクチルドデシルとして「ＮＩＫＫＯＬＯＤＭ−１００（日光ケミカルズ社製）」を用い、モノオレイン酸グリセリンとして「ＮＯＦＡＢＬＥＧＯ−９９１（日油社製）」を用い、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０として「ＮＩＫＫＯＬＨＣＯ−２０（日光ケミカルズ社製）」を用いた。

〔液体水性組成物の調製〕
〔実施例１〕
ペプチドとしてペプチド（Ａ）である配列番号１（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）で示されるペプチド（以下、ペプチド（１））、添加剤として添加剤（Ｃ）であるグリコール酸を表１に記載の量となるよう注射用水に溶解させ、塩酸および／または水酸化ナトリウムでｐＨを４．５に調整した。０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、ブチルゴム栓で密封した。これにより、液体水性組成物１を得た。

〔実施例２〜３８〕
実施例１と同様に、ペプチド（Ａ）であるペプチド（１）、添加剤（Ｃ）、（Ｄ）および／または（Ｅ）としてアルファヒドロキシ酸、ジカルボン酸および／またはメチオニンを表１〜９に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより液体水性組成物２〜３８を得た。

〔比較例１〜２３〕
実施例１と同様に、表１０〜１４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより、液体水性組成物３９〜６１を得た。

〔試験例１〕安定性評価（１）
調製した液体水性組成物を６０℃の恒温庫内で２週間保存後、ペプチド（１）に含まれるメチオニン残基が酸化したペプチド（ペプチド酸化体）の含量（ペプチド酸化体含量）を下記の方法に基づき測定した。
Ｃ１８逆相カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ）を用い、純水、アセトニトリル、メタノール、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりペプチド酸化体含量を測定した。ペプチド（１）として１０μｇ相当量を注入し、２２０ｎｍの波長で分光学的に検出した。本法で測定したピーク面積を用い、ペプチド酸化体含量（％）を以下の式で算出した。
ペプチド酸化体含量（％）＝ペプチド酸化体のピーク面積／類縁物質を含むペプチドの総ピーク面積×１００
実施例および比較例で得られた液体水性組成物のうち、表１〜６に記載の実施例１〜２２、および表１０〜１２に記載の比較例１〜１４を６０℃で２週間保存した後のペプチド酸化体含量（％）を表１５および１６に示す。表中の酸化体抑制率は下記式で算出した。
酸化体抑制率（％）＝｛（対照となる試料（比較例１）のペプチド酸化体含量）-（表１５および表１６に記載の実施例または比較例のペプチド酸化体含量）｝×１００／（対照となる試料（比較例１）のペプチド酸化体含量）
酸化体抑制率の数値が高いほど酸化抑制効果が高く、添加剤によるペプチド（１）の安定化効果が高いことを示す。

比較例として一般的な酸またはアミノ酸を添加剤として添加してペプチド（１）の酸化抑制効果を検討したところ、ほとんど酸化抑制効果が認められない（１０％未満）か逆にペプチド酸化体含量が増加する結果となった。これに対し、本発明の添加剤を添加した場合には、いずれも酸化抑制効果が認められた。また、表１５によれば、酸化抑制効果は、本発明の添加剤の体積あたりの含有量の影響をほとんど受けないことが確認された。

〔試験例２〕安定性評価（２）
調製した液体水性組成物を６０℃の恒温庫内で２週間保存後、安定性評価（１）と同様の方法を用いて、メチオニン残基が酸化したペプチド（ペプチド酸化体）の含量（ペプチド酸化体含量）を測定した。
実施例および比較例で得られた液体水性組成物のうち、表６および７に記載の実施例２３〜２７および表１０に記載の比較例１を６０℃で２週間保存した後のペプチド酸化体含量（％）を表１７に示す。表中の酸化体抑制率は安定性評価（１）と同様に算出した。

表１７によれば、本発明の添加剤を２種類以上組み合わせて使用することにより、対照と比較して高い酸化抑制効果が得られることが確認できた。

〔試験例３〕安定性評価（３）
調製した液体水性組成物を６０℃の恒温庫内で２週間保存後、安定性評価（１）と同様の方法を用いて、メチオニン残基が酸化したペプチド（ペプチド酸化体）の含量（ペプチド酸化体含量）を測定した。
実施例および比較例で得られた液体水性組成物のうち、表１４に記載の比較例１９、表９に記載の実施例３７を６０℃で２週間保存した後のペプチド酸化体含量（％）を表１８に示す。表中の酸化体抑制率は下記式で算出した。
酸化体抑制率（％）＝｛（対照となる試料（比較例１９）のペプチド酸化体含量）-（表１８に記載の実施例３７のペプチド酸化体含量）｝×１００／（対照となる試料（比較例１９）のペプチド酸化体含量）
酸化体抑制率の数値が高いほど酸化抑制効果が高く、添加剤によるペプチド（１）の安定化効果が高いことを示す。

表１５および表１８によれば、本発明の添加剤は、液体水性組成物中のペプチド濃度によらず、酸化抑制効果を示すことが確認できた。

〔試験例４〕安定性評価（４）
調製した液体水性組成物を４０℃の恒温庫内で４週間保存後、安定性評価（１）と同様の方法を用いて、メチオニン残基が酸化したペプチド（ペプチド酸化体）の含量（ペプチド酸化体含量）を測定した。ただし、Ｃ１８逆相カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）を用い、移動相として純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を用いた。
比較例で得られた液体水性組成物のうち、表１４に記載の比較例２０〜２３を４０℃で４週間保存した後のペプチド酸化体含量（％）を表１９に示す。表中の酸化体抑制率は下記式で算出した。
酸化体抑制率（％）＝｛（対照となる試料（比較例２０）のペプチド酸化体含量）-（表１９に記載の比較例のペプチド酸化体含量）｝×１００／（対照となる試料（比較例２０）のペプチド酸化体含量）
酸化体抑制率の数値が高いほど酸化抑制効果が高く、添加剤によるペプチド（１）の安定化効果が高いことを示す。

表１９に示されるように、一般に液剤において使用される抗酸化剤であるアスコルビン酸、チオグリコール酸ナトリウムまたはピロ亜硫酸ナトリウムの添加は、対照と比較してペプチド（１）を不安定化し、酸化体の生成を促進することが確認された。

〔試験例５〕特異的ＣＴＬ誘導活性の確認
液体水性組成物３６、３７、３８を用いて、アジュバントと混合することにより癌ワクチン組成物を調製した。

１）癌ワクチン組成物ａ１、ａ２の調製
アジュバントａとしてフロイント不完全アジュバントを用いた。液体水性組成物３６をペプチドを含まない１０ｍＭ酒石酸＋５０ｍＭメチオニン溶液を用いて１．７倍に希釈した。そのうち４５０μＬをガラスシリンジ（トップ）に採取し、４５０μＬのアジュバントａを採取した別のガラスシリンジとジョイントで連結した。双方のガラスシリンジの内筒を交互に３０回以上押し込むことによって乳化し、癌ワクチン組成物ａ１を得た。
また、同様に、液体水性組成物３８をペプチドを含まない１０ｍＭ酒石酸＋２００ｍＭメチオニン溶液を用いて１．７倍に希釈し、アジュバントａを用いて、同様の条件で調製することにより、癌ワクチン組成物ａ２を得た。

２）癌ワクチン組成物ｂ１、ｂ２の調製
あらかじめ、オレイン酸エチル（９６．５ｇ）と、モノオレイン酸ソルビタン（１７．５ｇ）と、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０（４．５ｇ）と、濃グリセリン（１．５ｇ）と、２５ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（２０．０ｇ）とを３００ｍＬガラス製トールビーカーに取り、ＣＬＥＡＭＩＸＣＬＭ−１．５（エムテクニック）を用いて、１００００ｒｐｍで５分間攪拌することにより、アジュバントｂを得た。
次いで、４００μＬの液体水性組成物３７と、９３０μＬのアジュバントｂとを試験管ミキサー（タッチミキサーＭＴ−５１、ヤマト科学）を用いて混合することにより、癌ワクチン組成物ｂ１を得た。
また、液体水性組成物３８とアジュバントｂを用いて、同様の条件で調製することにより、癌ワクチン組成物ｂ２を得た。

３）癌ワクチン組成物ｃ１、ｃ２の調製
あらかじめ、オレイン酸エチル（４９．０ｇ）と、ミリスチン酸オクチルドデシル（４９．０ｇ）と、モノオレイン酸ソルビタン（７．０ｇ）と、モノオレイン酸グリセリン（９．８ｇ）と、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０（１．４ｇ）と、濃グリセリン（１．４ｇ）と、２５ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（２２．４ｇ）とを３００ｍＬガラス製トールビーカーに取り、ＣＬＥＡＭＩＸＣＬＭ−１．５（エムテクニック）を用いて、１００００ｒｐｍで５分間攪拌することにより、アジュバントｃを得た。
次いで、４００μＬの液体水性組成物３６と、９３０μＬのアジュバントｃとを試験管ミキサー（タッチミキサーＭＴ−５１、ヤマト科学）を用いて混合することにより、癌ワクチン組成物ｃ１を得た。
また、液体水性組成物３８とアジュバントｃを用いて、同様の条件で調製することにより、癌ワクチン組成物ｃ２を得た。

４）ＣＴＬ誘導活性評価
上記１）から３）にて調製した癌ワクチン組成物６種（ａ１〜ｃ２）の特異的ＣＴＬ誘導能をＨＬＡ−Ａ^＊０２０１トランスジェニックマウス（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：３４、３０６０、２００４）を用いて評価した。
各癌ワクチン組成物１００μＬ（それぞれペプチド投与量６００μｇ）をＨＬＡ−Ａ^＊０２０１トランスジェニックマウスの尾根部皮内に投与した。マウスは各群３匹を用いた。投与７日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞の一部を１００μｍｏｌ／Ｌのペプチド（１）で1時間パルスした。パルスとは、ペプチド（１）を脾細胞に添加し、細胞表面上のＨＬＡに抗原ペプチドを結合させることを言う。ペプチド（１）をパルスしていない脾細胞および上記のペプチドをパルスした脾細胞を混合し、２４穴プレートに７．８×１０^６個／ｗｅｌｌで播種して培養した。培養液には、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２０ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ２−メルカプトエタノールを含ませ、５日間培養した。培養した脾細胞中の投与ペプチド特異的なＣＴＬの活性を^５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：１５９、４７５３、１９９７）により測定した。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１とＨ−２Ｄ^ｂのキメラのＭＨＣクラスＩ分子を安定的に発現するように、パスツール研究所においてマウスリンパ腫由来細胞株に遺伝子導入して作製された細胞株ＥＬ４−ＨＨＤ細胞（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．：１８５、２０４３、１９９７）を用いた。標的細胞は３．７ＭＢｑ／５×１０^５個で１時間^５１Ｃｒラベル後、前記ペプチドを１６７μｍｏｌ／Ｌになるように添加して更に１時間パルスした。また前記ペプチドをパルスしない（非パルスの）標的細胞を２時間^５１Ｃｒラベルしてコントロール標的細胞とした。これらのラベルされた標的細胞と先に調製された脾細胞を１：２０の割合で混合して４時間培養し、傷害を受けた標的細胞の割合よりＣＴＬ誘導活性（すなわち細胞傷害性）を求めた。結果を図１に示す。細胞傷害性は各投与群３匹のマウスの平均値で表している。
図１に示すように、本発明の液体水性組成物を用いて調製した癌ワクチン組成物を投与した群では、前記ペプチドをパルスした標的細胞を強く傷害したが、コントロールの前記ペプチドをパルスしていない標的細胞に対する傷害性は弱かったことから、ペプチド特異的ＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。この結果から、本発明の液体水性組成物は、種々のアジュバントと組み合わせることにより、癌抗原に特異的なＣＴＬの誘導を活性化することがわかる。

〔液体水性組成物の調製〕
〔実施例３９〜４４〕、〔比較例２４〕
ペプチドとしてペプチド（Ａ）であるペプチド（１）、添加剤として添加剤（Ｃ）である酒石酸および添加剤（Ｅ）であるメチオニンを表２０に記載の量となるよう注射用水に溶解させ、塩酸または／および水酸化ナトリウムで表２０に記載のｐＨになるように調整した。０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、ブチルゴム栓で密封した。これにより、液体水性組成物６２〜６８を得た。

〔試験例６〕安定性評価（５）
調製した液体水性組成物を４０℃の恒温庫内で１ヶ月保存後、ペプチド（１）の含量（以下、ペプチド含量）を下記の方法に基づき測定した。
Ｃ１８逆相カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ）を用い、純水、アセトニトリル、メタノール、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりペプチド含量を測定した。ペプチド（１）として１０μｇ相当量を注入し、２２０ｎｍの波長で分光学的に検出した。本法で測定したピーク面積を用い、ペプチド含量（％）を以下の式で算出した。
ペプチド含量（％）＝ペプチド（１）のピーク面積／類縁物質を含むペプチドの総ピーク面積×１００
保存前のペプチド含量（イニシャル）（％）を同様に測定し、ペプチド残存率（％）を以下の式で算出した。
ペプチド残存率（％）＝ペプチド含量（％）／ペプチド含量（イニシャル）（％）×１００
実施例および比較例で得られた液体水性組成物のうち、表２０に記載の実施例３９〜４４および比較例２４を４０℃で１ヶ月間保存した後のペプチド残存率（％）を表２１に示す。

表２１に示されるように、ｐＨが３〜６の範囲では、液体水性組成物中のペプチド残存率が９７％以上を示す安定性の高い液体水性組成物が得られた。一方、ｐＨが７．１では、ペプチド残存率は低下が認められた。

〔試験例７〕安定性評価（６）
調製した液体水性組成物を４０℃の恒温庫内で４週間保存後、安定性評価（１）と同様の方法を用いて、ペプチド酸化体含量を測定した。
実施例および比較例で得られた液体水性組成物のうち、表８に記載の実施例３４、表１３に記載の比較例１５、１６を４０℃で４週間保存した後のペプチド酸化体含量（％）を表２２に示す。表中の酸化体抑制率は下記式で算出した。
酸化体抑制率（％）＝｛（対照となる試料（比較例１５）のペプチド酸化体含量）-（表８に記載の実施例３４または表１３に記載の比較例１６のペプチド酸化体含量）｝×１００／（対照となる試料（比較例１５）のペプチド酸化体含量）
酸化体抑制率の数値が高いほど酸化抑制効果が高く、添加剤によるペプチド（１）の安定化効果が高いことを示す。

表２２に示されるように、本発明の添加剤は、液体水性組成物中のペプチド濃度が低い場合でも、酸化抑制効果を示すことが確認できた。

〔液体水性組成物の調製〕
〔実施例４５〕、〔比較例２５〕
実施例１と同様に、表２３に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより、液体水性組成物６９および７０を得た。

〔試験例８〕安定性評価（７）
調製した液体水性組成物１ｍＬに０．３％のH_２O_２水を１００μＬ添加し簡単に振り混ぜた後、直ちにメチオニン残基が酸化したペプチド（ペプチド酸化体）の含量（ペプチド酸化体含量）を測定した。ペプチド酸化体含量の測定は、安定性評価（１）と同様の方法を用いて行った。
実施例および比較例で得られた液体水性組成物のうち、表１３に記載の比較例１７、１８、表２３に記載の実施例４５および比較例２５、表８に記載の実施例３５の液体水性組成物１ｍＬに０．３％のH_２O_２水を１００μＬ添加した後のペプチド酸化体含量（％）を表２４に示す。表中の酸化体抑制率は下記式で算出した。
酸化体抑制率（％）＝｛（対照となる試料（比較例１７）のペプチド酸化体含量）-（表１３、表２３および表８に記載の実施例または比較例のペプチド酸化体含量）｝×１００／（対照となる試料（比較例１７）のペプチド酸化体含量）
酸化体抑制率の数値が高いほど酸化抑制効果が高く、添加剤によるペプチド（１）の安定化効果が高いことを示す。

表２４に示されるように、本発明の添加剤は、液体水性組成物中のペプチド濃度が高い場合でも、酸化抑制効果を示すことが確認できた。

〔試験例９〕安定性評価（８）
調製した液体水性組成物のうち、表１４に記載の比較例２０、表９に記載の実施例３６、３７および３８の液体水性組成物１ｍＬに０．３％のH_２O_２水を１００μＬ添加し簡単に振り混ぜた後、直ちにメチオニン残基が酸化したペプチド（ペプチド酸化体）の含量（ペプチド酸化体含量）を測定した。ペプチド酸化体含量の測定は、安定性評価（１）と同様の方法を用いて行った。
実施例および比較例で得られた液体水性組成物のうち、表１４に記載の比較例２０、表９に記載の実施例３６、３７および３８の液体水性組成物１ｍＬに０．３％のH_２O_２水を１００μＬ添加した後のペプチド酸化体含量（％）を表２５に示す。表中の酸化体抑制率は下記式で算出した。
酸化体抑制率（％）＝｛（対照となる試料（比較例２０）のペプチド酸化体含量）-（表９に記載の実施例のペプチド酸化体含量）｝×１００／（対照となる試料（比較例２０）のペプチド酸化体含量）
酸化体抑制率の数値が高いほど酸化抑制効果が高く、添加剤によるペプチド（１）の安定化効果が高いことを示す。

表２５に示されるように、試験例５でCTL誘導活性が確認された実施例３６、３７および３８の液体水性組成物は、酸化抑制効果を示すことが確認できた。

本発明により、ＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドを含有する安定性の高い液体水性組成物を提供することが可能になり、当該ペプチドを目的に応じてさまざまなアジュバントと容易に組み合わせることが可能となる。

Claims

ペプチドおよび添加剤を含み、かつｐＨが３〜６である、液体水性組成物：
ここにおいて、
該ペプチドは、以下の（Ａ）および（Ｂ）からなる群から選択され、
（Ａ）Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加され、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド；かつ、
該添加剤は、以下の（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群から１種以上選択される、
（Ｃ）グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸、
（Ｄ）マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸、
（Ｅ）メチオニン。
ペプチドが、（Ａ）Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の液体水性組成物。
添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有する、請求項１または２に記載の液体水性組成物。
添加剤として（Ｃ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｃ）が、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体水性組成物。
添加剤として（Ｄ）および（Ｅ）の両者を含有する、請求項１または２に記載の液体水性組成物。
添加剤として（Ｄ）および（Ｅ）の両者を含有し、ここにおいて（Ｄ）が、コハク酸およびその薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸である、請求項１、２または５に記載の液体水性組成物。
アルファヒドロキシ酸の体積あたりの含有量が１〜１００ｍＭまたはジカルボン酸の体積あたりの含有量が１０〜１００ｍＭである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の液体水性組成物。
メチオニンの体積あたりの含有量が１〜３００ｍＭである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の液体水性組成物。
添加剤を添加することにより、液体水性組成物中におけるArg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの安定性を向上させる方法：
ここにおいて該添加剤は、以下の（Ｃ）、（Ｄ）および（Ｅ）からなる群から１種以上選択される、
（Ｃ）グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるアルファヒドロキシ酸、
（Ｄ）マロン酸、コハク酸、グルタル酸、マレイン酸、およびそれらの薬理学的に許容し得る塩からなる群より１種以上選択されるジカルボン酸、
（Ｅ）メチオニン。