CN104876934A - 一种含氮杂环苯基哌啶类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐，其结构如通式a所示：其中，R1为氢，单取代或多取代卤素、甲基、甲氧基、叔丁基或三氟甲基；R2为氢、氯、溴、甲基或乙基。本发明的化合物结构新颖，以哌啶环形式引入活泼氨基，使得侧链氨基构型加固，化合物刚性加强。通过这种设计改造方式，得到了明显具有较强Akt1激酶抑制活性和PC-3细胞株生长抑制活性的化合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种含氮杂环苯基哌啶类化合物及其制备方法与应用，属于有机化合物合成及医药技术领域。
背景技术
磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，亦称Akt)信号转导通路中的基因突变相当普遍，是一条与肿瘤发生发展密切相关的通路。该通路的过度激活在急、慢性白血病，淋巴瘤，骨髓瘤及卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤中常见。PI3K/Akt信号通路通常由各种配体(如生长因子或细胞因子)与多种受体[最重要的是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)和G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptors，GPCRs)]结合而激活。细胞外生长因子与RTKs结合激活RTKs；在细胞膜上，活化的RTKs既可以直接使磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)聚集并激活，也可以通过衔接蛋白GAB(growth factor receptor-bound protein 2-associated binder)使PI3K聚集并激活，PI3K磷酸化磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate，PIP2)的3-OH使其转化为磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(phosphatidylinositol(3,4,5)trisphosphate，PIP3)并锚定在细胞质膜的内侧。磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)是PI3K/Akt通路主要的负向调节剂，PTEN使PIP3去磷酸化而转化为PIP2，从而下调PI3K/Akt信号(PIP3的大量积累能促进Akt的活化)。PIP3与Akt的PH域结合使其移位至细胞膜，Akt构象改变暴露出苏氨酸Thr308和丝氨酸Ser473两个磷酸化位点，继而分别被磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)和mTORC2(mammalian targetof rapamycin complex 2)磷酸化而使Akt完全活化。(Hennessy BT；Smith DL：Exploiting thePI3K/AKT pathway for cancer drug discovery.Nat Rev Drug Discov 2005,4:988-1004.)
活化的Akt可磷酸化糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)，以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p21Cip1和p27Kip1，从而引起细胞周期变短，加速细胞周期进程；活化的Akt可进入细胞核磷酸化转录因子家族叉形头转录因子(Forhead box class O，FOXO)，阻断FOXO介导的一些促凋亡蛋白基因的转录；也可直接磷酸化凋亡级联反应的调节蛋白(Bcl-XL/Bcl-2associated death factor，Bad)，从而抑制细胞凋亡。(Bhutani J；Sheikh A：Aktinhibitors:mechanism of action and implications for anticancer therapeutics.Infect Agent Cancer2013,8:49.)研究发现，在40％的乳腺癌和卵巢癌及超过50％的前列腺癌中发现有高活性的Akt1，在30-40％的胰腺癌和卵巢癌中观测到高活性的Akt2，在雌激素受体缺陷型乳腺癌和雄激素不敏感型前列腺癌细胞株中发现了高活性的Akt3。无论是Akt激酶本身还是Akt激酶上游调节分子，例如PTEN和PI3K，在超过50％的人类肿瘤中均有异常变化。所以Akt是发现抗肿瘤药物的一个重要靶标。(参见Cheng GZ；Park S：Advances of AKT pathway in humanoncogenesis and as a target for anti-cancer drug discovery.Curr Cancer Drug Targets.2008,8:2-6.)
当前，已报道众多ATP-竞争性Akt抑制剂(如GSK690693、GDC0068、AZD5363、GSK2110183)。此类抑制剂与ATP竞争Akt催化域中央ATP的结合部位，从而阻碍活化的Akt对下游底物的磷酸化。GSK690693是第一个进入临床研究的Akt抑制剂，但由于其诱发高血糖症的副作用而中止了临床试验；GDC0068在肿瘤细胞中阻止Akt磷酸化多种下游靶标，在PI3K/Akt通路活化的肿瘤移植模型中表现出强的抗肿瘤作用，已进入II期临床试验；AZD5363是一广谱的Akt抑制剂(对Akt1，Akt2和Akt3均有强的抑制作用，且对Akt的选择性高，在乳腺癌移植瘤模型中显著抑制肿瘤生长，现正进行I期临床试验。GSK2110183已经完成在血癌病人中的临床Ⅱ期研究。(参见Khurum HK；Timothy AY:Targeting thePI3K-AKT-mTOR signaling network in cancer.Chin J Cancer 2013,32:253–265.)
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种含氮杂环苯基哌啶类化合物，该类化合物具有良好的细胞生长抑制活性和对Akt1的抑制活性。
本发明的另一目的是提供该含氮杂环苯基哌啶类化合物的制备方法及其用途。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐，其结构如通式a所示：
其中，R1为氢，单取代或多取代卤素、甲基、甲氧基、叔丁基或三氟甲基；R2为氢、氯、溴、甲基或乙基。
优选的，所述R1为氢、4-氯、4-溴、4-氟、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴、3,4-二氯或2,4-二氯；R2为氢、氯、溴或甲基。
进一步优选的，所述含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐选自下列化合物：
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-1)；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-2)；
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-3)；
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-4)；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-5)；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-6)；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-叔丁基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-7)；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-8)；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-9)；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-10)；
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-11)；
(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-12)；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-13)；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-14)；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-15)；
上述优选的15个化合物名称后的括号中为其相应的代号，为叙述方便和表达简洁，上述括号中的代号在本说明书以下内容中将被直接应用。
结构为通式a所示的含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐的制备方法，其合成路线如下：
合成路线中，所用的试剂及反应条件如下：
(1)1-叔丁氧羰基哌嗪，DMF，110℃；(2)HCl-二氧六环，甲醇，室温；(3)(Boc)2O,二氯甲烷，氢氧化钠水溶液(10％),室温；(4)氢化钠，DMF，60℃；(5)乙醇，氢氧化钠水溶液(10mol/L)，78℃；(6)EDCI,HOBT,DIEA,DMF,室温；(7)HCl-二氧六环，甲醇，室温。
具体合成步骤为：
(1)将4-氯-5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(起始原料b)溶解在DMF溶液中，加入三乙胺和Boc保护的哌嗪，将反应加热到110℃，反应16h，加入10倍DMF体积的冰水，乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，柱层析分离纯化(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝1:3)得中间体c，此处所述起始原料b和中间体c中，R2为氢、氯、溴、甲基；上述反应中起始原料b：三乙胺：Boc保护的哌嗪＝1：1.5：1.1(摩尔比)；
(2)将中间体c用少量甲醇溶解，加入4mol/L氯化氢二氧六环溶液中，反应液室温搅拌12h，减压蒸除甲醇，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗，干燥，得中间体d。所述中间体c和中间体d中，R2为氢、氯、溴、甲基；
(3)将二(2-氯乙基)氨盐酸盐(原料e)加入二氯甲烷溶液中，冰浴状态下边搅拌便加入质量分数为10％氢氧化钠水溶液，将二碳酸二叔丁酯溶于二氯甲烷溶液中，加入到上述起始原料e的溶液中，室温搅拌18.5h，加入二氯甲烷溶液，两相分开，水相再被二氯甲烷溶液萃取一次，有机相用硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得中间体f。上述反应中原料e、二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:1，每1毫摩尔原料e加入的10％氢氧化钠水溶液的量为1ml。
(4)将中间体f与取代苯乙腈(原料g)加入到干燥的DMF溶液当中，搅拌并置于冰浴当中，氢化钠(分散于矿物油中，质量分数60％)分多次加入，之后将反应移到室温当中，并油浴60℃加热16h。反应完后加入冰水淬灭，水相用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗两次，盐水再洗一次，硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离纯化(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1)后，乙酸乙酯/石油醚重结晶得中间体h。上述反应中中间体f、原料g、氢化钠的摩尔比为1：1：5；此处所述原料g和中间体h中，R1为氢、4-氯、4-溴、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴、3,4-二氯；
(5)将中间体h溶解在乙醇当中，加入10mol/L的氢氧化钠水溶液，反应液回流48h，冷却至室温，倒入1mol/L的盐酸水溶液，乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，乙酸乙酯/石油醚重结晶，得中间体i。所述中间体h和中间体i中，R1为氢、4-氯、4-溴、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴、3,4-二氯；上述反应中，每1摩尔中间体h所需10mol/L的氢氧化钠溶液为3ml；
(6)将中间体i溶解在无水DMF中，室温搅拌10min，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，接着加入1-羟基苯并三唑(HOBT)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA),将反应混合物在室温下搅拌20min，冷却至0℃，中间体d加入分批加入到反应中，室温下搅拌48h，TLC监测反应完成后，加入10倍DMF体积的冰水，沉淀析出完全后，过滤，水洗，干燥，得中间体j。上述反应中，中间体i、EDCI、HOBT、DIEA、中间体d的摩尔比为1：1.1：1.1：3：1；所述中间体i、中间体d、中间体j中，R1为氢、4-氯、4-溴、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴、3,4-二氯，R2为氢、氯、溴、甲基；
(7)将中间体j混悬于甲醇溶液中，加入4M的HCl-二氧六环溶液，室温搅拌48h，减压蒸除甲醇溶液，溶液析出固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗，干燥，得目标化合物a。上述反应中，每1毫摩尔中间体j所需甲醇、4M的HCl-二氧六环溶液分别为20ml、60ml；所述中间体j、目标化合物a中，R1为氢、4-氯、4-溴、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴、3,4-二氯，R2为氢、氯、溴、甲基。
本发明还提供一种具有Akt1激酶抑制活性的药物制剂，该药物制剂含有有效量的通式a结构的化合物，该药物制剂可以作为抗肿瘤药物，尤其是作为抗前列腺癌的药物。
该种药物制剂可进一步的与一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂结合，制成口服制剂和肠胃外给药制剂，可以为片剂、丸剂、胶囊剂或注射剂。
所述载体选自生理盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇或它们的组合物；所述赋形剂可以选自磷酸钙，硬脂酸镁，滑石粉，糊精，淀粉，凝胶纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠盐或聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的有益效果：
本发明设计合成了结构新颖的含氮杂环苯基哌啶类化合物，通式a所示化合物以哌啶环形式引入活泼氨基，使得侧链氨基构型加固，化合物刚性加强。通过这种设计改造方式，得到了明显具有较强Akt1激酶抑制活性和PC-3细胞株生长抑制活性的化合物。其中化合物a-1、a-3在浓度为40nM时，对Akt1的抑制率分别为94％、91％，优于阳性药GSK690693；对PC-3细胞株的生长抑制活性IC50分别为26uM、6uM，优于阳性药GSK690693的38uM。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例中采用的条件可以根据现有的设备条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1：化合物a-1～化合物a-15的制备
(1)4-(5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体c)的制备
将4-氯-5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(起始原料b)(3.2mmol)分别溶解在3ml DMF溶液中，加入0.65ml三乙胺(4.9mmol)和Boc保护的哌嗪(0.75g，3.6mmol)，将反应加热到110℃，反应16h，加入10倍DMF体积的冰水，乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，柱层析分离纯化(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝1:3)，得4-(5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体c)。
起始原料b的取代基分别为氢、氯、溴和甲基，得到的中间体c有4种，分别为：
4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-1).灰白色固体，产率：59％.1HNMR(600MHz,DMSO)δ11.73(s,1H),8.15(S,1H),7.20(d,J＝0.6Hz,1H)，6.64(d,J＝1.8Hz,1H),3.86(s,4H),3.48(s,4H),1.43(s,9H).MS(ESI)m/z:304[M+H]+.
4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-2).灰白色固体，产率：51％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.23(s,1H),8.29(s,1H),7.52(d,J＝2.8Hz,1H),3.52(s,8H),1.428(s,9H).
4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-3).浅黄色固体，产率：48％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.21(s,1H)，8.37(s,1H)，7.52(d,J＝2.6Hz,1H)，3.52(s,8H)，1.42(s,9H).
4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-4).白色固体，产率：47％.MS(ESI)m/z:318[M+H]+.
(2)5-取代-4-(哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶盐酸盐(中间体d)的制备
将上述4-(5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体c)(1mmol)加入2ml甲醇溶液中，加入4mol/L氯化氢二氧六环溶液15ml，反应24h，减压蒸除甲醇，析出固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗，干燥得5-取代-4-(哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶盐酸盐(中间体d)。
该步骤中，中间体c分别为4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-1)、4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-2)、4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-3)和4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(c-4)；相应的，得到的中间体d有4种，分别为：
4-(哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶盐酸盐(d-1).白色固体，产率：89％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.72(s,1H),9.78(s,1H),9.71(s,2H),8.42(s,1H),7.48(s,1H),6.94(s,1H),4.22(s,4H),3.29(s,4H).MS(ESI)m/z:204[M+H]+。
5-氯-4-(哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶盐酸盐(d-2).白色固体，产率：87％.MS(ESI)m/z:238[M+H]+。
5-溴-4-(哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶盐酸盐(d-3).浅黄色固体，产率：85％.MS(ESI)m/z:282[M+H]+。
5-甲基-4-(哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶盐酸盐(d-4).白色固体，产率：89％.MS(ESI)m/z:218[M+H]+。
(3)二(2-氯乙基)氨基甲酸叔丁酯(中间体f)的制备
将二(2-氯乙基)氨盐酸盐(原料e)(10g，56mmol)加入40ml二氯甲烷溶液中，冰浴状态下边搅拌便加入质量分数为10％氢氧化钠水溶液56ml，将二碳酸二叔丁酯(12g，56mmol)溶于30ml二氯甲烷溶液中，加入到上述二(2-氯乙基)氨盐酸盐的溶液中，室温搅拌18.5h，加入50ml二氯甲烷溶液，两相分开，水相再被二氯甲烷溶液萃取一次，有机相用硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得二(2-氯乙基)氨基甲酸叔丁酯(中间体f)。
二(2-氯乙基)氨基甲酸叔丁酯(中间体f).白色固体，产率：97％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ3.71-3.67(m,4H),3.52(t,J＝1.8Hz,4H),1.40(s,9H).
(4)4-氰基-4-(取代苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体h)的制备
将二(2-氯乙基)氨基甲酸叔丁酯(中间体f)(0.25g，1.66mmol)与取代苯乙腈(原料g)(1.66mmol)加入到5ml干燥的DMF溶液当中，搅拌并置于冰浴当中，氢化钠(分散于矿物油中，质量分数60％)(0.22g，8.4mmol)分多次加入，之后将反应移到室温当中，并油浴60℃加热16h。反应完后加入冰水淬灭，水相用乙酸乙酯萃取，有机相用水洗两次，盐水再洗一次，硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离纯化(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1)后，乙酸乙酯/石油醚重结晶得4-氰基-4-(取代苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体h)。
上述所述取代苯乙腈(原料g)中，取代基分别为氢、4-氯、4-溴、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴和3,4-二氯，相应的，得到的中间体h有7种，分别为：
4-氰基-4-苯基哌啶-1-甲酸叔丁酯(h-1).白色固体，产率30％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.55(m,2H),7.44(t,J＝7.8Hz,2H),7.38(d,J＝7.2Hz,1H)，4.13(d,J＝13.2Hz,2H),3.02(br.s,1H)，2.12(d,J＝11.8Hz,2H),1.42(s,9H),1.92(td,J1＝12.9Hz,J2＝4.3Hz,2H).
4-氰基-4-(4-氯苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(h-2).白色固体，产率51％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ7.58(d,J＝8.4Hz,2H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),4.12(br.s,2H),3.00(br.s,2H),2.12(d,J＝13.2Hz,2H),1.91(td,J1＝12.9Hz,J2＝4.2Hz,2H),1.42(s,9H).
4-氰基-4-(4-溴苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(h-3).白色固体，产率50％.MS(ESI)m/z:365.
4-氰基-4-(4-甲氧基苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(h-4).淡黄色色固体，产率61％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.44(d,J＝8.8Hz,2H)，6.98(d,J＝8.76Hz,2H)，4.11(d,J＝12.9Hz,2H)，3.76(s,3H),3.01(br.s,2H),2.09(d,J＝12.8Hz,2H),1.86(td,J1＝13.0Hz,J2＝4.1Hz,2H),1.42(s,9H).
4-氰基-4-(4-叔丁基苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(h-5).淡黄色色固体，产率59％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.45(s,4H),4.12(d,J＝6.5Hz,2H),3.01(br.s,3H),2.10(d,J＝6.2Hz,2H),1.89(td,J1＝13.1Hz,J2＝4.2Hz,2H),1.42(s,9H),1.28(s,9H).
4-氰基-4-(3-溴苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(h-6).白色固体，产率63％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.74(t,J＝1.76Hz,1H),7.58(td,J1＝7.76Hz,J2＝1.52Hz,2H),7.41(t,J＝7.9Hz,1H),4.13(d,J＝13.0Hz,2H),3.00(br.s,2H),2.14(d,J＝12.1Hz,2H),1.90(td,J1＝13.0Hz,J2＝4.4Hz,2H),1.42(s,9H).
4-氰基-4-(3，4-二氯苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(h-7).淡黄色色固体，产率58％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.82(d,J＝2.3Hz,1H),7.72(d,J＝8.5Hz,1H),7.57(dd,J1＝6.2Hz,J2＝2.3Hz,1H),4.13(d,J＝13.1Hz,2H),2.15(d,J＝12.2Hz,2H),1.96(m,2H),1.42(s,9H).
(5)1-(叔丁氧基羰基)-4-(取代苯基)哌啶-4-羧酸(中间体i)的制备
将4-氰基-4-(取代苯基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体h)(1.15mmol)溶解在3ml乙醇当中，加入10mol/L的氢氧化钠水溶液3ml，反应液回流48h，冷却至室温，倒入1mol/L的盐酸水溶液，乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸除溶剂，乙酸乙酯/石油醚重结晶，得1-(叔丁氧基羰基)-4-(取代苯基)哌啶-4-羧酸(中间体i)。
该步骤中，中间体h的取代基分别为氢、4-氯、4-溴、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴和3,4-二氯；相应的，得到的中间体i有7种，分别为：
1-(叔丁氧基羰基)-4-苯基哌啶-4-羧酸(i-1).白色固体，产率73％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.70(s,1H),7.40-7.33(m,4H),7.28-7.24(m,1H),3.80(d,J＝13.6Hz,2H),2.96(br.s,2H),2.36(d,J＝13.2Hz,2H),1.73-1.67(m,2H),1.39(s,9H).
1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-氯苯基)哌啶-4-羧酸(i-2).白色固体，产率80％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.80(s,1H),7.41(s,4H),3.77(d,J＝13.6Hz,2H)；2.97(br.s,2H),2.34(d,J＝13.6Hz,2H),1.74-1.67(m,2H),1.39(s,9H).
1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-溴苯基)哌啶-4-羧酸(i-3).白色固体，产率68％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.81(s,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),3.77(d,J＝13.8Hz,2H)；2.96(br.s,2H),2.33(d,J＝13.8Hz,2H),1.72-1.67(m,2H),1.39(s,9H).
1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-羧酸(i-4).白色固体，产率57％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.58(s,1H),7.30(m,2H),6.91(m,2H),3.78-3.72(m,5H),2.95(br.s,2H),2.33(d,J＝13.6Hz,2H),1.63-1.70(m,2H),1.38(s,9H).
1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-叔丁基苯基)哌啶-4-羧酸(i-5).白色固体，产率67％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.62(br.s,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),3.80(d,J＝13.6Hz,2H),2.93(br.s,2H),2.35(d,J＝13.6Hz,2H),1.71-1.64(m,2H),1.38(s,9H),1.25(s,9H).
1-(叔丁氧基羰基)-4-(3-溴苯基)哌啶-4-羧酸(i-6).白色固体，产率78％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.87(s,1H),7.52(t,J＝18Hz,1H),7.50-7.47(m,1H),7.42-7.40(m,1H),7.33(t,J＝7.8Hz,1H),3.79(d,J＝5.6Hz,2H),2.99(br.s,2H),2.34(d,J＝13.6Hz,2H),1.75-1.67(m,2H),1.39(s,9H).
1-(叔丁氧基羰基)-4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-羧酸(i-7).白色固体，产率81％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.97(s,1H),7.63(d,J＝8.2Hz,1H),7.59(d,J＝3.6Hz,1H),7.40(dd，J1＝8.2Hz,J2＝2.0Hz,1H),3.76(d,J＝21Hz,2H),2.97(br.s,2H),2.33(d,J＝20.4Hz,2H),1.77-1.70(m,2H),1.39(s,9H).
(6)4-(4-(5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-取代哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体j)的制备
将1-(叔丁氧基羰基)-4-(取代苯基)哌啶-4-羧酸(中间体i)(0.30mmol)溶解在6ml无水DMF中，室温搅拌10min，加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.33mmol，63mg)，接着加入1-羟基苯并三唑(HOBT)(0.33mmol，50mg)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(3mmol，116mg),将反应混合物在室温下搅拌20min，冷却至0℃，5-取代-4-(哌嗪-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶盐酸盐(中间体d)分批加入到反应中，室温下搅拌48h，TLC监测反应完成后，加入10倍DMF体积的冰水，沉淀析出完全后，过滤，水洗，干燥，得4-(4-(5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-取代哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体j)。
该步骤中，中间体i的取代基分别为氢、4-氯、4-溴、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴、3,4-二氯，中间体d的取代基分别为氢、氯、溴、甲基；得到的中间体j有15种，分别为：
4-(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-氯苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-1).淡黄色固体，产率：71％.MS(ESI)m/z:605[M+H]+.
4-(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(3，4-二氯苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-2).淡黄色固体，产率：74％.MS(ESI)m/z:639[M+H]+.
4-(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(3，4-二氯苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-3).灰白色固体，产率：70％.MS(ESI)m/z:593[M+H]+.
4-(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-氯苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-4).灰白色固体，产率：75％.MS(ESI)m/z:559[M+H]+.
4-(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(3-溴苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-5).灰白色固体，产率：72％.MS(ESI)m/z:605[M+H]+.
4-(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-苯基哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-6).灰色固体，产率：65％.MS(ESI)m/z:571[M+H]+.
4-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-叔丁基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-7).灰色固体，产率：79％.MS(ESI)m/z:547[M+H]+.
4-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-氯苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-8).灰白色固体，产率：69％.MS(ESI)m/z:525[M+H]+.
4-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(3,4-二氯苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-9).灰白色固体，产率：78％.MS(ESI)m/z:559[M+H]+.
4-(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-10).淡黄色色固体，产率：、84％.MS(ESI)m/z:601[M+H]+.
4-(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-溴苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-11).灰白色固体，产率：、82％.MS(ESI)m/z:605[M+H]+.
4-(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-苯基哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-12).灰白色固体，产率：67％.MS(ESI)m/z:505[M+H]+.
4-(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(3-溴苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-13).灰白色固体，产率：67％.MS(ESI)m/z:649[M+H]+.
4-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-甲氧基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-14).灰白色固体，产率：67％.MS(ESI)m/z:521[M+H]+.
4-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-(4-溴苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(j-15).灰白色固体，产率：67％.MS(ESI)m/z:571[M+H]+.
(7)(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(目标化合物a)的制备
将4-(4-(5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-取代哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体j)(0.2mmol)混悬于4ml甲醇溶液中，加入4M的HCl-二氧六环溶液20ml，室温搅拌48h，减压蒸除甲醇，溶液析出固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗，干燥，得(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(目标化合物a)。
上述所述4-(4-(5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-羰基)-4-取代哌啶-1-甲酸叔丁酯(中间体j)为步骤(11)制备的j-1～j-15，得到的目标化合物a有15种，分别为：
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-1).灰白色固体，产率：87％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.57(s,1H),9.11(s,2H),8.30(s,1H),7.62(s,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),3.57(s,8H),3.28(d,J＝11.1Hz,2H),3.06(br.s,2H),2.36(d,J＝13.7Hz,2H),2.18(d,J＝11.0Hz,2H).MS(ESI)m/z:505[M+H]+.
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-2).淡黄色固体，产率：88％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.58(s,1H),9.07(d,J＝21.0Hz,2H),8.31(s,1H),7.70(d,J＝7.8Hz,1H),7.62(s,1H),7.51(s,1H),7.26(d,J＝7.8
Hz,1H),3.76-3.53(m,8H),3.28(d,J＝12.6Hz,2H),3.06(m,2H),2.37(d,J＝14.4Hz,2H),2.23-2.12(m,2H).MS(ESI)m/z:539[M+H]+.
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-3).灰白色固体，产率：85％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.32(s,1H),8.86-8.75(m,2H),8.27(s,1H),7.70(d,J＝9.0Hz,1H),7.54-7.51(m,2H),7.26-7.25(m,1H),7.26(d,J＝7.8Hz,1H),4.00-3.57(m,8H),3.29(d,J＝12.6Hz,2H),3.06(m,2H),2.37(d,J＝13.2Hz,2H),2.16-2.08(m,2H).MS(ESI)m/z:493[M+H]+.
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-4).灰白色固体，产率：86％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.62(s,1H),9.22(s,2H),8.30(s,1H),7.59(s,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,2H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),3.57(s,8H),3.29-3.26(m,2H),3.10-3.02(m,2H),2.39-2.34(m,2H),2.20-2.17(m,2H).MS(ESI)m/z:459[M+H]+.
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-5).淡黄色固体，产率：80％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.40(s,1H),8.94(d,J＝34.2Hz,2H),8.28(s,1H),7.55-7.54(m,2H),7.45(s,1H),7.41(t,J＝7.8Hz,1H),7.29(d,J＝7.8Hz,1H),3.90-3.57(m,8H),3.29(d,J＝12.6Hz,2H),3.08-3.06(m,2H),2.39-2.36(d,J＝15.0Hz,2H),2.17-2.15(m,2H).MS(ESI)m/z:505[M+H]+.
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-6).灰白色固体，产率：83％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.37(s,1H),8.68(d,J＝44.4Hz,2H),8.27(s,1H),7.57(s,1H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),6.72-6.67(m,3H),3.75(s,8H),3.29-3.27(m,2H),3.09-3.06(m,2H),2.36(d,J＝13.6Hz,2H),2.10-2.06(m,2H).MS(ESI)m/z:471[M+H]+.
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-叔丁基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-7).灰白色固体，产率：89％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.98(s,1H),8.63(s,2H),8.21(s,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.27(s,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(s,1H),3.57(s,8H),3.32-3.29(m,3H),3.10-3.28(m,2H),2.38-2.36(m,2H),2.09(s,2H),1.27(s,9H).MS(ESI)m/z:447[M+H]+.
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-8).灰白色固体，产率：87％.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.68(s,1H),9.18(d,J＝12.6Hz,2H),8.31(s,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,2H),7.42(s,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,2H),6.82(s,1H),3.90-3.42(m,8H),3.28(d,J＝12.0Hz,2H),3.07-3.05(m,2H),2.35(d,J＝13.2Hz,2H),2.20-2.16(m,2H).MS(ESI)m/z:425[M+H]+.
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-9).灰白色固体，产率：88％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.36(s,1H),9.13(s,2H),8.25(s,1H),7.69-7.63(m,3H),7.50(s,1H),7.42(d,J＝8.1Hz,1H),6.73(s,1H),4.03–3.33(m,8H),3.22-3.18(m,2H),2.94-3.90(m,2H),2.54-2.52(m,2H),2.18-2.13(m,2H).MS(ESI)m/z:459[M+H]+.
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-10).灰白色固体，产率：82％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.51(s,1H),8.99(s,2H),8.29(s,1H),7.59(s,1H),7.21(d,J＝8.7Hz,2H),7.00(d,J＝8.7Hz,2H),3.75(s,4H),3.57(s,7H),3.29-3.26(m,2H),3.08-3.07(m,2H),2.37-2.35(m,2H),2.13-2.11(m,2H).MS(ESI)m/z:501[M+H]+.
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-11).淡黄色固体，产率：81％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.28(s,1H),8.76(d,J＝31.4Hz,2H),8.26(s,1H),7.64(d,J＝8.3Hz,2H),7.52(s,1H),7.25(d,J＝8.3Hz,2H),3.48(s,8H),3.30-3.27(m,2H),3.10-3.07(m,2H),2.36-2.34(m,2H),2.11-2.08(s,2H).MS(ESI)m/z:505[M+H]+.
(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-12).油，产率：89％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.21(s,1H),9.40(s,2H),8.25(s,1H),7.46-7.42(m,2H),7.39-7.38(m,1H),7.32-7.28(m,2H),7.19(s,1H),3.60(s,8H),3.31-3.28(m,2H),3.13-3.05(m,2H),2.41-2.39(m,2H),2.26(s,3H),2.18-2.11(m,2H).MS(ESI)m/z:405[M+H]+.
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-13).油，产率：83％.1H NMR(400MHz,D2O)δ8.31(s,1H),7.62(m,2H),7.57(s,1H),7.44(m,2H),3.80(s,8H),3.55(m,2H),3.42(m,2H),2.65(m,2H),2.31(m,2H).MS(ESI)m/z:549[M+H]+.
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-14).油，产率：89％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.42(s,1H),8.85(d,J＝30.0Hz,2H),8.27(s,1H),7.37(s,1H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),6.75(s,1H),3.75(s,8H),3.57(s,3H),3.28(m,2H),3.07(m,2H),2.37-2.35(m,2H),2.10(m,2H).MS(ESI)m/z:421[M+H]+.
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐(a-15).油，产率：85％.1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.54(s,1H),9.02(d,J＝13.6Hz,2H),8.30(s,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.39(s,1H),7.24(d,J＝8.8Hz,2H),6.79(s,1H),3.79-3.31(m,8H),3.28(d,J＝12.4Hz,3H),3.11-3.06(m,2H),2.36(d,J＝14.0Hz,2H),2.18-2.13(m,2H).MS(ESI)m/z:471[M+H]+.
实施例2：对Akt1抑制活性测试及对PC-3细胞的生长抑制测定实验
(1)实验试剂及药品：
阳性对照药GSK690693(美国Selleck公司)、RPMI-1640干粉培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美国Gibico公司)、MTT(美国Sigma公司)(1×PBS溶解，5mg/ml)、DMSO(AR,中国医药集团上海化学试剂有限公司)、PBS缓冲液(g/L)：NaCl 8.0，KCl 0.2，Na2HPO4·12H2O 3.58，KH2PO4 0.2，pH7.2～7.4。
本发明实施例1制备的化合物a1-a15。
(2)实验主要仪器：
96孔细胞培养板：北京COSTAR公司、二氧化碳培养箱：美国Forma Scientific公司、电子分析天平(ER-182A型)：日本A&D公司、超净工作台(ZHJH-1209型)：上海智城分析仪器制造有限公司、电热恒温水浴箱：上海医疗仪器三厂生产、酶联免疫检测仪(MK3Multiskan)：上海Thermo Labsystem分析仪器有限公司生产、台式离心机：上海安亭科学仪器厂、64R低温高速离心机：Allegra 64R，美国Beckman公司、超低温冰箱：MDF-382E，日本SANYO公司、漩涡混合器：江苏海门其林医用仪器厂。
2.实验方法：
(1)化合物对Akt1抑制活性测定实验
化合物对Akt1激酶的抑制活性采用时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的方法进行测定。
该实验设定测试组(S)、背景组(C)、空白组(B)三组。测试组用排枪向384孔板中分别加入不同浓度的化合物a1-a15，4uL/孔，之后加入Akt1激酶2uL/孔和底物2uL/孔，最后加入ATP为2uL；，同测试组相比，背景组中不加化合物，其他与测试组相同；空白组中不加化合物和Akt1激酶，其他与测试组相同。将384孔板离心机离心开始反应，于37℃条件下孵育50min，加入终止液与抗体，离心，37℃孵育1h，开始检测步骤，检测每孔在620nm和665nm荧光的数值(激发波长330nm)，得ratio值，计算抑制率，以抑制率和浓度做曲线，得IC50。
其中S表示测试组，C表示背景组，B表示空白组。
化合物对Akt1抑制活性测定实验结果见表1。
(2)化合物对PC-3细胞的生长抑制测定实验
化合物对PC-3细胞的生长抑制测定实验采用四甲基偶氮唑兰微量酶标比色法(MTT法)。取对数生长期PC-3细胞，1×PBS洗涤后用10％FBS RPM1640培养基调整细胞数为5×104个/ml，每孔100μl接种于96孔培养板中，并将铺好的96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱内培养12小时后加入不同浓度的测试样品，置于37℃，5％CO2恒温培养箱内培养72h；终止培养前每孔加入10μl用PBS缓冲液配制的5mg/ml MTT溶液，37℃孵育4h。孵育完毕后，2500rpm离心20min。扣除全部培养基，每孔加DMSO 200μl，振荡待甲瓒产物充分溶解。置于酶联免疫检测仪上测570nm处吸光度(OD值)，按公式计算细胞抑制率。再计算IC50值。
测定结果见表1。
表1对Akt1抑制活性测试及对PC-3细胞的生长抑制测定实验结果
从表1可以看出，化合物a-1～a-15对Akt1激酶具有较好的抑制活性，且除了化合物a-10、a-14，该系列其余化合物对PC-3细胞株均具有较好的生长抑制活性。与阳性药GSK690693相比，化合物a-1、a-3对Akt1激酶的抑制活性要强于GSK690693，a-2、a-4、a-13则与之相近；a-1、a-2、a-3、a-4、a-13相比于GSK690693，明显具有更好的PC-3细胞生长抑制活性。
Claims (10)
1.一种含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐，其结构如通式a所示：
其中，R1为氢，单取代或多取代卤素、甲基、甲氧基、叔丁基或三氟甲基；R2为氢、氯、溴、甲基或乙基。
2.如权利要求1所述的含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐，其特征在于，所述R1为氢、4-氯、4-溴、4-氟、4-甲氧基、4-叔丁基、3-溴、3,4-二氯或2,4-二氯；R2为氢、氯、溴或甲基。
3.如权利要求1所述的含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐，其特征在于，所述含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐选自下列化合物：
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-叔丁基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3,4-二氯苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-苯基哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(3-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐；
(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)(4-(4-溴苯基)哌啶-4-基)甲酮盐酸盐。
4.权利要求1至3任一项所述的含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将4-氯-5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶溶解在DMF溶液中，加入三乙胺和Boc保护的哌嗪，进行反应，反应后，经萃取、水洗、干燥、过滤、除去溶剂、分离纯化，得到中间体c，加入的4-氯-5-取代-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶、三乙胺和Boc保护的哌嗪的摩尔比为1：1.5：1.1；
(2)将中间体c加入到氯化氢二氧六环溶液中，反应液室温搅拌，减压蒸除甲醇，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗，干燥，得中间体d，中间体c与氯化氢二氧六环溶液加入量的比为1mmol:15ml；
(3)将二(2-氯乙基)氨盐酸盐加入二氯甲烷溶液中，冰浴状态下边搅拌便加入氢氧化钠水溶液，将二碳酸二叔丁酯加入到二(2-氯乙基)氨盐酸盐的二氯甲烷溶液中，室温搅拌17-20h，加入二氯甲烷溶液，两相分开，水相再用二氯甲烷溶液萃取，有机相干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得中间体f；二(2-氯乙基)氨盐酸盐、二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:1，每1毫摩尔二(2-氯乙基)氨盐酸盐加入的氢氧化钠水溶液的量为1ml；
(4)将中间体f与取代苯乙腈加入到干燥的DMF溶液当中，搅拌并置于冰浴中，氢化钠分多次加入，之后将反应移到室温当中，并油浴加热反应；反应完后加入冰水淬灭，水相用乙酸乙酯萃取，有机相洗涤，干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离纯化后，乙酸乙酯/石油醚重结晶得中间体h；中间体f、取代苯乙腈和氢化钠加入的摩尔比为1：1：5；
(5)将中间体h溶解在乙醇当中，加入10mol/L的氢氧化钠水溶液，反应液回流48h，冷却至室温，倒入1mol/L的盐酸水溶液，乙酸乙酯萃取，有机相水洗，干燥，减压蒸除溶剂，乙酸乙酯/石油醚重结晶，得中间体i；每1摩尔中间体h所需10mol/L的氢氧化钠溶液为3ml；
(6)将中间体i溶解在无水DMF中，室温搅拌，加入EDCI，接着加入HOBT和DIEA,将反应混合物在室温下搅拌，冷却至0℃，中间体d加入分批加入到反应中，室温下搅拌反应，TLC监测反应完成后，加入10倍DMF体积的冰水，沉淀析出完全后，过滤，水洗，干燥，得中间体j；中间体i、EDCI、HOBT、DIEA、中间体d加入的摩尔比为1：1.1：1.1：3：1；
(7)将中间体j混悬于甲醇溶液中，加入4M的HCl-二氧六环溶液，室温搅拌48h，减压蒸除甲醇溶液，溶液析出固体，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗，干燥，得目标化合物a；上述反应中，每1毫摩尔中间体j所用甲醇、4M的HCl-二氧六环溶液分别为20ml、60ml。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应的温度为110℃，反应时间为16h。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，柱层析的洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1。
7.权利要求1至3任一项所述的含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗前列腺癌的药物。
9.一种具有Akt1激酶抑制活性的药物制剂，其特征在于，该药物制剂含有有效量的权利要求1至3任一项所述的含氮杂环苯基哌啶类化合物或其药用盐。
10.如权利要求9所述的药物制剂，其特征在于，该药物制剂还含有一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
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