CN104856954B - 一种绿原酸微乳及其制备工艺和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绿原酸微乳及其制备工艺和应用。所述绿原酸微乳是以绿原酸为主药并添加辅料制成的W/O型微乳，其中，所述辅料包括水、油相和乳化剂。所述绿原酸的制备工艺包括以下步骤：将绿原酸溶于水中制成水相；将乳化剂与油相均匀混合得到混合液；在不断振摇的条件下，向所述混合液中缓慢滴加所述水相直至混合均匀，密封后得到所述绿原酸微乳。所述绿原酸的应用为绿原酸微乳在制备药物中的应用。本发明针对绿原酸亲水性强而亲脂性差的特点，在选定适宜的油相和乳化剂的条件下，将绿原酸制备成W/O型的微乳，从而达到了提高绿原酸生物利用度并且促进绿原酸吸收的目的，对绿原酸的广泛应用具有深远意义。

Description

一种绿原酸微乳及其制备工艺和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地讲，涉及一种绿原酸微乳及其制备工艺和应用。

背景技术

绿原酸(chlorogenic acid CA)又名咖啡鞣酸，是由咖啡酸(caffeic acid)和奎尼酸(quinic acid)组成的缩酚酸，其化学名为3-o-咖啡酰奎尼酸(3-o-caffeoylquinicacid CA)。

绿原酸是植物在进行有氧呼吸的过程中，经磷酸戊糖途径中间产物合成的一种苯丙素类物质。绿原酸已经被开放应用于食品、保健品、化妆品和药品等多个领域。由于绿原酸广泛地存在于常见的各种蔬菜水果中，具有多种生物活性，如抗菌作用、抗病毒作用、抗肿瘤作用和免疫调节作用等，因此其在医药化工和食品等领域都具有广泛的应用。绿原酸属于小分子物质，其水溶性好、脂溶性差且药物透膜能力弱，通常情况将其以非注射途径给药的生物利用度差，如何改善这一不足以扩大其应用范围并增强其使用顺应性，对于绿原酸作为药物的开发和应用具有重大且深远的意义。

微乳通常是由油、水和乳化剂自发形成的各向同性、澄清透明的热力学和动力学稳定体系。微乳被广泛地应用于日用化工、三次采油、酶催化等方面，由于微乳剂除了具有乳剂的一般性质外，还具有稳定、澄清、透明和粒径小等优点，因此近年来在药物制剂以及临床等领域得到了越来越多的关注。

微乳剂型按照结构划分，可以分为水包油型(O/W型)、油包水型(W/O型)和双连续型。油包水型的微乳能够增溶水溶性药物并提高水溶性药物的稳定性和生物利用度，尤其对于绿原酸这样的亲水性好却亲脂性差的小分子活性物质而言，若能够将其制备成W/O型乳剂，则能够为其广泛地使用提供可能性。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种绿原酸微乳及其制备方法和应用，以改善绿原酸在应用上的局限性。

本发明提供了一种绿原酸微乳，所述绿原酸微乳是以绿原酸为主药并添加辅料制成的W/O型微乳，其中，所述辅料包括水、油相和乳化剂。

根据本发明的绿原酸微乳的一个实施例，以质量百分比计，所述绿原酸微乳包括油相30～55％、乳化剂20～55％和水相5～25％，其中，所述水相为绿原酸溶于水形成的溶液。

根据本发明的绿原酸微乳的一个实施例，所述水相为绿原酸溶于水形成的质量浓度为4％以下的溶液。

根据本发明的绿原酸微乳的一个实施例，所述绿原酸为从植物中提取的或通过化学合成的绿原酸原料药。

根据本发明的绿原酸微乳的一个实施例，所述绿原酸原料药的纯度为98％以上。

根据本发明的绿原酸微乳的一个实施例，所述油相为甘油三酯、月桂酸甘油酯、肉蔻豆酸异丙酯、棕榈酸异丙脂和棕榈酸异辛脂中的任意一种。

根据本发明的绿原酸微乳的一个实施例，所述乳化剂包括表面活性剂和助表面活性剂，所述表面活性剂与助表面活性剂的质量比为3:1～5:1。

根据本发明的绿原酸微乳的一个实施例，所述表面活性剂为聚山梨酯-80、脱水山梨醇倍半油酸酯、三蓖麻油酸聚甘油酯和大豆磷脂中的任意一种，所述助表面活性剂为丙二醇、乙醇、司盘80和PEG400中的任意一种。

本发明还提供了一种上述绿原酸微乳的制备工艺，所述制备工艺包括以下步骤：将绿原酸溶于水中制成水相；将乳化剂与油相均匀混合得到混合液；在不断振摇的条件下，向所述混合液中缓慢滴加所述水相直至混合均匀，得到所述绿原酸微乳。

根据本发明的绿原酸微乳的制备工艺的一个实施例，所述乳化剂包括表面活性剂和助表面活性剂，所述制备工艺还包括将所述表面活性剂和助表面活性剂均匀混合制成乳化剂的步骤。

本发明还提供了一种上述绿原酸微乳在制备药物中的应用。

根据本发明的绿原酸微乳在制备药物中的应用，将所述绿原酸微乳与医学上可接受的辅料或辅助性成分一起加工成注射剂、透皮剂或软胶囊。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明针对绿原酸亲水性强而亲脂性差的特点，在选定适宜的油相和乳化剂的条件下，将绿原酸制备成W/O型的微乳；并从剂型着手，对绿原酸的性质进行了优化，从而达到了提高绿原酸生物利用度并且促进绿原酸吸收的目的，对绿原酸的广泛应用具有深远意义。

附图说明

图1示出了实施例5中不同给药组的荷瘤小鼠的抑瘤率对比图。

图2示出了实施例6中不同给药组的荷瘤小鼠的抑瘤率对比图。

具体实施方式

在下文中，将对本发明的绿原酸微乳及其制备工艺和应用的示例性实施例进行详细说明。

绿源酸是属于多酚类的小分子单体，其存在广泛的生物活性和药用价值，然而其存在水溶性较高而脂溶性低和透膜吸收能力差的特点，这导致其与细胞的亲和性较差且生物利用度较低，在一定程度上限制了其应用。微乳是由油、水和乳化剂自发形成的各向同性、澄清透明的热力学和动力学稳定体系，属于新型的药物释放载体，具有稳定和吸收完全等特点。本发明针对绿原酸亲水性强而亲脂性差的特点进行了相应的研究，希望通过制备绿原酸微乳并进而将其制备成各种制剂，从而改善绿原酸在医药领域应用上的局限性。

根据本发明的示例性实施例，所述绿原酸微乳是以绿原酸为主药并添加辅料制成的W/O型微乳，其中，所述辅料包括水、油相和乳化剂。也即，本发明的绿原酸微乳是以绿原酸为主，添加水、油相和乳化剂制成的油包水型微乳，从而能够实现增溶水溶性药物并提高水溶性药物的稳定性和生物利用度。其中，水可以是蒸馏水、纯化水、注射用水等常用的药剂配制用水。

具体地，以质量百分比计，上述绿原酸微乳包括油相30～55％、乳化剂20～55％和水相5～25％。由于绿原酸微乳的各组分含量总和为100％，因此当油相与乳化剂的含量确定后，就可以确定水相的含量。其中，水相为绿原酸溶于水形成的溶液。本发明中绿原酸微乳中形成微乳的各相比例对于制剂的稳定性具有较大的影响，经过实施例的验证，上述比例范围下的微乳制剂具有较好的稳定性。

绿原酸是亲水性比较强而亲脂性比较弱的小分子单体，其在水中的溶解度是一定的，例如其在25℃的室温环境下的溶解度为4，即每100ml或者100g水中最多可以溶解4g的绿原酸。为了让水相尽可能的少并且体系不至于过大，本发明优选使用的水相是最高浓度的绿原酸饱和水溶液，但也可以使用不饱和的绿原酸水溶液。也即，根据本发明的示例性实施例，所述水相为绿原酸溶于水形成的质量浓度为4％以下的溶液。在确定绿原酸在水中的溶解度以及所需要使用的水相的质量浓度后，就可以根据水相的含量确定水和绿原酸的使用量，也即绿原酸的具体使用量是可以根据需求确定的，只要不超过可以溶解的上限值即可。

根据本发明，绿原酸可以为从植物中提取的或通过化学合成的绿原酸原料药。例如，可以选择杜仲、金银花、牛蒡子等植物进行绿原酸的提取。优选地，绿原酸原料药的纯度为98％以上，以提高所制备的微乳质量。

油相可以为甘油三酯、月桂酸甘油酯、肉蔻豆酸异丙酯、棕榈酸异丙脂和棕榈酸异辛脂中的任意一种。在本发明中所选用的油相均为药剂学中常用的油相，具有生物相容性好、刺激性小等特点。

根据本发明，乳化剂包括表面活性剂和助表面活性剂。其中，表面活性剂可以改变两相之间的界面性质，助表面活性剂能够调节两相的极性，二者相互配合组成乳化剂能够起到很好的乳化作用。

其中，表面活性剂与助表面活性剂的质量比为3:1～5:1。

上述的表面活性剂可以为聚山梨酯-80、脱水山梨醇倍半油酸酯、三蓖麻油酸聚甘油酯和大豆磷脂中的任意一种；助表面活性剂可以为丙二醇、乙醇、司盘80和PEG400中的任意一种。

为了制备上述绿原酸微乳，本发明还提供了一种上述绿原酸微乳的制备工艺，所述制备工艺包括以下步骤：首先，将绿原酸溶于水中制成水相；然后，将乳化剂与油相均匀混合得到混合液；最后在不断振摇的条件下向所述混合液中缓慢滴加所述水相直至混合均匀，得到绿原酸微乳。当然，在制备时，可以根据前述的配比关系进行制备前的预先配料。其中，振摇是形成乳剂的必要步骤，有助于一相(水相)在另外一相(油相)中的分散。优选地，在制得绿原酸微乳后进行密封，避免主要损失。

根据本发明，若乳化剂包括表面活性剂和助表面活性剂，则上述制备工艺还包括将表面活性剂和助表面活性剂均匀混合制成乳化剂的步骤。

此外，本发明还提供了上述绿原酸微乳在制备药物中的应用。具体地，将上述绿原酸微乳与医学上可接受的辅料或辅助性成分一起加工成注射剂、透皮剂或软胶囊，从而改善绿原酸在应用上的局限性。本发明通过改变剂型，既使得绿原酸之前的药理活性得到保持且生物利用度有所提高，而且也可以使绿原酸通过非注射途径发挥药效。具体地，本发明的绿原酸微乳可以在制备抗肿瘤、抗炎、抗病毒等药物中应用。

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

另外，若无特别说明，以下各实施例均在室温下进行。

实施例1：绿原酸W/O型微乳的制备

1.实验材料与器材

从杜仲叶中提取的纯度为99.8％的绿原酸、肉蔻豆酸异丙酯(上海谱振生物科技有限公司)、大豆磷脂(美国Avanti)、乙醇(上海谱振生物科技有限公司)、超纯水、电子天平(日本Shimadzu公司)、磁力搅拌器等。

2.处方

制备绿原酸W/O微乳的处方如表1所示：

表1实施例1中制备的绿原酸微乳的处方

组分	质量(g)
		99.8％绿原酸	0.25g
肉蔻豆酸异丙酯	50g
		大豆磷脂	50g
乙醇	10g
		水	6g

3.绿原酸微乳的制备

称取从杜仲叶中提取的纯度为99.8％的绿原酸0.25g，将其溶解于6g水中，得到水相(即绿原酸水溶液)；另称取大豆磷脂50g和乙醇10g，混合均匀后再加入肉蔻豆酸异丙酯50g，搅拌并混合均匀得到混合液；在不断振摇的条件下，向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。

实施例2：绿原酸W/O型微乳的制备

1.实验材料与器材

从金银花中提取的纯度为99.4％的绿原酸、月桂酸甘油酯(上海谱振生物科技有限公司)、聚山梨酯-80(上海谱振生物科技有限公司)、丙二醇(上海谱振生物科技有限公司)、超纯水、磁力搅拌器等。

2.处方

制备绿原酸W/O微乳的处方如表2所示：

表2实施例2中制备的绿原酸微乳的处方

处方名称	质量(g)
		99.8％绿原酸	0.8g
月桂酸甘油酯	46g
		聚山梨酯-80	38g
丙二醇	7g
		水	24g

3.绿原酸微乳的制备

称取从金银花中提取的纯度为99.4％的绿原酸0.8g，将其溶解于24g水中，得到水相(即绿原酸水溶液)；另称取聚山梨酯-8038g和丙二醇7g，混合均匀后再加入月桂酸甘油酯46g，搅拌并混合均匀后得到混合液；在不断振摇的条件下，向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。

实施例3：绿原酸W/O型微乳的制备

1.实验材料与器材

合成的纯度为68.4％的绿原酸、月桂酸甘油酯(上海谱振生物科技有限公司)、聚山梨酯-80(上海谱振生物科技有限公司)、丙二醇(上海谱振生物科技有限公司)、超纯水、磁力搅拌器等。

2.处方

制备绿原酸W/O微乳的处方如表3所示：

表3实施例3中制备的绿原酸微乳的处方

处方名称	质量(g)
		68.4％绿原酸	0.4g
棕榈酸异丙脂	80g
		三蓖麻油酸聚甘油酯	40g
PEG400	15g

水

10g

3.绿原酸微乳的制备

称取合成的纯度为68.4％的绿原酸0.4g，将其溶解于10g水中，得到水相(即绿原酸水溶液)；另称取三蓖麻油酸聚甘油酯40g和PEG40015g，混合均匀后再加入棕榈酸异丙脂80g，搅拌并混合均匀后得到混合液；在不断振摇的条件下，向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。

实施例4：绿原酸微乳的鉴定与质量评价实验

1.实验试药与器材

从杜仲叶中提取的纯度为99.2％的绿原酸、甘油三酯(上海谱振生物科技有限公司)、肉蔻豆酸异丙酯(上海谱振生物科技有限公司)、月桂酸甘油酯(上海谱振生物科技有限公司)、棕榈酸异辛脂(上海谱振生物科技有限公司)、聚山梨酯-80(上海谱振生物科技有限公司)、司盘80(上海谱振生物科技有限公司)、乙醇(上海谱振生物科技有限公司)、丙二醇(上海谱振生物科技有限公司)、大豆磷脂(美国Avanti)和PEG400(成都宝信试剂有限公司)。

电子天平(日本Shimadzu公司)、DDS-HA型电导率仪(上海雷磁仪器厂)、离心机(Bechman)，阿贝折光仪(上海光学仪器厂)，粒度测定仪(美国PSS)等。

2.不同处方绿原酸微乳的制备

按照表4所示的处方，制备不同的绿原酸微乳。具体地，称取从杜仲叶中提取出的纯度为99.2％的绿原酸适量，将其溶解于适量水中，得到水相(即绿原酸水溶液)；另称取处方量的表面活性剂和助表面活性剂，混合均匀后再加入处方量的油相，搅拌并混合均匀后得到混合液；在不断振摇的条件下，

向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。

表4实施例4中不同处方的绿原酸微乳

3.不同处方制备的绿原酸微乳的鉴定和质量评价

3.1.绿原酸微乳的鉴定

①离心法

将不同处方制得的绿原酸微乳分别置于离心机中，以4000g/min的速率离心30min后观察各制剂的外观性状。

②染料法

将不同处方制得的绿原酸微乳分别均分为两份，每份3mL，向这两份绿原酸微乳中分别加入亚甲基蓝和苏丹Ⅲ粉末，其中亚甲基蓝属于水溶性染料，而苏丹Ⅲ属于油溶性染料，通过考察两种染料在制剂中的扩散速度来对微乳进行鉴定。

③稀释法

在3mL的蒸馏水和油相中，分别滴加不同处方制成的绿原酸微乳，观察其在水相和油相中的溶解度来对制剂进行鉴定。为了便于进行比较，均使用同一种油相即可，例如甘油即可。

④电导法

用电导仪对不同处方制得的绿原酸微乳进行检测，测得每种制剂的电导率，并以单纯水相和油相的电导率作为参考，对不同处方制得的绿原酸微乳进行鉴定。其中，油相可以为甘油。

3.2绿原酸微乳的稳定性考察

①离子强度对于微乳稳定性的影响

根据不同的处方，分别称取处方量的油相和乳化剂并混合均匀后，制得6份不同的混合液。之后，分别以质量浓度为0.9％和2％的NaCl溶液作为水相对6份混合液进行滴定直至微乳形成，记录水相的用量。

②pH值对微乳稳定性的影响

分别用0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH分别滴定不同处方制得的绿原酸微乳，缓慢地调节微乳的酸碱度使其pH值逐渐上升至10或降至4，在微乳酸碱度变化的过程中观察期性状的变化情况。

③环境对微乳稳定性的影响

分别制备不同处方的绿原酸微乳，将其分别放置于室温3个月，观察样品是否保持为澄清、流动性良好的液体。并且，以不同处方制备的绿原酸微乳中的绿原酸初始含量为基线，用HPLC法检测放置一个月后不同绿原酸微乳中的剩余绿原酸含量百分比并计算剩余绿原酸含量百分比，具体检测步骤如下：

A)将不同处方制得的绿原酸微乳用10％的TritonX-100进行破乳；

B)将破乳之后的混合物水浴超声20min；

C)最后将液体以5000rpm/min的速度离心5min；

D)取上清液，用高效液相色谱法对微乳中的绿原酸含量进行测定。

4.试验结果

4.1绿原酸微乳的鉴定

①离心法

该部分的实验结果显示，采用A、B、C、D、E、F六种处方所制备的绿原酸微乳，在离心之后，仅有A处方的绿原酸微乳出现了略微的浑浊，其余各处方所制备的绿原酸微乳均未出现分层，维持着澄清、透明的外观性状。

②染料法

该部分的实验结果显示，在采用A、B、C、D、E、F六种处方所制备的绿原酸微乳中，油性染料亚甲基蓝染料在其中的扩散速度均大于苏丹Ⅲ染料，表明不同处方所制备的绿原酸微乳均为W/O型。

③稀释法

该部分的实验结果显示，将采用A、B、C、D、E、F六种处方所制备的绿原酸微乳滴入油相中均能被稀释，而滴入水相中则不能分散开，这证明不同处方所制备的绿原酸微乳均为W/O型。

④电导法

油性介质的导电性差、电导率低，用电导仪对不同处方制备的绿原酸微乳进行电导率的测定。结果显示，绿原酸水溶液的电导率为19.25us/cm，不同处方制备的绿原酸微乳的电导率测定结果如表5所示。表5中数据表明绿原酸制成微乳后其导电性显著下降。

表5不同处方制备的绿原酸微乳的电导率测定结果

处方名称	电导率(us/cm)

A	0.45
		B	0.41
C	0.27
		D	0.25
E	0.33
		F	0.28

4.2绿原酸微乳的稳定性考察

①离子强度对于微乳稳定性的影响

该部分的实验结果显示，离子强度对不同处方制备的绿原酸微乳的稳定性没有显著的影响，对微乳载水量的影响也很小。

②pH值对微乳稳定性的影响

不同处方制备的绿原酸微乳在HCl滴定的过程中，没有出现漂油或分层的现象，而在NaOH滴定过程中，各个处方的绿原酸微乳均先后出现了不同程度的分层现象。这表明，所制备的绿原酸微乳在碱性条件下并不稳定。

③环境对微乳稳定性的影响

在这部分实验中，利用高效液相色谱法检测了放置3个月之后的绿原酸微乳中的绿原酸含量并以不同处方的绿原酸投药量作为基准，算一个月后不同处方中剩余的绿原酸含量百分比，实验结果如表6所示。表6中的数据表明所制备的微乳B、C、D、E、F，在实验考查的3个月内显示出良好的稳定性，绿原酸含量百分比均没有较大的损失。

表6不同处方制备的绿原酸微乳放置3个月后的剩余绿原酸百分比

处方名称	剩余绿原酸百分比(％)
		A	77.3
B	96.8
		C	96.8
D	98.7
		E	98.2
F	98.2

实施例5：绿原酸微乳软胶囊在抗小鼠黑色素瘤方面的应用

1.实验试药和仪器

从牛蒡子中提取的纯度为98.7％的绿原酸、大豆磷脂(美国Avanti)、乙醇(成都宝信试剂有限公司)、肉蔻豆酸异丙酯(上海谱振生物科技有限公司)、B16细胞(四川大学生物治疗国家重点实验室)、电子天平等。

2.绿原酸微乳注射剂的制备

称取牛蒡子中提取出的纯度为98.7％的绿原酸1g，将其溶解于25g水中，得到水相(即绿原酸水溶液)；另称取大豆磷脂100g和乙醇15g，混合均匀后再加入100g的肉蔻豆酸异丙酯，搅拌并混合均匀后得到混合液；在不断振摇的条件下，向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。对得到的绿原酸微乳进行过滤除菌并将其避光封装于灭菌容器内，即得到绿原酸微乳注射剂。

3.实验动物分组及实验方案

取6周龄的C57小鼠36只，取处于对数期生长的B16细胞并将其浓度调整为5×10⁵个/mL的浓度时，将细胞皮下注射于小鼠的腋下形成黑色素异位瘤。将注射细胞当天计为第0天，在注射后的第7天观测小鼠的瘤块生长情况，若能摸到米粒大小的瘤块，则代表建模成功。

将建模成功的小鼠随机分为三组，分别给予绿原酸原料药注射、绿原酸微乳注射和生理盐水注射，具体的动物分组和给药方案如表7所示。连续给药15天后将各组小鼠处死，用电子天平对各组小鼠的瘤块进行称重，按照公式抑瘤率％＝(1-实验组瘤块重量/对照组瘤块重量)×100％来计算各组药物的抑瘤率。

表7动物实验分组及给药方案

分组	给药方式	给药量(mg/kg)
			绿原酸原料药注射液组(CGA组)	腹腔注射	40
绿原酸微乳注射剂组(CGA-ME组)	腹腔注射	100
			生理盐水(NC组)	腹腔注射	/

3.实验结果

对不同给药组的荷瘤小鼠测定抑瘤率后的实验结果如图1所示，与绿原酸原料药相比，绿原酸微乳注射剂对小鼠的抑瘤率更加明显，两组之间有显著性差异(p<0.05)。

实施例6：绿原酸微乳软胶囊的制备和用于小鼠体内抗肿瘤的实验研究

1.实验试药和仪器

从杜仲叶中提取的纯度为99.2％的绿原酸、大豆磷脂(美国Avanti)、乙醇(成都宝信试剂有限公司)、肉蔻豆酸异丙酯(上海谱振生物科技有限公司)、MCF-7细胞(四川大学生物治疗国家重点实验室)、电子天平等。

2.绿原酸微乳软胶囊的制备

取从杜仲叶中提取的纯度为99.2％的绿原酸1g，将其溶解于25g水中，得到水相(绿原酸水溶液)；另称取大豆磷脂100g和乙醇15g，混合均匀后再加入100g的肉蔻豆酸异丙酯，搅拌并混合均匀后得到混合液；在不断振摇的条件下，向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。将制得的绿原酸微乳封装于软胶囊壳中，即得到绿原酸微乳软胶囊制剂。

3.实验动物分组及实验方案

取6周龄的BALC/C裸鼠36只，取处于对数期生长的MCF-7细胞并将其浓度调整为1×10⁶个/mL的浓度时，将细胞皮下注射于小鼠的腋下，形成乳腺癌异位瘤。将注射细胞当天计为第0天，在注射后的第15天，观测小鼠的瘤块生长情况，若能摸到米粒大小的瘤块，则代表建模成功。

将建模成功的小鼠随机分为三组，分别给予绿原酸原料药灌胃、绿原酸微乳软胶囊灌胃和生理盐水灌胃，具体的动物分组和给药方案等如表8所示。连续给药20天后将各组小鼠处死，用电子天平对各组小鼠的瘤块进行称重，按照公式抑瘤率％＝(1-实验组瘤块重量/对照组瘤块重量)×100％来计算各组药物的抑瘤率。

表8动物实验分组及给药方案

分组	给药方式	给药量(mg/kg)
			绿原酸原料药组(CGA组)	灌胃	60
绿原酸微乳软胶囊组(CGA-ME组)	灌胃	120
			生理盐水(NC组)	灌胃	/

4.实验结果

对不同给药组的荷瘤小鼠测定抑瘤率后的实验结果如图2所示。与绿原酸原料药相比，绿原酸微乳注软胶囊对小鼠的抑瘤率明显比绿原酸原料药高，两组之间有非常显著性的差异(p<0.01)。实验结果提示，绿原酸微乳软胶囊有效地提高了绿原酸的生物利用度。

实施例7：绿原酸微乳制剂的体外透皮性能考察

1.实验动物和仪器

1.1动物样品的制备

取250g的Wistar大鼠2只，用脱毛膏脱毛后处死，剥去腹部皮肤并仔细剥离皮下脂肪，以少量的生理盐水润湿后备用。

1.2绿原酸微乳的制备

取从金银花中提取的纯度为99.5％的绿原酸1g，将其溶解于25g水中，得到水相(绿原酸水溶液)；另称取大豆磷脂100g和乙醇15g，混合均匀后再加入100g的肉蔻豆酸异丙酯，搅拌并混合均匀后得到混合液；在不断振摇的条件下，向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。通过HPLC测定，可得到绿原酸的终浓度为5mg/mL。

绿原酸原料药对照组：将从金银花中提取的纯度为99.5％的绿原酸1g溶解于200mL的生理盐水中，制得绿原酸浓度为5mg/mL的绿原酸水溶液，备用。

1.3实验分组和方法

将处理好的皮肤置于V-C水平扩散池结合处，使角质层面向供给池。用弹簧夹将皮肤固定在供给池中加入供试药液，平行做2组，分别为绿原酸原料药组(CGA组)和绿原酸微乳组(CGA-ME)。接收池中则加入生理盐水并采用恒速电磁搅拌，扩散池夹层的水浴温度保持在37℃，于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8h分别取出接收液1.5mL并立即补充等量的生理盐水，再用紫外可见分光光度计测定三组实验接收池内的绿原酸浓度，根据药物的累积渗透量Q对时间T作图，计算不同制剂对药物的增渗倍数。

2.实验结果

最终的实验结果显示，绿原酸微乳能够有效地增加皮肤对绿原酸的渗透能力，其相对于绿原酸原料药的增渗倍数为3.78，实验结果提示绿原酸微乳增加了绿原酸的透皮率。

实施例8：绿原酸微乳生物利用度的考察

1.实验材料和仪器

从杜仲叶中提取的纯度为99.9％的绿原酸、大豆磷脂(美国Avanti)，乙醇(成都宝信试剂有限公司)、肉蔻豆酸异丙酯(上海谱振生物科技有限公司)、甲醇、乙腈、四氢呋喃、冰醋酸、无水乙醇、HPLC系统、pH计等。

2.实验方法

2.1绿原酸微乳的制备

取从杜仲叶中提取的纯度为99.9％的绿原酸1g，将其溶解于25g水中，得到水相(即绿原酸水溶液)；另称取大豆磷脂100g和乙醇15g，混合均匀后再加入100g的肉蔻豆酸异丙酯，搅拌并混合均匀后得到混合液；在不断振摇的条件下，向混合液中缓慢地滴加上述水相，即得到绿原酸微乳。随即进行以下实验。

2.2动物实验

取6周龄的SD大鼠共210只，随机分为三组且每组70只大鼠，分别命名为绿原酸原料药组(CGA组)、绿原酸微乳组(CGA-ME组)和空白对照组(B组)。将所有大鼠禁食12h之后，对其中两组大鼠分别给予绿原酸原料药和绿原酸微乳灌胃，大鼠口服绿原酸的药物剂量为40mg/kg。大鼠灌胃后，分别于5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、8h和12h分别对各组大鼠尾部取血2.0mL，以3000r/min的速率离心10min得上层血清，其中，每个时间点分别取5只大鼠的样品。

2.3样品的检测

取300μL上述得到的血清并置于10mL的尖嘴玻璃管中，加入5mL的甲醇并用电动混匀器混匀之后，以10000r/min的速率离心20min，取上层清液并置于尖嘴玻璃管中，再置于37℃的水浴中用氮气流吹干；之后用100μL的流动相溶解，再次以10000r/min的速率离心20min，取上层清液，采用HPLC系统对绿原酸含量进行测定，得到各组的大鼠血清绿原酸药时曲线并得出相应的药代动力学参数。

2.4实验结果

本实施例研究了不同形式的绿原酸，以口服给药的途径进入大鼠体内后的相对生物利用度。最终的实验结果显示，以CGA作为参比，CGA-ME组的相对生物利用度为289.2％，即：绿原酸微乳制剂的形成使得绿原酸的口服生物利用度被显著提高，其中的空白对照组(B组)的数据是作为基线使用的

由于绿原酸的亲水性较好而亲脂性差，故其在生物药物系统中被分为第三类药物，这些特性决定了其较低的生物利用度和较差的细胞吸收性。本发明针对这些特点对绿原酸进行剂型改造，采用微乳技术制备了W/O型的绿原酸微乳，通过不同处方配比制备了不同处方含量的绿原酸微乳并对它们的性状、稳定性等进行了考察，最后将绿原酸微乳延用到了软胶囊、注射剂和透皮剂的制备，考察了不同制剂在不同动物实验中的药效。结果显示，与绿原酸原料药相比，绿原酸微乳注射剂和软胶囊均能有效地提高绿原酸的生物利用度，为绿原酸更广范围的使用创造了可能性。

综上所述，本发明实现了绿原酸非注射途径应用的突破，有益于绿原酸改变其自身的理化性质，进而发挥更为广泛的疗效作用；还有益于提高非注射途径的绿原酸使用的有效性；更有益于通过非注射途径发挥绿原酸的抗炎、抗菌等一些列药理活性，对于绿原酸的深入开发和应用具有重大意义。

尽管上面已经结合示例性实施例描述了本发明的绿原酸微乳及其制备工艺和应用，但是本领域普通技术人员应该清楚，在不脱离权利要求的精神和范围的情况下，可以对上述实施例进行各种修改和变化。

Claims (7)

1.一种绿原酸微乳，其特征在于，所述绿原酸微乳是以绿原酸为主药并添加辅料制成的W/O型微乳，其中，所述辅料包括水、油相和乳化剂；以质量百分比计，所述绿原酸微乳包括油相30～55％、乳化剂20～55％和水相5～25％，所述水相为绿原酸溶于水形成的质量浓度为4％以下的溶液,

其中，所述油相为甘油三酯、月桂酸甘油酯、肉蔻豆酸异丙酯、棕榈酸异丙脂和棕榈酸异辛脂中的任意一种；所述乳化剂包括表面活性剂和助表面活性剂，所述表面活性剂与助表面活性剂的质量比为3:1～5:1，所述表面活性剂为聚山梨酯-80、脱水山梨醇倍半油酸酯、三蓖麻油酸聚甘油酯和大豆磷脂中的任意一种，所述助表面活性剂为丙二醇、乙醇、司盘80和PEG400中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的绿原酸微乳，其特征在于，所述绿原酸为从植物中提取的或通过化学合成的绿原酸原料药。

3.根据权利要求2所述的绿原酸微乳，其特征在于，所述绿原酸原料药的纯度为98％以上。

4.权利要求1-3中任一项所述的绿原酸微乳的制备工艺，其特征在于，所述制备工艺包括以下步骤：

将绿原酸溶于水中制成水相；

将乳化剂与油相均匀混合得到混合液；

在不断振摇的条件下，向所述混合液中缓慢滴加所述水相直至混合均匀，得到所述绿原酸微乳。

5.根据权利要求4所述的绿原酸微乳的制备工艺，其特征在于，所述乳化剂包括表面活性剂和助表面活性剂，所述制备工艺还包括将所述表面活性剂和助表面活性剂均匀混合制成乳化剂的步骤。

6.权利要求1-3中任一项所述的绿原酸微乳在制备药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的绿原酸微乳在制备药物中的应用，其特征在于，将所述绿原酸微乳与医学上可接受的辅料或辅助性成分一起加工成注射剂、透皮剂或软胶囊。