CN105018075B - 一类荧光纳米球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类荧光纳米球及其制备方法，属于生物检测领域。为SiO2荧光纳米球、PAM荧光纳米球或SiO2@PAM荧光纳米球，所述SiO2荧光纳米球为粒径80‑150nm的SiO2表面通过酰胺键偶联荧光分子，所述PAM荧光纳米球为粒径70‑150nm的聚丙烯酰胺表面通过酰胺键偶联荧光分子，所述SiO2@PAM荧光纳米球以SiO2为内核，外层为聚丙烯酰胺偶联荧光分子，其粒径为100‑200nm，外层厚度为5‑20nm。本发明的荧光纳米球，可以与不同的荧光分子偶联，从而可以对各个环节进行综合评价，更好的用于生物检测。
Description
技术领域
本发明涉及一类荧光纳米球及其制备方法，属于生物检测领域。
背景技术
临床检验医学是医学专业的一个重要分支。随着科学技术的进步，现代医学对于各种疾病的诊断越来越依赖各项临床检验数据。临床检验数据已经成为现代医学诊断疾病、治疗监测的重要工具。目前在我国，临床检验工作基本都是在正规医院的检验科来完成的。他们检测的结果准确，所用的仪器设备正在向大型化和自动化方向发展。医院检测科的标本都是人工从各临床科室收集上来的，检测完成之后，检测报告也是人工送到各临床科室。这整个过程最快也要4-5个小时，通常是今天送标本，明天出结果，发报告的周期至少为24小时。但是临床科室对某些特殊疾病是需要很快知道检测结果的，如心肌梗塞的检测（心肌标志物的检测），肺栓塞等，目前的检测周期可能让病人错过最佳抢救时间。
目前国内的体外快速诊断市场已经发展到了每年100-150亿人民币的销售额，而且每年还会有高达15%-20%的增长率。荧光免疫检测，作为体外快速诊断的一种检测方法极具潜力。荧光纳米球作为荧光免疫检测的具体工具，市场上对其的需求也越来越多。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一类荧光纳米球及其制备方法。
本发明提供的一类荧光纳米球，为SiO2荧光纳米球、PAM荧光纳米球或SiO2@PAM荧光纳米球，所述SiO2荧光纳米球为粒径80-150nm的SiO2表面通过酰胺键偶联荧光分子，所述PAM荧光纳米球为粒径70-150nm的聚丙烯酰胺表面通过酰胺键偶联荧光分子，所述SiO2@PAM荧光纳米球以SiO2为内核，外层为聚丙烯酰胺偶联荧光分子，其粒径为100-200nm，外层厚度为5-20nm。
上述的荧光纳米球中，纳米球至少偶联一种荧光分子，如罗丹明B，罗丹明X，荧光素等；荧光分子的质量含量为0.1%-3%，优先0.5%（wt）。
本发明基于二氧化硅和聚丙烯酰胺纳米材料，提供了三种荧光纳米球。该类荧光小球荧光强度高，分散性好，稳定性高，与抗体的耦联效率高。
本发明还提供上述三种荧光纳米球的制备方法。
一、制备SiO2荧光纳米小球的方法，包括如下步骤：
（1）制备SiO2纳米小球
以无水乙醇为共溶剂，氨水为催化剂，将超纯水、氨水和无水乙醇置于烧瓶中，搅拌均匀，另将正硅酸四乙脂（TEOS） 与无水乙醇混合物置于烧杯中，搅拌均匀后倒入烧瓶中，室温搅拌 16h，12000rpm 离心 10min，再用 超纯水和乙醇反复洗涤，去掉表面没有聚合的材料，最后悬浮于乙醇中；
（2）制备羧基功能化的SiO2纳米小球
取一定量顺丁烯二酸酐溶于二氯甲烷中，在冰浴情况下逐滴加入等摩尔量的氨基硅烷偶联剂，搅拌4h，用旋转蒸发仪旋干二氯甲烷，得到白色粉末状固体，为羧基硅烷耦联剂；
将5-10mL 10mg/ml的SiO2纳米小球分散到由1-10mL水、5-30mL乙醇和0.1-1mL26wt %氨水组成的混合溶液，室温下搅拌均匀，加入0.05-0.9mmol的羧基硅烷耦联剂，室温搅拌7h-24h，离心洗涤4-5遍，即得羧基功能化的SiO2纳米小球；
（3）制备荧光SiO2纳米小球
将1-10mg的荧光染料溶于1-5ml的乙醇中，加入0.3-30μL的氨基硅烷偶联剂，避光搅拌2-24h，得到修饰有荧光分子的硅烷偶联剂；
将5-10mL羧基功能化的SiO2纳米小球置于由1-15mL水、5-30mL乙醇和0.1-1mL26wt %氨水组成的混合溶液，室温下搅拌均匀，加入10-500μL的修饰有荧光分子的硅烷偶联剂，室温搅拌7h-24h，离心洗涤4-5遍，透析一天，即得SiO2荧光纳米小球。
二、制备PAM荧光纳米小球的方法，包括如下步骤：
（1）制备羧基功能化的PAM纳米小球
将1.03-2.10g丙烯酰胺，0.25-0.50g甲基双丙烯酰胺，10-100μL丙烯酸溶于超纯水中作为水相；取25-48ml正己醇，8-15mlTX-100，120-250ml环己烷混匀作为油相；在缓慢搅拌下，将水相逐滴加入油相，搅拌15-60min后，用液氮冷冻-真空-解冻反复4-6次除氧；在通保护气体的情况下，加入30-90μL的30wt%的过硫酸铵和20-60μL的四甲基乙二胺（TEMED)，室温搅拌4-6h；加入乙醇和氯化钠溶液，静置10-24h；收集沉淀，用乙醇离心清洗4-6次，最后溶于超纯水中，再次离心去除不溶物和大颗粒；透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成50mg/mL羧基功能化的PAM纳米小球溶液；
（2）制备荧光PAM纳米小球、
取1-10mg的荧光染料加入pH 9~11的缓冲液中，加入0.2-15μL的乙二胺，避光搅拌过夜，得氨基改性的荧光染料；
将5-10mL制备的羧基功能化的PAM纳米小球溶液加入到pH 5~7的缓冲液中，加入10倍羧基摩尔量的EDC和NHS，室温活化0.5-2h后加入氨基改性的荧光染料，搅拌2-4h；透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成10mg/ml的溶液，即得PAM荧光纳米球溶液。
三、制备SiO2@PAM荧光纳米小球的方法，包括如下步骤：
(1)制备SiO2纳米小球
以无水乙醇为共溶剂，氨水为催化剂，将超纯水、氨水和无水乙醇至于圆
底烧瓶中，磁力搅拌混合均匀，另将TEOS 与无水乙醇混合物置于烧杯中，搅拌均匀后迅速倒入烧瓶中，室温搅拌 16h，12000rpm 离心 10min，再用 超纯水和乙醇反复洗涤，去掉表面没有聚合的材料，最后悬浮于乙醇中；
（2）制备SiO2@PAM纳米小球
将5-10mL 10mg/ml的SiO2纳米小球分散到由1-10mL水、5-30mL乙醇和0.1-1mL26wt %氨水组成的混合溶液，室温下搅拌均匀，加入10-100μL的3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS)，回流搅拌7h-24h，离心洗涤4-5遍，最后溶于超纯水中，制得SiO2@MPS溶液;
取10-20ml的SiO2@MPS溶液，加入0.10-0.20g丙烯酰胺，0.05-0.10g亚甲基双丙烯酰胺，10-100μL丙烯酸，在通保护气体的情况下，加入30-60μL的30%（wt）的过硫酸铵和20-40μL的四甲基乙二胺（TEMED)，室温搅拌4-6h；离心清洗4-6次，即得羧基功能化的SiO2@PAM纳米小球溶液；
（3）SiO2@PAM荧光纳米小球
制备氨基改性的荧光染料:取1-10mg的荧光染料加入到一定量的pH 9~11的缓冲液中，缓慢加入0.2-15μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的荧光染料；
（4）将5-10mL制备的羧基功能化的SiO2@PAM纳米小球加入到一定量pH 5~7的缓冲液中，加入10倍羧基摩尔量的EDC和NHS，室温活化0.5-2h后加入1-10mL的氨基改性的荧光染料，搅拌2-4h；离心清洗5-8次，透析一天，即制得SiO2@PAM荧光纳米小球。
以上氨基硅烷偶联剂可以为3-氨丙基甲氧基硅烷（APTMS),3-氨丙基乙氧基硅烷（APTES)等；以上荧光染料可以为罗丹明B，罗丹明X或荧光素等；以上保护气体可以为氮气，氩气等。
本发明还提供上述三种荧光纳米球在荧光快速检测中的应用。三种荧光纳米球与抗体耦联的方法为：将荧光纳米球加入到pH 5~7的缓冲液中，加入10倍羧基量的EDC和NHS，室温活化0.5-2h后，加入一定量的抗体温育0.5-4h后，在加入盐酸羟氨温育一个小时，离心清洗5次，4℃保存。
本发明的荧光纳米球，可以与不同的荧光分子偶联，从而可以对各个环节进行综合评价，更好的用于生物检测。
二氧化硅纳米材料是一种生物兼容性良好的材料，采用修饰过的改性剂对其进行改性不仅使其能很好的耦联抗体，还可以提高材料的酸碱稳点度；聚丙烯酰胺具有极好的亲水性，在水中分散极其稳定；SiO2@PAM荧光纳米小球综合二氧化硅和聚丙烯酰胺两者的优点。
综上所述，本发明的优点和有益效果为：
1.采用Stober法制备硅纳米球，工艺简单，成本低；
2.制备的羧基荧光硅纳米球比直接用氨基改性剂制备氨基荧光会纳米球稳定性要好，且羧基修饰过的硅在水中分散性有所改善；
3.反相微乳法制备聚丙烯酰胺，制备方法简单，制备出来的纳米球在水中分散性好，极其稳定；
4.SiO2@PAM纳米球，是在二氧化硅纳米球表面包埋一层聚丙烯酰胺，能改善二氧化硅在水中的分散性和稳定性。
具体实施方式
实施例1 硅纳米球的制备
Stober法制备80nmSiO2纳米小球：
1.取1ml TEOS加入到25ml乙醇中，之后再加入1.2ml的氨水和1ml的超纯水，室温搅拌16h；
2.12000rpm 离心 10min，再用 超纯水和乙醇反复洗涤，最后悬浮于乙醇中。
实施例2 3-氨丙基甲氧基硅烷（APTMS)的羧基改性：
1.90g（50mmol）顺丁烯二酸酐溶于一定量的二氯甲烷中，在冰浴情况下逐滴加入8.95g（50mmol）的APTMS，搅拌4h，用旋转蒸发仪旋干二氯甲烷，得到白色粉末状固体，即得APTMS-COOH。
实施例3 3-氨丙基乙氧基硅烷（APTES)的羧基改性
1.90g（50mmol）顺丁烯二酸酐溶于一定量的二氯甲烷中，在冰浴情况下逐滴加入9.65g（50mmol）的APTMS，搅拌4h，用旋转蒸发仪旋干二氯甲烷，得到白色粉末状固体，即得APTES-COOH。
实施例4羧基硅小球的制备
取实施例1制备的SiO2纳米小球5ml加入5ml乙醇，1ml的超纯水和0.1ml氨水，搅拌均匀后加入0.05mmol实施例2制备的APTMS-COOH，室温搅拌7h。
得到的纳米小球用乙醇和水交替清洗4遍，最后配置成10mg/ml溶液。
实施例5羧基硅小球的制备
取实施例1制备的SiO2纳米小球10ml加入10ml乙醇和2ml的超纯水和0.5ml氨水，搅拌均匀后加入0.5mmol实施例2制备的APTMS-COOH，室温搅拌10h。
得到的纳米小球用乙醇和水交替清洗4遍，最后配置成10mg/ml溶液。
实施例6羧基硅小球的制备
取实施例1制备的SiO2纳米小球10ml加入30ml乙醇，5ml的超纯水和1ml氨水，搅拌均匀后加入0.9mmole实施例3制备的APTES-COOH，室温搅拌24h。
得到的纳米小球用乙醇和水交替清洗4遍，最后配置成10mg/ml溶液。
实施例7羧基荧光硅小球的制备
1.取1mg 异氰酸根罗丹明B加入到1ml乙醇中，混合均匀后加入0.3μL的APTMS,避光搅拌10h，制得APTMS-Rh B；
2.取实例4制备的羧基硅小球10ml加入10ml乙醇、1ml超纯水、0.2ml氨水搅拌均匀后，加入上一步制备的APTMS-Rh B 1mL,避光搅拌10h；
3.得到荧光纳米球离心清洗后，透析一天。
实施例8羧基荧光硅小球的制备
1.取2mg 罗丹明X加入到3ml乙醇中，混合均匀后加入1μL的APTES,0.5μL三乙胺，避光搅拌16h，制得APTES-Rh X
2.取实例6制备的羧基硅小球10ml加入30ml乙醇、1ml超纯水、0.5ml氨水搅拌均匀后，加入上一步制备的APTES-Rh X 3mL,避光搅拌16h；
3.得到荧光纳米球离心清洗后，透析一天。
实施例9羧基荧光硅小球的制备
1.取5mg 荧光素加入到5ml乙醇中，混合均匀后加入1μL的APTES,0.5避光搅拌16h，制得APTES-FS
2.取实例6制备的羧基硅小球10ml加入30ml乙醇、1ml超纯水、0.5ml氨水搅拌均匀后，加入上一步制备的APTES-FS5mL,避光搅拌24h；
3.得到荧光纳米球离心清洗后，透析一天。
实施例10羧基功能化PAM纳米小球的制备
1.取1.03g丙烯酰胺，0.5g亚甲基双丙烯酰胺，10μL的丙烯酸溶于3ml的水中，作为水相；
2.取25ml正己醇，8mlTX-100，120ml环己烷混匀作为油相；
3.将水相逐滴加入油相水相逐滴加入油相，搅拌15min后，用液氮冷冻-真空-解冻反复4次除氧；在通保护气体的情况下，加入30-的的30%（wt）的过硫酸铵和20μL的TEMED，室温搅拌4h；
4.加入一定量的乙醇和氯化钠溶液，静置10-h；收集沉淀，用乙醇离心清洗4-6次，最后溶于超纯水中，再次离心去除不溶物和大颗粒；透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成50mg/mL的溶液；
实施例11羧基功能化PAM纳米小球的制备
1.取1.50g丙烯酰胺，0.75g亚甲基双丙烯酰胺，80μL的丙烯酸溶于5ml的水中，作为水相；
2.取40ml正己醇，10mlTX-100，200ml环己烷混匀作为油相；
3.将水相逐滴加入油相水相逐滴加入油相，搅拌40min后，用液氮冷冻-真空-解冻反复5次除氧；在通保护气体的情况下，加入40μL的30%（wt）的过硫酸铵和25μL的TEMED，室温搅拌5h；
4.加入一定量的乙醇和氯化钠溶液，静置16h；收集沉淀，用乙醇离心清洗4-6次，最后溶于超纯水中，再次离心去除不溶物和大颗粒；透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成50mg/mL的溶液；
实施例12羧基功能化PAM纳米小球的制备
1.取2.06g丙烯酰胺，0.25g亚甲基双丙烯酰胺，100μL的丙烯酸溶于5ml的水中，作为水相；
2.取48ml正己醇，15mlTX-100，200ml环己烷混匀作为油相；
3.将水相逐滴加入油相水相逐滴加入油相，搅拌60min后，用液氮冷冻-真空-解冻反复4次除氧；在通保护气体的情况下，加入60μL的的30%（wt）的过硫酸铵和40μL的TEMED，室温搅拌6h；
4.加入一定量的乙醇和氯化钠溶液，静置24h；收集沉淀，用乙醇离心清洗6次，最后溶于超纯水中，再次离心去除不溶物和大颗粒；透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成50mg/mL的溶液；
实施例13 PAM荧光纳米小球的制备
1.取1mg的异氰酸根罗丹明B加入到1ml的pH 9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，加入0.2μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的罗丹明B；
2.将5mL实例10中制备的羧基功能化的PAM纳米小球加入到一定量pH 5~7的缓冲液中，加入26.5mgEDC和16.0mgNHS，室温活化0.5h后加入1mL的氨基改性的罗丹明B，避光搅拌搅拌2h；
3.透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成10mg/ml的溶液。
实施例14 PAM荧光纳米小球的制备
1.取5mg的罗丹明X加入到1ml的pH 10.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，加入5μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的罗丹明X；
2.将7.5mL实例11中制备的羧基功能化的PAM纳米小球加入到一定量pH 5~7的缓冲液中，加入353.7mgEDC和279.6mgNHS，室温活化1h后加入1mL的氨基改性的罗丹明X，避光搅拌搅拌3h；
3.透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成10mg/ml的溶液。
实施例15 PAM荧光纳米小球的制备
1.取10mg的荧光素加入到5ml的pH 10.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，加入5μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的荧光素；
2.将10mL实例12中制备的羧基功能化的PAM纳米小球加入到一定量pH 5~7的缓冲液中，加入666.8mg EDC和527.2mg NHS，室温活化1h后加入1mL的氨基改性的荧光素，避光搅拌搅拌4h；
3.透析三天，冷冻干燥后，用超纯水配成10mg/ml的溶液。
实施例16 SiO2@PAM纳米小球的制备
1.取5mL实施例1中SiO2纳米小球加入1mL水、5mL乙醇和0.1mL氨水，室温下搅拌均匀，加入10μL的3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS)，回流搅拌7h，离心洗涤4遍，最后溶于超纯水中;
2.取10mL的SiO2@MPS溶液，加入0.10g丙烯酰胺，0.05g亚甲基双丙烯酰胺，10μL丙烯酸，在通保护气体的情况下，加入30μL的30%（wt）的过硫酸铵和20-μL的四甲基乙二胺（TEMED)，室温搅拌4h ；
3.离心清洗 6次，用超纯水配成10mg/ml的溶液。
实施例17SiO2@PAM纳米小球的制备
1.取8mL实施例1中SiO2纳米小球加入5mL水、8mL乙醇和0.2mL氨水，室温下搅拌均匀，加入80μL的3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS)，回流搅拌10h，离心洗涤4遍，最后溶于超纯水中;
2.取16mL的SiO2@MPS溶液，加入0.15g丙烯酰胺，0.08g亚甲基双丙烯酰胺，70μL丙烯酸，在通保护气体的情况下，加入40μL的30%（wt）的过硫酸铵和30μL的四甲基乙二胺（TEMED)，室温搅拌6h ；
3.离心清洗 6次，用超纯水配成10mg/ml的溶液。
实施例18 SiO2@PAM纳米小球的制备
1.取10mL实施例1中SiO2纳米小球加入10mL水、30mL乙醇和1mL氨水，室温下搅拌均匀，加入100μL的3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS)，回流搅拌24h，离心洗涤4遍，最后溶于超纯水中;
2.取20mL的SiO2@MPS溶液，加入0.20g丙烯酰胺，0.10g亚甲基双丙烯酰胺，100μL丙烯酸，在通保护气体的情况下，加入60μL的30%（wt）的过硫酸铵和40μL的四甲基乙二胺（TEMED)，室温搅拌5h ；
3.离心清洗 6次，用超纯水配成10mg/ml的溶液。
实施例19 SiO2@PAM荧光纳米小球的制备
1.取1mg的异氰酸根罗丹明B加入到1ml的pH 9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，加入0.2μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的罗丹明B；
2.取5ml实施例16中SiO2@PAM纳米小球加入0.1mL pH 5.0 MES缓冲液，搅拌均匀后加入265mg EDC和260mg NHS，室温活化0.5h，加入1ml氨基改性的罗丹明B，搅拌2h；
3.离心清洗5次，透析24h，配置成10mg/ml溶液。
实施例20 SiO2@PAM荧光纳米小球的制备
1.取5mg的罗丹明X加入到1ml的pH 9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，加入8μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的罗丹明X；
2.取5ml实施例17中SiO2@PAM纳米小球加入0.5mL pH 5.0 MES缓冲液，搅拌均匀后加入385mg EDC和240mg NHS，室温活化1h，加入1ml氨基改性的罗丹明X，搅拌3 h；
3.离心清洗8次，透析24h，配置成10mg/ml溶液。
实施例21 SiO2@PAM荧光纳米小球的制备
1.取10mg的荧光素加入到20ml的pH 9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，加入15μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的荧光素；
2.取10ml实施例18中SiO2@PAM纳米小球加入1mL pH 5.0 MES缓冲液，搅拌均匀后加入574mg EDC和340mg NHS，室温活化2h，加入1ml氨基改性的荧光素，搅拌4h；
3.离心清洗6次，透析24h，配置成10mg/ml溶液。
实施例22 荧光硅小球耦联抗体
1.取1ml实施例7中的荧光硅小球，用0.1M pH 5.0的MES缓冲液离心清洗两遍 ，加入9.5mg EDC和8.6mg NHS，室温活化0.5h；
2.用0.01M pH 7.4的PBS缓冲液离心清洗两次，加入10μg抗体，室温温育0.5h；
3.加入10mg盐酸羟胺，室温反应1h，0.01M pH 7.4的PBS缓冲液离心清洗两次，加入1ml封闭液（0.01M PBS,1%牛血清白蛋白），室温反应1h；
4.离心清洗两次，加入1ml 保存液（0.01M PBS，0.1%BSA，0.05%Tween-20，0.02%NaN3），4℃保存。
实施例23 荧光硅小球耦联抗体
1.取1ml实施例14中的PAM荧光纳米小球，用0.1M pH 5.0的MES缓冲液离心清洗两遍 ，加入5.0mg EDC和4.8mg NHS，室温活化1h；
2.用0.01M pH 7.4的PBS缓冲液离心清洗两次，加入10μg抗体，室温温育0.5h；
3.加入5.2mg盐酸羟胺，室温反应1h，0.01M pH 7.4的PBS缓冲液离心清洗两次，加入1ml封闭液（0.01M PBS,1%牛血清白蛋白），室温反应1h；
4.离心清洗两次，加入1ml 保存液（0.01M PBS，0.1%牛血清白蛋白，0.05%Tween-20，0.02%NaN3），4℃保存。
实施例24荧光硅小球耦联抗体
1.取1ml实施例21中的SiO2@PAM荧光纳米小球，用0.1M pH 5.0的MES缓冲液离心清洗两遍 ，加入8.9mg EDC和7.6mg NHS，室温活化4h；
2.用0.01M pH 7.4的PBS缓冲液离心清洗两次，加入10μg抗体，室温温育0.5h；
3.加入8.5mg盐酸羟胺，室温反应1h，0.01M pH 7.4的PBS缓冲液离心清洗两次，加入1ml封闭液（0.01M PBS,1%牛血清白蛋白），室温反应1h；
4.离心清洗两次，加入1ml 保存液（0.01M PBS，0.1%牛血清白蛋白，0.05%Tween-20，0.02%NaN3），4℃保存。
Claims (1)
1.一种SiO2@PAM荧光纳米球的制备方法， 所述SiO2@PAM荧光纳米球以SiO2为内核，外层为聚丙烯酰胺偶联荧光分子，其粒径为100-200nm，外层厚度为5-20nm；所述荧光分子为罗丹明B，罗丹明X，或荧光素；荧光分子的质量含量为0.1%-3%；
其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备SiO2纳米小球
以无水乙醇为共溶剂，氨水为催化剂，将超纯水、氨水和无水乙醇至于圆
底烧瓶中，磁力搅拌混合均匀，另将TEOS 与无水乙醇混合物置于烧杯中，搅拌均匀后迅速倒入烧瓶中，室温搅拌 16h，12000rpm 离心 10min，再用 超纯水和乙醇反复洗涤，去掉表面没有聚合的材料，最后悬浮于乙醇中；
（2）制备SiO2@PAM纳米小球
将5-10mL 10mg/ml的SiO2纳米小球分散到由1-10mL水、5-30mL乙醇和0.1-1mL26 wt %氨水组成的混合溶液，室温下搅拌均匀，加入10-100μL的3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷，回流搅拌7h-24h，离心洗涤4-5遍，最后溶于超纯水中，制得SiO2@MPS溶液；
取10-20ml的SiO2@MPS溶液，加入0.10-0.20g丙烯酰胺，0.05-0.10g亚甲基双丙烯酰胺，10-100μL丙烯酸，在通保护气体的情况下，加入30-60μL的30 wt %的过硫酸铵和20-40μL的四甲基乙二胺，室温搅拌4-6h；离心清洗4-6次，即得羧基功能化的SiO2@PAM纳米小球溶液；
(3)SiO2@PAM荧光纳米小球
制备氨基改性的荧光染料:取1-10mg的荧光染料加入到一定量的pH 9~11的缓冲液中，缓慢加入0.2-15μL的乙二胺，避光搅拌过夜，制得氨基改性的荧光染料；
(4)将5-10mL制备的羧基功能化的SiO2@PAM纳米小球加入到一定量pH 5~7的缓冲液中，加入10倍羧基摩尔量的EDC和NHS，室温活化0.5-2h后加入1-10mL的氨基改性的荧光染料，搅拌2-4h；离心清洗5-8次，透析一天，即制得SiO2@PAM荧光纳米小球。
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