CN104865336B - 高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高效液相色谱检测阿瑞匹坦胶囊中有关物质的方法，它包括以下步骤：a、制备供试品溶液；b、制备对照品溶液；c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测；d、按外标法以峰面积计算供试品中有关物质的含量。本发明采用特定的流动相和梯度洗脱程序，就能实现阿瑞匹坦中有关物质的检测，主峰分离度高，主峰拖尾因子的数值小，杂质化合物的分离度高，对阿瑞匹坦中有关物质的检测、控制更为全面，检测结果更加准确、可靠，同时，由于没有添加三氟乙酸、十二烷基硫酸钠等对色谱柱伤害很大的离子对试剂，本发明检测方法对色谱柱的伤害也更小。

Description

高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法
技术领域
本发明涉及高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法。
背景技术
阿瑞匹坦的化学名称为：5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啡啉]甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮，分子式：C23H21F7N4O3，分子量：534.43，结构式如下所示；现已上市的阿瑞匹坦产品有阿瑞匹坦胶囊(阿瑞匹坦胶囊收载于国家食品药品监督管理总局《进口药品注册标准》，标准号：JX20050253)。
在阿瑞匹坦产品中，往往会存在有多种不同的有关物质：杂质化合物A-1、A-F、B、B’、C、C’、D、D’等；这些杂质化合物的存在会严重影响阿瑞匹坦产品的质量控制和用药安全，因此需要对阿瑞匹坦中的有关物质进行检测和监控。
杂质A-1的化学名称为(2R，3S)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)甲基吗啉盐酸盐，其结构式如下所示：
杂质A-F的化学名称为5-(((2R，3S)-2-(1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-苯基吗啉基)甲基)-1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮，其结构式如下所示：
杂质B的化学名称为5-[[(2R，3R)-2-[(R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-1,2-二氢--1,2,4-三唑-3-酮，其结构式如下所示：
杂质B’的化学名称为5-(2S，3S)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮，其结构式如下所示：
杂质C的化学名称为5-(2R，3S)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮，其结构式如下所示：
杂质C’的化学名称为5-(((2S，3R)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮，其结构式如下所示：
杂质D的化学名称为5-(((2R，3R)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮，其结构式如下所示：
杂质D’的化学名称为5-(((2S，3S)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮，其结构式如下所示：
目前，检测阿瑞匹坦中的有关物质时，为了达到良好的分离度和检测效果，往往需要在流动相中添加三氟乙酸、十二烷基硫酸钠等对色谱柱伤害很大的离子对试剂(余丽辜慧晁若冰.阿瑞匹坦中有关物质检查方法的研究.药物分析杂志.2013，33(8)和中国专利CN103760257 A.)，三氟乙酸、十二烷基硫酸钠等离子对试剂会对色谱柱造成不可逆的伤害，而且该类离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，会大大缩短色谱柱的使用寿命，检测成本高，同时，该类离子对试剂对pH值敏感，配制流动相时要求精确度较高，否则直接影响实验的重复性和重现性，该检测方法的实际应用价值也很小。
因此，需要开发一种检测阿瑞匹坦中有关物质的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相色谱检测阿瑞匹坦胶囊中有关物质的方法。
本发明提供的高效液相色谱检测阿瑞匹坦胶囊中有关物质的方法，它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：取阿瑞匹坦胶囊的内容物，用稀释剂溶解，得到供试品溶液；
b、制备对照品溶液：取有关物质的对照品，用稀释剂溶解，得到对照品溶液；
c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为10：90～20：80；
流动相B：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为80：20～90：10；
缓冲液是由以下重量份数的组分组成：磷酸1.9～2.1份、四丁基硫酸氢铵0.3～0.4份、磷酸二氢钾0.8～1.2份、水1000份；
按照如下梯度洗脱程序进行洗脱：
时间 流动相A 流动相B
0～5分钟 70％ 30％
5～35分钟 70％～45％ 30％～55％
35～50分钟 45％～20％ 55％～80％
50～51分钟 20％～70％ 80％～30％
51～60分钟 70％ 30％
测波长：210nm～220nm；
d、按外标法以峰面积计算供试品中有关物质的含量。
进一步的，步骤a和b中，所述稀释剂为乙腈-水，乙腈与水的体积比为1：1。
进一步的，步骤a中，供试品溶液的浓度为0.8～1.2mg/ml；步骤b中，对照品溶液的浓度为0.8～1.2μg/ml。
进一步的，步骤b中，有关物质选自(2R，3S)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)甲基吗啉盐酸盐、5-(((2R，3S)-2-(1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-苯基吗啉基)甲基)-1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-[[(2R，3R)-2-[(R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-1,2-二氢--1,2,4-三唑-3-酮、5-(2S，3S)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(2R，3S)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(((2S，3R)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(((2R，3R)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(((2S，3S)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮中的任意一种或两种以上。
进一步的，步骤c中，色谱柱为Waters Symmetry C18柱；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
进一步的，步骤c中，流动相A：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为10：90；流动相B：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为90：10；
或，流动相A：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为20：80；流动相B：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为80：20。
进一步的，步骤c中，缓冲液是由以下重量份数的组分组成：磷酸1.9份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.9份、四丁基硫酸氢铵0.4份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.9份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾1.2份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾1.2份、水1000份；或，磷酸2.1份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸2.1份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸2.1份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾1.2份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾1.0份、水1000份。
进一步的，步骤c中，柱温为30℃～40℃；流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
进一步的，柱温为35℃；流速为1.0ml/min。
进一步的，步骤c中，检测波长为215nm；进样量为20μl。
本发明采用特定的流动相和梯度洗脱程序，就能实现阿瑞匹坦中有关物质的检测，主峰分离度高，主峰拖尾因子的数值小，杂质化合物的分离度高，对阿瑞匹坦中有关物质的检测、控制更为全面，检测结果更加准确、可靠，同时，由于没有添加三氟乙酸、十二烷基硫酸钠等对色谱柱伤害很大的离子对试剂，本发明检测方法对色谱柱的伤害也更小。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1本发明方法供试品溶液的色谱图；
图2为实施例1本发明方法杂质对照混合溶液的色谱图；
图3为对比试验1方法供试品溶液的色谱图；
图4为试验例1对比试验2的色谱图；
图5为本发明杂质A-1标准曲线图；
图6为本发明杂质A-F标准曲线图；
图7为本发明杂质B标准曲线图；
图8为本发明杂质C标准曲线图；
图9为本发明杂质D标准曲线图；
图10为试验例3专属性研究供试品溶液的色谱图；
图11为试验例3专属性研究对照品溶液的色谱图；
图12为试验例3专属性研究阴性样品溶液的色谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
阿瑞匹坦对照品(批号：20131101，来源于上海医药工业研究院，含量：99.85％)。
杂质A’对照品(批号：20130513A’，来源于上海医药工业研究院，含量98.81％)
杂质A-1对照品(批号：20131001，来源于上海医药工业研究院，含量99.94％)。
杂质A-F对照品(批号：20130406，来源于上海医药工业研究院，含量89.09％)。
杂质B对照品(批号：20130513B，来源于上海医药工业研究院，含量99.68％)。
杂质B’对照品(批号：20130513B’，来源于上海医药工业研究院，含量98.72％)。
杂质C对照品(批号：20130513C，来源于上海医药工业研究院，含量96.08％)。
杂质C’对照品(批号：20130513C’，来源于上海医药工业研究院，含量97.78％)。
杂质D对照品(批号：20130513D，来源于上海医药工业研究院，含量99.79％)。
杂质D’对照品(批号：20130513D’，来源于上海医药工业研究院，含量99.47％)。
实施例1
本发明高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
稀释剂：乙腈-水(1：1)；
流动相A：乙腈-缓冲液(20：80)，流动相B：乙腈-缓冲液(80：20)；
缓冲液：1.96g磷酸，0.34g四丁基硫酸氢铵，1.0g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中；
按照如下梯度洗脱程序进行洗脱，见表1：
表1、本发明的梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 70 30
5～35 70～45 30～55
35～50 45～20 55～80
50～51 20～70 80～30
51～60 70 30
检测波长：215nm；
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；
系统适用性试验：
取有关物质A-F、B、C、D各5mg，加稀释剂溶解并定容至100ml，摇匀，作为杂质混合溶液；精密量取杂质混合溶液0.5ml，称取阿瑞匹坦约25mg，置于同一25ml量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。量取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，阿瑞匹坦主峰拖尾因子应不大于2.0，主峰及各有关物质之间的分离度应不小于1.5。
(1)供试品溶液的制备：称取阿瑞匹坦胶囊内容物(约相当于阿瑞匹坦25mg)，置于25ml量瓶中，加稀释剂适量，振摇20分钟，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(2)杂质对照混合溶液的配制：取有关物质A-1、A-F、B、C、D、B’、C’、D’的对照品各5mg，加稀释剂溶解并定容至100ml，摇匀，得到杂质对照贮备溶液；精密量取0.5ml杂质对照贮备溶液，置于25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照混合溶液。
测定方法：精密量取供试品溶液和杂质对照混合溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中有关物质的含量。
对比试验1：
将《进口药品注册标准》阿瑞匹坦胶囊有关物质检测方法作为对比试验。
《进口药品注册标准》阿瑞匹坦胶囊有关物质检测方法：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS3，50×4.6mm，5μm)；以磷酸二氢钾溶液(取3.40g磷酸二氢钾，置于1000ml量瓶中，加水900ml，用磷酸调节pH至3.0，再用水稀释至刻度，混匀)-乙腈(55：45)为流动相，流速为1.5ml/min；检测波长为210nm。
取阿瑞匹坦胶囊10粒，将内容物全量转移至500ml量瓶中，加乙腈-水(2：3)混合液250ml，强力振摇数秒钟，再用台式振荡器以每分钟200转的速率振荡18分钟上，再加乙腈200ml，再次强力振摇后用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去至少5ml的初滤液，精密量取续滤液适量，用流动相稀释制成每1ml中约含阿瑞匹坦0.25mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。各杂质峰与对照溶液主峰比较，以峰面积计算，最大单个杂质不得过0.1％，杂质总量不得过0.2％。
供试品中有关物质限度如表2所示，供试品溶液色谱图中溶剂峰和辅料峰应扣除，必要时取溶剂和辅料进行定位。
表2、供试品中有关物质的限度
杂质 相对保留时间 相对校正因子 限度
A-1 0.27 1.8 不得过0.1％
A-F 0.97 1.0 不得过0.1％
B、B’ 1.09 1.0 总和不得过0.1％
C、C’ 1.11 1.0 总和不得过0.1％
D、D’ 1.26 1.0 总和不得过0.1％
其他单杂 — 1.0 不得过0.1％
总杂 — — 不得过0.2％
本发明方法与对比试验方法的检测结果见表3和图1～3：图1：本发明方法供试品溶液的色谱图；图2：本发明方法杂质对照混合溶液的色谱图；图3：对比试验1方法供试品溶液的色谱图。
表3、本发明方法与对比试验方法的检测结果
测定方法 本发明方法 对比试验方法
杂质A-1 未检出 未进行控制
杂质A-F 0.006％ 未进行控制
杂质B、B’总和 未检出 未进行控制
杂质C、C’总和 未检出 未进行控制
杂质D、D’总和 未检出 未进行控制
试验结果表明，本发明方法对阿瑞匹坦中有关物质的检测、控制更为全面，能够检测出的杂质个数远多于对比试验方法能够检测出的杂质个数，可以同时实现杂质A-1、杂质A-F、杂质B和B’总和、杂质C和C’总和、杂质D和D’总和的检测，检测结果更加准确、可靠；而对比试验方法则存在局限性，没有对单个杂质的含量进行控制，且其检测的总杂质含量结果偏低，存在漏检微量杂质的风险，不能很好的实现对阿瑞匹坦的质量控制。
实施例2
除了改变流动相为“流动相A：乙腈-缓冲液(10：90)，流动相B：乙腈-缓冲液(90：10)；缓冲液：1.96g磷酸，0.34g四丁基硫酸氢铵，1.0g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中”，其他步骤、条件、梯度洗脱程序等均与实施例1相同。
实施例3
除了改变柱温和流速为“柱温30℃；流速0.8ml/min”，其他步骤、条件、梯度洗脱程序等均与实施例1相同。
实施例4
除了改变柱温和流速为“柱温40℃；流速1.2ml/min”，其他步骤、条件、梯度洗脱程序等均与实施例1相同。
实施例5
除了改变缓冲液的组分组成为“1.90g磷酸、0.30g四丁基硫酸氢铵、0.80g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中”，其他步骤、条件、梯度洗脱程序、流动相A与流动相B的体积比等均与实施例1相同。
实施例6
除了改变缓冲液的组分组成为“1.90g磷酸、0.40g四丁基硫酸氢铵、0.80g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中”，其他步骤、条件、梯度洗脱程序、流动相A与流动相B的体积比等均与实施例1相同。
实施例7
除了改变缓冲液的组分组成为“1.90g磷酸、0.30g四丁基硫酸氢铵、1.20g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中”，其他步骤、条件、梯度洗脱程序、流动相A与流动相B的体积比等均与实施例1相同。
实施例8
除了改变缓冲液的组分组成为“2.10g磷酸、0.30g四丁基硫酸氢铵、0.80g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中”，其他步骤、条件、梯度洗脱程序、流动相A与流动相B的体积比等均与实施例1相同。
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1、检测条件的筛选试验
1、确定检测波长
精密称取阿瑞匹坦及杂质A-1、A-F、B、C、D、B’、C’、D’适量，分别用溶剂(乙腈：水＝1：1)配制成每1ml含5μg的供试品溶液及杂质对照品溶液，备用。
取上述供试品溶液及杂质对照品溶液在200-400nm范围内进行扫描，其结果见表4。
表4、在200-400nm范围内的试验结果
No. 峰波长(nm) 峰值 谷波长(nm) 谷值
阿瑞匹坦 215.2 0.5618 231.8 0.0210
杂质A-1 214 0.6223 241.5 0.0078
杂质A-F 216.8 0.5118 238.6 0.0322
杂质B 217.5 0.3988 251.5 0.0085
杂质B’ 216.8 0.4228 252.0 0.0092
杂质C 213.2 0.6882 241.7 0.0157
杂质C’ 214.1 0.6779 242.8 0.0165
杂质D 211.8 0.7172 237.8 0.0223
杂质D’ 212.6 0.7089 235.9 0.0228
试验结果表明，检测波长在210nm～220nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱检测方法；优选的，检测波长为215nm。
2、流动相的筛选试验
高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
稀释剂：乙腈-水(1：1)；
流动相A：乙腈-缓冲液(20：80)，流动相B：乙腈-缓冲液(80：20)；
按照如下梯度洗脱程序进行洗脱，见表5：
表5、本发明的梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 70 30
5～35 70～45 30～55
35～50 45～20 55～80
50～51 20～70 80～30
51～60 70 30
检测波长：215nm；
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；
系统适用性试验：
取有关物质A-F、B、C、D各5mg，加稀释剂溶解并定容至100ml，摇匀，作为杂质混合溶液；精密量取杂质混合溶液0.5ml，称取阿瑞匹坦约25mg，置于同一25ml量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。量取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，阿瑞匹坦主峰拖尾因子应不大于2.0，主峰及各有关物质之间的分离度应不小于1.5。
(1)供试品溶液的制备：称取阿瑞匹坦胶囊内容物(约相当于阿瑞匹坦25mg)，置于25ml量瓶中，加稀释剂适量，振摇20分钟，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(2)杂质对照混合溶液的配制：取有关物质A-1、A-F、B、C、D、B’、C’、D’的对照品各5mg，加稀释剂溶解并定容至100ml，摇匀，得到杂质对照贮备溶液；精密量取0.5ml杂质对照贮备溶液，置于25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照混合溶液。
2.1、取系统适用性溶液考察缓冲液的组分组成对本发明方法的影响；缓冲液的组分组成见表6，对应的试验结果见表7。
表6、缓冲液的组分组成
表7、表6对应的试验结果
试验结果表明，表6中编号为1～10的缓冲液均可以用于本发明高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法中，特别是，在编号为10的缓冲液条件下，主峰拖尾因子的数值最小，主峰保留时间以及主峰分离度、杂质A-F分离度都更为适宜。
2.2、取系统适用性溶液考察流动相A和流动相B对本发明方法的影响；流动相A与流动相B见表8，对应的试验结果见表9；其中，流动相中缓冲液的组成为：1.96g磷酸、0.34g四丁基硫酸氢铵、1.0g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中。
表8、流动相A与流动相B
编号 流动相A 流动相B
1 乙腈-缓冲液＝20：80 乙腈-缓冲液＝80：20
2 乙腈-缓冲液＝10：90 乙腈-缓冲液＝90：10
3 乙腈-缓冲液＝30：70 乙腈-缓冲液＝70：30
4 甲醇-缓冲液＝20：80 甲醇-缓冲液＝80：20
表9、表8对应的试验结果
编号 主峰保留时间 主峰分离度 主峰拖尾因子 杂质A-F分离度
1 34.885min 6.785 1.062 9.127
2 40.128min 14.128 1.378 13.885
3 29.780min 1.868 1.082 1.912
4 38.852min 3.986 1.087 2.886
试验结果表明，流动相A为乙腈-缓冲液＝10：90～20：80、流动相B为乙腈-缓冲液＝80：20～90：10，均可以用于本发明高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法中，特别是，在流动相A为乙腈-缓冲液＝20：80、流动相B为乙腈-缓冲液＝80：20时，主峰拖尾因子的数值小，主峰保留时间以及主峰分离度、杂质A-F分离度都更为适宜。
3、改变柱温和流速
高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法：
色谱柱：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
稀释剂：乙腈-水(1：1)；
流动相A：乙腈-缓冲液(20：80)，流动相B：乙腈-缓冲液(80：20)；
缓冲液：1.96g磷酸，0.34g四丁基硫酸氢铵，1.0g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中；
按照如下梯度洗脱程序进行洗脱，见表10：
表10、本发明的梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 70 30
5～35 70～45 30～55
35～50 45～20 55～80
50～51 20～70 80～30
51～60 70 30
检测波长：215nm；
取系统适用性溶液考察柱温和流速对本发明方法的影响，试验结果见表11。
表11、不同柱温和流速的试验结果
试验结果表明，柱温在30℃～40℃范围内；流速在0.8ml/min～1.2ml/min范围内，均可以用于本发明高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法中，特别是，柱温为35℃、流速为1.0ml/min时，主峰拖尾因子的数值小，主峰保留时间以及主峰分离度、杂质A-F分离度都更为适宜。
4、对比试验2
将《进口药品注册标准》阿瑞匹坦胶囊有关物质检测方法作为对比试验。
《进口药品注册标准》阿瑞匹坦胶囊有关物质检测方法：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS3，50×4.6mm，5μm)；以磷酸二氢钾溶液(取3.40g磷酸二氢钾，置于1000ml量瓶中，加水900ml，用磷酸调节pH至3.0，再用水稀释至刻度，混匀)-乙腈(55：45)为流动相，流速为1.5ml/min；检测波长为210nm。
取阿瑞匹坦胶囊10粒，将内容物全量转移至500ml量瓶中，加乙腈-水(2：3)混合液250ml，强力振摇数秒钟，再用台式振荡器以每分钟200转的速率振荡18分钟上，再加乙腈200ml，再次强力振摇后用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去至少5ml的初滤液，精密量取续滤液适量，用流动相稀释制成每1ml中约含阿瑞匹坦0.25mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。各杂质峰与对照溶液主峰比较，以峰面积计算，最大单个杂质不得过0.1％，杂质总量不得过0.2％。但该方法不能完全检测其产品制备过程中的A-1、A-F、B、C、D、B’、C’、D’等特定杂质，如图4所示，杂质A-1的出峰时间为1.2min，主峰出峰时间为5.6min，出峰时间太靠前，其它各峰均与主峰重叠在一起。且各杂质之间不能达到完全的分离，杂质测定的结果准确度不高，专属性不强。
试验例2、线性关系试验
精密称取杂质A-1、A-F、B、C、D分别为10.73mg、10.43mg、10.09mg、10.14mg、10.33mg，置于各10ml量瓶中，分别加稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀，作为储备液；分别精密量取各储备液1ml，置于同一量瓶中，加稀释剂配制成浓度约为10μg/ml的混合溶液，分别精密量取该混合溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0ml置于各10ml量瓶中，加稀释液定容至刻度，摇匀，作为各浓度点线性关系检测对象。
在本发明优化的高效液相色谱条件下，分别取各线性溶液20μl进样分析，计算峰面积与浓度的线性关系，结果见图5～9；图5：杂质A-1标准曲线图；图6：杂质A-F标准曲线图；图7：杂质B标准曲线图；图8：杂质C标准曲线图；图9：杂质D标准曲线图。
试验例3、专属性研究
按照本发明方法制备供试品溶液、对照品溶液。
取甘露醇10g、交联羧甲基纤维钠1g、羟丙甲纤维素1.2g、十二烷基硫酸钠0.72g、微晶纤维素2.1g、硬脂酸镁0.5g，以上六种辅料，混匀；按照类似方法制备阴性样品溶液，按照下述色谱条件进行测定。
色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；如：色谱柱的型号为WatersSymmetry C18，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填充剂粒径为5μm；
稀释剂：乙腈-水(体积为1：1)；
流动相A：乙腈—缓冲液(20：80)，流动相B：乙腈—缓冲液(80：20)；
缓冲液：1.96g磷酸，0.34g四丁基硫酸氢铵，1.0g磷酸二氢钾溶于1000ml水中；
按照如下梯度洗脱程序进行洗脱，见表12：
表12、本发明的梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 70 30
5～35 70～45 30～55
35～50 45～20 55～80
50～51 20～70 80～30
51～60 70 30
检测波长：215nm
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；
精密量取上述各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图10～12；图10：阴性样品溶液；图11：混合对照品溶液；图12：阿瑞匹坦们囊样品溶液。
试验结果表明，阴性样品溶液不会对本发明高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法造成干扰，本发明方法的专属性好。
试验例4、精密度试验
取杂质A-1、A-F、B、C、D各5mg，置于100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得到杂质对照贮备溶液；精密量取0.5ml杂质对照贮备溶液，置于25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照混合溶液。
取杂质B’、C’、D’各5mg，置于100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得到杂质对照贮备溶液；精密量取0.5ml杂质对照贮备溶液，置于25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为另一种杂质对照混合溶液。
在本发明优化的高效液相色谱条件下，连续进样(杂质对照混合溶液)测定6次，记录峰面积，考察检测结果的精密度，见表13。
表13、精密度试验结果
通过计算可知，杂质A-1峰面积的RSD为0.53％，杂质A-F峰面积的RSD为0.36％，杂质B峰面积的RSD为1.03％，杂质C峰面积的RSD为1.08％，杂质D峰面积的RSD为0.55％，杂质B’峰面积的RSD为1.24％％，杂质C’峰面积的RSD为0.45％，杂质D’峰面积的RSD为0.42％，试验结果说明发明方法检测结果的精密度良好。
试验例5、稳定性试验
取两种不同规格(80mg、125mg)的阿瑞匹坦胶囊内容物(约相当于阿瑞匹坦25mg)，置于25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
取供试品溶液，在本发明优化的高效液相色谱条件下，分别于0h、2h、4h、6h、8h进样，考察检测结果的稳定性情况，按外标法以峰面积计算样品中各杂质的量，并统计杂质个数，试验结果见表14和表15。
表14、规格为80mg的稳定性试验结果
表15、规格为125mg的稳定性试验结果
试验结果表明，本发明方法的稳定性好，可以满足阿瑞匹坦中有关物质的检测需要。
试验例6、重复性试验
取两种不同规格(80mg、125mg)的阿瑞匹坦胶囊内容物(约相当于阿瑞匹坦25mg)，置于25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
取供试品溶液，在本发明优化的高效液相色谱条件下，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算相应杂质的含量，试验结果见表16和表17。
表16、规格为80mg的重复性试验结果
表17、规格为125mg的重复性试验结果
试验结果表明，本发明方法的重复性好，可以满足阿瑞匹坦中有关物质的检测需要。
试验例7、本发明高效液相色谱检测阿瑞匹坦中有关物质的方法
色谱条件：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，如：Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
稀释剂：乙腈-水(1：1)；
流动相A：乙腈-缓冲液(20：80)，流动相B：乙腈-缓冲液(80：20)；
缓冲液：1.96g磷酸，0.34g四丁基硫酸氢铵，1.0g磷酸二氢钾，溶于1000ml水中；
按照如下梯度洗脱程序进行洗脱，见表18：
表18、本发明的梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 70 30
5～35 70～45 30～55
35～50 45～20 55～80
50～51 20～70 80～30
51～60 70 30
检测波长：215nm；
柱温：35℃；流速：1.0ml/min；
系统适用性试验：
取有关物质A-F、B、C、D各5mg，加稀释剂溶解并定容至100ml，摇匀，作为杂质混合溶液；精密量取杂质混合溶液0.5ml，称取阿瑞匹坦约25mg，置于同一25ml量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。量取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，阿瑞匹坦主峰拖尾因子应不大于2.0，主峰及各有关物质之间的分离度应不小于1.5。
(1)供试品溶液的制备：称取阿瑞匹坦胶囊内容物(约相当于阿瑞匹坦25mg)，置于25ml量瓶中，加稀释剂适量，振摇20分钟，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(2)杂质对照混合溶液的配制：取有关物质A-1、A-F、B、C、D的对照品各5mg，加稀释剂溶解并定容至100ml，摇匀，得到杂质对照贮备溶液；精密量取0.5ml杂质对照贮备溶液，置于25ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照混合溶液。
测定方法：精密量取供试品溶液和杂质对照混合溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中有关物质的含量。
两种不同规格(80mg、125mg)的试验结果见表19。
表19、两种不同规格阿瑞匹坦胶囊的检测结果
综上所述，本发明采用特定的流动相和梯度洗脱程序，就能实现阿瑞匹坦中有关物质的检测，主峰分离度高，主峰拖尾因子的数值小，杂质化合物的分离度高，对阿瑞匹坦中有关物质的检测、控制更为全面，检测结果更加准确、可靠，同时，由于没有添加三氟乙酸、十二烷基硫酸钠等对色谱柱伤害很大的离子对试剂，本发明检测方法对色谱柱的伤害也更小。

Claims (9)

1.高效液相色谱检测阿瑞匹坦胶囊中有关物质的方法，其特征在于：所述有关物质选自(2R，3S)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)甲基吗啉盐酸盐、5-(((2R，3S)-2-(1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-苯基吗啉基)甲基)-1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-[[(2R，3R)-2-[(R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-1,2-二氢--1,2,4-三唑-3-酮、5-(2S，3S)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)-1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(2R，3S)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(((2S，3R)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(((2R，3R)-2-((S)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮、5-(((2S，3S)-2-((R)-1-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基)甲基)1,2-二氢-1,2,4-三唑-3-酮中的任意两种以上；它包括以下步骤：
a、制备供试品溶液：取阿瑞匹坦胶囊的内容物，用稀释剂溶解，得到供试品溶液；
b、制备对照品溶液：取有关物质的对照品，用稀释剂溶解，得到对照品溶液；
c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为10：90～20：80；
流动相B：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为80：20～90：10；
缓冲液是由以下重量份数的组分组成：磷酸1.9～2.1份、四丁基硫酸氢铵0.3～0.4份、磷酸二氢钾0.8～1.2份、水1000份；
按照如下梯度洗脱程序进行洗脱：
时间 流动相A 流动相B 0～5分钟 70％ 30％ 5～35分钟 70％～45％ 30％～55％ 35～50分钟 45％～20％ 55％～80％ 50～51分钟 20％～70％ 80％～30％ 51～60分钟 70％ 30％
测波长：210nm～220nm；
d、按外标法以峰面积计算供试品中有关物质的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a和b中，所述稀释剂为乙腈-水，乙腈与水的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，供试品溶液的浓度为0.8～1.2mg/ml；步骤b中，对照品溶液的浓度为0.8～1.2μg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，色谱柱为Waters Symmetry C18柱；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，流动相A：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为10：90；流动相B：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为90：10；
或，流动相A：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为20：80；流动相B：乙腈-缓冲液，乙腈与缓冲液的体积比为80：20。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，缓冲液是由以下重量份数的组分组成：磷酸1.9份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.9份、四丁基硫酸氢铵0.4份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.9份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾1.2份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾1.2份、水1000份；或，磷酸2.1份、四丁基硫酸氢铵0.3份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸2.1份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾0.8份、水1000份；或，磷酸2.1份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾1.2份、水1000份；或，磷酸1.96份、四丁基硫酸氢铵0.34份、磷酸二氢钾1.0份、水1000份。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，柱温为30℃～40℃；流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：柱温为35℃；流速为1.0ml/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，检测波长为215nm；进样量为20μl。
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