CN105010138B - 一种铁皮石斛的组培繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛的组培繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）外植体准备：选取健康一年生的铁皮石斛的茎段作为外植体材料，所述茎段为切取两节间间的节，且距离节左端和右端各0.5‑1cm为外植体，然后进行外植体消毒；（2）愈伤组织培养；（3）分化培养；（4）壮苗培养；（5）生根培养；（6）炼苗与移栽。本发明不仅能缩短生产培养单周期和生长周期，而且能提高育苗成活率，从而减少投资资金，降低生产成本，提高工业化生产的利润。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，特别涉及一种铁皮石斛的组培繁殖方法。
背景技术
铁皮石斛(Musa balbisiana Colla)是我国南方的重要热带水果之一，同时也是许多地区的重要经济收入来源，并且许多农户依靠种植铁皮石斛脱贫致富。大多数的栽培食用铁皮石斛都是单性三倍体AAA，具有高度的不育特性，主要靠无性繁殖，生产上通常利用吸芽进行繁殖，种苗不足时，也可采用铁皮石斛的地下茎切块来繁殖种苗，但是该方法长期使用会累积许多病毒，如：束顶病、花叶病等。造成严重的危害。另外，不良的铁皮石斛种苗会导致生长不良，果品不佳，收获不统一等问题。铁皮石斛组织培养技术能够在短时间内快速繁殖出大量规格统一的优质的无病虫害的健康种苗，并且，新品种的培育和引进也需要利用脱病毒和组培快繁技术加快名优品种的发展。铁皮石斛组培技术是我国农业科研工作者在20世纪80年代后期研发推广，该技术的应用对我国铁皮石斛产业的迅速发展起到了重大的推进作用，也使得种苗工厂化生产得以实现，在短时间内将优良品种大面积推广，达到大规模商品化铁皮石斛生产。但是该产业经过20多年的应用，我们发现该技术存在不足，在生产应用中主要问题是：
1.组培期间，易出现褐化现象，无法防止连带的影响，造成成活率低。
2.由于生产周期长，导致生产场地周转慢，占用大量培养架，从而导致厂房面积增加。
以上缺点是传统组培生产中普遍存在的问题，在中国南方的热带及亚热带地区，铁皮石斛组培苗已经成为大宗种苗品种，每年都有超过上亿株的市场需求，但是由于生产成本在逐年的递增(人工费用，场地租金等)极大的阻了种苗工厂化产业的发展，因此开发一种新的铁皮石斛组培繁殖的技术以克服原有培养方式的缺点，确保铁皮石斛种苗产业的进一步发展。
发明内容
本发明针对上述存在的问题，本发明提供了一种铁皮石斛的组培繁殖方法，不仅能缩短生产培养单周期和生长周期，而且能提高育苗成活率，从而减少投资资金，降低生产成本，提高工业化生产的利润。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种铁皮石斛的组培繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取健康一年生的铁皮石斛的茎段作为外植体材料，所述茎段为切取两节间间的节，且距离节左端和右端各0.5-1cm为外植体，然后进行外植体消毒；
(2)愈伤组织培养：将消毒后的2-3份外植体放入愈伤组织培养基中在30℃下进行培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养：将愈伤组织接入分化培养基在28℃下进行培养7天，得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养：将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上，在28℃下继续培养7天；
(5)生根培养：将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上28℃下培养5天；
(6)炼苗与移栽：选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，再驯化5-10天后，移栽至种植基质中。
在本发明中，作为进一步说明，所述外植体消毒为体积浓度为75％乙醇+体积浓度为2％次氯酸钠溶液或体积浓度为75％乙醇+体积浓度为2％次氯酸钠+体积浓度为0.1％氯化汞溶液进行消毒。
在本发明中，作为进一步说明，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA0.1mg/L+KT 0.3mg/L+BA 0.1mg/L+8g/L琼脂+30g/L蔗糖+8g/L马铃薯汁。
在本发明中，作为进一步说明，所述分化培养的培养基配方为：MS+IBA 0.4～0.5mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+2,4-D 0.8～1.0mg/L+10～15g/L琼脂+30～50g/L蔗糖+10～15g/L香蕉泥。
在本发明中，作为进一步说明，所述壮苗培养的培养基配方为：MS+IBA 0.3～0.5mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+2,4-D 0.3～0.5mg/L+10～15g/L琼脂+35g/L蔗糖+15g/L香蕉泥；
在本发明中，作为进一步说明，所述生根培养的培养基配方为MS+IBA 2～5mg/L+NAA 2～5mg/L+0.1～0.2g/L活性炭+5～10g/L琼脂+20～30g/L蔗糖+10～15g/L马铃薯泥。
本发明具有的有益效果为：
1、本发明巧妙采取两节间间的节作为外植体，与现有技术中直接采用茎段且每2-3节为一段，不仅在组培时占用培养基的位置，需要选用规格较大的培养基，进而增加了培养基配方的使用量，增加了组培的成本，本发明采用距离节左右两端0.5-1cm的距离为外植体，完全避免的现有技术出现的弊端，现有技术中一般采用在一个培养基放2个外植体，外植体过长在组培期间若出现霉变现象容易出现交叉感染，本发明的外植体长度的选取就降低了组培期间霉变的交叉感染的机率，进而使本发明更有可行性，适合大规模生产应用。
2、本发明采用的消毒方法，能防止外植体褐变，保证外植体进行组培的成活率。
3、本发明针对不同的培养阶段添加不同的激素和外源物质，能缩短生产培养单周期和生长周期。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明，以使本发明的优点和特征更易于被理解，应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一种铁皮石斛的组培繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取健康一年生的铁皮石斛的茎段作为外植体材料，所述茎段为切取两节间间的节，且距离节左端和右端各0.5cm为外植体，然后使用体积浓度为75％乙醇+体积浓度为2％次氯酸钠溶液进行外植体消毒；
(2)愈伤组织培养：将消毒后的2份外植体放入培养基配方为1/2MS+NAA 0.1mg/L+KT 0.3mg/L+BA 0.1mg/L+8g/L琼脂+30g/L蔗糖+8g/L马铃薯汁的愈伤组织培养基中在30℃下进行培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养；将愈伤组织接入配方为MS+IBA 0.4mg/L+NAA 0.3mg/L+2,4-D0.8mg/L+10g/L琼脂+30g/L蔗糖+10g/L香蕉泥的分化培养基在28℃下进行培养7天，得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养；将铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+2,4-D0.3mg/L+10g/L琼脂+35g/L蔗糖+15g/L香蕉泥的壮苗培养基上，在28℃下继续培养7天；
(5)生根培养；将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 2mg/L+NAA 2mg/L+0.1g/L活性炭+5g/L琼脂+20g/L蔗糖+10g/L马铃薯泥的生根培养基上28℃下培养5天；
(6)炼苗与移栽：选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，再驯化5天后，移栽至种植基质中。
实施例2：
一种铁皮石斛的组培繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取健康一年生的铁皮石斛的茎段作为外植体材料，所述茎段为切取两节间间的节，且距离节左端和右端各1cm为外植体，然后使用浓度为体积浓度为75％乙醇+体积浓度为2％次氯酸钠+体积浓度为0.1％氯化汞溶液进行外植体消毒；
(2)愈伤组织培养：将消毒后的3份外植体放入培养基配方为1/2MS+NAA 0.1mg/L+KT 0.3mg/L+BA 0.1mg/L+8g/L琼脂+30g/L蔗糖+8g/L马铃薯汁的愈伤组织培养基中在30℃下进行培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养；将愈伤组织接入配方为MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L+15g/L琼脂+50g/L蔗糖+15g/L香蕉泥的分化培养基在28℃下进行培养7天，得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养；将铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+15g/L琼脂+35g/L蔗糖+15g/L香蕉泥的壮苗培养基上，在28℃下继续培养7天；
(5)生根培养；将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 5mg/L+NAA 5mg/L+0.2g/L活性炭+10g/L琼脂+30g/L蔗糖+15g/L马铃薯泥的生根培养基上28℃下培养5天；
(6)炼苗与移栽：选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，再驯化10天后，移栽至种植基质中。
实施例3：
一种铁皮石斛的组培繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取健康一年生的铁皮石斛的茎段作为外植体材料，所述茎段为切取两节间间的节，且距离节左端和右端各0.6cm为外植体，然后使用体积浓度为75％乙醇+体积浓度为2％次氯酸钠溶液进行外植体消毒；
(2)愈伤组织培养：将消毒后的2份外植体放入培养基配方为1/2MS+NAA 0.1mg/L+KT 0.3mg/L+BA 0.1mg/L+8g/L琼脂+30g/L蔗糖+8g/L马铃薯汁的愈伤组织培养基中在30℃下进行培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养；将愈伤组织接入配方为MS+IBA 0.45mg/L+NAA 0.35mg/L+2,4-D0.85mg/L+12g/L琼脂+35g/L蔗糖+12g/L香蕉泥的分化培养基在28℃下进行培养7天，得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养；将铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 0.35mg/L+NAA 0.35mg/L+2,4-D 0.35mg/L+12g/L琼脂+35g/L蔗糖+15g/L香蕉泥的壮苗培养基上，在28℃下继续培养7天；
(5)生根培养；将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 3mg/L+NAA3mg/L+0.15g/L活性炭+7g/L琼脂+25g/L蔗糖+12g/L马铃薯泥的生根培养基上28℃下培养5天；
(6)炼苗与移栽：选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，再驯化6天后，移栽至种植基质中。
实施例4：
一种铁皮石斛的组培繁殖方法，包括如下步骤：
(1)外植体准备：选取健康一年生的铁皮石斛的茎段作为外植体材料，所述茎段为切取两节间间的节，且距离节左端和右端各0.8cm为外植体，然后使用浓度为体积浓度为75％乙醇+体积浓度为2％次氯酸钠+体积浓度为0.1％氯化汞溶液进行外植体消毒；
(2)愈伤组织培养：将消毒后的3份外植体放入培养基配方为1/2MS+NAA 0.1mg/L+KT 0.3mg/L+BA 0.1mg/L+8g/L琼脂+30g/L蔗糖+8g/L马铃薯汁的愈伤组织培养基中在30℃下进行培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养；将愈伤组织接入配方为MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.4mg/L+2,4-D0.9mg/L+14g/L琼脂+40g/L蔗糖+14g/L香蕉泥的分化培养基在28℃下进行培养7天，得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养；将铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 0.4mg/L+NAA 0.45mg/L+2,4-D0.4mg/L+14g/L琼脂+35g/L蔗糖+15g/L香蕉泥的壮苗培养基上，在28℃下继续培养7天；
(5)生根培养；将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至配方为MS+IBA 4mg/L+NAA 4mg/L+0.18g/L活性炭+8g/L琼脂+28g/L蔗糖+14g/L马铃薯泥的生根培养基上28℃下培养5天；
(6)炼苗与移栽：选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，再驯化8天后，移栽至种植基质中。
将实施例1-4进行愈伤组织培养，在其他条件不变的情况下，取两节茎段作为外植体，分别作为实施例1-4的对照组CK1、CK2、CK3、CK4，每组试验接种5瓶培养基，记录愈伤组织培养过程中7D、10D、13D、15D、16D、17D愈伤组织的变化情况表如下：
表1愈伤组织培养愈伤组织变化表
由上表可知，实施例1-4的成活率在93％以上，且出现褐化情况后，不会立即出现增加情况，而对照组出现褐化情况后立即出现加倍或递增的褐化情况，造成交叉感染，对照组的成活率只在67％～80％之间。
Claims (2)
1.一种铁皮石斛的组培繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）外植体准备：选取健康一年生的铁皮石斛的茎段作为外植体材料，所述茎段为切取两节间间的节，且距离节左端和右端各0.5-1cm为外植体，然后进行外植体消毒；
（2）愈伤组织培养：将消毒后的2-3份外植体放入愈伤组织培养基中在30℃下进行培养20天，得到愈伤组织；所述愈伤组织培养的培养基配方为：1／2 MS＋NAA 0.1mg／L＋KT0.3mg／L＋BA 0.1mg／L＋8g/L琼脂＋30 g/L蔗糖＋8g/L马铃薯汁；
（3）分化培养：将愈伤组织接入分化培养基在28℃下进行培养7天，得到铁皮石斛苗；所述分化培养的培养基配方为：MS＋IBA 0.4～0.5mg／L＋NAA 0.3～0.5mg／L＋2,4-D 0.8～1.0mg／L＋10～15g/L琼脂＋30～50 g/L蔗糖＋10～15g/L香蕉泥；
（4）壮苗培养：将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上，在28℃下继续培养7天；所述壮苗培养的培养基配方为：MS＋IBA 0.3～0.5mg／L＋NAA 0.3～0.5mg／L＋2,4-D 0.3～0.5mg／L＋10～15g/L琼脂＋35 g/L蔗糖＋15g/L香蕉泥；
（5）生根培养：将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上28℃下培养5天；所述生根培养的培养基配方为MS＋IBA 2～5mg／L＋ NAA 2～5mg／L＋0.1～0.2g/L活性炭＋5～10g/L琼脂＋20～30 g/L蔗糖＋10～15g/L马铃薯泥；
（6）炼苗与移栽：选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，再驯化5-10天后，移栽至种植基质中。
2.根据权利要求1所述铁皮石斛的组培繁殖方法，其特征在于，所述外植体消毒为体积浓度为75%乙醇＋体积浓度为2%次氯酸钠溶液或体积浓度为75%乙醇＋体积浓度为2%次氯酸钠＋体积浓度为0.1%氯化汞溶液进行消毒。
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