CN104788391A - 肉桂酰中性红酰胺(ca-pz)及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂及其应用，所述抑制剂为肉桂酰中性红酰胺化合物(CA-PZ)，实验研究结果表明，CA-PZ通过巨胞饮大量进入细胞，发挥HDAC抑制作用，有望成为一种具有开发价值与前景的抗肿瘤药物。

Description

肉桂酰中性红酰胺(CA-PZ)及其制备与应用
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种新的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂及其应用。
背景技术：
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂作为抗癌药物，是具有潜在治疗作用的一种新兴类别。目前，两个HDACIs-伏立诺他(辛二酰苯胺异羟肟酸，ZOLINZA)和缩肽(罗米地辛，ISTODAX)已获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准用于治疗难治性皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，以及缩酚酸肽获得FDA批准用于治疗外周T细胞淋巴瘤(PTCL)。HDAC的失调可以改变表型和基因表达，干扰体内平衡并有助于肿瘤增长。HDAC抑制剂家族是庞大的，并且是多样化的。目前已确定18种哺乳动物的HDAC，这些亚型通常在细胞核内表达。虽然组蛋白广泛代表它们的主要靶点，但是这些亚型还是显示出组织特异性分布，并在细胞核和细胞质之间穿梭。
此外，在已知的内吞作用路线中，巨胞饮为进入细胞提供了一个有趣的途径，由于它是一种大量摄取的形式，因而可以有效地吸收和内化靶向药物。通过巨胞饮内化基于抗体的靶向疗法，可能对多种人类癌症提供额外的肿瘤特异性。已发现膜皱褶形成、巨胞饮和细胞迁移都是在HDAC6-缺损的细胞中受损。相反，HDAC6水平升高则促进膜皱褶形成，伴随巨胞饮和能动性增加。
另一方面，HDAC抑制剂的毒性主要表现在腹泻、骨髓抑制和心脏QT间期持久性的副作用。大部分HDAC抑制剂在血浆中的半衰期是2-8小时并将发生肝代谢和随后的肠排泄。由于存在的毒副作用，HDAC抑制剂的广泛应用仍然受到限制。因此，寻找新的具有良好作用同时毒性较低的HDAC抑制剂已经成为当务之急。
肉桂酸(Cinnamic acid，tCA)，属肉桂的成分(樟科属)，具有广谱的生物活性，包括抗氧化、抗炎和抗癌等特性。肉桂酸显示对黑色素瘤细胞与肺癌细胞有抗增殖活性。有研究发现，肉桂酸本身针对黑色素瘤细胞和成胶质细胞瘤等可抑制细胞增殖。
在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红(NR)并向液泡中排泌。由于液泡在一般情况下呈酸性反应，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，所以中性红溶液用于细胞中液泡的染色，可以鉴定细胞的存活情况。
本实验室利用中性红的这一特性与肉桂酸缩合，制备形成新的化合物肉桂酰中性红酰胺(CA-PZ)，通过中性红的氨基与肉桂酸的羰基连接，可以将肉桂酸更多地带进细胞，以发挥其抗肿瘤作用，并验证其是否与巨胞饮和HDAC有关联。
本发明所涉及的化合物是经大胆设想，利用中性红将含羰基的肉桂酸有效成分更多地带入细胞，惊喜地发现所述化合物具有良好的抗肿瘤作用，几乎无毒副作用，并且是通过巨胞饮大量进入细胞内，从而抑制靶点位于胞内的HDAC发挥作用，有望成为一种具有抗肿瘤作用及开发价值的HDAC抑制剂。本发明所述CA-PZ在制备抗肿瘤药物中的应用，迄今尚未见有相关报道。
本发明的目的之一是，提供一种肉桂酰中性红酰胺CA-PZ化合物；
本发明的目的之二是，提供所述化合物CA-PZ的制备方法；
本发明的目的之三是，提供所述化合物CA-PZ在肿瘤治疗中的应用。
发明内容：
本发明提供了式(1)所示的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物：
所述的CA-PZ是一种紫红色结晶状物质，分子式为C24H22N4O，分子量为382，其特征是，肉桂酸的羰基和中性红的氨基缩合，形成稳定的酰胺结构。HPLC检测在11.773分钟出现吸收峰，峰高为403207，曲线下面积百分比为95.413％。式(1)所述化合物，至今尚未见其具有HDAC抑制活性的报道，也未见该化合物具有其他生物活性的报道。
本发明提供了式(1)所述化合物的制备方法，其包括以下步骤：干燥反应瓶中投入定量中性红、适量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和干燥吡啶，室温搅拌下加入相应量的肉桂酰氯，从室温开始缓缓加热升温至50-65℃进行反应，用TLC硅胶薄层60F254检测其反应终点。约48-96小时反应完毕后，将反应液减压蒸馏至干燥。余留物分别用苯、乙醚搅拌提取杂质。过滤、干燥得肉桂酰中性红酰胺粗产物。经硅胶柱层析分离纯化后，制得结晶性产物CA-PZ。经HPLC、质谱和核磁检测结果，确证为化合物CA-PZ。
本发明还提供了式(1)化合物CA-PZ在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明又提供了一种药物组合物，其包含式(1)所述化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物；可选地，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明还提供了所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所述式(1)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物或其药物组合物，可用于治疗包括实体瘤(如鳞癌、肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、纤维肉瘤等)和多种形式的白血病，包括对一种或多种其它治疗(如化疗、放疗等)抵抗或耐受的白血病和其它肿瘤。
本发明所述的式(1)化合物或含有它的药物组合物可以是任何药用剂型，例如：片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、膏剂、贴剂、滴剂、口含剂、丸剂、栓剂等。可以是普通制剂、控释制剂、缓释制剂及各种微粒给药系统。给药途径可经胃肠道或非经胃肠道，包括但不限于口服、皮肤、皮下、肌肉、腹膜或直肠等。
本发明式(1)化合物或其药物组合物的给药剂量取决于诸多因素，例如患者所要治疗疾病的严重程度和既往病史，患者的年龄、体重及个体反应，所用具体药物的活性、给药途径及给药次数等。例如，本领域的做法是，化合物的剂量水平可以从低于达到所需治疗效果的剂量水平开始，逐步增加剂量，直至达到预期的效果。一般说来，本发明式(1)化合物或其药物组合物用于哺乳动物特别是人的剂量，可以介于0.01～100mg/kg体重/天，例如介于0.1～20mg/kg体重/天。
本发明式(1)化合物还包括其溶剂合物或其药学上可接受的衍生物如任何药学上可接受的盐、酯、或该酯的盐、或任何其它加成产物或衍生物。上述化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式，前药含有其它在体内易于除去的部分而产生作为药理学活性物质的母体分子，例如在体内裂解产生所述化合物的酯。
本发明通过生物学实验研究，还提供了CA-PZ在肿瘤治疗中的应用。通过MTT方法研究发现，CA-PZ对体外培养的人结肠癌HT29细胞、胰腺癌MIAPaCa-2细胞、卵巢癌OVCAR3细胞增殖均有明显的抑制作用，并且作用均强于肉桂酸。共聚焦观察表明，CA-PZ可通过巨胞饮的方式大量进入胞内，明显强于肉桂酸，Western Blot研究发现，CA-PZ对凋亡相关蛋白Bax、Bim、Bcl-2和PARP的表达有明显的抑制作用，并且CA-PZ可上调Ac-H3和Ac-H4及p21，即抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)。已知HDAC的靶点主要分布于胞内和细胞核，说明该药物是通过巨胞饮发挥作用的HDAC抑制剂。本发明所述化合物的药效结果，为含羰基药物的化学结构改造提供了新思路。体内研究结果表明，CA-PZ对小鼠H22肝癌和HT29裸鼠移植瘤模型肿瘤生长有明显的抑制作用，并且对主要器官无明显损害。
本发明的优点与积极效果在于，CA-PZ是一种新的HDAC抑制剂，该化合物通过巨胞饮大量进入细胞，发挥HDAC抑制作用，对结肠癌裸鼠移植瘤模型有明显的抑制作用，并且对其他脏器的损害微乎其微，是一种潜在的具有开发价值的HDAC抑制剂类抗癌药物。由于工艺简单，成本低廉，符合环保要求，利于生产，从而为其尽快推上临床创造了良好条件。
附图说明：
图1-HPLC图谱
HPLC检测在11.773分钟出现吸收峰，峰高为403207，曲线下面积百分比为95.413％；
图2-ESI-MS质谱图
经ESI-MS鉴定其分子离子峰(m/z)为383.2[M+H]+，确定其分子量为382.1794，分子式为C24H22N4O；
图3-1HNMR图谱
经1HNMR鉴定其主要峰群的H数量，确定其分子量为382.1794，分子式为C24H22N4O；
图4-CA-PZ抑制多种细胞增殖
CA-PZ在HT29、OVCAR-3、MIA PaCa-2和L02细胞的IC50值分别是121.6±9.6、186.9±3.0、292.9±10.7和1152.8±31.3μM，而tCA的IC50值均大于500μM；
表明CA-PZ对HT29细胞最敏感，对正常细胞L02作用较弱，选择性良好；
图5-CA-PZ对凋亡相关蛋白影响的Western Blot图
其中：3.125、6.25、12.5、25、50、100-CA-PZ的剂量、单位μmol/L；
A：Bcl-2随CA-PZ剂量增加降低；Bax、Bim随剂量增加而提高；B：靠上方的PARP蛋白表达水平下降及下方的Cleaved PARP表达增加；表明CA-PZ在体外可诱导凋亡；
图6-CA-PZ的细胞摄取荧光图
其中：EIPA(5-(N-Ethyl-N-isopropyl)Amiloride，5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利)为巨胞饮的特异性抑制剂；表明CA-PZ通过巨胞饮大量进入细胞，与中性红类似；
图7-CA-PZ对HDAC相关蛋白影响的Western Blot图
其中：3.125、6.25、12.5、25、50、100-CA-PZ的剂量、单位μmol/L；Ac-H3、Ac-H4和p21-蛋白表达水平随浓度的增加而增加；表明CA-PZ可抑制HDAC；
图8-CA-PZ对人结肠癌HT29裸鼠异种移植瘤的抗肿瘤疗效图
1.0和1.5mmol/kg的CA-PZ和1.0mmol/kg的tCA通过灌胃，在细胞接种1周开始，每周3次，共给药两周，持续35天；A：在不同组的HT29裸鼠移植瘤的生长曲线(n＝6组)，治疗后每3天测量肿瘤体积，零代表第一次给药量，CA-PZ相比对照组，肿瘤体积抑制肿瘤生长的比率分别为52.6％(P＜0.05)和58.8％(P＜0.01)，而1.0mmol/kg的tCA是37.1％；CA-PZ治疗组与对照组之间有显著差异(*P＜0.05；**P＜0.01)；B：对照组和CA-PZ、tCA给药组在35天内的体重变化曲线图，每3天测量一次，直至实验终结；
图9-CA-PZ处理组(1.5mmol/kg)和对照组在HT29裸鼠肿瘤的HE染色图
其中：A1和A2，心脏；B1和B2，肝脏；C1和C2，肺；D1和D2，肾脏；E1和E2，大肠；F1和F2，股骨髓；均没有明显改变。
具体实施方式：
以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
《实施例一》化合物CA-PZ的合成及制备
步骤：中性红(NR)去除氯离子，将4克中性红溶于200毫升无水甲醇后，追加4毫升三乙胺，于50℃水浴锅中减压旋蒸，再加50毫升无水苯减压旋蒸至干燥。余留物再放入真空干燥器中60℃干燥6-8小时后，称量为5克，即每1克中性红增加0.25克重量。原因是生成Et3N·Hcl(三乙胺盐酸盐).向500毫升容积的三颈瓶中投入3.9克中性红，350毫升DMF温热搅拌溶解，再加入8毫升吡啶。室温搅拌下，分次加入5.62克肉桂酰氯，待反应2-8小时后缓缓加热升温至58-61℃，TLC跟踪检测反应终点，共计约24-96小时。
将反应液转移入蒸馏瓶，50℃水浴锅中减压旋蒸，最后加入100毫升1，4-二氧六环旋蒸一次。余留物加60毫升无水苯，温热旋摇提取一次，放置片刻后，倾出上层苯清液。
苯提取后的粗产物用30毫升苯和60毫升乙醚电磁搅拌室温提取一次后，抽滤，乙醚冲洗后晾干，再放入干燥器中60℃干燥2-4小时，称量为7.664克。将7.664克粗品溶于100毫升无水甲醇后，加入15克硅胶。50℃水浴锅中减压旋蒸干燥。再加入50毫升苯带蒸一次至全干。
取出粗品的硅胶混合物放入干燥器中真空干燥4小时后，再碾磨成细粉装柱。
柱层析溶剂系统：
1号系统乙酸乙酯：苯：甲醇(EA:Beng:MeOH 3:2:0.5)，2号系统EA:Beng:MeOH(3:1:0.6)，3号系统EA:Beng:MeOH(3:1:3)。提取过程：1、2号系统洗脱液为浅红，TLC显示主斑与中红主斑相似，另外主斑上下端有小杂斑，故收集液全部倒掉。3号系统洗脱液为蓝紫色，TLC显示一个蓝紫色主斑，Rf值0.55≧NR-Rf:0.42，主斑下端有一个小红色斑与中性红相似。
收集全部3号系统洗脱液，50℃水浴锅中减压旋蒸干燥，余留物加60毫升苯温热提取一次，TLC显示可除去部分杂质。倾出上层苯清液后，再加入30毫升苯和60毫升无水乙醚，电磁搅拌1小时后，抽滤，乙醚冲洗，晾干后放入真空干燥箱中60℃干燥2小时后，取出称量5.706克。HPLC检测。
TLC检测：EA:Beng:MeOH(2:3:1)CA-PZ呈一个蓝紫色斑，无明显杂质斑，Rf＝0.55。HPLC检测含量：84.51％，保留值：8.897，图1。第二次柱层析纯化，直至纯度达96％。经ESI-MS鉴定其分子离子峰(m/z)为383.2[M+H]+，确定其分子量为382.1794，分子式为C24H22N4O，图2。经1HNMR鉴定其主要峰群的H数量，确定其分子量为382.1794，分子式为C24H22N4O，图3。
《实施例二》CA-PZ对培养细胞的细胞毒作用
MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测CA-PZ对培养细胞的细胞毒活性。人正常肝L02细胞，人结肠癌HT29细胞，人卵巢癌OVCAR-3细胞，用含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素的RPMI-1640培养基(Gibco BRL Inc.)在37℃含5％CO2的培养箱中培养。人胰腺癌MIA PaCa-2细胞用含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素的DMEM培养基(Gibco BRL Inc.)在37℃含5％CO2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞消化计数，按4 000个细胞/孔铺于96孔板，培养24小时后，加入不同浓度的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养48小时后，每孔加入以PBS溶解的MTT(5mg/mL)20μL，37℃继续培养4小时后，吸弃上清，加入150μL二甲基亚砜，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪上测定570nm的光吸收值A。每次实验均设无药对照孔和无细胞空白孔各3孔。按公式：抑制率％＝(A对照组－A给药组)/(A对照组－A空白组)×100％计算药物对细胞的增殖抑制率并计算半数抑制浓度(IC50)。结果如图4所示，CA-PZ对HT29、OVCAR-3、MIAPaCa-2的肿瘤细胞的IC50值分别是121.6±9.6、186.9±3.0、292.9±10.7μM；正常细胞L02不敏感，IC50值为1152.8±31.3μM。
《实施例三》Western blot检测凋亡相关蛋白
制备蛋白：取加药后孵育的细胞置于冰上，弃掉上清，并用冷PBS冲洗3次，吸净液体，加入新鲜配制的细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mM Na3VO4；1mM NaF，临用时加入3种蛋白酶抑制剂(1mg/ml aprotinin；1mg/ml leupeptin；1mg/ml PMSF)，使细胞与裂解液充分混合，4℃充分裂解30min后，4℃16000rpm离心15min，收集上清于新的微量EP管中，用BCATM Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白含量。按照试剂盒说明书进行操作，准备一系列不同浓度的BSA蛋白标准品(0-2000μg/ml)，根据待检测样品的数量配制工作液(Reagent A:B＝50:1)。96孔板中加入工作液(200μL/孔)，依次加入BSA蛋白标准品和待测样品，混匀，每个浓度设置(2-3)个复孔，37℃孵育30min，于562nm处测定光吸收值，绘制标准曲线，计算样品蛋白含量。
蛋白变性：将20μL上清与5μL 5×上样缓冲液混匀，100℃加热5min使蛋白变性。变性后样品可储存于-80℃。分次使用，一般限于半年内使用。
制胶
1)12％分离胶
2)灌胶前用清洁剂、清水洗净、晾干并安装好所用的玻璃板，检查其密闭性。根据所测得的蛋白分子量大小选择合适的浓度配置分离胶，快速将丙烯酰胺溶液灌注到两玻璃板间，留出一定空间用双蒸水封胶，以隔绝空气。
3)室温放置，当凝胶与双蒸水之间出现一条清晰的直线时，表示凝胶已聚合。
4)倒掉上层双蒸水，用滤纸吸干凝胶表面的水分。室温较低时，可用风机加热以加速凝固。
5)制备5％浓缩胶
将上述混合液迅速灌满两玻璃板间的空隙，至短玻璃板的顶端，快速插入梳子，室温放置，30min左右聚合。
电泳
1)将凝胶放置到电泳槽内，加入电泳液并拔出梳子。
2)按顺序加入样品，每孔上50μg蛋白。
3)80V恒压电泳30min左右，待溴酚蓝迁移出浓缩胶提高电压到100V电泳，大约3h，电泳分离各自目的蛋白。
转膜
1)电泳后根据预染Marker的位置，判断目的蛋白在胶上的位置，在合适范围内将胶切下，在转移Buffer中浸泡至少10min，先用甲醇活化PVDF膜，然后与滤纸和海绵一起浸泡到转膜液中。
2)按照负极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-正极的顺序放置，并用玻璃棒
赶走中间的气泡。
3)夹好夹子，放入转膜槽，倒满转膜液
4)在冰浴中，250mA转移90min。
5)取出PVDF膜，丽春红染色，去离子水漂洗。
免疫反应
1)封闭：将PVDF膜放到TBTS溶解的5％的脱脂奶粉中，室温下缓慢摇动1h
2)孵一抗：将PVDF膜放到杂交袋中，加入Bax(1:1000)，Bcl-2(1:1000)，PARP(1:1000)，Actin(1:5000)等相应抗体，4℃过夜。
3)室温下在摇床上用TBST洗涤5min×4次。
4)孵二抗：加入辣根过氧化物标记的羊抗鼠IgG(1:10000)和羊抗兔IgG(1:10000)37℃摇床孵育1h。
6)TBST洗涤条带10min×4次
ECL将化学发光剂和增强剂按1:1混合后，滴加到PVDF膜上，捕获图像。
凝胶成像：X光片扫描，应用Gel-Pro analyzer 4图像分析软件对条带灰度进行半定量分析。比较各组的积分光密度值，以β-actin为内参。抗体的稀释比例按照说明书进行。
Western blot结果(图5)表明Bcl-2随CA-PZ剂量增加降低；Bax、Bim随剂量增加而提高；PARP蛋白表达水平下降及Cleaved PARP表达增加；表明CA-PZ在体外可诱导凋亡；
《实施例四》巨胞饮的形态学观察
细胞以适量密度种植在Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II腔室玻片上。种植后24h待细胞完全贴壁后，细胞血清饥饿12h，然后加入CA-PZ、NR和tCA孵育24h，随后，用冷PBS冲洗细胞三次并立即用4％的多聚甲醛固定10分钟，弃掉液体并继续用冷PBS冲洗三次，加入适量PBS。利用共聚焦显微镜观察并拍摄图像。由于CA-PZ和NR有自发荧光，因此不用使用特殊荧光标记即可观察到进入细胞的情况。结果见图6。
CA-PZ和NR具有非常明显的红色荧光，均位于胞内，并且在加入巨胞饮抑制剂EIPA后红色荧光明显变少，表明未大量进入胞内，从而表明CA-PZ通过巨胞饮大量进入细胞，与NR类似；
《实施例五》Western blot检测HDAC相关蛋白
制备蛋白：取加药后孵育的细胞置于冰上，弃掉上清，并用冷PBS冲洗3次，吸净液体，加入新鲜配制的细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mM Na3VO4；1mM NaF，临用时加入3种蛋白酶抑制剂(1mg/ml aprotinin；1mg/ml leupeptin；1mg/ml PMSF)，使细胞与裂解液充分混合，4℃充分裂解30min后，4℃16000rpm离心15min，收集上清于新的微量EP管中，用BCATM Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白含量。按照试剂盒说明书进行操作，准备一系列不同浓度的BSA蛋白标准品(0-2000μg/ml)，根据待检测样品的数量配制工作液(Reagent A:B＝50:1)。96孔板中加入工作液(200μL/孔)，依次加入BSA蛋白标准品和待测样品，混匀，每个浓度设置(2-3)个复孔，37℃孵育30min，于562nm处测定光吸收值，绘制标准曲线，计算样品蛋白含量。
蛋白变性：将20μL上清与5μL 5×上样缓冲液混匀，100℃加热5min使蛋白变性。变性后样品可储存于-80℃。分次使用，一般限于半年内使用。
制胶
1)12％分离胶
2)灌胶前用清洁剂、清水洗净、晾干并安装好所用的玻璃板，检查其密闭性。根据所测得的蛋白分子量大小选择合适的浓度配置分离胶，快速将丙烯酰胺溶液灌注到两玻璃板间，留出一定空间用双蒸水封胶，以隔绝空气。
3)室温放置，当凝胶与双蒸水之间出现一条清晰的直线时，表示凝胶已聚合。
4)倒掉上层双蒸水，用滤纸吸干凝胶表面的水分。室温较低时，可用风机加热以加速凝固。
5)制备5％浓缩胶
将上述混合液迅速灌满两玻璃板间的空隙，至短玻璃板的顶端，快速插入梳子，室温放置，30min左右聚合。
电泳
1)将凝胶放置到电泳槽内，加入电泳液并拔出梳子。
2)按顺序加入样品，每孔上50μg蛋白。
3)80V恒压电泳30min左右，待溴酚蓝迁移出浓缩胶提高电压到100V电泳，大约3h，电泳分离各自目的蛋白。
转膜
1)电泳后根据预染Marker的位置，判断目的蛋白在胶上的位置，在合适范围内将胶切下，在转移Buffer中浸泡至少10min，先用甲醇活化PVDF膜，然后与滤纸和海绵一起浸泡到转膜液中。
2)按照负极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-正极的顺序放置，并用玻璃棒
赶走中间的气泡。
3)夹好夹子，放入转膜槽，倒满转膜液
4)在冰浴中，250mA转移90min。
5)取出PVDF膜，丽春红染色，去离子水漂洗。
免疫反应
1)封闭：将PVDF膜放到TBTS溶解的5％的脱脂奶粉中，室温下缓慢摇动1h
2)孵一抗：将PVDF膜放到杂交袋中，加入Ac-H3(1:1000)，Ac-H4(1:1000)，p21(1:1000)，Actin(1:5000)等相应抗体，4℃过夜。
3)室温下在摇床上用TBST洗涤5min×4次。
4)孵二抗：加入辣根过氧化物标记的羊抗鼠IgG(1:10000)和羊抗兔IgG(1:10000)37℃摇床孵育1h。
6)TBST洗涤条带10min×4次
ECL将化学发光剂和增强剂按1:1混合后，滴加到PVDF膜上，捕获图像。
凝胶成像：X光片扫描，应用Gel-Pro analyzer 4图像分析软件对条带灰度进行半定量分析。比较各组的积分光密度值，以β-actin为内参。抗体的稀释比例按照说明书进行。
Western blot结果(图7)表明Ac-H3、Ac-H4和p21-蛋白表达水平随浓度的增加而增加；表明CA-PZ可抑制HDAC；
《实施例六》CA-PZ的动物实验治疗方案。
运用人结肠癌HT29异种移植瘤模型评价CA-PZ的体内疗效。结肠癌HT29细胞(1×107)在200μL无菌生理盐水中悬浮并皮下注射裸鼠右腋窝进行接种。大约3个星期后，供体动物的肿瘤进行无菌解剖，切成2×3mm大小的碎块。然后，采用无菌皮下针把肿瘤组织块移植至裸鼠。HT29瘤块接种一周后用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和肿瘤短径(b)，根据肿瘤体积计算公式V＝0.5a×b2，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积大小，把裸小鼠随机分组。当肿瘤体积达到约100mm3时，对小鼠进行随机分组(n＝6)。用不同剂量的CA-PZ(1.0mmol/kg和1.5mmol/kg)的治疗组和对照组。CA-PZ采用灌胃法给药，每周3次，共给药6次。观察期为接种后35天，处死，称体重，剥离肿瘤称瘤重。在实验过程中，每2天测量HT29裸鼠的最长径和垂直短径，并进行体积计算和统计分析。肿瘤体积是由下面的公式估算的：V＝0.5a×b2，其中a和b分别代表肿瘤的长、短径。期间观察小鼠的营养状况和活动情况。实验结果(图8)表明，CA-PZ可显著抑制肿瘤的生长，1.0和1.5mmol/kg的CA-PZ相比对照组，肿瘤体积抑制肿瘤生长的比率分别为52.6％(P＜0.05)和58.8％(P＜0.01)，而1.0mmol/kg的肉桂酸(tCA)是37.1％。所有处理组的动物没有明显的体重下降或行为的异常，说明小鼠能较好的耐受这一剂量的药物。
《实施例七》苏木素-伊红(H&E)染色
病理切片制备
将观察结束的裸鼠处死，取出瘤块及心、肝、脾、肺、肾、股骨、小肠和大肠等器官切成组织片固定，依次放入75％、80％、85％、90％酒精中各2h，95％酒精过夜，无水乙醇脱水2h，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，在LeicaRM2315切片机上制备(4-5)μm石蜡切片。
苏木素-伊红(H&E)染色
脱蜡处理。主要步骤为：二甲苯I 3-5min，二甲苯II 3-5min，100％乙醇3min，95％乙醇3min，80％乙醇3min，自来水洗去乙醇，再过蒸馏水。
H&E染色。取水化切片，苏木素染色5min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精分色，自来水返蓝；伊红染色2min，蒸馏水冲洗，常规脱水透明；中性树胶封片。光镜下观察瘤块及心、肝、脾、肺、肾、股骨、小肠和大肠等组织病理学改变。结果见图9。说明CA-PZ处理组(1.5mmol/kg)和对照组在HT29裸鼠肿瘤的心、肝、肺、肾、大肠和股骨髓等均没有明显改变。

Claims (8)

1.一种肉桂酰中性红酰胺CA-PZ化合物或其溶剂合物，其结构如式(1)所示：
所述化合物或其溶剂合物是一种紫红色结晶状物质，分子式为C24H22N4O，分子量为382，系肉桂酸的酰氯与中性红的氨基缩合形成的稳定酰胺结构。
2.权利要求1所述化合物或其溶剂合物，其特征是，它由式(1)化合物与溶剂乙醇或甲醇按照化学式1:1-1:5组成，溶剂合物可以固体或液体形式存在。
3.制备权利要求1所述化合物或其溶剂合物的方法，其基本步骤是：向干燥反应瓶中投入定量中性红，溶于甲醇，适量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和干燥吡啶，室温搅拌下加入相应量的肉桂酰氯，从室温开始缓缓加热升温至50-65℃进行反应，用TLC硅胶薄层60F254检测其反应终点，约48-96小时反应完毕后，干燥得肉桂酰中性红酰胺粗产物，经硅胶柱层析分离纯化后，制得结晶性产物CA-PZ，经HPLC检测纯度及质谱和核磁检测，确证为CA-PZ。
4.权利要求1所示化合物或其溶剂合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种抗肿瘤药物组合物，其特征是，所述组合物含有0.1-99.5％重量的式(1)化合物或其溶剂合物与药学上可接受的载体。
6.权利要求5所述的药物组合物，其使用剂型包括片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、膏剂、贴剂、滴剂、口含剂、丸剂或栓剂。
7.权利要求5所述的药物组合物，其辅料选自药学上常用的一种或多种填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或矫味剂。
8.权利要求5、6或7中任一项所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110156703A (zh) * 2019-05-21 2019-08-23 中国药科大学 作为TrxR1抑制剂的吩嗪衍生物、中间产物及其制备方法和用途
KR20200131515A (ko) * 2019-05-14 2020-11-24 성균관대학교산학협력단 Usp4 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003087066A1 (en) * 2002-04-11 2003-10-23 Sk Chemicals, Co., Ltd. α,β-UNSATURATED HYDROXAMIC ACID DERIVATIVES AND THEIR USE AS HISTONE DEACETYLASE INHIBITORS
CN1787999A (zh) * 2003-03-17 2006-06-14 塔克达圣地亚哥公司 组蛋白脱乙酰基酶抑制剂
CN100566711C (zh) * 2002-04-15 2009-12-09 斯隆-凯特林癌症研究院 治疗癌症的化合物及其用途
CN101857554A (zh) * 2009-04-03 2010-10-13 彦臣生技药品股份有限公司 抑制组蛋白去乙酰化酶的肉桂化合物和其衍生物
CN104136410A (zh) * 2011-12-29 2014-11-05 药品循环公司 作为组蛋白脱乙酰酶8抑制剂的肉桂酸羟基酰胺

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003087066A1 (en) * 2002-04-11 2003-10-23 Sk Chemicals, Co., Ltd. α,β-UNSATURATED HYDROXAMIC ACID DERIVATIVES AND THEIR USE AS HISTONE DEACETYLASE INHIBITORS
CN100566711C (zh) * 2002-04-15 2009-12-09 斯隆-凯特林癌症研究院 治疗癌症的化合物及其用途
CN1787999A (zh) * 2003-03-17 2006-06-14 塔克达圣地亚哥公司 组蛋白脱乙酰基酶抑制剂
CN101857554A (zh) * 2009-04-03 2010-10-13 彦臣生技药品股份有限公司 抑制组蛋白去乙酰化酶的肉桂化合物和其衍生物
CN104136410A (zh) * 2011-12-29 2014-11-05 药品循环公司 作为组蛋白脱乙酰酶8抑制剂的肉桂酸羟基酰胺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CA: "353510-83-5/RN", 《DATABASE CA [ONLINE]》 *
王国红,等.: "肉桂酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和分化的影响", 《中国药理学通报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200131515A (ko) * 2019-05-14 2020-11-24 성균관대학교산학협력단 Usp4 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR102313342B1 (ko) 2019-05-14 2021-10-18 성균관대학교산학협력단 Usp4 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
CN110156703A (zh) * 2019-05-21 2019-08-23 中国药科大学 作为TrxR1抑制剂的吩嗪衍生物、中间产物及其制备方法和用途
CN110156703B (zh) * 2019-05-21 2022-08-05 中国药科大学 作为TrxR1抑制剂的吩嗪衍生物、中间产物及其制备方法和用途

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