CN104997825A - 从漏芦花中提取总生物碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明研究漏芦花中总生物碱超声提取工艺并进行含量测定，采用紫外分光光度测定漏芦花中生物碱含量，以其作为评价指标，从而确定最佳工艺。响应面优化后漏芦花中总生物碱最佳提取工艺为：超声温度41℃，超声功率200W，料液比1:28g/mL，超声时间40min，四因素影响顺序依次为超声功率>料液比>超声温度>超声时间，总生物碱含量为0.2774％，平均回收率为99.77％，RSD为2.0％(n＝9)。响应面优化漏芦花生物碱提取工艺，精密度高、可预测性高，为其进一步开发提供了科学、合理的理论依据。

Description

从漏芦花中提取总生物碱的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种从漏芦花中提取总生物碱的超声提取方法。

背景技术

漏芦花，为一种常见的中蒙药，别名为祁州漏芦(Rhaponticum uniflorum(L.)DC.)干燥花，属于菊科管状花亚科祁州漏芦属植物。漏芦花作为常用蒙药，具有止刺痛、清热、解毒、解表等功效。

总生物碱类物质是漏芦花的主要药用成分。为此，研究漏芦花中总生物碱的提取、分离、纯化方法对后续研究其生物活性具有重要意义。

要从漏芦花中充分地获得总生物碱，应当尽可能地破坏漏芦花细胞结构。在提取阶段采用超声波法提取总生物碱类物质，是一种创新，其原理是超声波可在液体中产生“空穴作用”，而“空穴作用”产生的冲击波和射流可以破坏植物细胞和细胞膜结构，从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力，有助于总生物碱类化合物的释放与溶出，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应对原料有水浴作用。目前，在提取阶段采用超声波从漏芦花中提取总生物碱的研究尚未报道。

目前，多采用正交试验设计对中蒙药中主要成分进行提取工艺优化，响应面优化与其比较具有明显优势，可以实现应用较少的试验数据在给定的范围内找到因素与响应值之间明确的函数表达式，得出最佳因素组合和响应值的最优值。

因此，本发明以漏芦花中总生物碱含量为指标，采用响应面优化漏芦花总生物碱的提取工艺，为其进一步研究提供了科学的理论基础。

发明内容

本发明提供了一种从漏芦花中提取总生物碱的超声提取方法，以漏芦花为原料，利用超声波提取，可高得率地获得较高含量的漏芦花总生物碱。

本发明提供了一种从漏芦花中提取总生物碱的超声提取方法，包括：

称取漏芦花，加入石油醚，50℃水浴回流2h，取药渣，加入1％酸性乙醇，静置30min，在一定超声温度下超声提取一定时间，进行超声提取，抽滤，将滤液浓缩，即得。

作为一种具体实施方式，本发明提供了一种从漏芦花中提取总生物碱的超声提取方法，包括：

称取漏芦花0.5g，按1:10g/mL比例加入石油醚，50℃水浴回流2h，取药渣，加入一定量1％酸性乙醇，静置30min，在一定超声温度下超声提取一定时间，进行超声提取，抽滤，将滤液浓缩至25mL，即得。

优选地，所述的超声温度在20-60℃，优选为41℃。

优选地，超声时间为20-60分钟，优选为40分钟。

优选地，超声功率为120-200W，优选为200W。

优选地，料液比为1:20(g/mL)到1:40(g/mL)之间，更优选为1:28(g/mL)。“料液比”，指固态的“料”的质量与作为浸提液的“液”的体积的比。“料”的单位用g、mg，“液”的单位用L、mL，于是“料液比”的单位有g/L、mg/L、g/mL、mg/mL等。本发明所采用的单位为g/mL。

超声波作为一种物理能对漏芦花进行处理，更有利于漏芦花中总生物碱的提取，一方面，能通过空化作用产生极大的压力，造成被破碎物的细胞壁甚至整个生物体破裂而使胞内物质释放、扩散或溶解出来；另一方面，适宜强度的超声波能够使总生物碱分子的构象发生正向转化，从而提高总生物碱的活性。

在超声温度一定时，随着超声功率的增大，总生物碱提取率呈递增趋势，这是由于超声功率的增大，有助于超声波破坏细胞结构，进而提高总生物碱提取率。在超声功率一定时，随着超声温度增大，总生物碱提取率呈现先增加后减少趋势，其原因是，温度升高加快分子运动速度，提取率增高，但温度过高，破坏生物碱结构，进而导致总生物碱提取率相对下降。综上所述，在超声温度与超声功率相互作用下，总生物碱提取率呈先增大后减少的趋势。

总生物碱提取率随着料液比和超声温度的增加呈现先升后降的趋势。料液比一定时，在高温区和低温区的生物碱提取率较低，这主要是因为温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了生物碱析出速度和提取率，而温度过高会破坏生物碱结构，降低提取率。料液比的增大，使得生物碱浓度降低，更容易从细胞中溶出。

总生物碱提取率随超声时间的延长和超声温度的升高而增大，根据超声波作用原理，超声时间的延长有利于超声波充分破坏漏芦花细胞壁，从而使生物碱得以充分溶出，同时超声温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了总生物碱提取率。因此适当地延长时间和提高温度有助于提高生物碱的提取率。但超声温度过高、超声时间过长导致生物碱提取率下降，这是由于时间长、温度高使生物碱分解或破坏了生物碱结构。

在料液比不变时，生物碱提取率随功率增大而逐渐增大，这是由于超声功率的增大，有助于超声波破坏细胞结构，进而提高生物碱提取率。在功率不变时，生物碱提取率随料液比增大，呈抛物线形状，料液比的增大，使得生物碱浓度降低，更容易从细胞中溶出。

在超声时间不变时，生物碱提取率随超声功率增大而逐渐增大，这是由于超声功率的增大，有助于超声波破坏细胞结构，进而提高生物碱提取率。在超声功率不变时，生物碱提取率随超声时间增大，呈抛物线形状。这是因为超声时间的延长有利于超声波充分破坏漏芦花细胞壁，从而使生物碱得以充分溶出。

在超声时间一定时，总生物碱提取率随料液比增加而升高，在料液比一定时，生物碱提取率随超声时间延长先增加后减小。主要原因是超声波可以使得漏芦花的细胞壁破碎，从而使生物碱从细胞中析出，而超声时间过长会破坏生物碱结构，进而影响提取率。

本发明利用超声对漏芦花中的总生物碱进行了提取，首先通过石油醚进行脱脂脱色脱蜡，将漏芦花细胞中总生物碱以乙醇为溶剂进行提取，协同超声波处理破碎的漏芦花细胞，可高效获得含总生物碱的漏芦花内容物提取液；再通过抽滤处理以除去提取液中的药渣后，即可高得率地获得漏芦花总生物碱。相比传统提取法，该法具有使用溶剂少、工艺简便、条件温和、易于控制、安全可靠等特点；该法提取效率更高，操作时间短，提取得率较高。

附图说明

图1：对照品溶液和供试品溶液的吸收光谱曲线

图2：盐酸小檗碱标准曲线

图3：超声温度对漏芦花中总生物碱提取效果的影响

图4：超声功率对漏芦花中总生物碱提取效果的影响

图5：料液比对漏芦花中总生物碱提取效果的影响

图6：超声时间对漏芦花中总生物碱提取效果的影响

图7：超声温度(A)和超声功率(B)交互作用对总生物碱提取率影响的响应面(左图)及等高线图(右图)

图8：超声温度(A)和料液比(C)交互作用对总生物碱提取率影响的响应面(左图)及等高线图(右图)

图9：超声温度(A)和超声时间(D)交互作用对总生物碱提取率影响的响应面(左图)及等高线图(右图)

图10：超声功率(B)和料液比(C)交互作用对总生物碱提取率影响的响应面(左图)及等高线图(右图)

图11：超声功率(B)和超声时间(D)交互作用对总生物碱提取率影响的响应面(左图)及等高线图(右图)

图12：料液比(C)和超声时间(D)交互作用对总生物碱提取率影响的响应面(左图)及等高线图(右图)

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行描述：

实施例1.从漏芦花中提取总生物碱的方法

1.1 实验材料准备

漏芦花，采自内蒙古呼和浩特市大青山，经鉴定为菊科管状花亚科祁州漏芦属植物的干燥花(Rhaponticum uniflorum(L.)DC.)]。

1.2 实验具体方法

1.2.1 缓冲溶液及显色剂的配制

pH＝5.4缓冲溶液：取40mL 0.1mol/L的柠檬酸溶液和85mL 0.1mol/L的柠檬酸钠溶液置于250mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即得。

溴甲酚绿指示液：称取溴甲酚绿0.125g，用25mL 0.1mol/L NaOH溶液溶解后，加邻苯二甲酸氢钾2.55g，用水溶解，转移至250mL容量瓶中，用水定容即得。

1.2.2 供试品溶液的制备

精密称取漏芦花0.5g，按1:10g/mL比例加入石油醚，50℃水浴回流2h。取药渣，加入一定量1％酸性乙醇，静置30min，在一定超声温度下超声提取一定时间，进行超声提取，抽滤，将滤液浓缩至25mL。

1.2.3 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品3.00mg，用1％酸性乙醇溶解，置10mL容量瓶，稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.327mg/mL对照品溶液。

1.2.4 波长的确定

精密量取供试品溶液1mL，置分液漏斗中，加入pH＝5.4缓冲溶液5mL，溴钾酚绿指示液2mL，振摇1min，加氯仿10mL，振摇1min，静置30min；另取对照品溶液0.4mL，加0.6mL1％酸性乙醇，同法操作，进行全波长(200～800nm)扫描，结果见图1，对照品和供试品溶液均在419nm处有最大吸收，因此选取419nm作为测定波长。

1.2.5 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL分别置于分液漏斗中，加1％酸性乙醇至1mL，依次加入缓冲溶液5mL，溴钾酚绿指示剂2mL，振摇1min，氯仿10mL，振摇1min，静置30min，分别在419nm处测定吸光度，结果见表1。以吸光度(A)为纵坐标，对照品溶液浓度(C)为横坐标，得到回归方程为A＝0.0535C-0.0325(r＝0.9999,n＝5)，线性范围为3.27～26.16μg/mL。

表1 盐酸小檗碱浓度实验数据

实施例2.单因素试验

选取超声温度、超声功率、料液比、超声时间4个因素进行单因素试验，得到各因素与总生物碱提取率的关系。

2.1 超声温度对漏芦花中总生物碱提取率的影响

精密称取漏芦花0.5g，以超声功率200W，料液比1:30g/mL，超声时间30min，分别在20、30、40、50、60℃进行超声提取。按照实施例1下显色方法处理后，测定吸光度。结果见表2。

表2 超声温度对总生物碱提取率影响实验数据

2.2 超声功率对漏芦花中总生物碱提取率的影响

精密称取漏芦花0.5g，以超声温度30℃，料液比1:30g/mL，超声时间30min，分别在120、140、160、180、200W进行超声提取。按照实施例1下显色方法处理后，测定吸光度。结果见表3。

表3 超声功率对总生物碱提取率影响实验数据

2.3 料液比对漏芦花中总生物碱提取率的影响

精密称取漏芦花0.5g，以超声温度40℃，超声功率200W，超声时间30min，分别在料液比1:20、1:25、1:30、1:35、1:40g/mL进行超声提取。按照实施例1下显色方法处理后，测定吸光度。结果见表4。

表4 料液比对总生物碱提取率影响实验数据

2.4 超声时间对漏芦花中总生物碱提取率的影响

精密称取漏芦花0.5g，以超声温度40℃，超声功率100W，料液比1:30g/mL，分别在超声时间为20、30、40、50、60min进行超声提取。按照实施例1下显色方法处理后，测定吸光度。结果见表5。

表5 超声时间对总生物碱提取率影响实验数据

实施例3 单因素试验结果分析

3.1 不同超声温度对漏芦花中总生物碱提取率的影响，结果见图3，超声温度在30℃时，提取率急剧下降，30℃之后，图像呈抛物线形状，在超声温度30，40，50℃，生物碱提取率较大，其中40℃，提取率最大。故选取30、40、50℃进行响应面分析。

3.2 不同超声功率对漏芦花中总生物碱提取率的影响，结果见图4。整个图像呈单调递增，但增加趋势缓慢，这是由于超声功率越大，超声波作用越强，总生物碱溶出物越多，从而提取率越大。在160、180、200W时，提取率较大，在200W时，提取率最大。故选取160、180、200W进行响应面优化。

3.3 不同料液比对漏芦花中总生物碱提取率的影响，结果见图5。随着料液比的增大，总生物碱提取率逐渐增大，当料液比介于1:25～1:30g/mL时，总生物碱提取率达到最大，当料液比高于1:30g/mL时，提取率反而下降，可能是随着溶剂体积的增大，其他非生物碱类可溶性物质溶解度也逐渐增大，从而使总生物碱相对提取率降低。故选取料液比1:25、1:30、1:35g/mL进行响应面法优化。

3.4 不同超声时间对漏芦花中总生物碱提取率的影响，结果见图6。随提取时间的延长，提取率随之增加，在前40min内增加趋势缓慢，40min后总生物碱提取率急剧下降，这是由于超声波在40min内对细胞膜的破坏作用较大，总生物碱溶出物多，提取率也高，但超过40min时，超声波作用会使提取物中部分生物碱的结构受破坏，进而导致总生物碱提取率相对降低。故选择30、40、50min进行响应面优化。

实施例4 响应面分析法分析超声提取效果的影响因素

4.1 响应面优化工艺

在单因素试验基础上，以超声温度(A)、超声功率(B)、料液比(C)、超声时间(D)为自变量，总生物碱提取率为响应值，使用Design-Expert 8.0.6.1试验设计，进行响应面分析试验，见表6。

表6 漏芦花提取工艺响应面试验因素水平

4.2 对漏芦花中总生物碱提取工艺进行响应面分析，具体试验方案见下表，表中分为24次析因实验和5次中心实验，其中中心实验用以估计实验误差。

表7 漏芦花中总生物碱提取工艺条件Box-behnken设计方案及数据结果

4.3 响应面分析方案与试验结果

表8 漏芦花总生物碱提取工艺Box-behnken设计方案及响应值

表9 漏芦花中总生物碱提取工艺条件响应面分析拟合回归方程的方差分析结果

注：P值小于0.05，表示对应因素对响应值的影响显著

以总生物碱提取率(Y)为考察响应指标，建立其与超声温度、超声功率、料液比、超声时间四因素的回归模型，得到二次多项回归模型为：Y＝+0.27-2.683×10^-3A+0.012B-7.458×10^-3-8.333×10^-5D+2.725×10^-3AB-4.525×10^-3AC-1.000×10^-3AD-1.475×10^-3BC+2.125×10^-3BD+3.025×10^-3CD-0.014A²+1.262-003B²-0.012C²-0.013D²

4.4 方程显著性检验

由表9方差分析结果看出，总模型显著(P<0.0001)，表明不同因素间的差异高度显著；失拟项不显著(P>0.05)，表明模型选择合适。由P值可以看出各因素对总生物碱提取率影响顺序：B>C>A>D，即超声功率>料液比>超声温度>超声时间，其中C²、D²对总生物碱提取率有显著影响。相关系数R²＝0.9675，表示模型拟合程度良好；修正相关系数平方表明实验误差小，可用该模型进行实验预测。因此可以用此模型对漏芦花中总生物碱提取率进行分析与预测。

4.5 响应面图及等高线分析

响应面图是响应值对各试验因子A、B、C、D所构成的三维空间的曲面图，从响应面图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。图7～图12是根据上述模拟的多项回归模型和对回归方差的分析，得到各因素对漏芦花中总生物碱提取率影响的响应面及等高线图，此反映了任意两因素及其交互作用对总作用生物碱提取率的影响，等高线的形状越趋向椭圆，表示交互作用越强；趋向于正圆，则表示交互越弱。

由图7可知，在超声温度一定时，随着超声功率的增大，总生物碱提取率呈递增趋势，这是由于超声功率的增大，有助于超声波破坏细胞结构，进而提高总生物碱提取率。在超声功率一定时，随着超声温度增大，总生物碱提取率呈现先增加后减少趋势，其原因是，温度升高加快分子运动速度，提取率增高，但温度过高，破坏生物碱结构，进而导致总生物碱提取率相对下降。综上所述，在超声温度(A)与超声功率(B)相互作用下，总生物碱提取率呈先增大后减少的趋势。

由图8可知，总生物碱提取率随着料液比和超声温度的增加呈现先升后降的趋势。料液比一定时，在高温区和低温区的生物碱提取率较低，这主要是因为温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了生物碱析出速度和提取率，而温度过高会破坏生物碱结构，降低提取率。料液比的增大，使得生物碱浓度降低，更容易从细胞中溶出。

由图9可知，总生物碱提取率随超声时间的延长和超声温度的升高而增大，根据超声波作用原理，超声时间的延长有利于超声波充分破坏漏芦花细胞壁，从而使生物碱得以充分溶出，同时超声温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了总生物碱提取率。因此适当地延长时间和提高温度有助于提高生物碱的提取率。但超声温度过高、超声时间过长导致生物碱提取率下降，这是由于时间长、温度高使生物碱分解或破坏了生物碱结构。

由图10可知，在料液比不变时，生物碱提取率随功率增大而逐渐增大，这是由于超声功率的增大，有助于超声波破坏细胞结构，进而提高生物碱提取率。在功率不变时，生物碱提取率随料液比增大，呈抛物线形状，料液比的增大，使得生物碱浓度降低，更容易从细胞中溶出。

由图11可知，在超声时间不变时，生物碱提取率随超声功率增大而逐渐增大，这是由于超声功率的增大，有助于超声波破坏细胞结构，进而提高生物碱提取率。在超声功率不变时，生物碱提取率随超声时间增大，呈抛物线形状。这是因为超声时间的延长有利于超声波充分破坏漏芦花细胞壁，从而使生物碱得以充分溶出。

由图12可知，在超声时间一定时，总生物碱提取率随料液比增加而升高，在料液比一定时，生物碱提取率随超声时间延长先增加后减小。主要原因是超声波可以使得漏芦花的细胞壁破碎，从而使生物碱从细胞中析出，而超声时间过长会破坏生物碱结构，进而影响提取率。

4.6 漏芦花中总生物碱提取工艺条件优化

利用Design-Expert 8.0.6.1统计分析软件对边界值和求得的极值进行分析后，得到最优的提取条件为超声温度40.63℃、料液比1:28.04g/mL、超声时间40.29min、超声功率200W，理论预测值Y(总生物碱提取率)＝0.0.288034％。按照修正为超声温度41℃，料液比1:28g/mL，超声时间40min，超声功率200W。

实施例5 总生物碱含量测定

按实施例4下的最佳工艺提取漏芦花中总生物碱，按“实施例1下的方法显色处理后，在419nm处测定吸光度，由回归方程计算漏芦花中总生物碱的含量为0.2774％，RSD为1.9％，结果见表11，与理论值0.288034％，误差为0.010634％。优化得到的试验预测值与实验结果吻合较好，说明响应面优化得到的漏芦花生物碱提取工艺条件可靠。

表10 总生物碱含量测量数据

表11 总生物碱含量测定结果

5.1 稳定性试验

精密量取同一供试品溶液，按实施例1下方法显色，分别在10、20、30、40、50、60min时，于419nm处分别测定吸光度，结果见表10：RSD为2.8％，结果表明供试品在60min内稳定性较好。

表10 稳定性试验结果

5.2 精密度试验

精密量取供试品溶液5份，每份1.0mL，按实施例1项下方法显色，在419nm处分别测定吸光度，由回归方程计算总生物碱提取率，结果见表11：RSD为0.55％，结果表明精密度良好。

表11 精密度试验结果

5.3 重复性试验

精密称取漏芦花0.5g，5份，按实施例4项下制备供试品溶液和实施例1项下方法显色，在419nm处分别测定吸光度，由回归方程计算总生物碱提取率。结果见下表12，RSD为1.9％。结果表明，该方法重复性良好。

表12 重复性试验数据

表13 重复性试验结果

5.4 加样回收率试验

精密称取漏芦花0.5g，9份，分别加入相当于供试品中总生物碱含量80％、100％、120％的盐酸小檗碱对照品，按最佳提取工艺制备供试液溶液和实施例1项下显色方法，在419nm处测定吸光度，计算加样回收率，结果见表15。

表15 加样回收试验结果

响应面优化克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷，响应面优化是研究几种因素间交互作用的回归分析方法。

本实验通过Box-Benhnken中心组合设计响应面法，建立了4个影响因素(超声温度、超声功率、料液比、超声时间)与响应值(生物碱提取率)相互作用的数学模型，采用重叠等高线法实现了总生物碱提取率多因素优化，得到漏芦花中总生物碱的最佳提取工艺为：超声温度41℃，超声功率200W，料液比1:28g/mL，超声时间40min，测得总生物碱含量为0.2774％，为今后工作提供理论基础。

Claims (6)

1.一种从漏芦花中提取总生物碱的超声提取方法，包括：

称取漏芦花，加入石油醚，50℃水浴回流2h，取药渣，加入1％酸性乙醇，静置30min，进行超声提取，抽滤，将滤液浓缩，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：超声温度为20-60℃，优选为41℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：超声时间为20-60min，优选为40min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：料液比为1:20g/mL到1:40g/mL之间，优选1:28g/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：超声波的功率为120-200W，优选200W。

6.一种从漏芦花中提取总生物碱的超声提取方法，包括：

称取漏芦花0.5g，按1:10g/mL比例加入石油醚，50℃水浴回流2h，取药渣，加入一定量1％酸性乙醇，静置30min，在一定超声温度下超声提取一定时间，进行超声提取，抽滤，将滤液浓缩至25mL，即得。