CN104825442A - 五味子乙素在制备预防结肠炎或结肠癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种五味子乙素在制备预防结肠炎或结肠癌药物中的应用;所述五味子乙素的用量为15-30mg/kg体重;五味子乙素可有效预防结肠炎以及结肠炎相关结肠癌,具有临床应用前景;五味子乙素具有较低的毒性,副作用小,其可以减少炎性因子的产生;五味子乙素成药性良好;因此,五味子乙素具有良好的临床预防治疗的应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种五味子乙素在制备治疗和预防结肠炎或结肠癌药物中的应用。
(二)背景技术
结直肠癌(CRC)是常见的恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位,其死亡率居恶性肿瘤第二位,我国结肠癌死亡率已位于恶性肿瘤第五位,严重危害着人类健康。结肠癌起源于肠道上皮细胞,通过一系列复杂的遗传及表观遗传改变,经过漫长的时间积累,最终发生细胞恶变,形成特定类型的癌症。当结肠癌形成后,其临床治疗的困难性也非常大,主要是因为结肠癌还没有明确的病因,因此彻底治愈结肠癌还是没有特效的方法。在结肠癌的发生发展过程中,良性腺瘤是结肠癌最早期的病理变化,该状态具有典型的癌前病变特征,但与此同时该状态尚未发生真正的恶性转变,具有可治愈性,也是控制结肠癌最终发生发展的重要节点,具有重要的研究和临床干预价值,因此有效的早期干预以及合适的预防手段显得尤为重要。
已有文献报道:结肠癌良性病变到发生癌变,直至转移性癌变的复杂过程中,慢性炎症具有重要作用,甚至可以说在细胞恶化前期以及恶性转变期发挥了致命推动作用(Inflammation and cancer:role of nuclearfactor-kappaB activation.Cancer Sci.2008 May;99(5):836-42.)。肠道上皮粘膜是隔离宿主与外界大量微生物的天然阻挡屏障,长期的高脂肪饮食会加重肠道负担,加剧肠道上皮细胞(IECs)炎症反应,从而启动并持续加剧一系列复杂的级联反应:众多的促炎因子(如TNF-α,IL-1β,LPS)作用于细胞,激活NF-κB,调节多种参与早期炎症反应的基因表达,包括TNF-α,IL-8以及ICAM-1,增加肠上皮通透性,如此往复循环作用又进一步加剧炎性反应,最终形成非可控性慢性炎症,导致细胞恶变。研究表明结肠癌变的早期阶段涉及促炎性环氧酶COX-2和诱导型一氧化氮合酶iNOS的增加,COX-2和iNOS促进慢性炎症,继而创造了一个在结肠癌变过程中促进肿瘤形成前期病灶发展的有益微环境,进一步加剧了炎癌转化;当在不同的动物模型中抑制这两种酶时,能抑制结肠肿瘤的发展,表明了这两种酶是结肠炎症和肿瘤发生的重要调节因子。此外,NF-kB能够调节COX-2和iNOS的表达,与炎症诱导的结肠癌变相关,并且NF-kB抑制剂能阻止癌症的发展。由此提示我们,使用化合物抑制炎症可能是一个有效的控制结肠癌的发生和发展的策略。
结肠癌的化学预防探索日益受到关注,近年来开发了几种对结肠癌具有相当化学预防功能的制剂,包括非甾体类抗炎药(NSAIDs)、阿司匹林、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂等等,然而在进一步的深入探索中发现这些预防药物存在较强副作用,如长期或大量服用非甾体类抗炎药(NSAIDs)和阿司匹林会造成胃肠运动减弱,消化道出血;环氧合酶-2(COX-2)抑制剂能够引起NF-κB相关蛋白表达减少,进而引起慢性肠道炎症发生,同时对心血管系统也产生较大威胁,因此,寻找有效无毒副作用的化学预防制剂成为当务之急。
五味子乙素(Schizandrin B)是五味子属植物中含量最丰富的联苯环辛二烯类木脂素,其结构式如下:
早在1996年就有文献报道五味子乙素具有显著的抗氧化活性,能有效降低肝细胞转氨酶的活性,抑制脂质过氧化保护肝脏等功效。同时五味子乙素还被证明通过恢复与自由基损伤相关的酶活对缺血再灌注的心肌有保护作用。随后多个研究证实了五味子乙素的抗炎作用:五味子乙素在巨噬细胞中能够抑制LPS诱导的p38MAPK,ERK1/2和JNK的磷酸化,下调NO、PGE2、COX-2和iNOS的表达,显示出抗炎活性;五味子乙素还能通过TLR4受体调控的MyD88/IKK/NF-ΚB信号通路拮抗脂多糖诱导的大鼠小神经胶质细胞神经炎,发挥抗神经炎症作用。五味子乙素能使人宫颈癌传代细胞发生凋亡,并且在癌细胞局部发病的时候抑制上皮-间质转化,减缓癌症的入侵及转移,为其运用于癌症的治疗提供了应用的可能,但尚未有文献报道和专利公开表明五味子乙素在制备预防和治疗结肠炎或结肠癌药物中的有任何应用前景。
(三)发明内容
本发明的目的就是对结肠炎以及结肠炎相关结肠癌的预防和治疗提供了一种对人体毒副作用小,预防和治疗作用显著的药物,即是五味子乙素。
本发明提供一种五味子乙素在制备预防和治疗结肠炎或结肠癌药物中的应用。
进一步,所述应用为五味子乙素在制备预防和治疗结肠炎药物中的应用。
再进一步,所述应用为五味子乙素在制备预防和治疗结肠癌药物中的应用。
更进一步,所述应用为五味子乙素在制备预防和治疗结肠炎相关结肠癌炎症药物中的应用,即制备预防和治疗结肠炎到结肠癌病变过程中炎症的药物。
本发明所述五味子乙素的用量为15-30mg/kg体重。
本发明所述的五味子乙素给药剂量,其中30mg/kg的药用效果明显优于15mg/kg。
本发明所述五味子乙素能够抑制结肠炎到结肠癌病变过程产生的炎性因子活性,所述炎性细胞因子为肿瘤坏死因子TNF-α,白细胞介素IL-1β、白细胞介素IL-6、白细胞介素IL-10或转化生长因子TGF-β1。
本发明所述药物剂型可按本领域已知方法制成下列肠道剂型:①片剂、②胶囊剂、③颗粒剂、④缓释剂或⑤靶向制。
与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:(1)五味子乙素可用于制备有效预防结肠炎以及结肠炎相关结肠癌的药物,同时还能够制备有效预防结肠炎到结肠癌病变过程相关炎症的药物;五味子乙素能够降低促炎因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)以及抑炎因子(IL-10,TGF-β1)mRNA和蛋白水平,减少巨噬细胞的浸润,从而达到预防治疗结肠炎相关结肠癌的作用;五味子乙素能够改善DSS诱导结肠炎小鼠的结肠充血现象、结肠缩短、血便以及腹泻、体重降低情况,具有临床应用前景;(2)五味子乙素具有较低的毒性,副作用小,其可以减少炎性因子的产生;(3)五味子乙素成药性良好;因此,五味子乙素具有良好的临床预防治疗的应用前景。
(四)附图说明
图1为AOM/DSS给药方案示意图。
图2为五味子乙素对AOM/DSS结肠癌模型小鼠结肠中肿瘤分布,数量,大小的影响;A为各组小鼠结肠照片,B为各组小鼠结肠肿瘤分布图。
图3为五味子乙素对AOM/DSS结肠癌模型小鼠生存率的影响。
图4为五味子乙素对AOM/DSS结肠癌模型小鼠体重的影响。
图5为五味子乙素对AOM/DSS结肠癌模型小鼠肝重指数以及脾重指数的作用,A为各组小鼠肝重指数,B为各组小鼠脾重指数。
图6为五味子乙素对AOM/DSS结肠癌模型小鼠外周血中3种促炎因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的作用,A为五味子乙素对各组小鼠外周血中TNF-α分泌的影响,B为五味子乙素对各组小鼠外周血中IL-1β分泌的影响,C为五味子乙素对各组小鼠外周血中IL-6分泌的影响。
图7为五味子乙素对AOM/DSS结肠癌模型小鼠结肠组织中5种炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10,TGF-β1)mRNA水平的影响作用,A为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中TNF-α的mRNA水平的影响,B为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-1β的mRNA水平的影响,C为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-6的mRNA水平的影响,D为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-10的mRNA水平的影响,E为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中TGF-β1的mRNA水平的影响。
图8为五味子乙素对AOM/DSS结肠癌模型小鼠结肠组织中5种炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10,TGF-β1)蛋白水平的影响作用,A为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中TNF-α蛋白水平的影响,B为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-1β的蛋白水平的影响,C为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-6的蛋白水平的影响,D为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-10的蛋白水平的影响,E为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中TGF-β1的蛋白水平的影响。
图9为五味子乙素对结肠炎相关结肠癌模型小鼠结肠组织中巨噬细胞表达的影响。
图10为五味子乙素对DSS急性结肠炎模型小鼠结肠长度,充血情况的影响。
图11为五味子乙素对DSS急性结肠炎模型小鼠体重的影响。
图12为五味子乙素对DSS急性结肠炎模型小鼠肝重指数以及脾重指数的影响,A为各组小鼠肝重指数,B为各组小鼠脾重指数。
图13为五味子乙素对DSS急性结肠炎模型小鼠结肠组织中3种炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)mRNA水平的影响,A为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中TNF-α的mRNA水平的影响,B为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-1β的mRNA水平的影响,C为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-6的mRNA水平的影响。
图14为五味子乙素对DSS急性结肠炎模型小鼠结肠组织中3种炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)蛋白水平的影响,A为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中TNF-α的蛋白水平的影响,B为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-1β的蛋白水平的影响,C为五味子乙素对各组小鼠结肠组织中IL-6的蛋白水平的影响。
图15为五味子乙素对三种结肠癌细胞株的毒性作用,A为五味子乙素对小鼠结肠癌细胞株CT-26的毒性作用,B为五味子乙素对人结肠癌细胞株HCT-116的毒性作用,C为五味子乙素对人结肠癌细胞株Caco-2的毒性作用。
图16为五味子乙素对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7炎性因子分泌的影响,A为五味子乙素对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7TNF-α分泌的影响,B为五味子乙素对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7IL-6分泌的影响,C为五味子乙素对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7IL-10分泌的影响,D为五味子乙素对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7TGF-β1分泌的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
本发明实施例所用百分浓度,除特别说明外,均为体积百分比。
实施例1:五味子乙素减少结肠炎相关结肠肿瘤的发生
(1)实验材料:
实验试剂:五味子乙素(纯度≥95%,此处为质量百分比),用5mg/mlCMC-Na溶液分别配成1.5mg/ml和0.75mg/ml两种浓度,按20ml/kg小鼠体重进行给药;羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购于国药集团,用双蒸水配成5mg/ml溶液;氧化偶氮甲烷(AOM)购自Sigma公司,用生理盐水配成0.5mg/ml的AOM工作液,按20ml/kg小鼠体重进行给药;葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MP Biomedicals公司,用生理盐水配成25mg/ml的DSS溶液。
实验动物:C57雄性小鼠,8周龄,体重18-20g,购自北京维通利华。
(2)实验方法:
结肠癌造模方法(即AOM/DSS给药方案):腹腔注射AOM工作液(AOM用量为10mg/kg小鼠体重),对照组腹腔注射等量生理盐水。AOM给药一周后,持续一周以饮水方式给予25mg/ml DSS溶液,每只鼠保证每天饮入5ml DSS溶液,DSS溶液给予结束后,连续正常饮水14天,给予DSS溶液和水的步骤为一个循环,连续进行三个循环。
取53只C57雄性小鼠,随机分为4组:溶剂对照组(8只),AOM/DSS模型组(15只),AOM/DSS+Sch B高剂量组(15只),AOM/DSS+Sch B低剂量组(15只)。
动物给药周期:
溶剂对照组:小鼠每天灌胃给予5mg/ml CMC-Na溶液;AOM/DSS模型组:小鼠每天灌胃给予5mg/ml CMC-Na溶液,第8天开始实施AOM/DSS给药方案;AOM/DSS+Sch B高剂量组:小鼠每天灌胃给予SchB溶液(Sch B给药量为30mg/kg小鼠体重),第8天开始实施AOM/DSS给药方案(即图1中第7天,Sch B灌胃1小时后腹腔注射AOM);AOM/DSS+Sch B低剂量组:小鼠每天灌胃给予Sch B溶液(Sch B给药量15mg/kg小鼠体重),第8天开始实施AOM/DSS给药方案(即图1中第7天,Sch B灌胃1小时后腹腔注射AOM),第122天处死小鼠,评价肿瘤的发展水平。
统计与数据分析:数值采用±SD。统计比较采用Student's t-test,P值小于0.05为显著差异。
(3)实验结果
1)抑制AOM/DSS结肠癌模型鼠结肠肿瘤的生长:
由图2可知,溶剂对照组小鼠结肠组织无任何异常现象,而AOM/DSS模型组小鼠结肠组织产生肿瘤,且体积较大,分布广,数目多;提前给予五味子乙素的小鼠结肠肿瘤体积明显减小,肿瘤数也相应降低,并且与五味子乙素给药剂量呈剂量依赖性。
2)延长AOM/DSS结肠癌模型鼠的生存时间:
由图3可知,整个实验过程中,溶剂对照组小鼠无死亡现象且状态良好;AOM/DSS模型组小鼠生存时间最短,而提前给予五味子乙素的小鼠生存时间显著延长,并且与五味子乙素给药剂量呈剂量依赖性。
3)改善AOM/DSS结肠癌模型鼠体重减轻的情况:
由图4可知,溶剂对照组小鼠体重逐渐增加;而AOM/DSS模型组结肠癌小鼠体重在实验开始时逐渐降低,而后略有增加,而提前给予五味子乙素的结肠癌小鼠在实验开始时略有降低,而后显著增加,并且与五味子乙素给药剂量呈剂量依赖性。
4)对肝重指数及脾重指数的影响:
肝重指数及脾重指数是临床评价结肠癌恶性程度的辅助指标。由图5可知,各组小鼠肝重指数无显著性差异;AOM/DSS模型组小鼠脾重指数与溶剂对照组相比,明显升高;而提前给予五味子乙素的小鼠,脾重指数明显降低,随着五味子乙素剂量的增加,脾重指数降低更加显著。
结论:五味子乙素能够预防AOM/DSS模型小鼠结肠肿瘤的发生,减小肿瘤体积和数量,延长小鼠的生存时间,改善脾重指数,同时五味子乙素无肝脏毒性副作用。因此,五味子乙素在AOM/DSS小鼠结肠癌模型中具有有效的预防和治疗作用。
实施例2:五味子乙素减少结肠炎相关结肠癌中的炎症状况
(1)实验材料:
实验试剂:mTNF-α(EM008),mIL-1β(EM001),mIL-6(EM004),mIL-10(EM005),mTGF-β1(EM010)ELISA试剂盒均购自上海依科赛生物公司;mTNF-α,mIL-1β,mIL-6,mIL-10,mTGF-β1的引物定于南京金斯瑞;Takara,PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime),Code No.RR047A;Takara,Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseHPlus),Code No.RR820A;BCA蛋白定量试剂盒。
实验仪器:核酸定量仪(Eppendorf),恒温水浴锅,普通PCR仪,ABI Step One Plus实时定量PCR仪,全自动酶标仪,台式高速冷冻离心机,生化培养箱。
(2)实验方法:
1)AOM/DSS模型小鼠(实施例1方法构建)终点实验时眼眶静脉丛取血,4℃静置2-3小时,待血液凝固血块收缩,3000rpm离心10min,小心取上清分装,-80℃保存待用。血清TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10,TGF-β1测定步骤参照酶联免疫吸附试验试剂盒的操作说明。
2)取实施例1中AOM/DSS模型小鼠各组别结肠组织,分别加入1mlTrizol,将组织充分研磨,室温静止5min,7500rpm×10min 4℃离心,小心吸取上清加200μL氯仿,颠倒振荡70-80次,静置5min,12000rpm×10min 4℃离心,吸取上层水相400μL至另一RNase-Free离心管中,加入400μL异丙醇,颠倒60-70次,室温静置10min,12000rpm×10min 4℃离心,弃上清,加DEPC水配置的体积浓度75%乙醇,12000rpm×10min4℃离心,并且重复一次,弃上清后,置于冰上,快速晾干,20μL RNase-FreeH2O将沉淀溶解,取2μL样品溶于48μL RNase-Free H2O中,测定RNA浓度。
(a)去除基因组DNA反应,1×反应体系如下:
(b)反转录反应,用于<Green qPCR法>,1×反应体系如下:
(c)Realtime PCR,1×反应体系如下:
使用ABI Step One Plus实时定量PCR仪进行Real Time PCR反应。3)取AOM/DSS模型小鼠各组别结肠组织,分别加入配制的CompleteRIPA buffer将组织充分研磨,12000rpm×10min 4℃离心,吸取上清,采用BCA法测定蛋白浓度,组织蛋白TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10,TGF-β1测定步骤参照酶联免疫吸附试验试剂盒的操作说明。
4)取AOM/DSS模型小鼠各组别结肠组织于40mg/ml多聚甲醛(用PBS配置)固定,经取材,包埋,切片制得结肠组织病理切片进行IHC染色,具体步骤如下:
烤片:60℃烘箱中烘烤30min。
脱蜡:二甲苯I中浸泡20min(已预热至60℃),二甲苯II中浸泡脱蜡10min。
梯度酒精复水:100%酒精I 3min,100%酒精II 3min,95%酒精3min,85%酒精3min,75%酒精3min,50%酒精3min,蒸馏水3min,蒸馏水3min(修复前保持在水中)。
抗原修复:微波修复,切片置于0.01M,pH6.0的柠檬酸钠缓冲液中,最大功率煮沸起计时沸腾20min,自然冷却至室温。
透化:用0.025%的Triton-X 100(用PBS配制)洗2*10min,轻轻震荡。
封闭:用含10%山羊血清的PBST(PBST为用PBS配制的含1‰吐温的溶液)封闭1h,每片滴加30μl,封口膜覆盖。
孵一抗:甩去封闭液,孵一抗,4℃过夜。
复温:37℃复温45min。用0.025%的Triton-X 100(用PBS配制)洗2×5min(不透化用PBST洗)。
阻断:0.3%的H2O2溶液(用PBS配制)中孵育15min(新鲜配置)。PBST清洗3×10min。
孵育二抗:直接使用商品化二抗,滴加30μl,20-30min。PBST清洗3×10min。
DAB显色:DAB底物贮存液A:稳定过氧化氢溶液B:缓冲液=1:1:20,避光3min左右,镜下观察显色。蒸馏水冲洗,苏木素复染3min,盐酸酒精分化(新鲜配置)2-3次(动作迅速)。氨水返蓝1min(新鲜配置)。
脱水:依次放入梯度酒精中脱水,50%酒精,75%酒精,85%酒精,95%酒精,100%酒精,每次3分钟。
透明:二甲苯中透明5min。
封片:在标本上滴加中性树脂封片;镜检。
统计与数据分析:数值采用±SD。统计比较采用Student's t-test,P值小于0.05为显著差异。
(3)实验结果
1)五味子乙素对结肠炎相关结肠癌模型小鼠外周血中的炎性因子分泌的影响:
由图6可知,与溶剂对照组相比,AOM/DSS模型小鼠外周血中炎性因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)无显著性差异,并且提前给予五味子乙素的小鼠外周血中炎性因子也无明显差异。因此,该炎症相关癌变小鼠的外周血中并未出现明显的炎症状态。
2)五味子乙素对结肠炎相关结肠癌模型小鼠结肠组织中炎性因子分泌的影响:
由图7和图8可知,模型组小鼠结肠组织中促炎因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)以及抑炎因子(IL-10,TGF-β1)的mRNA和蛋白水平显著高于溶剂对照组;当小鼠提前给予五味子乙素后,上述炎性因子的mRNA和蛋白水平显著降低,并且具有剂量依赖性。说明五味子乙素能够下调该炎症相关肿瘤模型小鼠结肠中的炎症状态,从而达到预防治疗结肠炎相关结肠癌的作用。
3)五味子乙素对结肠炎相关结肠癌模型小鼠结肠组织中巨噬细胞的影响:
由图9可知,溶剂对照组小鼠结肠组织中巨噬细胞较少,而在AOM/DSS模型小鼠结肠肿瘤周围巨噬细胞的浸润较多;提前给予五味子乙素的小鼠结肠肿瘤周围巨噬细胞的浸润显著降低,并且具有剂量依赖性。说明五味子乙素减少该炎症相关肿瘤模型小鼠结肠中巨噬细胞的浸润,从而达到预防治疗结肠炎相关结肠癌的效果。
结论:五味子乙素通过抑制结肠组织炎症,发挥预防治疗结肠炎相关结肠癌的作用。
实施例3:五味子乙素减轻结肠炎的发生
(1)实验材料及实验仪器同实施例1。
(2)实验方法
32只C57雄性小鼠,随机分为4组,每组8只:溶剂对照组,DSS模型组,DSS+Sch B高剂量组,DSS+Sch B低剂量组。溶剂对照组:实验第一周,小鼠每天灌胃给予5mg/ml CMC-Na溶液,第8天开始自由饮水8天;DSS模型组:实验第一周,小鼠每天灌胃给予5mg/ml CMC-Na溶液,第8天给予25mg/ml DSS溶液,然后自由饮水8天;DSS+Sch B高/低剂量组:实验第一周,小鼠每天灌胃给予Sch B(30mg/kg or 15mg/kg小鼠体重)溶液,第8天各组开始给予25mg/ml DSS溶液,自由饮用8天用于造模;各组小鼠恢复2天,在第17天解剖各组小鼠评价结肠结肠炎发生程度。
(3)实验结果
1)五味子乙素对DSS诱导结肠炎小鼠的外观形态及结肠长度的变化的影响:
由图10可知,与正常组相比,模型组小鼠结肠部分呈暗红色,粪便不成形,充血,结肠长度显著性缩短;提前给予五味子乙素的小鼠的结肠中上诉症状明显改善,结肠缩短现象呈不同程度的缓解,并具有一定的剂量依赖性。说明五味子乙素对DSS诱导结肠炎小鼠的结肠充血现象和结肠缩短具有一定的改善作用。
2)五味子乙素对DSS诱导结肠炎小鼠的结肠活动指数的影响:
由表1可知,除溶剂对照组外,其余各组小鼠均出现了不同程度的血便以及腹泻情况,其中模型组小鼠结肠病理变化较为严重。提前给予五味子乙素的小鼠,上诉症状呈不同程度的缓解。说明五味子乙素对DSS诱导结肠炎小鼠的血便以及腹泻情况具有一定的改善作用。
表1 五味子乙素对DSS急性结肠炎模型小鼠结肠活动指数的影响
注:1)腹泻评分(0分-正常,2分-稀便,4分水样腹泻);2)便血评分(0分-正常,2分-轻微出血,4分-严重出血)。
3)五味子乙素对DSS诱导结肠炎小鼠的体重变化的影响:
由图11可知,与溶剂对照组相比,模型组小鼠体重呈逐渐降低趋势,提前给予五味子乙素的小鼠,体重降低有所减缓,并伴随一定的剂量依赖性。说明五味子乙素对DSS诱导结肠炎小鼠的体重降低具有一定的改善作用。
4)五味子乙素对DSS诱导结肠炎小鼠肝重指数及脾重指数的影响:
由图12可知,模型组的肝重指数及脾重指数显著升高,当提前给予五味子乙素处理后,小鼠肝重指数及脾重指数得到相应降低。说明五味子乙素无肝脏毒副作用,同时能够改善DSS诱导的结肠炎。
结论:五味子乙素无肝脏毒副作用,且对DSS诱导的小鼠结肠炎具有一定的预防治疗作用。
实施例4:五味子乙素降低结肠炎模型中的炎症状况
(1)实验材料及实验仪器同实施例1。
(2)实验方法同实施例2。统计与数据分析:数值采用±SD。统计比较采用Student's t-test,P值小于0.05为显著差异。
(3)实验结果
五味子乙素对结肠炎模型小鼠结肠组织中炎性因子分泌的影响:由图13和图14可知,模型组小鼠结肠组织中促炎因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)的mRNA和蛋白水平显著高于溶剂对照组;当小鼠提前给予五味子乙素后,上述炎性因子的分泌显著降低,并且具有剂量依赖性。说明五味子乙素能够下调该结肠炎小鼠结肠中的炎症状态,从而达到预防治疗结肠炎的作用。
实施例6:五味子乙素对多种结肠癌细胞株的作用
(1)实验材料
实验细胞株:小鼠结肠癌细胞株CT-26,人结肠癌细胞株HCT116和Caco2(均购自中科院上海细胞库)。
实验试剂:五味子乙素(纯度大于95%,此处为质量百分比),溶于DMSO,配成100mmol/L的母液,再以DMEM/1640培养基稀释成相应浓度。四甲基偶氮唑盐(MTT)购于sigma公司。
实验仪器:酶标仪,二氧化碳培养箱,
(2)实验方法
分别取处于对数生长期,状态良好的CT-26,HCT116和Caco2用2.5mg/ml胰蛋白酶液(用PBS配置)消化,收集细胞,接种于96孔培养板,每孔12000个细胞,培养24h细胞完全贴壁后,将培养液更换为含有不同浓度五味子乙素的培养液,其浓度依次为10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,每个浓度接种3个复孔,即为实验组;另设不加五味子乙素的3个阴性对照孔和不加培养液的3个空白对照孔。于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续孵育培养72h。待培养结束后,每孔吸弃上清,加入5mg/mL MTT 15μL,37℃继续孵育4h,吸弃孔内上清,每孔加入150μLDMSO,避光震荡15min,于酶联免疫检测仪上测定各孔570nm波长处光吸收值。每组实验重复三次。
统计与数据分析:数值采用±SD。统计比较采用Student's t-test,P值小于0.05为显著差异。
(3)实验结果
五味子乙素对于多种结肠癌细胞株的作用:由图15可知,在CT-26,HCT116和Caco2细胞实验中,与对照组相比,不同浓度的五味子乙素对于上述三种细胞均无显著的生长抑制或生长促进作用。说明Sch B对结肠癌细胞株无明显的促增值/凋亡作用,对结肠癌细胞无直接作用。
实施例6:五味子乙素对LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子的影响作用
(1)实验材料
实验细胞株:小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7,购自中科院上海细胞库。
实验试剂:五味子乙素(纯度大于95%,此处为质量百分比),溶于DMSO,配成100mmol/L的母液,再以DMEM/1640培养基稀释成相应浓度;脂多糖(Escherichia coli,0111:B4,LPS)购于sigma公司;mTNF-α(EM008),mIL-1β(EM001),mIL-6(EM004),mIL-10(EM005),mTGF-β1,(EM010)ELISA试剂盒均购自上海依科赛生物公司。
实验仪器:酶标仪,二氧化碳培养箱。
(2)实验方法
取处于对数生长期,状态良好的RAW264.7接种于六孔培养板,每孔106个细胞,用DMEM+10%FBS培养基,在37℃、CO2培养箱中培养24h细胞完全贴壁后,细胞分为对照组,LPS刺激组,LPS+五味子乙素高中低三个浓度组。首先,在LPS+五味子乙素高中低三个浓度组中分别加入10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的五味子乙素预孵育1h,然后与LPS组同时加入LPS(终浓度为1μg/L)溶液,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下刺激RAW264.7细胞24h,收集上清,上清中TNF-α,IL-6,IL-10,TGF-β1测定步骤参照酶联免疫吸附试验试剂盒的操作说明。
统计与数据分析:数值采用±SD。统计比较采用Student's t-test,P值小于0.05为显著差异。
(3)实验结果
五味子乙素对LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子的影响:由图16可知,与空白对照组相比,LPS模型组上清中TNF-α,IL-6,IL-10和TGF-β1四种炎性因子表达均显著性增高,而提前加入五味子乙素处理的细胞,上述炎性因子的分泌显著降低,同时具有剂量依赖性。说明五味子乙素能够在体外显著减少LPS刺激的RAW264.7分泌炎性因子。
Claims (6)
1.五味子乙素在制备预防结肠炎或结肠癌药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述应用为五味子乙素在制备预防和治疗结肠炎药物中的应用。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述应用为五味子乙素在制备预防和治疗结肠炎相关结肠癌药物中的应用。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述应用为五味子乙素在制备预防和治疗结肠炎相关结肠癌炎症药物中的应用。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述五味子乙素的用量为15~30mg/kg体重。
6.如权利要求1所述的应用,其特征在于药物剂型为下列之一:①片剂、②胶囊剂、③颗粒剂、④缓释剂或⑤靶向制。
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