CN104736712A - 用于生成植物的荧光激活细胞分选(facs)富集 - Google Patents
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Abstract
描述了一种工程化转基因整合平台(ETIP)，它能在植物基因组中随机地或在靶定位置处插入，从而推动快速选择和检测完美靶定(3'和5'端二者)在ETIP基因组位置处的GOI。本发明中的一个要件是在ETIP内引入特定双链断裂。在一些实施方案中，描述了一种ETIP，它使用锌指核酸酶结合位点，但是可利用其它靶向技术，诸如大范围核酸酶、TAL、CRISPR、或亮氨酸拉链。还描述了转基因植物的组合物和用于生成转基因植物的方法，其中供体或有效载荷DNA表达稳定整合入植物细胞中ETIP的外源核酸序列的一种或多种产物(例如蛋白质或RNA)。在多个实施方案中，从构思贯穿开发阶段，ETIP推动测试基因候选和植物表达载体。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月7日提交的、流水号61/697,890的美国临时专利申请的优先权。
发明领域
本公开文本涉及用于生成植物的荧光激活细胞分选的领域。在一个优选实施方案中，本公开文本描述了用于生成可繁殖的、经过编辑的植物的经过编辑的、可再生的原生质体的FACS富集。
发明背景
荧光激活细胞分选仪(FACS)是由Bonner、Sweet、Hulett、Herzenberg、及其他人在二十世纪六十年代晚期发明的，用于进行可存活细胞的细胞分选和流式细胞计量术。Becton Dickinson免疫细胞计量术系统在二十世纪七十年代早期引入商业性机器。荧光激活细胞分选(FACS)是一种专门化类型的流式细胞计量术。它提供一种方法，基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物学细胞的异质混合物分选入两个或更多个容器，一次一个细胞。它是一种有用的科学仪器，因为它提供来自细胞个体的荧光信号的快速、客观且定量记录以及有特定兴趣的细胞的物理分出。
细胞悬浮液在较窄、快速流动的液体流的中央带走。流动是安排好的，使得细胞之间相对于它们的直径有较大的分开。振荡机制引起细胞流断成各个小滴。调节系统，使得每个小滴超过一个细胞的概率较低。刚好在液流断成小滴之前，流动穿过荧光测量站，在那里测量每个细胞的感兴趣荧光特征。将一个充电环恰好放置在液流断成小滴的点。根据刚刚之前的荧光强度测量，在环上放置一个电荷，并在自液流断成小滴时在小滴上捕获相反的电荷。然后，带电荷的小滴落入、穿过静电偏转系统，该系统根据小滴的电荷将它们转向入容器。在一些系统中，将电荷直接应用液流，而且小滴中断保留与液流相同符号的电荷。然后，在小滴中断后，液流恢复中性。
较宽范围的荧光团可用作流式细胞计量术中的标记物。通常将荧光团(或简称“fluor”)附着于识别细胞上或细胞中的靶特征的抗体；也可以将它们附着于对细胞膜或其它细胞结构具有亲和力的化学实体。每种荧光团具有特征性的峰激发和发射波长，而且发射谱常常交叠。因而，可使用的标记物的组合取决于用于激发荧光染料的灯或激光的波长及可用的检测仪。
荧光激活细胞分选(FACS)提供自细胞的异质混合物分离大数目荧光标记细胞的一种快速手段。具有荧光标志物基因诸如绿色荧光蛋白(GFP)的细胞类型特异性表达的转基因植物的收集理想地适合于各种细胞类型的FACS辅助研究。
已经证明植物原生质体的流式细胞计量术分析和荧光激活细胞分选(FACS)是可实施的，而且，这种技术已经在许多不同研究领域产生有价值的结果(Harkins and Galbraith,1984；Galbraith et al.,1995；Sheen et al.,1995)。例如，来自表达组织特异性荧光蛋白标志物的拟南芥植物的原生质体的FACS已经用于检查特定细胞类型中的基础和环境刺激的转录谱二者(Birnbaum et al.,2003；Brady et al.,2007；Gifford et al.,2008；Dinneny et al.,2008)，而且流式细胞计量术已经用于分析烟草原生质体中的反应性氧种类生成和程序性细胞死亡(Nicotiana tabacum；Lin et al.，2006)。有较宽选集的荧光工具可用于研究植物中的众多生理学参数，例如，与荧光蛋白融合的顺式调节元件(Haseloff and Siemering,2006)、遗传编码的分子传感器(Looger etal.,2005)或基于染料的传感器(Haugland,2002)可以与细胞计量术组合用于测量多种多样的生物学过程。然而，由于测定法的灵敏度，这种方法有某些无效，因此仍有改进的空间。
发明概述
本公开文本的一个特定实施方案涉及一种通过利用目的多核苷酸分离植物原生质体、自一群植物细胞生成植物的方法，该方法通过下述步骤来进行：提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体，其中该群基本上没有包含荧光标志物且不包含目的多核苷酸的植物原生质体；其中该植物原生质体由藻酸钠封装；自该群中的其余植物原生质体分出至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体，由此分离包含目的多核苷酸的植物原生质体；自所述分离的植物原生质体再生植物；并培养所述植物。
在本发明的另一个实施方案中，可以是通过分离包含整合入植物原生质体基因组的目的多核苷酸的植物原生质体而再生的植物，这通过下述步骤来进行：提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体；其中该植物原生质体由藻酸钠封装；自该群包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体回收微愈伤组织，其中该至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体已经用目的多核苷酸和编码荧光标志物的多核苷酸转化；自所述微愈伤组织再生植物；并培养所述植物。
备选实施方案包括用于生成转基因植物的方法，该方法可包括提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体，其中该至少一个原生质体包含位点特异性核酸酶，使得目的多核苷酸能够通过位点特异性核酸酶的识别位点处的同源重组整合在至少一个植物原生质体的基因组中且其中该植物原生质体由藻酸钠封装；自该群中的其余植物原生质体分出至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体；自至少一个原生质体再生转基因植物；并培养所述转基因植物。
根据下述数个实施方案的详细描述，上述和其它特征会变得更加明显，这参照附图进行。
附图简述
图1A-1E：显示FAD2基因序列的序列比对，这是使用生成的。
图2：显示FAD2基因序列的系统发生树，这是使用v2.3基于邻居连接距离生成的。
图3A-3M’：显示FAD3基因序列的序列比对，这是使用生成的。
图4：显示FAD3基因序列的系统发生树，这是使用v2.3基于邻居连接距离生成的。标记的序列对应下述各项：FAD3A’/A”贯穿本申请描述为FAD3A’；单元型2贯穿本申请描述为FAD3C’；单元型1贯穿本申请描述为FAD3C”；和，单元型3贯穿本申请描述为FAD3A”。
图5：显示pDAB104010的质粒图，它是一种代表性锌指核酸酶表达盒。这种构建物的布局对其它ZFN表达盒是相似的，其中锌指域(24828和24829)与上文描述的备选锌指域交换。
图6：是一幅例示性多线图，显示每10,000个序列读出中在靶ZFN位点处具有删除的序列读出的数目。图上的X轴表示删除的碱基的数目，Y轴表示序列读出的数目，而Z轴表示颜色编码的样品身份，如图右边描述的。显示的具体例子是含有3个靶ZFN位点(A、B和C)的FAD2基因家族基因座1的，评估四个基因家族成员和两个对照转染(作为对照样品A和B)。
图7：(A)图轴的详情如图6。该图展示来自靶向FAD2基因家族基因座4的ZFN的数据。该基因座含有两个ZFN位点和两个必需的对照转染。图7：(B)ZFN靶位点周围的具体序列背景(SEQ ID NO:471-480)，鉴定含有C、T和G的三核苷酸重复的FAD2A和C，导致经由FAD2A和C基因座测序观察到的单碱基删除增多。
图8：显示pDAS000130的质粒图。
图9：显示pDAS000271的质粒图。
图10：显示pDAS000272的质粒图。
图11：显示pDAS000273的质粒图。
图12：显示pDAS000274的质粒图。
图13：显示pDAS000275的质粒图。
图14：显示pDAS000031的质粒图。
图15：显示pDAS000036的质粒图。
图16：显示pDAS000037的质粒图。
图17：图示一种ETIP和有效载荷核酸构造，以及植物细胞基因组中ETIP位点处的靶定有效载荷的产物。
图18：图示原生质体的转化，接着是使用3'和5'端二者处的截短型可评分和可选择标志物的重建，宿主系中ETIP处的靶定有效载荷DNA的FACS选择。
图19A和19B：图示ETIP芸苔事件的同源性定向修复，其源自锌指核酸酶(pDAS000074或pDAS000075)对基因组基因座的双链DNA切割及后续的Ds-red供体(pDAS000068、pDAS000070、或pDAS000072)进入芸苔染色体ETIP基因座的整合。供体整合入基因组基因座产生完全功能性、高表达Ds-red转基因。
图20：显示芸苔原生质体的FACS分选和用pDAS000031(“pDAS31”)转染的芸苔原生质体的计算转染效率。另外，提供未转化芸苔原生质体的FACS分选结果作为阴性对照。
图21：显示芸苔原生质体的FACS分选和用pDAS000064/pDAS000074(顶部图)和pDAS000064/pDAS000075(底部图)转染的芸苔ETIP原生质体事件的计算转染效率。
图22：显示芸苔原生质体的FACS分选和用pDAS000068/pDAS000074(顶部图)和pDAS000068/pDAS000075(底部图)转化的芸苔ETIP原生质体事件的计算转染效率。
图23：显示芸苔原生质体的FACS分选和用pDAS000070/pDAS000074(顶部图)和pDAS000070/pDAS000075(底部图)转化的芸苔ETIP原生质体事件的计算转染效率。
图24：显示芸苔原生质体的FACS分选和用pDAS000072/pDAS000074(顶部图)和pDAS000072/pDAS000075(底部图)转化的芸苔ETIP原生质体事件的计算转染效率。
图25：显示pDAS000074的质粒图。
图26：显示pDAS000075的质粒图。
图27：显示pDAS000064的质粒图。
图28：显示pDAS000068的质粒图。
图29：显示pDAS000070的质粒图。
图30：显示pDAS000072的质粒图。
图31：是一幅示意图，显示用于转基因拷贝数评估测定法的转基因靶引物和探针的结合位点。
图32：显示一份文件，显示FAD2A ZFN DNA识别域(bc12075_Fad2a-r272a2和bc12075_Fad2a-278a2)，和ZFN特异性引物(FAD2A.UnE.F1和FAD2A.UnE.R1)和内源引物(FAD2A/2C.RB.UnE.F1和FAD2A/2C.RB.UnE.R1)的结合位点。
图33：显示一幅示意图，显示FAD2A处经完美HDR的转基因整合的检测中使用的内源和转基因靶引物的结合位点。
图34：是一幅示意图，显示完美编辑的FAD2A基因座中会存在Kpn1限制性内切核酸位点的地方，及FAD2a 5’、hph和FAD2A 3’Southern探针结合的地方。
图35：显示Kpn1片段、FAD2A 5’、hph、FAD2A 3’探针的定位和尺寸及ETIP经HDR在FAD2A基因座处整合的植物的Southern分析的预期结果。
图36：显示来自拷贝数评估qPCR的代表性数据输出。左手柱代表自具有单一随机转基因插入物的已知T0转基因植物获得的数据，并用作校准样品，所有其它样品针对它“标准化”。右手柱是具有5处转基因整合的已知T0转基因植物。两种植物的插入物拷贝数是使用Southern分析测定的。其余柱提供推定转基因植物的拷贝数估值。柱下面的标记对应于图中的柱，而且可用于确定每种转基因植物的评估拷贝数。在使用软件评估拷贝数时，野生型植物、非转化对照植物、和仅质粒对照不产生拷贝数，因为它们不拥有hph和HMG I/Y靶二者的Cq。
发明详述
原生质体的瞬时转化是植物研究中一种广泛利用的工具，迅速且不成问题。该技术可用于例如监测启动子元件的调节、分析响应多种刺激的基因表达或酶活性、检查转录因子或信号转导级联成分的作用或研究蛋白的亚细胞定位(Sheen,2001；Yoo et al.,2007)。与一般耗时数月且要求使用转染剂(通常是根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))的植物(拟南芥(Arabidopsisthaliana)是最常用的平台)稳定转化相反，原生质体转染能在仅仅一天中实现，而且只需要粗制DNA和基于化学制品或电穿孔任一的转染方法。另外，瞬时转化分析能克服稳定过表达遭遇的问题，诸如多效发育效应或不可存活性，此时基于细胞的测定法是适宜的。然而，由于原生质体转化效率从未达到100％这一事实，结果会因非转化细胞而变得复杂。
转化效率常常较低且多变(例如Cummins et al.,2007；<10％)，而且取决于采用的方法以及使用的原生质体和DNA的特性。本发明涉及植物生物技术领域，但是可用于所有生物学目的。特别地，本发明的实施方案涉及经由流式细胞计量分选自一群异质植物细胞生成天然或转基因植物细胞系。此类植物细胞系可以是单子叶植物或双子叶植物。正如对技术人员会是显然的，本发明还使用植物细胞系来再生完整可繁殖植物。
本发明的实施方案之一涉及基于FACS的灵敏选择，其中有选出成功转化细胞的更好选择。先前报告了转化一群植物细胞诸如植物悬浮培养物常常产生具有异质和不一致表达水平的转基因培养物。本发明主要关注提供一种基于植物的系统。分离和培养单细胞的能力具有众多可能应用。例如，本文中概述的方法可用于改进涉及植物细胞培养物生产力的方法。然而，本申请对所有细胞具有广泛适用性。
本发明的实施方案包括流式细胞计量分选诸如FACS技术用于分出或分离单个即个别化原生质体(它是使用本领域已知材料和方法自一群植物细胞制备的)的用途。这些原生质体可以转化且能够1)生成荧光标志物蛋白质或多肽；2)生成期望产物；和/或3)在选择剂存在下存活。FACS的分选标准可选自包含下述各项的组：遗传背景(例如倍性、非整倍性)，突变体，转基因，基因交换产物，和荧光(自身荧光(叶绿体、代谢物)、荧光蛋白或酶介导荧光)。可使用任何荧光蛋白。可使用或不使用选择剂。
在通过流式细胞计量分选分出或分离单原生质体后，再生每个经过转化的单原生质体，直至通过共培养形成微集落(微愈伤组织)。植物来源起源不受限制，但是限于其原生质体具有再生，直至形成微集落或微愈伤组织的潜力的那些系、品种和物种。如此，本发明会适用于已经建立或会提供再生方案的所有植物品种和物种。如此，可以用已经建立或将来会提供再生方案的所有植物品种和物种实施本发明。
可以自饲养细胞材料分出或移出微集落自身，并培养，直至形成植物细胞系。
本发明的实施方案还可包括生成愈伤组织，这通过下述步骤进行：1)将微集落或微愈伤组织转移至固体培养基，并2)在至少一种选择剂存在下培养微集落或微愈伤组织，直至形成转基因愈伤组织，通过将愈伤组织转移至液体培养基，可以自转基因愈伤组织建立转基因植物细胞系。也可以通过机械手段自饲养细胞材料移出或分出微集落，即通过克隆挑取。在这种情况中，不需要选择剂，而且微集落包含的细胞不需要展示针对任何选择剂的抗性。
在一些实施方案中，细胞可构成一群异质植物细胞，它们在进行流式细胞计量分选之前是天然或非转基因细胞，而且用包含至少一种异源核酸序列(可以与功能性启动子可操作连接)的至少一种表达载体稳定或瞬时转化，其中所述至少一种异源核酸序列编码期望产物。在另外的实施方案中，至少一种异源核酸序列与至少一种功能性启动子可操作连接，其中至少一种异源核酸序列编码荧光标志物蛋白质或多肽，而且至少一种异源核酸序列编码针对选择剂的抗性或编码期望产物。另外的实施方案可包括其中的细胞可另外包含编码要在提供的转基因植物细胞系中积累的期望产物的异源核酸序列。
在其它实施方案中，可表达宿主细胞的基因组，使得可通过重组(例如同源重组或异源重组)来修饰重组蛋白或肽。
可以在前体、诱导剂、激素、稳定剂、抑制剂、RNAi/siRNA分子、信号化合物、酶和/或引发剂存在下(作为载体悬浮液的补充或替代)处理或培养建立的任何(转基因)单克隆或双克隆植物细胞系，用于生成重组蛋白或代谢物。
异源核酸可编码细菌、真菌、植物或非植物起源诸如融合蛋白、和动物起源的蛋白的基因。生成的多肽可用于生成能自其纯化、用于别处的多肽。可在本发明的方法中生成的蛋白包括异二聚体、免疫球蛋白、融合抗体和单链抗体。而且，可改变上述基因以生成特征改变的蛋白。
本发明的实施方案包括生成很多种蛋白和多肽的能力。这些实施方案还可包括用于生成至少一种选自下组的期望产物的方法：异源蛋白或多肽，次级代谢物，和标志物。该方法包括使用依照本发明建立的植物细胞系，用于生成和积累至少一种期望产物，随后自生产细胞或培养基获得或分离。
另外的方法包括生成至少一种胞外异源蛋白的方法，其包括下述步骤：1)将包含编码异源蛋白或期望产物的核苷酸序列的第一核酸稳定导入一群起始植物细胞包含的靶细胞；2)自所述植物悬浮培养物提供的植物悬浮细胞制备原生质体，其中原生质体另外转化且能够i)生成荧光标志物蛋白质或多肽，和ii)在选择剂存在下存活；3)通过对原生质体制备物进行FACS分出经过转化的单原生质体；4)再生分出的经过转化的单原生质体，直至在饲养细胞材料存在下通过共培养形成微集落或微愈伤组织；5)生成愈伤组织，这通过下述步骤进行：i)将微集落或微愈伤组织转移至固体培养基，并ii)在至少一种选择剂存在下培养微集落或微愈伤组织，直至形成转基因愈伤组织；6)通过将愈伤组织转移至液体培养基建立转基因植物细胞系；7)通过提供适宜培养条件致使或允许自核酸表达异源蛋白或期望产物；并8)自生产细胞收获积累的异源蛋白或期望产物。此类分离可以是通过完全常规的手段，而且可能需要或不需要部分或完全纯化。
每种构建物中可使用超过一种基因。可以如本文或别处所述将多种载体导入靶细胞，每种包括一种或多种编码选定的异源蛋白的核苷酸序列。这对于生成酶的多种亚基会是有用的。
荧光标志物蛋白质或多肽可以是通过荧光可检测的蛋白诸如GUS，荧光蛋白诸如GFP或DsRed，萤光素酶，等。优选地，报告物是非侵入性标志物，诸如DsRed或GFP。
本发明的技术可用于选择要培养的某些植物。目的基因的选择可以以多种方式来操作。有多种技术可用于将DNA插入植物宿主细胞。这些技术包括使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂的T-DNA转化、融合、注射、生物射弹(biolistics)(微粒轰击)、碳化硅晶须、气溶胶聚束、PEG、或电穿孔以及其它可能的方法。如果使用土壤杆菌进行转化，那么不得不将要插入的DNA克隆入特殊的质粒，即中间载体或二元载体。由于与T-DNA中的序列同源的序列，中间载体能通过同源重组整合入Ti或Ri质粒。Ti或Ri质粒还包含T-DNA转移必需的vir区。中间载体在土壤杆菌中不能复制自身。依靠辅助质粒(接合)，中间载体能转移入根瘤土壤杆菌。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌二者中能复制自身。它们包含选择标志物基因和接头或多接头，以右和左T-DNA边界区为框。它们能直接转化入土壤杆菌(Holsters,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌要包含携带vir区的质粒。vir区是T-DNA转移入植物细胞必需的。可包含另外的T-DNA。如此转化的细菌用于转化植物细胞。可以与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一起有利地培养植物外植体，用于将DNA转移入植物细胞。然后，可以在可含有选择用抗生素或杀生物剂的合适培养基中自受到感染的植物材料(例如叶片、茎段、根，还有原生质体或悬浮培养细胞)再生完整植物。然后，可以对如此获得的植物测试插入DNA的存在。在注射和电穿孔的情况中，对质粒没有特殊要求。有可能使用普通质粒，诸如例如pUC衍生物。
经过转化的细胞以通常的方式在植物中生长。它们能形成生殖细胞，并将转化的性状遗传给后代植物。此类植物可以以正常方式培养及与具有相同的转化的遗传因子或其它遗传因子的植物杂交。所得杂种个体具有相应的表型特性。
在本发明的一些优选实施方案中，自插入植物基因组的转录单元表达编码目的蛋白的基因。优选地，所述转录单元是能够稳定整合入植物基因组且能够选择表达编码该蛋白的mRNA的经过转化的植物系的重组载体。
一旦插入的DNA整合在基因组中，它在那里相对稳定(且不会再出来)。它通常含有赋予经过转化的植物细胞以针对杀生物剂或抗生素(诸如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、或氯霉素)等等的抗性的选择标志物。植物可选择标志物通常还能提供针对各种除草剂诸如草铵膦(例如PAT/bar)、草甘膦(EPSPS)、ALS抑制剂(例如咪唑啉酮、磺酰脲、三唑嘧啶、磺酰苯胺、等)、溴苯腈、HPPD抑制剂抗性、PPO抑制剂、ACC酶抑制剂、等等的抗性。个别采用的标志物应当相应允许选择经过转化的细胞而非不含插入DNA的细胞。目的基因优选在植物细胞中通过组成性或诱导性启动子表达。一旦表达，mRNA翻译成蛋白质，由此将目的氨基酸掺入蛋白质。编码在植物细胞中表达的蛋白质的基因可以在组成性启动子、组织特异性启动子、或诱导性启动子控制下。
存在数种技术用于将外来重组载体导入植物细胞，及用于获得稳定维持并表达导入的基因的植物。此类技术包括将包被到微粒上的遗传材料直接导入细胞(美国专利No.4,945,050，Cornell和5,141,131，DowElanco，现在的DowAgroSciences,LLC)。另外，可使用土壤杆菌技术转化植物，参见美国专利No.5,177,010，University of Toledo；5,104,310，Texas A&M；欧洲专利申请0131624B1；欧洲专利申请120516，159418B1和176,112，Schilperoot；美国专利No.5,149,645，5,469,976，5,464,763和4,940,838和4,693,976，Schilperoot；欧洲专利申请116718，290799，320500，Max Planck；欧洲专利申请604662和627752，和美国专利No.5,591,616，Japan Tobacco；欧洲专利申请0267159和0292435，和美国专利No.5,231,019，Ciba Geigy，现在的Syngenta；美国专利No.5,463,174和4,762,785，Calgene；和美国专利No.5,004,863和5,159,135，Agracetus。其它转化技术包括晶须技术。参见美国专利No.5,302,523和5,464,765，Zeneca，现在的Syngenta。其它直接DNA投递转化技术包括气溶胶束技术。参见美国专利No.6,809,232。电穿孔技术也已用于转化植物。参见WO 87/06614，Boyce Thompson Institute；美国专利No.5,472,869和5,384,253，Dekalb；和WO 92/09696和WO 93/21335，Plant Genetic Systems。而且，病毒载体也可用于生成表达目的蛋白的转基因植物。例如，可以使用下述各项中记载的方法用病毒载体转化单子叶植物：美国专利No.5,569,597，Mycogen Plant Science和Ciba-Geigy(现在的Syngenta)，以及美国专利No.5,589,367和5,316,931，Biosource，现在的Large Scale Biology。
如先前提到的，将DNA构建物导入植物宿主的方式对于本发明不是至关重要的。可采用任何提供有效转化的方法。例如，本文中描述了多种用于植物细胞转化的方法，包括使用Ti或Ri质粒等等来实施土壤杆菌介导的转化。在许多情况中，会想要用于转化的构建物的两侧之一或二者以T-DNA边界为边界，更具体地是右边界。这在构建物使用根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化模式时是特别有用的，尽管T-DNA边界可以与其它转化模式一起使用。在将土壤杆菌用于植物细胞转化的情况中，可使用可导入宿主，与宿主中存在的T-DNA或Ti或Ri质粒进行同源重组的载体。可以经电穿孔、三亲交配和本领域技术人员知道的用于转化革兰氏阴性细菌的其它技术来实施载体的导入。载体转化入土壤杆菌宿主的方式对于本发明不是至关重要的。含有用于重组的T-DNA的Ti或Ri质粒可以能够或不能够引起瘿形成，而且对于本发明不是至关重要的，只要所述宿主中存在vir基因就行了。
在使用土壤杆菌进行转化的一些情况中，T-DNA边界内的表达构建物会插入广泛的载体，诸如pRK2或其衍生物，如记载于Ditta et al.(1980)和EPO 0120 515。表达构建物和T-DNA内包括的会是一种或多种本文所述标志物，其容许选择经过转化的土壤杆菌和经过转化的植物细胞。采用的具体标志物对于本发明不是至关重要的，优选的标志物取决于使用的宿主和构建物。
对于使用土壤杆菌转化植物细胞，可以将外植体与经过转化的土壤杆菌组合和温育足够时间以容许其转化。转化后，通过适宜抗生素的选择杀死土壤杆菌，并用适宜选择性培养基培养植物细胞。一旦形成愈伤组织，可依照植物组织培养和植物再生领域公知的方法通过采用适宜植物激素来促进枝条形成。然而，愈伤组织中间阶段并非总是必需的。枝条形成后，可以将所述植物细胞转移至促进根形成的培养基，由此完成植物再生。然后，可以培养植物以结籽，而且可以用所述种子建立未来的世代。不管转化技术，优选将编码细菌蛋白的基因掺入基因转移载体，通过在载体中包括植物启动子调节元件，以及3’非翻译转录终止区诸如Nos等等，基因转移载体适应在植物细胞中表达所述基因。
在众多用于转化植物的技术之外，与外来基因接触的组织的类型同样可变化。此类组织会包括但不限于胚发生组织、I、II、和III型愈伤组织、下胚轴、分生组织、根组织、用于在韧皮部中表达的组织、等等。可以使用本文中描述的适宜技术在去分化期间转化几乎所有植物组织。
如上文提到的，如果想要的话，可使用多种可选择标志物。优选的具体标志物任凭技术人员决定，但是可以与本文中未列出的、能发挥可选择标志物功能的任何其它基因一起使用任何下述可选择标志物。此类可选择标志物包括但不限于转座子Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(Aph II)，其编码针对抗生素卡那霉素、新霉素和G41的抗性；潮霉素抗性；甲氨蝶呤抗性，以及编码针对草甘膦的抗性或耐性的那些基因；膦丝菌素(双丙氨膦或草铵膦)；ALS抑制性除草剂(咪唑啉酮、磺酰脲和三唑嘧啶除草剂)，ACC酶抑制剂(例如芳基氧丙酸或环己烷二酮)，和其它，诸如溴苯腈，和HPPD抑制剂(例如甲基磺草酮)等等。
在可选择标志物以外，可能想要使用报告基因。在一些情况中，可以在有或无可选择标志物的情况中使用报告基因。报告基因指在接受者生物体或组织中通常不存在且通常编码导致一些表型变化或酶特性的蛋白的基因。此类基因的例子提供于Weising et al.,1988。优选的报告基因包括大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、来自大肠杆菌Tn9的氯霉素乙酰基转移酶基因、来自生物发光水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白、和来自萤火虫Photinus pyralis的萤光素酶基因。然后可以在所述基因导入接受者细胞之后的合适时间实施用于检测报告基因表达的测定法。一种优选的此类测定法需要使用Jefferson et al.(1987)记载的编码大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因来鉴定经过转化的细胞。
在植物启动子调节元件以外，来自多种来源的启动子调节元件可在植物细胞中有效用于表达外来基因。例如，可使用细菌起源的启动子调节元件，诸如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒起源的启动子，诸如花椰菜花叶病毒(35S和19S)，35T(它是再改造的35S启动子，参见美国专利No.6,166,302，尤其是实施例7E)等等。植物启动子调节元件包括但不限于核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)、β-伴大豆球蛋白启动子、β-菜豆蛋白启动子、ADH启动子、热休克启动子、和组织特异性启动子。可存在其它元件，诸如基质附着区、支架附着区、内含子、增强子、多腺苷酸化序列等等，而且因此可改进转录效率或DNA整合。此类元件可能是或不是DNA功能必需的，尽管它们能通过影响转录、mRNA稳定性、等等来提供更好的DNA表达或机能。此类元件可以在想要时包括在DNA中以获得转化DNA在植物中的最佳性能。典型的元件包括但不限于Adh-内含子1、Adh-内含子6、苜蓿花叶病毒衣壳蛋白前导序列、渗透蛋白UTR序列、玉米条纹病毒衣壳蛋白前导序列、以及熟练技术人员可得的其它元件。也可使用组成性启动子调节元件，由此在所有细胞类型中且在所有时间指导连续基因表达(例如肌动蛋白、遍在蛋白、CaMV 35S、等等)。组织特异性启动子调节元件负责特定细胞或组织类型中的基因表达，诸如叶或种子(例如玉米醇溶蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白、ACP、球蛋白等等)，而且这些也可以使用。
启动子调节元件也可以是在植物发育的某个阶段期间有活性(或无活性)的以及在植物组织和器官中有活性的。此类的例子包括包括但不限于花粉特异性、胚特异性、玉米穗丝特异性、棉纤维特异性、根特异性、种子胚乳特异性、或营养期特异性启动子调节元件等等。在某些情形下，可能想要使用诱导性启动子调节元件，它负责响应特定信号表达基因，诸如物理刺激(热休克基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代谢物、化学制品(四环素响应性的)、和应激。可使用在植物中发挥功能的其它期望转录和翻译元件。本领域知道众多植物特异性基因转移载体。
基于植物RNA病毒的系统也可用于表达细菌蛋白。在这样做时，可将编码蛋白的基因插入会感染目的宿主植物的合适植物病毒的衣壳启动子区。然后该蛋白能表达，如此给植物提供保护免于除草剂伤害。基于植物RNA病毒的系统记载于美国专利No.5,500,360，Mycogen Plant Sciences,Inc.和美国专利No.5,316,931和5,589,367，Biosource。
进一步提高耐性或抗性水平的手段。本文中显示了本发明的植物能在没有可观察到的对表型(包括产量)的不利影响的情况下赋予新颖的除草剂抗性性状。此类植物在本发明的范围内。本文中例示和建议的植物能抵挡2倍、3倍、4倍和5倍典型应用水平的例如至少一种受试除草剂。这些耐性水平的改进在本发明的范围内。例如，本领域知道多种技术，而且它们能预见性地优化和进一步开发，用于提高给定基因的表达。
一种此类方法包括增加受试基因的拷贝数(在表达盒等等中)。也可以为具有多拷贝基因的那些选择转化事件。
可使用强启动子和增强子来“增压”表达。此类启动子的例子包括优选的35T启动子，它使用35S增强子。此类用途包括35S、玉米遍在蛋白、拟南芥遍在蛋白、A.t.肌动蛋白、和CSMV启动子。其它强病毒启动子也是优选的。增强子包括4OCS和35S双重增强子。例如，基质附着区(MAR)也可用于提高转化效率和转基因表达。
改组(定向进化)和转录因子也可用于依照本发明的实施方案。
也可设计在序列水平不同但保留相同或相似总体必需三维结构、表面电荷分布、等等的变体蛋白。参见例如美国专利No.7,058,515；Larson et al.,Protein Sci.200211:2804-2813,“Thoroughly sampling sequence space:Large-scale protein design of structural ensembles”；Crameri et al.,NatureBiotechnology 15,436-438(1997),“Molecular evolution of an arsenatedetoxification pathway by DNA shuffling”；Stemmer,W.P.C.1994,DNAshuffling by random fragmentation and reassembly:in vitro recombination formolecular evolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；Stemmer,W.P.C.1994,Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,Nature 370:389-391；Stemmer,W.P.C.1995,Searching sequence space.Bio/Technology 13:549-553；Crameri,A.,Cwirla,S,and Stemmer,W.P.C.1996,Construction andevolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling,Nature Medicine 2:100-103；和Crameri,A.,Whitehorn,E.A.,Tate,E.and Stemmer,W.P.C.,1996,Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling,Nature Biotechnology 14:315-319。
插入植物细胞的重组多核苷酸的活性可取决于邻近插入物的内源植物DNA的影响。如此，另一个选项是利用已知是植物基因组中用于插入的卓越位置的事件。参见例如WO 2005/103266A1，其涉及cry1F和cry1Ac棉事件；FAD2，FAD3，其中可以替代那些基因组基因座中的诸如AAD1或AAD12或其它等基因，代替此类插入物。如此，例如，可依照本发明使用靶向同源重组。这种类型的技术是例如WO 03/080809A2和相应的已公开的美国申请(USPA 20030232410)的主题，它们涉及使用锌指进行靶向重组。本领域还知道重组酶(例如cre-10x和flp-frt)的使用。
也可以在本发明的范围内进行最适合于合成发夹的5’或3’UTR的计算设计。本文中别处讨论了一般性的计算机建模，以及基因改组和定向进化。更具体地说，关于计算机建模和UTR，用于预测/评估本发明5’和3’UTR衍生物的计算机建模技术包括但不限于：MFold，3.1版，可得自GeneticsCorporation Group，Madison，Wis.(参见Zucker et al.,Algorithms andThermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction:A Practical Guide.InRNA Biochemistry and Biotechnology,11-43,J.Barciszewski&B.F.C.Clark,eds.,NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,NL,(1999)；Zucker et al.,Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic ParametersImproves Prediction of RNA Secondary Structure.J.Mol.Biol.288,911-940(1999)；Zucker et al.,RNA Secondary Structure Prediction.In Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry,S.Beaucage,D.E.Bergstrom,G.D.Glick,and R.A.Jones eds.,John Wiley&Sons,New York,11.2.1-11.2.10,(2000))，COVE(使用协方差模型(随机背景自由文法方法)的RNA结构分析)v.2.4.2(Eddy&Durbin,Nucl.Acids Res.1994,22:2079-2088)，它以源代码自由分发且能通过访问网站genetics.wust1.edu/eddy/software/下载，和FOLDALIGN，也自由分发且在网站bioinf.au.dk.FOLDALIGN/下载可得(参见Finding the mostsignificant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences.J.Gorodkin,L.J.Heyer and G.D.Stormo.Nucleic Acids Research,vol.25,no.18pp 3724-3732,1997；Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set ofRNA Sequences.J.Gorodkin,L.J.Heyer,and G.D.Stormo.ISMB 5:120-123,1997)。
本发明的实施方案可以与天然进化的或化学诱导的突变体联合使用(可以通过筛选技术来选择突变体，然后用其它基因转化突变体)。本发明的植物可以与各种抗性基因和/或进化的抗性基因组合。传统育种技术也可以与本发明组合，从而有力地组合、渐渗、和改进性状选择。
提供本文中引用和讨论的所有参考文献(包括出版物、专利、和专利申请)仅仅是因为它们的公开早于本申请的提交日。本文中无一处解释为承认发明人没有权利凭借发明在先而早于此类公开。
实施例
提供下面的实施例来例示某些特定特征和/或方面。这些实施例不应解释为将公开限制于所描述的特定特征或方面。
实施例1：自细菌人工染色体文库鉴定旁系同源FAD2和FAD3靶序列
BAC构建
细菌人工染色体(BAC)文库购自供应商(Amplicon Express，Pullman，WA)。BAC文库由110,592个BAC克隆组成，其含有自油菜变种DH10275分离的高分子量基因组DNA(gDNA)片段。用BamHI或HindIII限制酶消化gDNA。将分离的约135Kbp的gDNA片段连接入pCC1BAC载体(Epicentre，Madison，WI)，并转化入大肠杆菌菌株DH10B(Invitrogen)。BAC文库由用两种不同限制酶构建的偶数个BAC克隆构成。因此，HindIII构建的BAC文库由144块384孔板组成。同样地，BamHI构建的BAC文库由144块384孔板组成。分离了总共110,592个BAC克隆，并排列入288块384孔板。288块384孔板中的每一个都由供应商以单一DNA提取提供，用于基于PCR的快速筛选。产生的BAC文库覆盖大约15Gbp gDNA，相当于油菜变种DH10275基因组的12倍基因组覆盖(如Johnston et al.(2005)Annals of Botany 95:229-235中所述，油菜基因组估值为约1.132Gbp)。
自BAC文库分离的FAD2编码序列的序列分析
用构建的BAC文库分离FAD2基因编码序列。进行测序实验以鉴定来自油菜变种DH10275的四种FAD2基因旁系同源物的具体基因序列。
FAD2基因序列最初是在模型物种拟南芥内鉴定的。基因序列在Genbank中列为基因座标签：At3g12120。先前描述了模型植物物种拟南芥和二倍体芜菁(四倍体油菜的祖先之一)之间的比较基因组关系(Schranz et al.(2006)Trends in Plant Science 11(11):535-542)。具体关于FAD2基因，比较分析预测在二倍体芸苔基因组内可存在基因的3-4个拷贝。另外的遗传作图研究由Scheffler et al.(1997)Theoretical and Applied Genetics 94:583-591完成。这些遗传作图研究的结果显示在油菜中存在FAD2基因的4个拷贝。
自油菜变种DH12075构建的BAC文库的测序分析导致了四种BAC序列的分离(SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，和SEQ ID NO:4)，由此确定了FAD2A(SEQ ID NO:5)，FAD2-1(SEQ ID NO:6)，FAD2-2(SEQ IDNO:7)，和FAD2-3(SEQ ID NO:8)基因的编码序列。鉴定FAD2A，FAD2-1，FAD2-2，和FAD2-3基因序列并进行遗传作图。使用序列比对程序和利用同一性百分比的邻居连接树进行四种FAD2基因的序列分析。经由来自VectorNTI Advance 11.0计算机程序(Life Technologies，Carlsbad，CA)的程序进行序列比对，并显示于图1中。使用改良的Clustal W算法来生成蛋白质或核酸序列的多重序列比对以进行相似性比较和注解。用JALVIEW 软件产生邻居连接树，并显示于图2。(Waterhouse et al.(2009)Bioinformatics 25(9):1189-1191)。如图2中所示，分离的序列的分析指示FAD2A和FAD2-3序列共享高水平的序列相似性，同样地，FAD2-1和FAD2-2共享高水平的序列相似性。四种序列可分类为两个进化枝，其中FAD2A和FAD2-3构成第一进化枝，而FAD2-1和FAD2-2构成第二进化枝。
接着，用自油菜新分离的FAD2序列对自芜菁基因组BAC文库和甘蓝鸟枪基因组序列读出分离的基因组文库进行BLAST。芜菁和甘蓝二者均为双二倍体物种油菜(AC基因组，n＝19)的二倍体祖先。油菜衍生自芜菁(A亚基因组，n＝10)和甘蓝(C亚基因组，n＝9)之间的最近杂交事件。使用BLASTn分析将二倍体祖先序列与自油菜分离的四种不同FAD2编码序列进行比较。此序列分析自芜菁和甘蓝鉴定出与新发现的油菜FAD2序列共享最高序列相似性的具体的带注释的基因序列。表1列出了新鉴定的FAD2编码序列和相应的祖先参照序列登录号和来源生物体。
表1：来自油菜和相应祖先生物体的FAD2序列及相关的FAD序列登录号。
*Genbank序列条目经过编辑
FAD2基因以每个亚基因组每个基因两个拷贝存在于油菜基因组中。每种基因的一个拷贝位于A亚基因组上，同样地，每种基因的一个拷贝位于C亚基因组上。描述了新的命名规则以指示每种基因位于哪个亚基因组上。自油菜BAC基因组DNA文库分离的四种不同FAD2编码序列和祖先序列数据之间的高水平序列相似性提示FAD2-3是来自C亚基因组的FAD2序列的副本，并且可重新标记为FAD2C；FAD2-1是来自A亚基因组的FAD2序列的副本，并且可因此标记为FAD2A’；最后，FAD2-2是自C亚基因组的FAD2序列复制的第二拷贝，并且可标记为FAD2C’。
自BAC文库分离的FAD3编码序列的序列分析
用构建的BAC文库分离FAD3基因编码序列。进行测序实验以鉴定来自油菜变种DH10275的五种FAD3基因旁系同源物的具体基因序列。
FAD3基因序列最初是在模型物种拟南芥内鉴定的。基因序列在Genbank中列为基因座标签：At2g29980。先前描述了模型植物物种拟南芥和二倍体芜菁(四倍体油菜的祖先之一)之间的比较基因组关系(Schranz et al.(2006)Trends in Plant Science 11(11):535-542)。具体关于FAD基因，比较分析预测在二倍体芸苔基因组内可存在基因的3-4个拷贝。另外的遗传作图研究由Scheffler et al.(1997)Theoretical and Applied Genetics 94:583-591完成。这些遗传作图研究的结果显示在油菜中存在FAD3基因的6个拷贝。
聚焦于来自油菜的FAD3基因的先前的测序努力已对A和C基因组二者的特定拷贝进行了鉴定和遗传学作图(Hu et al.(2006)Theoretical and AppliedGenetics 113(3):497-507)。Andrew Sharpe(Agriculture and Agrifood Canada，107Science Place，Saskatoon，Saskatchewan)先前已从植物系DH12075构建来自种子特异性cDNA文库的EST序列集合并测序。作为来自加倍单倍体芸苔植物DH12075的EST的集合，全长基因序列未获得，此外，序列质量的指标和正确识别核苷酸的置信度也未获得。因此，不同FAD基因序列读出之间的序列变异不可明确地归于FAD3基因家族的各种旁系同源物的不同基因拷贝，基因组序列也未获得。然而，当用EST以及Hu et al.(2006)中记载的两种FAD3A和FAD3C全长基因序列实施组合序列分析时，鉴定出与二者基因均匹配的EST连同另外的3种单元型。结果，鉴定了FAD3单元型的总共6种独特。在汇编了各种FAD3单元型的所有可获取数据之后，鉴定出外显子1中的高水平外显子序列趋异性。外显子1中的FAD3序列趋异性被鉴定为可利用来设计基因/等位基因特异性PCR引物的机会。另外，鉴定出在单元型之间最低程度区分(例如，外显子5，6，7和8有1-3bp在FAD3A和FAD3C之间有变化)或者没有序列变异(例如，外显子2和3)的外显子。
自油菜变种DH12075构建的BAC文库的测序分析导致了六种BAC序列的分离(SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQID NO:13，和SEQ ID NO:14)，由此确定了FAD3A(SEQ ID NO:15)，FAD3A’(SEQ ID NO:16)，FAD3A”(SEQ ID NO:17)，FAD3C(SEQ ID NO:18)，FAD3C”(SEQ ID NO:19)，和FAD3C’(SEQ ID NO:20)基因的编码序列。鉴定了FAD3A，FAD3A’，FAD3A”，FAD3C，FAD3C”，和FAD3C’基因序列并进行遗传作图。
使用序列比对程序和利用同一性百分比的邻居连接树进行六种FAD3基因的序列分析。经由来自Vector NTI Advance 11.0计算机程序(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)的程序进行序列比对，并显示于图3中。使用改良的Clustal W算法来生成蛋白质或核酸序列的多重序列比对以进行相似性比较和注解。用JALVIEW软件产生邻居连接树，并显示于图4。(Waterhouse et al.(2009)Bioinformatics 25(9):1189-1191)。用鉴定为包含FAD3基因的毗连群作为针对拟南芥基因数据库的BLASTn查询。经由与拟南芥FAD3基因(Genbank登录号：At2g29980)比较，鉴定出6个毗连群中每一个含有FAD3基因的区域。然后将FAD3毗连群定向，使得所有FAD3基因都处于5’至3’取向。修剪FAD3毗连群，在可能的情况下包含多至2个上游(5’)和1个下游(3’)拟南芥基因。一旦取向，自每个毗连群提取FAD3基因的完整编码区，并用于生成邻居连接树以展示不同FAD3基因家族成员之间的关系。将6个FAD3家族成员排列成3对FAD3基因(图4)。
基于PCR的筛选
设计一组PCR引物来筛选前述BAC文库。将引物设计为或者是通用引物(它们会扩增基因家族的所有成员)或者是基因特异性引物(它们用于靶定等位基因扩增)。将PCR引物设计成长20bp(+/-1bp)并包含50％(+/-8％)的G/C含量。表2和表3列出了设计和合成的引物。合并BAC文库的克隆，并经聚合酶链式反应(PCR)进行筛选。
表2：用于FAD3序列之PCR扩增的引物序列。
| 引物名称 | SEQ ID NO | 序列 |
| D_uni_F3_F1 | SEQ ID NO:21 | GAATAAGCCATCGGACACAC |
| D_spec_F3_F2 | SEQ ID NO:22 | ATGCGAACGGAGACGAAAGG |
| D_spec_F3_F3 | SEQ ID NO:23 | TGTTAACGGAGATTCCGGTG |
| D_spec_F3_F4 | SEQ ID NO:24 | GTAGCAATGTGAACGGAGAT |
| D_uni_F3_R1 | SEQ ID NO:25 | CAGTGTATCTGAGCATCCG |
| D_spec_F3_R2 | SEQ ID NO:26 | GTGGCCGAGTACGAAGATAG |
| D_spec_F3_R3 | SEQ ID NO:27 | CAGTAGAGTGGCCAGAGGA |
表3：为BAC文库筛选、FAD2基因鉴定设计的PCR引物序列。
| 引物名称 | SEQ ID NO | 序列 |
| D_UnivF2_F1 | SEQ ID NO:28 | ATGGGTGCAGGTGGAAGAATG |
| D_UnivF2_F2 | SEQ ID NO:29 | AGCGTCTCCAGATATACATC |
| D_UnivF2_R1 | SEQ ID NO:30 | ATGTATATCTGGAGACGCTC |
| D_UnivF2_R2 | SEQ ID NO:31 | TAGATACACTCCTTCGCCTC |
| D_SpecificF2_F3 | SEQ ID NO:32 | TCTTTCTCCTACCTCATCTG |
| D_SpecificF2_R3 | SEQ ID NO:33 | TTCGTAGCTTCCATCGCGTG |
| D_UnivF2_F4 | SEQ ID NO:34 | GACGCCACCATTCCAACAC |
| D_UnivF2_R4 | SEQ ID NO:35 | ACTTGCCGTACCACTTGATG |
用两套不同条件进行聚合酶链式反应(PCR)。第一系列PCR反应包含：1X PCR缓冲液(包含dNTP)；1.5mM MgCl2；200μM 0.25UDNA聚合酶(Bioline，London，UK)；250nM每种引物；和，约5-10ng模板DNA。第二系列PCR反应是为了扩增基因组DNA而开发的，而且包含：5-10ng基因组DNA，1X PCR缓冲液，2mM dNTP，0.4μM正向和反向引物，和0.25DNA聚合酶(Bioline，London，UK)。合并扩增体系成终体积13μL，并使用MJ热循环仪(BioRad，Hercules，CA)或ABI9700基因扩增系统(Life Technologies，Carlsbad，CA)进行扩增。使用基于Bryan等(Scottish Crops Research Institute annual report:2001-2002)描述的筛选系统的4维筛选办法以及上述PCR条件对特定平板进行基于PCR的筛选。在对合并的BAC文库进行基于PCR的筛选后，使用直接Sanger测序方法对扩增的PCR产物进行测序。依照v3.1方案(Applied Biosystems)，用乙醇、乙酸钠和EDTA纯化扩增产物，并在自动化毛细管电泳平台上实施电泳。
在基于PCR的筛选和构象Sanger测序后，鉴定出包含各种不同FAD2和FAD3基因家族成员的平板集合。鉴定出总共四种独特的FAD2和FAD3旁系同源基因序列(表4和表5)。对每种FAD2和FAD3旁系同源基因序列各自挑选总共两块平板进行平板筛选以鉴定平板内包含FAD2和FAD3基因的具体孔和克隆(表4和表5)。对二者的平板鉴定具体的孔，并针对每个FAD2和FAD3基因家族成员选择克隆个体。
表4：用详述的PCR引物组合提供阳性反应的BAC克隆平板的鉴定，连同进一步用于平板内克隆鉴定的两块平板的识别号。
表5：用详述的PCR引物组合提供阳性反应的BAC克隆平板的鉴定，连同进一步用于平板内克隆鉴定的两块平板的识别号。
对于每个鉴定的FAD基因家族成员，经由测序进一步分析单个BAC克隆。依照制造商的说明书使用LARGE CONSTRUCT试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离BAC克隆的DNA并准备好用于测序。依照制造商的说明书使用Titanium Technology(Roche，Indianapolis，IN)制备提取的BAC DNA用于测序。使用物理区分的GS-FLXPico-titer板实施测序反应，成对合并BAC以提供最佳数据输出。成对组合BAC，其中FAD2基因与FAD3基因配对。通过NEWBLER(454Life Sciences，Branford，CT)汇编所有生成的序列数据。使用SEQUENCHER(GeneCodes，AnnArbor，MI)手工评估汇编的毗连群中相应FAD基因的存在。
在鉴定并充分表征所有四种FAD2和六种FAD3基因的全基因组序列后，设计锌指核酸酶以结合每个特定基因家族成员的序列。
实施例2：对FAD2基因特异性的锌指结合域的设计
如前所述设计针对编码FAD2基因基因座的各种功能性序列的DNA序列的锌指蛋白。参见例如Urnov et al.(2005)Nature 435:646-651。例示性靶序列和识别螺旋显示于表6和表8(识别螺旋区设计)和表7和表9(靶位点)。在表8和表9中，靶位点中与ZFP识别螺旋接触的核苷酸以大写字母指示；非接触核苷酸以小写字母指示。设计锌指核酸酶(ZFN)靶位点以结合FAD2A的5个靶位点和FAD3的7个靶位点。将FAD2和FAD3锌指设计掺入编码如下蛋白质的锌指表达载体，该蛋白质具有至少一个具有CCHC结构的指。参见美国专利公开文本No.2008/0182332。特别是，每种蛋白质中的最后一个指具有用于识别螺旋的CCHC主链。将非规范锌指编码序列与IIS型限制酶FokI的核酸酶域(Wah et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10564-10569的序列的第384-579位氨基酸)经四个氨基酸的ZC接头和自玉蜀黍衍生的不透明-2核定位信号融合以形成FAD2A锌指核酸酶(ZFN)。融合蛋白的表达由相对强的组成型启动子驱动，诸如自木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子衍生且侧翼为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)ORF23 3’非翻译区(AtuORF23 3’UTR v1)的启动子。将来自明脉扁刺蛾(Thosea asigna virus)(β四体)病毒的自水解2A编码核苷酸序列(Szymczak et al.，2004)加到克隆入构建物的两个锌指核酸酶融合蛋白之间。下文记载了例示性的载体。
使用先前显示鉴定活性核酸酶的基于芽殖酵母的系统验证最佳锌指的切割活性。参见例如美国专利公开文本No.20090111119；Doyon et al.(2008)Nat Biotechnol.26:702-708；Geurts et al.(2009)Science 325:433。为各种功能域选择锌指供体内使用。在设计、生成和测试结合推定FAD基因组多核苷酸靶位点的众多ZFN中，一些ZFN鉴定为具有高水平的体内活性并选定用于进一步的实验。这些ZFN表征为能有效结合和切割植物中独特的FAD2基因组多核苷酸靶位点。
表6：FAD3锌指设计
表7：FAD3锌指的靶位点
| ZFP | 靶位点(5’至3’) | SEQ ID NO: |
| 27961 | cgCCGGAGAAAGAGAGAGAGctttgagg | SEQ ID NO:36 |
| 27962 | tgGTTGTCGCTATGGACcagcgtagcaa | SEQ ID NO:37 |
| 27969 | tcTCCGTTcGCATTGcTACGCTggtcca | SEQ ID NO:38 |
| 27970 | gaAAGGTTtGATCCGAGCGCAcaaccac | SEQ ID NO:39 |
| 27973 | ctTGAACGGTGGTTgTGCGCTcggatca | SEQ ID NO:40 |
| 27974 | tcGGAGATATAAGGGCGGCCattcctaa | SEQ ID NO:41 |
| 27987 | taGCCCAGAACAGGGTTccttgggcggc | SEQ ID NO:42 |
| 27988 | ctTCGTACTCGGCCACGactggtaattt | SEQ ID NO:43 |
| 27989 | ttGAAGTTGCAaTAAGCTttctctcgct | SEQ ID NO:44 |
| 27990 | acTTGCTGGTCGATCATGTTggccactc | SEQ ID NO:45 |
| 27991 | aaGTAGTTGAAGTTGCAataagctttct | SEQ ID NO:46 |
| 27992 | tgGTCGATCATGTTGGCcactcttgttt | SEQ ID NO:47 |
| 28004 | aaCGAGAATGAAGGAATGAAgaatatga | SEQ ID NO:48 |
| 28005 | atACCATGGTTGGTAAGtcatttatttt | SEQ ID NO:49 |
| 28021 | ccAACGAGgAATGATAGAtaaacaagag | SEQ ID NO:50 |
| 28022 | caGTCACAGTTcTAAAAGtctatggtgt | SEQ ID NO:51 |
| 28023 | tgTGACTGGACcAACGAGgaatgataga | SEQ ID NO:52 |
| 28024 | tcTAAAAGTCTATGGTGttccttacatt | SEQ ID NO:53 |
| 28025 | cgCCGGAGAAAGAGAGAGCTttgaggga | SEQ ID NO:54 |
| 28026 | tgGTTGTCGCTATGGACcagcgtagcaa | SEQ ID NO:55 |
| 28035 | ctTAAACGGTGGTTgTGCGCTcggatca | SEQ ID NO:56 |
| 28036 | tcGGAGATATAAGGGCTGCGattcctaa | SEQ ID NO:57 |
| 28039 | tcTCCGATctTAAACGGTGGTTgtgcgc | SEQ ID NO:58 |
| 28040 | atAAGGGCTGCGATTCCtaagcattgtt | SEQ ID NO:59 |
| 28051 | agATGGCCCAGAAAAGGgttccttgggc | SEQ ID NO:60 |
| 28052 | cgTACTCGGCCACGactggtaatttaat | SEQ ID NO:61 |
| 28053 | ttGAAGTTGCAaTAAGCTttctctcgct | SEQ ID NO:62 |
| 28054 | acTTGCTGGTCGATCGTGTTggccactc | SEQ ID NO:63 |
| 28055 | aaGTAGTTGAAGTTGCAataagctttct | SEQ ID NO:64 |
| 28056 | tgGTCGATCGTGTTGGCcactcttgttt | SEQ ID NO:65 |
表8：FAD2锌指设计
表9：FAD2锌指的靶位点
实施例3：FAD2基因的锌指核酸酶切割的评估
构建物装配
使用本领域普遍知道的技能和技术设计和完成如实施例2中所述使用酵母测定法鉴定的含有例示性锌指核酸酶之ZFN表达构建物的质粒载体。将每一种锌指编码序列融合至编码不透明-2核定位信号的序列(Maddaloni et al.(1989)Nuc.Acids Res.17(18):7532)，其位于锌指核酸酶的上游。
接着，将不透明-2核定位信号::锌指核酸酶融合序列与互补的不透明-2核定位信号::锌指核酸酶融合序列配对。因此，每个构建物由单个可读框组成，该可读框由通过来自明脉扁刺蛾(β四体)病毒的2A序列(Mattion et al.(1996)J.Virol.70:8124-8127)隔开的两个不透明-2核定位信号::锌指核酸酶融合序列构成。融合蛋白的表达由相对强的组成型启动子驱动，诸如自木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子衍生且侧翼为根癌农杆菌ORF23 3’非翻译区(AtuORF23 3’UTR)的启动子。
使用IN-FUSIONTMAdvantage Technology(Clontech，Mountain View，CA)装配载体。限制性内切核酸获自New England BioLabs(NEB；Ipswich，MA)，且将T4DNA连接酶(Invitrogen)用于DNA连接。使用质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc.，Bethlehem，PA)或Plasmid Midi试剂盒(Qiagen)依照供应商的说明书实施质粒制备。在琼脂糖Tris-乙酸盐凝胶电泳后使用QIAquick凝胶提取试剂盒TM(Qiagen)分离DNA片段。最初通过限制性消化微量制备的DNA来筛选所有装配质粒的菌落。由商品化测序供应商(EurofinsMWG Operon，Huntsville，AL)对选定克隆的质粒DNA进行测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)汇编和分析序列数据。在递送至油菜原生质体之前，使用Pure Yield PLASMID MAXIPREP(Promega Corporation，Madison，WI)或PLASMID MAXI试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)依照供应商的说明书从大肠杆菌培养物制备质粒DNA。
经限制酶消化和DNA测序确认了产生的11个质粒构建物：pDAB104008(含ZFN24845和ZFN24844构建物)，pDAB104009(含ZFN24820和ZFN24821构建物)，pDAB104010(含ZFN24828和ZFN24829构建物)(图5)，pDAB104003(含ZFN24810和ZFN24811构建物)，pDAB104011(含ZFN24832和ZFN24833构建物)，pDAB104002(含ZFN24794和ZFN24795构建物)，pDAB104006(含ZFN24796和ZFN24797构建物)，pDAB104004(含ZFN24814和ZFN24815构建物)，pDAB104001(含ZFN24800和ZFN24801构建物)，pDAB104005(含ZFN24818和ZFN24819构建物)，和pDAB104007(含ZFN24836和ZFN24837构建物)。表10列出了不同构建物和每种ZFN设计切割及结合的具体FAD序列。
经限制酶消化和DNA测序确认了产生的质粒构建物：pDAB107824(ZFN28025-2A-28026)，pDAB107815(ZFN 27961-2A-27962)，pDAB107816(ZFN27969-2A-27970)，pDAB107817(ZFN 27973-2A-27974)，pDAB107825(ZFN28035-2A-28036)，pDAB107826(ZFN 28039-2A-28040)，pDAB107818(ZFN27987-2A-27988)，pDAB107827(ZFN 28051-2A-28052)，pDAB107821(ZFN28004-2A-28005)，pDAB107819(ZFN 27989-2A-27990)，pDAB107828(ZFN28053-2A-28054)，pDAB107829(ZFN 28055-2A-28056)，pDAB107820(ZFN27991-2A-27992)，pDAB107822(ZFN 28021-2A-28022)和pDAB107823(ZFN28023-2A-28024)。
表10：列出锌指蛋白结合基序和相应的构建物编号。每种锌指设计为结合并切割表中所述FAD2A。
用于转染的DNA的制备
通过沉淀并在100％(v/v)乙醇中清洗来对上述载体的质粒DNA灭菌，并在层流净化罩中干燥。将DNA团粒以终浓度0.7μg/μl悬浮于30μL无菌双蒸水中以供如下所述转染入原生质体细胞。进行质粒DNA的制备以产生用于瞬时转染的超螺旋质粒DNA和用于稳定转染的线性化质粒DNA。对于原生质体细胞的瞬时转染，无需对转化质粒添加载体DNA(例如鱼精DNA)。对于瞬时研究，每次转化使用约30μg质粒DNA每106个原生质体。
转染
如Spangenberg et al.(1986)Plant Physiology 66:1-8中所述完成油菜变种DH10275的转染，培养基配方记载于Spangenberg G.and Protrykus I.(1995)Polyethylene Glycol-Mediated Direct Gene Transfer in Tobacco Protoplasts.In:Gene Transfer to Plants.(Protrykus I.and Spangenberg G.Eds.)Springer-Verlag,Berlin。在70％乙醇中对油菜种子进行表面灭菌。将种子浸入12mL 70％乙醇溶液中并通过将混合物温和摇动10分钟来混合。通过倒出溶液去除70％乙醇溶液，并用由1％w/v次氯酸钙和0.1％v/v Tween-20组成的种子灭菌溶液替换。将种子浸入种子灭菌溶液中并通过温和摇动混合物25分钟来混合。倒出种子灭菌溶液并将经过灭菌的种子在50mL无菌水中漂洗3次。最后，将种子转移至已放置于陪替培养皿中的无菌80mm 滤纸盘(Fisher-Scientific，St.Louis，MO)，并将种子用无菌水轻微饱和。用(Fisher-Scientific，St.Louis，MO)密封陪替培养皿，并将平板于25℃在完全黑暗的情况下温育1-2天。在观察到种子的幼苗出现迹象后，将幼苗转移至含固化GEM培养基的陪替培养皿以鼓励进一步的种子萌发。将幼苗在GEM培养基上于25℃温育4-5天。
将一定体积的液体PS培养基(约10mL)倒入无菌陪替培养皿中。使用无菌镊子和刮刀，将处于4叶生长和发育期的4-5日龄幼苗的气生部分取下并丢弃。确定长度20-40mm的下胚轴区段以生成最高总数的小、富含胞质的原生质体。无菌切下下胚轴区段并转移至液体PS培养基。将切下的下胚轴区段聚集在一起并横切成5-10mm区段。接着，将下胚轴区段转移至新鲜的PS培养基中并在室温温育1小时。将质壁分离的下胚轴转移至含酶溶液的陪替培养皿中。小心地将所有下胚轴区段浸入溶液中。用密封陪替培养皿并于20-22℃温和摇动过夜温育16-18小时。
从下胚轴区段释放原生质体细胞。将过夜的下胚轴消化物温和摇动以将原生质体释放入酶溶液中。轻微倾斜陪替培养皿以帮助转移由酶溶液和植物碎片组成的消化悬浮液。使用10mL移液管将消化悬浮液转移至经过灭菌的原生质体过滤(100微米网孔的滤器)单元以进一步将原生质体与植物碎片分开。温和轻敲过滤单元以释放筛网中残留的过量液体。将约8-9mL原生质体悬浮液温和混合并分入14mL无菌塑料圆底离心管中。每份悬浮液用1.5mLW5溶液覆盖。以一定角度将W5溶液小心地分发于原生质体悬浮液上并以最小程度的摇动逐滴分发。添加W5溶液至原生质体悬浮液导致生成富含原生质体的界面。使用移液管收集此界面。接着，将收集的原生质体转移入一个新的14mL离心管中并温和混合。使用血球计测定所获取原生质体的产量以确定每毫升的原生质体数目。重复该方法，其中消化叶组织以生成叶肉原生质体。
接着，添加W5溶液至体积10mL，并以70g使原生质体形成团粒，之后去除W5溶液。通过温和摇动重悬浮残余的原生质体悬浮液。将含原生质体悬浮液的每个管装满5mL W5溶液并室温温育1-4小时。以70g使原生质体悬浮液形成团粒，并去除所有W5溶液。接着，将300μL转化缓冲液加到每份含有分离的原生质体的成团粒原生质体悬浮液中。在每个管中，向原生质体悬浮液中加入10μg质粒DNA。质粒DNA由上述锌指核酸酶构建物(例如pDAB104010)组成。接着，将300μL预温热的PEG 4000溶液加入原生质体悬浮液中并轻敲管。在无任何摇动的情况下使原生质体悬浮液和转化混合物在室温温育15分钟。以序贯小样1mL，1mL，1mL，2mL，2mL，和3mL在每个管中添加另外的10mL W5溶液，在每次添加W5溶液之间温和颠倒管。通过在离心机中以70g旋转使原生质体形成团粒。去除所有W5溶液，留下纯的原生质体悬浮液。
接着，加0.5mL K3培养基至成团粒原生质体细胞并重悬浮细胞。将重悬浮的原生质体细胞放置于陪替培养皿中央，以1:1浓度5mL K3和0.6mLSea PlaqueTM琼脂糖(Cambrex，East Rutherford，NJ)。将陪替培养皿以单一的温和漩涡运动摇动并室温温育20-30分钟。用密封陪替培养皿并将原生质体在完全黑暗的情况下培养24小时。在黑暗中温育后，将陪替培养皿在弱光(5μMol m-2s-1的Osram L36W/21Lumilux白色管)下培养6天。在培养步骤后，用无菌刮刀将含原生质体的琼脂糖分成四个象限。将分开的四个象限放入含20mL A培养基的250mL塑料培养器皿中并在旋转摇床上以80rpm和1.25cm摆度于24℃持续弱光中温育14天，然后分析以测定每种锌指核酸酶构建物的活性水平。
自芸苔原生质体分离基因组DNA
将经转染的原生质体放置于各个1.5或2.0mL微量离心管中。使细胞于管基部在缓冲溶液中形成团粒。如下进行DNA提取，即将细胞速冻于液氮中，接着在LABCONCO FREEZONE(Labconco，Kansas City，MO)中于-40℃和约133x 10-3mBar压力将细胞冷冻干燥约48小时。使用(QIAGEN，Carlsbad，CA)植物试剂盒对冻干的细胞进行DNA提取，除了不需要组织破坏且将原生质体细胞直接加到裂解缓冲液中之外，均依照制造商的说明书进行。
在芸苔原生质体中对FAD2A和FAD3ZFN测试基因组DNA序列切割
将针对FAD2A和FAD3基因基因座的ZFN靶位点的设计聚簇，以便多对ZFN设计成与靶位点重叠。ZFN靶位点的聚簇使得PCR引物能设计成会在100bp窗口内扩增来自所有FAD2A和FAD3基因家族成员的周围基因组序列以封装所有重叠ZFN靶位点。如此，可利用Illumina短读出序列技术评估已转染原生质体的靶ZFN位点的完整性。另外，所设计的PCR引物需要包括会将序列读出归于FAD2A和FAD3家族的特定基因成员的特定核苷酸碱基。因此，会要求所有PCR引物结合离开任何ZFN靶切割位点5-10个核苷酸，因为已知非同源末端连接(NHEJ)活性引起小的删除，它能去除引发位点、抑制扩增并因此使NHEJ活性的评估失真。
将引物设计为结合FAD2A和FAD3基因家族的所有ZFN靶基因座(表11)，并且凭经验经由PCR扩增产物的基于Sanger的测序测试引物对所有基因家族成员的扩增。在若干情况中，未能开发出会区分所有基因家族成员的引物(表12和表13)，然而，在所有情况中，能区分FAD2A和FAD3的靶基因序列。在PCR引物设计后，将定制DNA条形码序列掺入PCR引物中，用于区分不同ZFN靶基因座并鉴定转染和ZFN的特定序列读出(表11，12和13)。
表11：为FAD2和FAD3ZFN活性评估设计的引物序列。引物包括定制条形码，连同Illumina文库构建(用于边合成边测序分析)必需的Illumina衔接子序列。购置的引物是所出现的全部三列的总和。
表12：设计的PCR引物对FAD2基因家族的扩增成效。“X”指示基因拷贝检测特异性，灰色阴影和“+”指示在待检测特定基因座处，通过两种引物设计的序列读出不能区分，而“N/A”指示不能自那些特定基因拷贝扩增基因座。
表13：设计的PCR引物对FAD3基因家族的扩增成效。“X”指示基因拷贝检测特异性，灰色阴影和“+”指示在待检测特定基因座处，通过两种引物设计的序列读出不能区分，而“N/A”指示不能自那些特定基因拷贝扩增基因座。
在用ZFN转染的芸苔原生质体的DNA提取后，实施靶ZFN基因座的PCR扩增以生成正确格式的必需的基因座特异性DNA分子用于基于Illumina的边合成边测序技术。将每项测定法优化成以25ng起始DNA(油菜基因组的约12,500个细胞当量)运作。实施多重反应，每份样品提供以适当水平评估NHEJ效率和特异性所需要的覆盖，约16个PCR反应相当于200,000个拷贝的取自原生质体个体的油菜基因组。为要以同一测试法测试的所有样品制备PCR扩增主混合物，并且使用定量PCR方法测定一式三份实施的一项反应，用于确定靶组织上实施的最佳循环数，以保证PCR扩增没有变成受试剂限制且仍然在指数扩增期。使用MX3000P热循环仪(Stratagene，LaJolla，CA)以96孔形式实施实验，包含必需的阴性对照反应。根据自定量PCR平台收集的输出，对循环至循环间荧光的相对增加作图，并测定每项测试法的如下循环数，其会递送足够扩增，同时不容许反应变成受试剂限制，这试图减少过量循环及扩增共同转录物或分子。将未用过的主混合物保持在冰上直至定量PCR分析结束且循环数得到确定，然后等分入期望数目的反应管中(每项ZFN测定法约16管)并实施PCR反应。扩增后，将单个ZFN基因座的样品合并在一起，并使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)依照制造商的说明书清洁每个ZFN的200μL合并产物。为了使样品能使用Illumina短读出技术进行测序，需要通过扩增将另外的配对末端引物附着于产生的片段上。这是通过使用引物进行PCR扩增完成的，所述引物会与第一轮扩增加入的序列部分互补，但是还包含必需的配对末端序列。再次使用样品通过先前所述定量PCR循环分析确定要实施的最佳PCR循环数，它会加入配对末端序列而不过度扩增模板共同的片段。PCR扩增后，用柱(Qiagen)依照制造商的说明书清洁生成的产物，并在2.5％琼脂糖凝胶上进行解析。对用SYBER(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)显现为正确大小的条带的DNA片段进行凝胶抽提以去除任何残留的PCR生成的引物二聚体或其它假片段，用凝胶提取试剂盒(Qiagen)依照制造商的说明书从凝胶条提取DNA。完成凝胶抽提后，用磁珠(Beckman-Coulter，Brea，CA)以1:1.7的DNA/珠比实施另外的DNA清洁。然后以1/40,000和1/80,000稀释，并且以一式三份实施的反应，使用基于定量PCR的文库定量试剂盒评估DNA的浓度，用于Illumina测序(KAPA)。基于定量PCR结果，将DNA稀释成2nM的标准浓度，并且组合所有文库供DNA测序。用CBOTgeneration试剂盒(Illumina，San Diego，CA)制备供测序用的样品，并在ILLUMINA上以100bp配对末端测序读出依照制造商的说明书进行测序。
用于检测靶锌指位点处的非同源末端连接的数据分析方法
在完成测序反应及利用关于碱基识别的Illumina生物信息渠道实施的初级数据识别后，实施完整分析以鉴定每一种情况中靶ZFN位点处删除的碱基。设计定制PERL正本以在计算上依照输入序列列表自DNA序列提取和分选条形码。要被接受，条形码必须以大于30的Phred得分匹配参照序列，以减少错误认定的序列读出。将序列读出归入已使用的不同条形码组后，使质量过滤器穿过所有的序列。质量过滤器是第二个定制开发PERL正本。若识别为“N”的碱基不超过三个，或者若中值Phred得分小于20，或者若有3个连续碱基具有小于20的Phred得分，或者若序列读出长度短于40bp，则排除该序列读出。在配对序列读出二者均可获得的情况下，利用(SoftGenetics，State College，PA)程序包合并剩余的序列。然后用第三个定制PERL正本将剩余的合并序列读出简化成一个独特序列读出集合，在剩余序列标识符的末端上记录已鉴定的冗余序列数目的计数。然后用软件将独特序列读出与FAD2和FAD3参照序列比对，产生带缺口的FASTA比对文件。
使用带缺口的FASTA文件，使用第四个定制PERL正本实施缺口碱基位置编号向输入参照的转换。这使得能够在汇编的数据中鉴定出区分不同基因家族成员的碱基(不同基因家族成员之间的部分同源或旁系同源序列变异)。一旦实施了碱基编号的转换，就有可能为每一个独特序列读出生成单元型报告并将读出归于特定基因家族成员。一旦将读出按照基因分组，就围绕ZFN靶位点鉴定和评估10bp窗口。记录每个基因具有删除的序列数目连同缺失碱基的数目。
然后就每10,000个序列读出中在靶ZFN位点处删除1-10个碱基的序列的数目而言，将数据图示为多线图(图6)。对所有ZFN转染连同对照转染实施此分析。在若干情况中，天然DNA序列中的重复导致靶ZFN位点中的测序错误增多，这样的错误通常可被视为所有样品(用ZFN或对照转染二者)中报告的单碱基删除的普遍性的增加(图7)。
从这些结果看出，在基因座E处鉴定出FAD2靶位点处的最高水平ZFN活性，如通过更大NHEJ活性确定的。鉴于其显著的基因组DNA切割活性和最小的脱靶活性的特征，选择在质粒pDAB104010上编码的ZFN(即ZFN24828和24829)用于工程化转基因整合平台(ETIP)的植物打靶。
实施例4：用于工程化转基因整合平台(ETIP)芸苔植物系的DNA构建物
使用本领域技术人员普遍知道的方法和技术构建下述质粒载体构建物。此段所述的具体试剂和技术的应用是本领域技术人员易于知道的，并且可以用其它试剂和技术容易地替换以实现构建质粒载体构建物的期望目的。限制性内切核酸酶获自New England BioLabs(NEB；Ipswich，MA)。用T4 DNA连接酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)完成连接。使用LR酶混合物(Invitrogen)实施Gateway反应以将一种进入载体组装成单一目的载体。使用IN-FUSIONTMAdvantage Technology(Clontech，MountainView，CA)实施IN-FUSIONTM反应以将一种进入载体组装成单一目的载体。使用质粒试剂盒(Macherey-Nagel Inc.，Bethlehem，PA)或Plasmid Midi试剂盒(Qiagen)依照供应商的说明书实施质粒制备。在琼脂糖Tris-乙酸盐凝胶电泳后使用QIAquick凝胶提取试剂盒TM(Qiagen)分离DNA片段。最初通过限制性消化微量制备的DNA来筛选所有装配质粒的菌落。由商品化测序供应商(Eurofins MWG Operon，Huntsville，AL)对选定克隆的质粒DNA进行测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)汇编和分析序列数据。
用于在芸苔的FAD2A基因座中精确整合ETIP的直接递送载体
使用标准克隆方法构建含ETIP的载体pDAS000130(图8，如SEQ ID NO:141的T链插入物)，用于特异性整合入油菜的FAD2A基因。此构建物设计成用锌指核酸酶构建物pDAB1004010递送入芸苔原生质体。锌指核酸酶构建物会切割FAD2A基因座，然后pDAS000130构建物会经由同源性定向修复机制整合在芸苔基因组内。ETIP由通过另外的ZFN识别序列分隔开的四个表达盒(两个不完全的)和含另外的ZFN识别序列的工程化着陆垫(ELP)组成。另外的ZFN识别序列是独特的，并且设计成作为靶，用于在ETIP和ELP转基因插入内引入多核苷酸序列。类似地，可利用ZFN识别序列切除多核苷酸序列。第一个基因表达盒是不完全的dsRED表达盒，并且包含来自拟南芥聚遍在蛋白10(AtUbi启动子)基因的启动子、5'非翻译区和内含子(Callis et al.(1990)J.Biol.Chem.265:12486-12493)，接着是为了在双子叶植物中表达经过密码子优化的来自珊瑚礁珊瑚(Discosoma sp.)(Clontech，Mountain View，CA)的dsRed基因的210bp(dsRED(双子叶优化)外显子1)，接着是来自拟南芥硫还原酶样基因的内含子(来自At硫还原酶的内含子1；登录号：NC_00374)及包含玉蜀黍胎萌-1(Viviparous-1，Vp1)基因转录终止子和多腺苷酸化位点的3'非翻译区(Zmlip终止子；Paek et al.(1998)Molecules and Cells 8(3):336-342)。第二个表达盒包含包括来自花椰菜花叶病毒的5’UTR的19S启动子(CaMV19S；Cook and Penon(1990)Plant Molecular Biology 14(3):391-405)，接着为了在双子叶植物中表达经过密码子优化的来自大肠杆菌的hph基因(hph(HygR)；Kaster et al.(1983)Nucleic Acids Research 11(19):6895-6911)及包含根癌农杆菌pTi15955可读框1转录终止子和多腺苷酸化位点的3’UTR(At-ORF1终止子；Barker et al.(1983)Plant Molecular Biology 2(6):335-50)。第三个表达盒是不完全的PAT表达盒，并且包含来自拟南芥4-香豆酰-CoA合酶的第一个内含子(内含子#24-香豆酰-CoA合酶v；登录号：At3g21320/NC003074)，接着是自绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)分离，编码赋予针对包括膦丝菌素(phosphinothricin)、草铵膦(glufosinate)、和双丙氨磷(bialaphos)在内的谷氨酰胺合成酶抑制剂的抗性的蛋白质的膦丝菌素乙酰基转移酶基因的合成、植物优化形式的最后256bp(PAT(v6)3’末端；Wohlleben et al.(1988)Gene 70(1):25-37)。此表达盒以包含根癌农杆菌pTi15955可读框23转录终止子和多腺苷酸化位点的3’UTR(AtuORF23终止子；Barker et al.(1983)Plant Molecular Biology 2(6):335-50)终止。第四个表达盒是ipt基因盒，并且包含来自拟南芥DNA结合蛋白MYB32基因(U26933)的启动子和5’UTR的588bp截短形式(AtMYB32(T)启动子；Li etal.(1999)Plant Physiology 121:313)，接着是来自根癌农杆菌的异戊基转移酶(ipt)基因和包含来自花椰菜花叶病毒的转录终止子和多腺苷酸化位点的35s终止子(CaMV 35S终止子；Chenault et al.(1993)Plant Physiology 101(4):1395-1396)。为了递送至FAD2A，ETIP序列的每一端侧翼为1kb FAD2A基因组序列，其来自通过将pDAB104010中编码的ZFN递送至油菜FAD2A基因而诱导的双链断裂的位置任一侧。
由商品化基因合成供应商(GeneArt，Life Technologies)合成ETIP序列。使用QiagenPlant mini试剂盒(Qiagen，Hilden)依照制造商的说明书从纯化自油菜DH12075叶组织的基因组DNA扩增FAD2A基因组序列的1kb区段。使用T4连接酶(NEB，Ipswich，MA)将1kb FAD2A序列连接入ETIP载体。首先通过限制性消化微量制备的DNA筛选所有装配质粒的菌落。限制性内切核酸酶获自New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA)和Promega(Promega Corporation，WI)。使用QIAPREP试剂盒(Qiagen)或Pure Yield PlasmidSystem(Promega Corporation，WI)依照供应商的说明书实施质粒制备。使用ABI Sanger Sequencing and BIG DYEv3.1循环测序方案(Applied Biosystems，Life Technologies)对选定克隆的质粒DNA进行测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene CodesCorp.，Ann Arbor，MI)汇编和分析序列数据。
用于在芸苔FAD3基因座中精确整合ETIP的直接递送载体
使用标准克隆方法构建含ETIP的载体pDAS000271(图9，如SEQ IDNO:142的T链插入物)、pDAS000272(图10，如SEQ ID NO:143的T链插入物)、pDAS000273(图11，如SEQ ID NO:144的T链插入物)、pDAS000274(图12，如SEQ ID NO:145的T链插入物)、和pDAS000275(图13，如SEQ ID NO:146的T链插入物)，其用于特异性整合入油菜的FAD3A或FAD3C基因基因座。此构建物设计成用锌指核酸酶构建物pDAB107828或pDAB107829递送入芸苔原生质体。特定锌指核酸酶构建物会切割FAD3A基因座，然后pDAS000273或pDAS000275构建物会经由同源性定向修复机制整合入芸苔基因组内。同样地，特定锌指核酸酶构建物会切割FAD3C基因座，然后pDAS000271、pDAS000272或pDAS000274构建物会经由同源性定向修复机制整合入芸苔基因组内。ETIP由通过另外的ZFN识别序列分隔开的四个表达盒(两个不完全的)和含另外的ZFN识别序列的工程化着陆垫(ELP)组成。另外的ZFN识别序列是独特的，并且设计成作为靶，用于在ETIP和ELP转基因插入内引入多核苷酸序列。类似地，可利用ZFN识别序列切除多核苷酸序列。第一个基因表达盒是不完全的dsRED表达盒，并且包含来自拟南芥聚遍在蛋白10(AtUbi启动子)基因的启动子、5'非翻译区和内含子(Callis et al.(1990)J.Biol.Chem.265:12486-12493)，接着是为了在双子叶植物中表达经过密码子优化的来自珊瑚礁珊瑚(Clontech，Mountain View，CA)的dsRed基因的210bp(dsRED(双子叶优化)外显子1)，接着是来自拟南芥硫还原酶样基因的内含子(来自At硫还原酶的内含子1；登录号：NC_00374)及包含玉蜀黍胎萌-1(Vp1)基因转录终止子和多腺苷酸化位点的3'非翻译区(Zmlip终止子；Paek et al.(1998)Molecules and Cells 8(3):336-342)。第二个表达盒包含包括来自花椰菜花叶病毒的5’UTR的19S启动子(CaMV 19S；Cook and Penon(1990)Plant MolecularBiology 14(3):391-405)，接着是为了在双子叶植物中表达经过密码子优化的来自大肠杆菌的hph基因(hph(HygR)；Kaster et al.(1983)Nucleic AcidsResearch 11(19):6895-6911)及包含根癌农杆菌pTi15955可读框1转录终止子和多腺苷酸化位点的3’UTR(At-ORF1终止子；Barker et al.(1983)PlantMolecular Biology 2(6):335-50)。第三个表达盒是不完全的PAT表达盒，并且包含来自拟南芥4-香豆酰-CoA合酶的第一个内含子(内含子#24-香豆酰-CoA合酶v；登录号：At3g21320/NC003074)，接着是自绿色产色链霉菌分离，编码赋予针对包括膦丝菌素、草铵膦、和双丙氨磷在内的谷氨酰胺合成酶抑制剂的抗性的蛋白质的膦丝菌素乙酰基转移酶基因的合成、植物优化形式的最后256bp(PAT(v6)3’末端；Wohlleben et al.(1988)Gene 70(1):25-37)。此表达盒以包含根癌农杆菌pTi15955可读框23转录终止子和多腺苷酸化位点的3’UTR(AtuORF23终止子；Barker et al.(1983)Plant Molecular Biology 2(6):335-50)终止。第四个表达盒是ipt基因盒，并且包含来自拟南芥DNA结合蛋白MYB32基因(U26933)的启动子和5’UTR的588bp截短形式(AtMYB32(T)启动子；Li et al.(1999)Plant Physiology 121:313)，接着是来自根癌农杆菌的异戊基转移酶(ipt)基因和包含来自花椰菜花叶病毒的转录终止子和多腺苷酸化位点的35s终止子(CaMV 35S终止子；Chenault et al.(1993)Plant Physiology101(4):1395-1396)。为了递送至FAD3A或FAD3C，ETIP序列的每一端侧翼为1kb FAD3A或FAD3C基因组序列，其来自油菜FAD3A或FAD3C基因中通过递送编码的ZFN而诱导的双链断裂的位置的任一侧。
由商品化基因合成供应商(GeneArt，Life Technologies)合成ETIP序列。使用Qiagen Plant mini试剂盒(Qiagen，Hilden)依照制造商的说明书从纯化自油菜DH12075叶组织的基因组DNA扩增FAD3A和FAD3C基因组序列的1kb区段。使用T4连接酶(NEB，Ipswich，MA)将1kb FAD3A或FAD3C序列连接入ETIP载体。首先通过限制性消化微量制备的DNA筛选所有装配质粒的菌落。限制性内切核酸酶获自New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA)和Promega(Promega Corporation，WI)。使用QIAPREP Spin试剂盒(Qiagen)或Pure Yield Plasmid MAXIPREP(Promega Corporation，WI)依照供应商的说明书进行质粒制备。使用ABI Sanger Sequencing and BIGDYEv3.1循环测序方案(Applied Biosystems，LifeTechnologies)对选定克隆的质粒DNA进行测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)汇编和分析序列数据。
对照载体
使用对照载体开发基于荧光激活细胞分选(FACS)的细胞分选方法。使用标准克隆方法构建对照载体，即由两个基因表达盒组成的pDAS000031(图14：如SEQ ID NO:147的T链插入物)。第一个基因表达盒包含花椰菜花叶病毒19s启动子(CaMV 19S启动子；Shillito et al.(1985)Bio/Technology 3:1099-1103)::潮霉素抗性基因(hph(HygR)；美国专利No.4,727,028)::和根癌农杆菌可读框13’非翻译区(AtORF1终止子；Huang et al.(1990)J.Bacteriol.172:1814-1822)。第二个基因表达盒包含拟南芥遍在蛋白10启动子(AtUbi10启动子；Callis et al.(1990)J.Biol.Chem.265:12486-12493)::dsRED(dsRED(D)；美国专利No.6,852,849)和来自拟南芥的内含子(内含子#1；GenBank：AB025639.1)::根癌农杆菌可读框233’非翻译区(AtORF23终止子；美国专利No.5,428,147)，作为反式取向(例如头对头取向)的框内融合。使用IN-FUSIONTM Advantage Technology(Clontech，Mountain View，CA)装配质粒载体。
用于ETIP在芸苔中随机整合的二元载体的构建
为了ETIP T链序列在油菜基因组内的随机整合，构建了两种二元载体。使用标准克隆方法构建含ETIP的载体pDAS000036(图15，如SEQ ID NO:148的T链插入物)和pDAS000037(图16，如SEQ ID NO:149的T链插入物)。ETIP载体由通过ZFN识别序列分隔开的四个表达盒(两个不完全的表达盒)和含另外的ZFN识别序列的工程化着陆垫(ELP)组成。第一个基因表达盒是不完全的dsRED表达盒，并且包含来自拟南芥聚遍在蛋白10(AtUbi 10启动子)基因的启动子、5'非翻译区和内含子(Norris et al.(1993)Plant Molecular Biology21(5):895-906)，接着是为了在双子叶植物中表达经过密码子优化的来自珊瑚礁珊瑚(Clontech，Mountain View，CA)的dsRed基因的210bp，接着是来自拟南芥硫还原酶样基因的内含子(登录号：NC_00374)及包含玉蜀黍胎萌-1(Vp1)基因转录终止子和多腺苷酸化位点的3’非翻译区(UTR)(ZmLip终止子；Paek et al.(1998)Molecules and Cells 8(3):336-342)。第二个表达盒包含包括来自花椰菜花叶病毒的5’UTR的19S启动子(CsVMV 19启动子；Cook andPenon(1990)Plant Molecular Biology 14(3):391-405)，接着是为了在双子叶植物中表达经过密码子优化的来自大肠杆菌的hph基因(hph(D)；Kaster et al.(1983)Nucleic Acids Research 11(19):6895-6911)及包含根癌农杆菌pTi15955可读框1(ORF1)转录终止子和多腺苷酸化位点的3’UTR(AtORF1终止子；Barker et al.(1983)Plant Molecular Biology 2(6):335-50)。第三个表达盒是不完全的PAT表达盒，并且包含来自拟南芥4-香豆酰-CoA合酶的第一个内含子(登录号：At3g21320(NC003074))，接着是自绿色产色链霉菌分离，编码赋予针对包括膦丝菌素、草铵膦、和双丙氨磷在内的谷氨酰胺合成酶抑制剂的抗性的蛋白质的膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)基因的合成、植物优化形式的最后256bp(PATv6(外显子2)；Wohlleben et al.(1988)Gene 70(1):25-37)。此表达盒以包含根癌农杆菌pTi15955可读框23(ORF23)转录终止子和多腺苷酸化位点的3’UTR(AtORF23终止子；Barker et al.(1983)Plant MolecularBiology 2(6):335-50)终止。第四个表达盒是ipt基因盒，并且包含来自拟南芥DNA结合蛋白MYB32基因(U26933)的启动子和5’UTR的588bp截短形式(AtMYB32(T)启动子；Li et al.(1999)Plant Physiology 121:313)，接着是来自根癌农杆菌的异戊基转移酶(ipt)基因和包含来自花椰菜花叶病毒的转录终止子和多腺苷酸化位点的35s终止子(CaMV 35S终止子；Chenault et al.(1993)Plant Physiology 101(4):1395-1396)。
由商品化基因合成供应商(GeneArt，Life Technologies)合成具有Multi-Gateway位点的表达盒和ELP。使用BP clonase II酶混合物TM(Invitrogen，Life Technologies)和pDONR221载体套组TM(Invitrogen，LifeTechnologies)构建每种表达盒和ELP的进入克隆。然后将进入克隆用于使用LR Clonase II Plus酶混合物TM(Invitrogen，Life Technologies)与Gateway使能性二元载体一起进行的Multi-Gateway反应中。首先通过限制性消化微量制备的DNA筛选所有装配质粒的菌落。限制性内切核酸酶获自New EnglandBioLabs(NEB，Ipswich，MA)和Promega(Promega Corporation，WI)。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒TM(Qiagen，Hilden)或Pure Yield PlasmidMaxiprep SystemTM(Promega Corporation，WI)依照供应商的说明书实施质粒制备。使用ABI Sanger Sequencing and Big Dye Terminator v3.1循环测序方案TM(Applied Biosystems，Life Technologies)对选定克隆的质粒DNA进行测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)汇编和分析序列数据。
实施例5：ETIP芸苔植物系的生成
油菜的转化
ETIP构建物(pDAS000036，pDAS000037)，DS-Red对照构建物(pDAS000031)，和FAD2A，FAD3A和FAD3C位点特异性构建物(pDAS000130，和pDAS000271-pDAS000275)以及伴随的锌指核酸酶(pDAB104010，pDAB10728，和pDAB10729)记载于实施例4中。将二元载体转化入根癌农杆菌菌株GV3101:PM90。使用实施例3中所述转化方案加以一些修改完成油菜原生质体细胞的转化。
对方案的修改包括用海藻酸钠代替Sea PlaqueTM琼脂糖。以包含5:1质粒DNA摩尔比的DNA浓度完成锌指核酸酶构建物和ETIP构建物二者共递送入油菜原生质体细胞的转染实验。以30μg质粒DNA的浓度转化其它ETIP和对照质粒构建物。因此，pDAS000130由浓度27.8μg质粒DNA组成，而pDAB104010由浓度2.2μg质粒DNA组成。以30μg质粒DNA的浓度转化其它ETIP和对照质粒构建物。
另外的对方案的修改包括在含1.5mg/mL潮霉素的培养基中从经过转化的原生质体细胞繁殖完整植物。完整植物的繁殖要求每两周更换A培养基，并且监测原生质体衍生集落的生长。在原生质体衍生集落生长到大约2-3mm直径后，将集落转移入含固化MS形态培养基的12孔板(FisherScientific，St.Louis，MO)的各个孔中。将平板于24℃在连续弱光下温育1-2周，直至愈伤组织增殖到直径8-10mm的大小。在原生质体细胞达到直径1-2cm之后，将原生质体细胞转移入含MS形态培养基的各个250mL培养器皿中。将器皿于24℃在16小时光照(20μMol m-2s-1Osram L36W/21Lumilux白色管)和8小时黑暗的条件下温育。在1-2周内，可见多个嫩芽。在嫩芽达到3-4cm长后，将它们转移入含MS培养基的250mL培养器皿中。将250mL培养器皿于24℃在16小时光照(20μMol m-2s-1Osram L36W/21Lumilux白色管)和8小时黑暗的条件下温育。将嫩芽保持在培养器皿中，直至它们发育成小植株，此时将它们转移至温室，生长至成熟。
实施例6：含T-DNA的ETIP在芸苔中的整合的分子确认
使用96 Plant DNA提取试剂盒TM或Plant Mini试剂盒TM(Qiagen)从所有推定转基因植物的叶组织提取基因组DNA。使用下述引物通过PCR分析来自每株植物的基因组DNA：设计为从pTiC58扩增virC以测试根癌农杆菌的存留的引物，pTiC58正向(SEQ ID NO:150，CGAGAACTTGGCAATTCC)和pTiC58反向(SEQ ID NO:151，TGGCGATTCTGAGATTCC)，设计为扩增来自油菜的肌动蛋白以检查基因组DNA的质量的引物，肌动蛋白正向(SEQ ID NO:152，GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)和肌动蛋白反向(SEQ ID NO:153，GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)。设计引物来扩增由ETIP编码的hph基因；HPH正向(SEQ ID NO:154，TGTTGGTGGAAGAGGATACG)和HPH反向(SEQID NO:155，ATCAGCAGCAGCGATAGC)。将自virC引物没有得到产物但用针对肌动蛋白和hph的引物从其中扩增出正确大小的产物的植物归类为转基因的。
完成第二步筛选，其中用设计成在T-DNA区以外扩增二元载体的五套引物通过PCR分析来自每株转基因植物的gDNA[(1F，SEQ ID NO:156，ATGTCCACTGGGTTCGTGCC；1R，SEQ ID NO:157，GAAGGGAACTTATCCGGTCC)(2F，SEQ ID NO:158，TGCGCTGCCATTCTCCAAAT；2R，SE ID NO:159，ACCGAGCTCGAATTCAATTC)(3F，SEQ ID NO:160，CCTGCATTCGGTTAAACACC；3R，SEQ ID NO:161，CCATCTGGCTTCTGCCTTGC)(4F，SEQ ID NO:162，ATTCCGATCCCCAGGGCAGT；4R，SEQ ID NO:163，GCCAACGTTGCAGCCTTGCT)(5F，SEQ ID NO:164，GCCCTGGGATGTTGTTAAGT；5R，SEQ ID NO:165，GTAACTTAGGACTTGTGCGA)]。认为用引物组3和4从中扩增出正确和预期大小的PCR产物的植物具有主链整合。
使用经过修改的CTAB方法(Maguire et al.(1994)Plant Molecular BiologyReporter 12(2):106-109)从20g叶组织纯化来自没有主链整合的植物的DNA。用数种限制酶消化分离的gDNA，并将10μg gDNA在琼脂糖凝胶上通过电泳分开，并使用标准Southern印迹方案转移至膜。使用DIG Easy Hyb SystemTM(Roche，South San Francisco，CA)依照制造商的说明书探查膜。用以下引物从ETIP构建物扩增针对ELP每一种表达盒和针对内源对照基因肌动蛋白的探针：(IPT-F，SEQ ID NO:166，TCTCTACCTTGATGATCGG；IPT-R，SEQID NO:167，AACATCTGCTTAACTCTGGC；dsRED-F，SEQ ID NO:168，ATGGCTTCATCTGAGAACG；dsRED-R，SEQ ID NO:169，TTCCGTATTGGAATTGAGG；PAT-F，SEQ ID NO:170，TTGCTTAAGTCTATGGAGGCG；PAT-R，SEQ ID NO:171，TGGGTAACTGGCCTAACTGG；ELP-F，SEQ ID NO:172，ATGATATGTAGACATAGTGGG；ELP-R，SEQ ID NO:173，AGGGTGTAAGGTACTAGCC；Hph-F，SEQ ID NO:174，TGTTGGTGGAAGAGGATACG；Hph-R，SEQ ID NO:175，ATCAGCAGCAGCGATAGC；肌动蛋白-F，SEQ ID NO:176，GTGGAGAAGAACTACGAGCTACCC；肌动蛋白-R，SEQ ID NO:177，GACTCATCGTACTCTCCCTTCG)。
从所有只含单一拷贝ETIP的植物扩增ETIP序列并测序。使用ABI3730xITM(Applied Biosystems，Life Teachnologies)通过PCR产物的直接测序分析每种T-DNA插入物的序列。使用Phusion Hot Start II聚合酶TM(Finnzymes，Thermo Fisher Scientific)从基因组DNA扩增T-DNA插入物。用多对引物完成T-DNA的扩增反应以扩增长度约2Kbp的重叠序列。用多种引物对每种PCR产物测序以保证完全覆盖。在对PCR反应测序前用虾碱性磷酸酶和外切核酸酶I(Applied Biosystems，Life Technologies)处理PCR反应以灭活过量引物。如下鉴定每种单拷贝ETIP系的T-DNA插入物侧翼的序列，即用8种限制性内切核酸酶消化纯化的基因组DNA并随后连接对由限制性内切核酸酶创建的悬垂部分特异性的双链衔接子。在此连接步骤后，用针对ETIP的3’或5’端的生物素化引物和针对每种衔接子的引物实施PCR。在AmpureSolid Phase Reversible Immobilization(SPRI)珠TM(Agencourt BioscienceCorporation，Beckman Coulter Company)上捕捉和清洁PCR产物。实施嵌套PCR，并使用ABI Sanger Sequencing and Big Dye Terminator v3.1循环TM测序方案(Applied Biosystems，Life Technologies)对所有产物测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)汇编和分析序列数据。
Southern印迹分析
在Southern探查前选择特定限制酶消化gDNA样品。如下分析推定转基因植物，即用EcoRI和SwaI消化基因组DNA。接着，用包含PATv6、IPT或ELP基因元件的多核苷酸片段探查经过消化的gDNA和未切割的gDNA样品，因为这些多核苷酸探针片段能区分EcoRI消化产物及SwaI消化产物中的多种插入物。然后用全部6种探针进一步分析已鉴定的单拷贝转基因植物系以鉴定插入载体的所有必要元件的存在。
因而，对用ETIP-pDAS000036转化的67例独立事件采样，并测试转基因(hph)的存在和载体主链的存在。在67株测试的植物中，发现47株具有整合在基因组内的转基因。在47株转基因植物中，发现17株植物包含载体主链(表14)。对剩余的30株不包含载体主链重要部分(Ori或SpecR缺失)的植物进行采样用于Southern分析。一般说来，首先用IPT探针筛选植物，然后用包含dsRED、PAT、ELP和hph基因元件的探针进一步测试鉴定为推定单拷贝系的植物系以确认完整盒的存在。
同样地，对用ETIP-pDAS000037转化且在土壤中存活的52例独立事件进行采样，并测试转基因(hph)的存在和载体主链的存在。在52株测试植物中，发现48株具有整合在基因组内的转基因。从48株转基因植物中，也发现23株植物包含载体主链，还有3株植物未测试(表14)。对剩余的22株不包含载体主链重要部分(Ori或SpecR缺失)的植物进行采样用于Southern分析。首先用IPT探针筛选这些转基因植物，并用dsRED、PAT、ELP、hph和肌动蛋白探针进一步测试鉴定为推定单拷贝系的植物系以确认结果。一旦获得5个独立单拷贝系的鉴定，就终止对剩余植物的Southern分析。总计，11个ETIP-pDAS000037系进行了Southern分析。
表14：+/-转基因和+/-载体主链PCR结果的汇总。
用pDAS000036和pDAS000037转化的ETIP转基因芸苔的结果
经pDAS000036和pDAS000037转化产生的转基因油菜事件导致生成单拷贝、全长T链插入。对于每一株植物完全表征3-4例事件，并推定定位到油菜基因组内的特定染色体。尽管在T链整合期间发生了一些单碱基对重排，选定事件包含能驱动转基因强劲表达的全长表达盒。将选定T0事件培养至T1发育阶段。使用上述PCR测定法重筛选T1以测定整合T链的接合性。将筛选事件归类为纯合子的，半合子的，或无效的。
从所有只含单拷贝整合ETIP序列的转基因事件扩增ETIP序列并测序。通过PCR产物的直接测序分析每种T-DNA插入物的序列。使用Phusion Hot StartII聚合酶TM(Finnzymes，Thermo Fisher Scientific)从基因组DNA扩增T-DNA插入物。接着，用多对引物扩增T-DNA以扩增长度约2Kb的重叠序列。用多种引物对每种PCR产物测序以保证完全覆盖。在对PCR反应测序前用虾碱性磷酸酶和外切核酸酶I(Applied Biosystems，Life Technologies)处理PCR反应以灭活过量引物。
如下鉴定每个单拷贝ETIP系的T-DNA插入物侧翼的序列，即用8种限制性内切核酸酶消化纯化的基因组DNA，随后连接对由限制性内切核酸酶创建的悬垂部分特异性的双链衔接子。在此步骤后，用针对ETIP的3’或5’端的生物素化引物和针对每种衔接子的引物实施PCR反应。在Ampure Solid PhaseReversible ImmobilizationTM(SPRI)珠(Agencourt Bioscience Corporation，Beckman Coulter Company)上捕捉和清洁PCR产物。实施嵌套PCR并使用ABISanger Sequencing and Big Dye Terminator v3.1循环测序方案(AppliedBiosystems，Life Technologies)对所有产物测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)汇编和分析序列数据。鉴定和选择8个ETIP系用于侧翼序列分析(表15)。左和右侧翼序列(也称作边界或连接序列)提供为SEQ ID NO:431–SEQ ID NO:446，划下划线的序列指示质粒载体，未划下划线的序列指示基因组侧翼序列。
表15：侧翼序列研究中使用的单拷贝事件的详情。
pDAS000036事件详情：em02-5788-1-1左边界侧翼(SEQ ID NO:431)
TCGAGATTGTGCTGAAGTAAACCATTTTACTTCAAATCTATTTTTAACTATTTACTTTTATTAAGGAGAGAAACTTTGCTGATTAATTCAAATTAGTGATCATTAAGATTCCAAAGATTCCGATTTAGAAAAGTCAAAGATTCAAAGAACAAGTCTAGGTCCTCATGGCTCATGTTGCATCCGATTCACCATCCACTCATCTTTCATATCTTCCTCCACTGTCTCTCTAGAAACAACTCATTTAATTTAGAAAACTCCTTTTTCAATTTAGAAATATTAAAGTTTATCACAATGTATCAATTAAATATTATCCGATGACTCATTCATAGTCAGGACCTTGCTGTCTGTGTCGTCCGTAATTATTATTTCAATACAAAACAAATATATGTTCACTCAGAAAATTACGGCGCAATCATCTAATTTTGTGGACCAAAATAAATAGCGTAGCTTCGAGATTTCAAAGTTGTGTTCAAATTTAATTTTGATTTCCGTTCCTCGTATACTCTTTTATGTATAGAAAATAATAATATCCACTACTAGTAGTTGATAACTACATTACATATATTAAAATTATGATGTCACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAA TTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAG CTTAGCTTGAGCTTGGATC
em02-5788-1-1右边界侧翼(SEQ ID NO：432)
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGAC TTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGA CTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCC AGCTTTCTTGTACACATAGCGACCGAGCTCGAGCCGAAGTTCGGTCGCTGTTTCACTGTTTGGGAAAGCATCAGTAACGCAGAAGACATAATTAAAAATTAATTATATATGGTAGTTTTTCTAGATTCTCCACTATACCTCATTGTGATTGAAAAACAACTATATATATATATATATATGTATTTAAAATTAAGAAATCATTAAATCGTACCATAATGCAGAAAACTTTATAAGTTCCTATTCTTTTGTCAAGATGAGTAGATGACACATCATGTACCACATAACATAACCATAATGGTGCGATACCATACCAAAACTTAATTTAGAAACTAATTAAAATTTTGGTAGTTTAAGATTCCTCCTAATGGTTGTCAAAAAAAAAAAAAGATTCCTCCTAATACATGGTAGAATATATTTTTGAGTTAAAATGAAAGTAAAATCTTCAAATTAGTCATAAGGAAATTCTAAAAAACATCGACTTTCTTTATAAAGATCCCATTGTAATTTTAGATGATTAATTTTATCCCAATCCAATTAAGAATTGTACACATCGGCCTCTATATATATCAAACACCTAAAA
pDAS000036事件详情：ad58-5784-2-1左边界侧翼(SEQ ID NO：433)
CGATTTGCAGCTATAATCAATCACACCTTATCGTTCTTTCAAAGAAAAATCGAAAGTTGTAAACTTTATCAGCCTGTGTAGTGATTATTTCAATTTGATAAAGAAAAAAAAAGGCTTAGCTTTATTTGGTTTTTTGTTACAATCTTGATTAATTTTAGATTAGCACTCTGATTCTAGCGGAACATGAGAGTGGTTCCATCAAACCTCAGACAGTGAGCACAGTGGTTGCAGCAAACCATTTGGGTGAGAGCTCTTCAGTTTCTTTGCTATTAGCTGGTTCTGGCTCTTCTCTTCAAGAAGCTGCTTCTCAAGCTGCCTCTTGTCATCCTTCTGTTTCCGAGGTAACTAACTACATTCTTCATTTGTCCTTTTTTCTTGTGGGTCTTAAATGTTYGTGCTTTTCTTTATAGGTACTTGTTGCTGATTCAGATAGATTTGAGTACCCTTTAGCTGAACCTTGGGCTAAACTGGTTGACTTTGTTCGCCAACAAAGAGATTACTCTCACATCCTTGCCTTCCTCTAGCTCATTTGGCAAGAACATACTTCCTCTAGACAACTTAATAACACATTG CGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTAC CCGGGGATCCTCTAGAGTC
ad58-5784-2-1右边界侧翼(SEQ ID NO：434)
CCTGTCATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCA ATGACTTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGA GGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGC CTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCGCCGGCCTACCTCGCGTTGCTGCTCTTTTAGATGTCTCTCCTGTTACTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGCTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGCA
pDAS000036事件详情：ad58-5898-10-1左边界侧翼(SEQ ID NO：435)
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATT GACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATT AACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCT GCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ad58-5898-10-1右边界侧翼(SEQ ID NO：436)
CGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTT TGATTAAAGATAAAATTTGATTTTTCATTACATAATAATCCATTAATTTTCACGCACGTGGAACCCATTTGGTGTACTTCCACGTCCTCTAAGAGAGCACTGACCCACTCATCAAAAAGATACATCTTTATAAGCCCCTTCATCGTCACACAGACACACACTTCCCTCTCAATTATTCCATATTCTCCTAATTTCTAATTGTTACACCTCAACACATTAGATTCGTACCAAACAAAAACGATTAGCTCCCAAGCCTAAGCTTTTATTTCCTTATAATTTTTCTTGGGTTTCTCTCTATAAAGAATGCAAATGACTGAGAGAGGCCGAGCCATGTGGCACACGTCCCTAGCCTCGGCATTCCGCACAGCTCTAGCTTGCACAATCGTTGGTGCGGCTACGCTCTACGGACCCGAGTGGATCCTCCGTTTTGTGGCATTCCCGGCGTTTTCTTACGTCACGGTCATTCTCATCATTACGGACGCCACGCTAGGCGACACACTACGTGGCTGCTGGCTAGCCCTTTACGCCACATGTCAGAGCGTTGCACCGGCTATCATTACACTAAGGCTTATAGGACCAGCTCGGCTCACGGCCGG
pDAS000037事件详情：lf31-6139-2-3左边界侧翼(SEQ ID NO：437)
TTTCTTTCCATCAGTTCTTCGGCACCTTCCTGGCTCTGCGTCTATCTTTCTTTCCATCCCGGCCCATCTCGTACACATTCCACCCAACTACACAAACACGTTATAGTCTTTTACATTATGACCAAATCAACCCTAAAGATACAGCCTTTATAAAAAATATAGGGGTCAAAGCAAAGAAGAGAAAGTTTGCTTACAGTGTGGAGAAAAGAAGTTGGAAGATGAGGAGTAAGAAGAAGAAGAGAAGAGAAAGGGTCTTCTGATGAGGAATAGGAGATAAGGTGGAACTGGAATGTTTGCCGCTAAATACTTGAAGACAAGAGCTTGATTTTCAAGCTCTTCCCATTGTGACTCAGTGAAAGGGATCCTAGTCGTCATGAAGAGATAGAGAAAATTGATGATGAAGGAGGTCTGATGAAGAGAAGAGAGAGAGAGAGATATTACACAAAGAGGGTTGTATTGCAAAATTGAAAGTGTAGAGAGAGTAGTAGGTAAGTTTTTATTAATAATGTTGTTCACACCTGCAGTCTGCAGAATATTGTGGTGTGAACAAATTGACGCTTAG ACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAA TTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATG CAAGCTTA
lf31-6139-2-3右边界侧翼(SEQ ID NO：438)
TTCAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGG GGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCT ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAACATATATATACGCATAATATTCTCAGAACCCGACCCATTGGTTGACTCGGATCAAGATCGACCCGATCCGACCCGGTTAAAAGCACGTCGTCTCCTTTGGTTCGCCCCTTATATTCGACGAGTGAGTTCGATTGGATCGCTGTTTGTCATTTCTCACTACCTTAAGAAAAAAAAAAAGGTGCGTCTCTCTCTCACCTTTACCGCTCACTTACCTCTCAGATCTGACATCGATTTTCCAAATCTTC：TCCAGGTACTCTCTCTCCTGGCCGTTGACGGTCCCGTCCCGGCCGTGGATCTGATTTCGCCGCGATCTGAGGTCAAGCATGGCGGCAGCTAACGCCCCCATCACGATGAAGGAGGTCCTAACGGTGAGTCCCGCCTCCATTTTTAGTAACATA
pDAS000037事件详情：bm56-6315-1-1左边界侧翼(SEQ ID NO：439)
TACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAATTGGGATCGCCTTATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCTTAATTCTTATGAGAATTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTACTTTTTGTATATAAATACAGCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGATTTGATTAGAATGACGAGAAAGTTGTCATATTCCCAAACAGGAAAACTGGGATCACCTGATTTGAAAGTGGGATAACTTCTTCATCCTAATTCTTATGAGATTTATTCCACTTCCTGGTGATTCTCCACTTCTTTATGTATCCAAATACATCTTCTTACATCGCGATTCATCCTGGTTTGATTAGAATGACGAGGAAGTTGTCATATTCCCAAACATGAAAACTGGGAAAGTGGGATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGG ACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCG GGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGAT
bm56-6315-1-1右边界侧翼(SEQ ID NO：440)
CCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGACTTCAA ATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTA CTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTT TCTTGTACAAAGTGACGATAAACTATCAGTCTTTCAAAGCGCATCTATGGCTAGTCATCACGGTTTTTAACTGTTTTACGAAGTCGCGGAGAGGCTCGTCTTCTCCCTAGGATAAACTGCAGAGGTCGACATCGGAGGTTTCTCGATCTATGAACATAGAGTACTGTTTGAGAAACTCCGAGGCGAGTTGGCGGAAACTCCCTATAGAGTTTTTCTTTAGACAAGAGAACCACTCAAGCGCTGCTTCGCGGAGGTTCTCGACGAAGAGGCGGCATTCGCCGGCATCTCTTTCTCTATCTTTAAACTTGGCTCTTCCCATCGCGATCTGGAAAGCCTGCAAGTGTGCCTTAGGATCGGTTGTACCATCGTAAGGAGCCACTTTGACTTTATCAGGATCCGAAACCGTAGTTTCGGTGATGCGGGTGGTGAAGGGCGTTTTTCGAGACTCCTCGAGGAGTAGGGTGATATCGAGTGCAGTACTAGTAGCGTGATGATTTGGGATTTCACCGCTCTAACCTCCGCAGCCGTTTTCA
pDAS000037事件详情：ad58-6372-1-1左边界侧翼(SEQ ID NO：441)
TTTTACAGTGTTAGAAGAAGTGGATGAAGCTGAAATTGAATTTTCAAACTCGTTCAGCTTGACTAGAGGTGGGAGAGAGTCAAAGCCTCCCATCAAGTACCAAAACATGGAATAGAAGACAGTCCGAGGGAGAGGAAACCGTGGCCGACGAGGCCGTGGCTCCTATCATTAACTAGTGTCTTTCTTACTATTAATGGTTTATTAAGTCTCAGCCTTTGTTGTTTCATTGGTTTGAGATTCACTCATACATGAAACTTGTTTCATTCCAGCTTTTCCAAACTATAAGAATATTTCCAATCTTATCTTGTAATAGTTTAAGTTTTAAATTGAAAGCCCTTAGTTCAAAAAACAAAAAAAAAAAATTAGCCCTTGAATTTATATATAATCACGACGGCCATATTTGGCAGCTACACTGATATGTTTTCAATTGGCTGACAGGCCTTGAGCAGGGTTTGCTGGGTATATTGGTAGGAAGATGTGTTGCGAGGTTGAAGCCTCATTTAGGCAATATAAACATGATCATTAGCGTTATGTCATTAGTTATACTTATACGTAGACTAAGTAACCCACTAAAGGTTGCTGATTCCTTTTGTATCGACTAACACATTGCGGACGTTTT TAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCC TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTG TCGTTTCCCGC
ad58-6372-1-1右边界侧翼(SEQ ID NO：442)
CATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAAC CAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATC AGTGTTTGACTGAATTTTAATTTCTAATTTTTGTAAAA AATTTGTATAACCTCAAATTATTAAAAGGCGGATTTTATTAGAATTATAACTAAATTATCTATAACTCCAAAATTTTGACAATCAATCATGTCTATATCTTTATTTTTTTGCTAAATTATCATGTCTATATCTTTTCTTTCTTCCAAACTTACTTGAGACTAAAAGTCTTTATAAATTTTGATAGGAGTTCCACACACAAACAAAAACAAAACAAATATTTTTCATCAAGGGATACTTATTTAACATCACGGATTCACAGTTTATTAACAAAAATCCAAACAAAGACTGAAAGACAGAAGATTCAATCTAACAATAGTCGGCAAACACCAGTGATTAACTAACGAAATAAATTAACAAGTGGTCAGATCTTCGGGAAA
pDAS000037事件详情：ad58-6620-4-1左边界侧翼(SEQ ID NO：443)
TAATTTCATTTTCGTCATTTTGGTAAAGTAACAAAAGACAGAATATTGGTTAGTCGTGTTGGTTAGGAATAAAATAAAGAACGTGGACATCGTGGAATAAAAATATTCAGACAAGGAAACTAACAATAAAACAGTAATGAACATGGTTCTGAATCTCATCTTTGTGTATCTCCAATGGAATCCACCGCCACGAATCAGACTCCTTCTCCAAGCTCCACCGTCGACGATGACAATGGCGACGGTGTCTATACCGACGAATTTACCAAACTACCCCCGGACCCGGGGATCCTCTAGAGTCAACAAATT GACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATT AACGCCGAATTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCT GCAGGCATGCAAGCTTAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTC
ad58-6620-4-1右边界侧翼(SEQ ID NO：444)
CATAACCACCATCTCAAACAATAGAACTTCCTAAGTGAAGCAATGAC TTCAAATCTACTTGAAGGCATGGAGTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGA CTGTACTTCTGTAGATTACTTTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCC AGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATAAACTATCAGTGTTTGAAATAATCGGATATTTAATTTTCTTAGACAGTTCATTAGTAGTTGATCTTAAACATTCACGTTTTATTTTCTTTTCTTTTCGAATGCTAGACTCTAGTTTGGTACCCATAGGATTCGAGTTACATGAAGCTATTGACACTGGGAGTGCTTCAAGATCTGTAAGAGGCAAAGATTCACAAACAGAACGTGATTTCTTGGATAGTGATGTGGAGATTGTGATAAGAACCAGCATGAGTATTACTTTTACTGCCCCTGCTGTGGTGAAGACATCACCAAAACAGTCAAGCTCGTGAAGAAATCAGATATTCAACCCGCAAAAAAATCTGACAATGCAAATAAACCTATTGACACTAAGAATGGTTCAAGATCCGAAGACAAGAAGACAAAAAATTTGTCCTGGCTCCCTGCTTATCTCCAGAAGCTGTTTCTTTCTGTTTATGGCCACATCAAAGACAAAGGTACCCTTTCTTTTGGTGCCTTTGGTGTGGACAGGTGTGATTGACTTTGGTTTCTTGGCAGATTCAGGCAAGATAGAGGTTGATTCAAAGTCAACTAACAATGATCTTGGTACCAATAGTGAGGA
pDAS000037事件详情：ad58-6620-17-1左边界侧翼(SEQ ID NO：445)
CCGCCTTGAACAACCGCTCCGCCGTTGCTCAGTACATTATCGAGGTTACCAAAAAGTTCAATCCTTTATGCTTGTTTTGGCGTGTGATTCGTTACGAATGAGTAAAATTGATTTGGTTTTTTTCTTTGAACAGCATGGTGGAGATGTGAATGCGACGGATCATACGGGGCAGACTGCGTTGCATTGGAGTGCGGTTCGTGGTGCGGTGCAAGTTGCGGAGCTTTTGCTTCAAGAGGGTGCAAGGGTTGATGCTACGGATATGTATGGATATCAGGTTCTAACCACTTCCTCTTTCTTTGTGGAGATTGTCTTTTTGTTTCAATGCTAGTCAACTTCTTTCTTTCTTTCACAAAACTAAGTAGTATTGCTTGTTTTGTTGTCGTTGCATTTTTTCTTATGGCTGTGTTCTGAGGTTCATGTAGGTATATAAGCACTTCGTACTTTGCCACTTGTTTCATTTAGGCAACATTGTGCACATATCTAAGTAGTTGGTCTTTGTAAAATTAGTTTGTTTGTCTTCAAAGTATATTGAGCAGTTTCATGACTCATTATTCAAAGGTTTGTCTAAATTAGAGAGAACTTTCATTTTGCCTGGATTTAATCAGCATTTAGAATGTTTATAGCGATATCATTTTTAGTTGAAAAAATCTCAACAAATTGACGCTTAGACAACTTA ATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTGAATTC GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT AGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTC
ad58-6620-17-1右边界侧翼(sEQ ID NO：446)
GTATAAGCCATGTTCCTTTCAGAGGGGACTGTACTTCTGTAGATTACT TTCCCTCATTAACCAGATCTGGCCGGCCTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTG GTGATAAACTATCAGTGTTAGATCCCCGACCGACCGCCCATCCTGGACGGCCTCGTGCATGCTGATGTTGTCAAAATCTTAGGATCCAATGAGTTTATCAGGTATACTTCTATCATGTATTGCTTGAGATTTTGGAGTGTTAGTAAAGATTTCAATAAAAGAATTTTTTCAAACAAAATTTTGGGGGCTTGAAGCTAATGTTTGGAAATATGTAACGGAGTTTAAATCTTTTGGCAGGCCTATATATGCGGGAAACGCCTTGTGTAGAGTTCGCTATACTGGTGCTGGTCCTTGTGTGTTGACTATTAGAACTACATCTTTTCCTGTTACCCCAATAACTGAGTCAAAGAAAGCTACTATCTCTCAGATTGATCTCTCGAAATTCAAAGAAGGTTTGTTTAGTATTATTCTCTTGTGCATAGCCTTTTTGSTTTTTTTTTTTTTATAAAAAAAGTTGAGTATGCTTATTGCCCATTGC
ETIP作图
对于包含单拷贝ETIP插入的每个转基因事件，手工装配后取侧翼序列并用作局部BLAST分析的查询。此过程鉴定出总共8株具有单拷贝整合的植物(表16和表17)。从NCBI GSS数据库下载来自甘蓝的595,478个基因组衍生鸟枪序列的集合，并格式化为核苷酸BLAST数据库。然后将侧翼ETIP序列与数据库进行BLASTn比较，并且手工检查所有匹配。然后从甘蓝数据库取对于侧翼ETIP序列最显著的序列匹配，并针对在线芜菁基因组序列(http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)进行比对，其中也找回了基因组中具有最显著序列匹配的位置。在只有5’或3’侧翼序列提供与甘蓝基因组序列的显著匹配的情况中，假定未比对或未匹配序列或者鉴定来自数据库的丢失序列或者具有在ETIP整合期间生成的显著基因组重排。对于8株单拷贝ETIP植物中的每一个，对于根据分析生成显著BLASTn匹配的样品，然后在SequencherTM v5.0软件(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI)中手工比对侧翼ETIP序列，最显著的甘蓝GSS匹配序列连同来自芜菁基因组的最显著匹配序列。然后比较3种序列，将来自二倍体芸苔物种任一、与侧翼ETIP相比最相似的序列指定为ETIP位于的基因组。对于大多数样品而言，两种二倍体芸苔基因组序列之间确实存在显著的变异，而且油菜衍生侧翼ETIP序列显示与二倍体序列之一或另一主要相关。然而，也有这样的情况，其中二倍体之间的序列变异不够，而且连锁群指派可以是有可能的但亚基因组指派是不可能的。然后从芜菁基因组序列的位置预测特定基因组位置。在ETIP鉴定为整合入甘蓝C基因组的情况中，用Parkin et al.(2005)Genetics 171:765-781中描述的二倍体芸苔基因组之间的比较同线性来推测进入油菜C亚基因组的基因组位置。另外，将已鉴定的序列与拟南芥基因组编码序列(TAIR 9CDS，自http://arabidopsis.org/index.jsp下载)进行BLASTn比较，并鉴定遭到破坏的任何基因序列的身份，以及依照Schranz et al.(2006,11)Trend in Plant Science 11:535-542中描述的拟南芥芸苔同线性确认基因组位置。
表16：这些上述序列的BLAST搜索和位置预测(油菜基因组中的预测位置)。
表17：来自两种构建物pDAS000036和37的含单拷贝ETIP的植物的描述，针对甘蓝基因组序列数据库的BLASTn结果，通过拟南芥基因比较鉴定的基因序列的潜在破坏和预测的基因组位置。
经先前所述方法使用纯合子事件生成原生质体。随后用设计成靶向掺入ETIP序列内的锌指结合位点的锌指核酸酶和与ETIP的特定区域共享同源性的供体质粒共转化原生质体。锌指核酸酶切割ETIP基因座，而供体质粒经同源性定向修复整合在油菜细胞的基因组内。作为供体质粒整合的结果，部分DS-red转基因修复成全长DS-red转基因。通过FACS方法使用现今完全可操作的DS-red转基因的表达分选原生质体细胞。使用实施例7中所述FACS方法分选推定转基因植物，并将分离的原生质体再生成成熟植物。使用分子确认方法确认ETIP靶向植物内供体质粒的整合。照此，ETIP基因座充当供体多核苷酸序列的基因靶向整合的位点特异性基因座。
基因组靶向位置提供不改变植物正常表型的基因组位置。当ETIP事件与对照植物比较时，转基因靶定在ETIP内的产生事件呈现出没有农艺学上有意义的非预定差异。另外，整合在ETIP基因座内的转基因的蛋白质表达水平强劲表达，而且在多个基因组位置间是一致且稳定的。已公开的基因组序列SEQ ID NO:431至SEQ ID NO:446提供芸苔基因组内可靶定用于整合包含转基因的基因表达盒的基因组位置。
芸苔中ETIP的FAD2A整合的分子确认
使用DNeasy Plant Mini试剂盒TM(Qiagen)依照制造商的说明书从所有推定转基因植物的叶组织提取基因组DNA，不同的是在80μl AE缓冲液对组织进行洗提。将30mg来自再生植物的年轻叶组织在液氮中速冻，之后研磨成粉。
使用三次独立的测定法实施FAD2A基因座的分子表征。使用下述对照设计和优化测定法；包含单一随机整合转基因的已表征转基因事件，具有5个随机整合转基因的已表征转基因事件，野生型芸苔栽培品种DH12075植物和非模板对照反应。一起考虑来自三项下述分子分析的结果以提供关于ETIP经HDR在FAD2A处整合的证据。
通过实时聚合酶链式反应鉴定转基因整合
使用对hph(也称作hpt)靶基因(SEQ ID NO:447，hpt F791，5'CTTACATGCTTAGGATCGGACTTG 3'；SEQ ID NO:448，hpt R909，5'AGTTCCAGCACCAGATCTAACG 3'；SEQ ID NO:449，hpt Taqman 872，5'CCCTGAGCCCAAGCAGCATCATCG 3'FAM)(图31)和编码高迁移率组蛋白质I/Y(HMG I/Y)的参照基因(SEQ ID NO:450，F，5'CGGAGAGGGCGTGGAAGG 3'；SEQ ID NO:451，R，5'TTCGATTTGCTACAGCGTCAAC 3'；SEQ ID NO:452，探针，5'AGGCACCATCGCAGGCTTCGCT 3'HEX)特异性的引物分析每株植物的四份复制品。使用以下条件扩增反应：95℃ 10分钟，接着是40个循环的95℃ 30秒，60℃ 1分钟，在每次退火步骤结束时捕捉扩增数据。使用ΔCq方法计算拷贝数，其中ΔCq＝Cq(靶基因)–Cq(参照基因)。Livak,K.J.and T.D.Schmittgen,Analysis of relative gene expression data using real-time quantitativePCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods,2001.25(4):p.402-8。认为具有hph和HMG I/Y扩增且拷贝数为0.5或更多的植物是转基因的，而拷贝数≥0.5且≤1.2的植物评分为推定单拷贝。用FastStart Universal Probe Master(ROX)(Roche，Basel，Switzerland)在BioRad CFX96 TouchTM实时PCR检测系统上实施扩增。
遭到破坏的FAD2A ZFN位点的检测
在遭到破坏的基因座测试中对每株植物分析内源靶扩增的存在和缺失，这是显性测定法。该测定法是Green I qPCR测定法并且是单路的，但是在同一PCR板上同时运行每一项反应，靶向内源基因座(FAD2A/2C.RB.UnE.F1，SEQ ID NO:453，5’CTTCCACTCCTTCCTCCTCGT*C 3’和FAD2A/2C.RB.UnE.R1，SEQ IDNO:454，5’GCGTCCCAAAGGGTTGTTGA*G 3’)和ZFN基因座(ZFNpDAB104010在此结合并切割基因组的基因座)(FAD2A.UnE.F1，SEQ IDNO:455，5’TCTCTACTGGGCCTGCCAGGG*C 3’和FAD2A.UnE.R1，SEQ IDNO:456，5’CCCCGAGACGTTGAAGGCTAAGTACAA*A 3’)(图32)。使用以下条件扩增两对引物：98℃ 30秒，接着是35个循环(98℃ 10秒，65℃ 20秒，72℃ 90秒)，然后接着是95℃ 10秒，然后进行50℃至95℃的解链分析，每0.05秒升高0.5℃，并且在每次升高时一个平板读数。反应条件列于表18中。
表18：用于PCR扩增的单一反应试剂成分和条件。
| 反应成分 | 体积(μl) |
| 10mM dNTP | 0.40 |
| 5X Phusion HF缓冲液 | 4.00 |
| Phusion Hot Start II高保真DNA聚合酶(2U/μl)(Thermo Scientific) | 0.25 |
| 正向引物10μM | 0.40 |
| 反向引物10μM | 0.40 |
| 1:10000稀释的SYBR Green I染料(Invitrogen) | 1.00 |
| 分子生物学级别的H2O | 11.55 |
| 基因组DNA模板(约20ng/μl) | 2.00 |
| 总体积 | 20.00 |
具有内源靶扩增但没有ZFN靶扩增的植物评分为对于遭到破坏的基因座测试呈阳性，而且认为具有遭到破坏的ZFN基因座。当FAD2A基因座处的两个等位基因上的ZFN结合位点均遭到破坏时，此测定法认为是阳性的。
经同源性定向修复在FAD2A处的转基因整合的PCR检测
使用终点用PCR引物分析每一个推定植物转化体，所述引物设计成扩增转基因靶hph(hph_ExoDigPC_F1，SEQ ID NO:457，5’TTGCGCTGACGGATTCTACAAGGA 3’和hph_ExoDigPC_R1，SEQ IDNO:458，5’TCCATCAGTCCAAACAGCAGCAGA 3’)，FAD2A内源基因座(FAD2A.Out.F1，SEQ ID NO:459，5’CATAGCAGTCTCACGTCCTGGT*C 3’和FAD2A.Out.Rvs3，SEQ ID NO:460，5’GGAAGCTAAGCCATTACACTGTTCA*G 3’)，跨越经HDR插入FAD2A基因座的任何转基因的5’端，位于进入FAD2A基因座的转基因上游的区域(FAD2A.Out.F1，SEQ ID NO:461，5’CATAGCAGTCTCACGTCCTGGT*C 3’和QA520，SEQ ID NO:462，5’CCTGATCCGTTGACCTGCAG 3’)和跨越经HDR插入FAD2A基因座的任何转基因的3’端，位于进入FAD2A基因座的转基因下游的区域(QA558，SEQ ID NO:463，5’GTGTGAGGTGGCTAGGCATC 3’和FAD2A.Out.Rvs3，SEQ ID NO:464，5’GGAAGCTAAGCCATTACACTGTTCA*G 3’)(图33)。使用以下条件扩增所有引物对，98℃ 30秒，接着是35个循环(98℃ 10秒，65℃ 20秒，72℃ 90秒)。反应试剂条件如表19中所述。
表19：用于PCR扩增的单一反应试剂成分和浓度。
| 反应成分 | 体积(μl) |
| 5x Phusion HF缓冲液 | 6.00 |
| 10mM dNTP | 0.60 |
| 正向引物10μM | 0.60 |
| 反向引物10μM | 0.60 |
| Phusion Hot Start II高保真DNA聚合酶(2U/μl)(Thermo Scientific) | 0.25 |
| 分子生物学级别的H2O | 19.95 |
| 基因组DNA模板(约20ng/μl) | 2.00 |
| 总体积 | 30.0 |
5’转基因-基因组侧翼靶的扩增和/或3’转基因-基因组侧翼靶的扩增指示推定插入事件。必须注意，由于pDAS000130盒中大约1,000bp FAD2A同源臂(包含与ZFN切割位点上游和下游紧接的FAD2A区域具有100％序列同一性的多核苷酸序列)，PCR反应易出现假阳性PCR产物扩增，这是由于脱靶ETIP整合事件的扩增造成的PCR嵌合现象。hph靶的扩增确认转基因整合已发生。FAD2A靶的扩增提示FAD2A基因座是完整的或只包含部分插入。由于ETIP的大小(ETIP盒11,462bp或在包括FAD2A同源臂和ETIP盒的情况中13,472bp)，预期当完整ETIP整合入FAD2A基因座时，FAD2A引物不会扩增产物。
FAD2A编辑的Southern检测
对于具有5’基因组-转基因侧翼靶产物扩增和/或3’转基因-基因组侧翼靶扩增的植物，或没有ZFN基因座靶扩增的植物，或二者的植物进行Southern分析以检测FAD2A基因座处的转基因整合。使用改良的CTAB方法(Maguire,T.L.,G.G.Collins,and M.Sedgley,A modified CTAB DNA extraction procedurefor plants belonging to the family proteaceae.Plant Molecular Biology Reporter,1994.12(2):p.106-109)从5g叶组织纯化基因组DNA。接着，用Kpn1-HF(NewEngland BioLabs)消化12μg基因组DNA，并通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳将消化片段分开，之后使用标准Southern印迹方案转移至膜。使用针对FAD2A 5’靶区(F，SEQ ID NO:465，5'AGAGAGGAGACAGAGAGAGAGT 3'和R，SEQID NO:466，5'AGACAGCATCAAGATTTCACACA 3')，FAD2A 3’靶区(F，SEQID NO:467，5'CAACGGCGAGCGTAATCTTAG 3'和R，SEQ ID NO:468，5'GTTCCCTGGAATTGCTGATAGG 3')和hph(F，SEQ ID NO:469，5'TGTTGGTGGAAGAGGATACG 3'和R，SEQ ID NO:470，5'ATCAGCAGCAGCGATAGC 3')的引物产生探针，用以使用DIG EASY HYB(Roche，South San Francisco，CA)依照制造商的说明书检测FAD2A基因座内ETIP的存在(图34)。对于FAD2A 5’区在42℃实施杂交，对于FAD2A 3’区在45℃实施杂交，对于检测hph在42℃实施杂交。
以特定次序探查膜结合基因组DNA；首先探查FAD2A 5’序列，然后探查FAD2A 3’序列，最后探查hph序列(图35)。对此的合理情况如下。第一种探针(FAD2A 5’)是诊断性探针，若ETIP经完美HDR整合入FAD2A，则在膜上会可见5,321bp片段。产生的条带大小易于在电泳期间辨别，并会位于接近DIG标记的Roche DNA分子量标志物(Roche，Indianapolis，IN)中的5,148bp片段。膜的第二种探针是FAD2A 3’探针，而且经过编辑的植物会具有22,433bp片段，而未经编辑的植物会具有16,468bp片段。用FAD2A 3’探针鉴定的同一22,433bp片段也应受到hph探针结合和鉴定。在凝胶上难以区分这些片段，因为它们极其大，而且可能难以确定在DIG标记的Roche DNA分子量标志物中最大的21,226bp片段之上或之下出现的片段之间的任何差异。照此，这些探针提供了可加强鉴定ETIP经同源性定向修复(HDR)整合入FAD2A的证据，这通过使用FAD2A 5’探针显现5kb片段来进行。限制酶KpnI是适于在此测定法中使用的唯一限制性内切核酸酶，因为KpnI位点出现在ETIP盒中的单一位点，并且存在于FAD2A ZFN基因座的两个位点中(as KpnI sitesoccurred in a single locus of the cut the ETIP cassette in a single locus,and waspresent in two sites of the FAD2A ZFN locus)。一个位点位于FAD2A同源臂的上游，而第二个位点位于下游。另外，KpnI不是甲基化敏感的，并且可作为具有提高的保真性的重组酶获得(New England Biolabs)。
分子和Southern分析的结果
在转染、培养和选择后，将转基因植物转移至土壤。自此过程，139株植物存活，并进行组织采样用于gDNA提取和分析。对全部139株植物分析拷贝数估算。在这些139株植物中，56株是ETIP阳性的，而且56株阳性植物中11株具有推定单拷贝整合(图36)(表20)。在56株ETIP整合阳性的植物中，FAD2A 5’-基因组-转基因侧翼序列的扩增出现于7株植物中。FAD2A 3’-转基因-基因组侧翼序列的扩增不出现于ETIP整合阳性的56株植物中的任一个。此外，在转基因整合阳性的56株植物中，11株植物对遭到破坏的基因座qPCR测试是阳性的。将对于FAD2A 5’基因组-转基因侧翼序列的扩增阳性和/或对于遭到破坏的基因座qPCR测试阳性的14株植物进行Southern分析，使用上述3种探针。当使用FAD2A 5’探针，FAD2A 3’和hph探针探查时，在进行Southern分析的14株植物中，所有植物均显示FAD2A基因座内的部分整合，但这些植物无一显示FAD2A基因座处经HDR的完整全长ETIP整合的证据。没有条带看起来是i)比野生型更大和ii)与用FAD2A 3’探针探查时对那些样品观察到的条带相同(表20)。
表20：来自ETIP整合分析的结果的概述。
| 在土壤中存活的植物的数目 | 139 |
| 采样的植物的数目 | 139 |
| 完成qPCR拷贝数分析的植物的数目 | 139 |
| ETIP整合阳性的植物的数目 | 56 |
| 包含推定单拷贝插入物的植物的数目 | 11 |
| ETIP/FAD2输入-输出5'反应的数目 | 7(来自56株) |
| ETIP/FAD2输入-输出3'反应的数目 | 0(来自56株) |
| 遭到破坏的qPCR测试的基因座的数目 | 9(来自56株) |
| ETIP中靶(Southern) | 0(来自14株) |
用pDAS000130和pDAB104010转化的ETIP转基因芸苔的结果
经pDAS000130和pDAB104010转化产生的转基因油菜事件导致来自pDAS000130的ETIP多核苷酸序列的单拷贝全长T链插入FAD2A基因座内的整合。完全表征3-4例事件，并确认包含整合的ETIP。使用输入-输出PCR扩增方法完成确认，并经Southern印迹进一步验证。将选定T0事件培养至T1发育阶段。重筛选T1植物以测定整合T链的接合性。将筛选事件归类为纯合子的，半合子的，或无效的。
经先前所述方法使用纯合子事件生成原生质体。随后用设计成靶向掺入ETIP序列内的锌指结合位点的锌指核酸酶和与ETIP的特定区域共享同源性的供体质粒共转化原生质体，其中供体经HDR机制整合在ETIP内。同样地，随后用设计成靶向掺入ETIP序列内的锌指结合位点的锌指核酸酶和与ETIP的特定区域不共享同源性的供体质粒共转化原生质体，其中供体经非同源末端连接机制整合在ETIP内。锌指核酸酶切割ETIP基因座，而供体质粒经同源性定向修复或非同源末端连接整合在油菜细胞的基因组内。作为供体质粒整合的结果，部分DS-red转基因修复成全长DS-red转基因。通过FACS方法使用现今完全可操作的DS-red转基因的表达分选原生质体细胞。使用实施例7中所述FACS方法分选推定转基因植物，并将分离的原生质体再生成成熟植物。使用分子确认方法确认ETIP靶向植物内供体质粒的整合。照此，ETIP基因座充当供体多核苷酸序列的基因靶向整合的位点特异性基因座。
用锌指核酸酶和pDAS000271-pDAS000275 ETIP构建物转化的ETIP转
基因芸苔的结果
经ETIP和锌指核酸酶构建物转化产生的转基因油菜事件导致来自pDAS000273或pDAS000275的ETIP多核苷酸序列的单拷贝全长T链插入FAD3A基因座内，来自pDAS000271、pDAS000272或pDAS000274的ETIP多核苷酸序列的单拷贝全长T链插入FAD3C基因座的整合。完全表征3-4例事件，并确认包含整合的ETIP。使用输入-输出PCR扩增方法完成确认，并经Southern印迹进一步验证。将选定T0事件培养至T1发育阶段。重筛选T1植物以测定整合T链的接合性。将筛选事件归类为纯合子的，半合子的，或无效的。
经先前所述方法使用纯合子事件生成原生质体。随后用设计成靶向掺入ETIP序列内的锌指结合位点的锌指核酸酶和与ETIP的特定区域共享同源性的供体质粒共转化原生质体。锌指核酸酶切割ETIP基因座，而供体质粒经同源性定向修复整合在油菜细胞的基因组内。作为供体质粒整合的结果，部分DS-red转基因修复成全长DS-red转基因。通过FACS方法使用现今完全可操作的DS-red转基因的表达分选原生质体细胞。使用实施例7中所述FACS方法分选推定转基因植物，并将分离的原生质体再生成成熟植物。使用分子确认方法确认ETIP靶向植物内供体质粒的整合。照此，ETIP基因座充当供体多核苷酸序列的基因靶向整合的位点特异性基因座。
实施例7：基于FACS的原生质体细胞分选
使用BD Biosciences Influx-Cell分选仪TM(San Jose，CA)经FACS介导的细胞分选来分选用DS-Red对照构建物pDAS000031转染的油菜原生质体。如实施例3所述分离并转染原生质体细胞。在用pDAS000031转染细胞后，使用FACS分选仪用表21中所述条件分选细胞。
表21：用于分选用pDAS000031转染的原生质体细胞的条件。
分选和分离表达DS-red转基因的原生质体。使用分选仪对FACS分离的原生质体计数。在FACS分离后的第一天将约1x105至1.8x105个细胞放入24孔微量滴定板的一个孔中。将细胞转移至珠培养达5-20天。测试相似的条件，其中在FACS分离后的第二天将约1x104个细胞放置于2或4孔微量滴定板的一个孔中。测试的各种条件造成细胞以总分离原生质体细胞的95-98％的存活率回收。将FACS分选的原生质体细胞转移至珠培养达3-20天。将FACS分选的原生质体细胞在含1.5mg/mL潮霉素的培养基上使用上述方案再生成植物。经分子确认方案确认推定转基因植物包含来自pDAS000031的完整T链插入物。
用ZFN介导的DS-RED同源重组靶向ETIP系
获得含来自pDAS000036的T链插入物的芸苔系，并经分子表征确认包含全长、单拷贝T链。此芸苔事件标注为pDAS000036–88，并经由先前描述的方法用于生成原生质体。分离原生质体，并随后用设计成靶向掺入ETIP序列内的锌指结合位点的锌指核酸酶pDAS000074(图25)或pDAS000075(图26)和与ETIP的特定区域共享同源性的供体质粒pDAS000064，pDAS000068，pDAS000070，或pDAS000072(分别见图27，图28，图29，和图30)一起共转化约50,000个芸苔原生质体细胞。图19和图20图解说明经锌指核酸酶介导的同源重组导致Ds-red转基因位点特异性整合的同源性定向修复。锌指核酸酶设计成在限定的锌指结合序列处切割ETIP基因座，由此在基因组内产生双链断裂。接着，供体质粒经同源性定向修复整合在油菜原生质体细胞的基因组内。供体质粒的内含子-1和内含子-2区与ETIP基因座的相应内含子-1和内含子-2区共享同源性。作为供体质粒整合的结果，部分DS-red转基因修复成全长、高表达DS-red转基因。用上述FACS方法使用完全可操作的DS-red转基因的表达分选原生质体细胞。照此，ETIP基因座充当供体多核苷酸序列的靶向整合的位点特异性基因座。最后，可分选分离的原生质体并再生成成熟植物。可使用分子确认方法确认ETIP靶定植物内供体质粒的整合。
将供体质粒DNA和ZFN质粒DNA以各种浓度混合并用于转染含有事件pDAS000036–88的芸苔原生质体细胞，使用先前描述的FACS转染分选转基因原生质体细胞。表22描述了各项转染实验和用于转染包含事件pDAS000036–88的芸苔原生质体的DNA浓度。经先前描述的方法分离和制备ZFN和供体质粒DNA用于转染。
表22：用于ETIP靶向实验的供体质粒和锌指核酸酶构建物。以供体对锌指核酸酶的指示比例使用DNA浓度，每次转染总浓度30微克质粒DNA。
转染实验完成后，将原生质体在室温温育48小时，并用上述FACS方案进行分选。独立分选每一项实验，并经表达DS-red转基因的各个事件的鉴定确认锌指介导的转基因渐渗。图21-24显示FACS分选的结果。根据图表中所示结果，产生了包含完整的完全整合的DS-red转基因的多个事件。这些多个Ds-Red事件是锌指核酸酶介导的供体DNA构建物在ETIP基因组基因座内整合的结果。此位点特异性整合造成了高表达的、完整拷贝的Ds-Red转基因。Ds-Red转基因表达的频率范围为约0.03-0.07％的总的芸苔原生质体细胞(约50,000个)。然而，锌指核酸酶介导的供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的转染效率的频率则高得多，范围为约0.07-0.64％。
图21显示共转化供体质粒和ZFN质粒的转染的结果。顶部图，其中以26μg对4μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000064和锌指核酸酶pDAS000074，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.03％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转化只有约10-30％的这些芸苔原生质体细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.22-0.07％。类似地，底部图，其中以26μg对4μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000064和锌指核酸酶pDAS000075，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.03％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转染只有约10-30％的这些细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.26-0.08％。锌指介导的同源性定向修复的结果显著高于阴性对照实验，其中约50,000个原生质体中只有一个鉴定为具有红色荧光，由此导致0.00％的重组频率，如图20中所示。
图22显示共转化供体质粒和ZFN质粒的转染的结果。顶部图，其中以28μg对2μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000068和锌指核酸酶pDAS000074，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.03％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转化只有约10-30％的这些芸苔原生质体细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.22-0.07％。类似地，底部图，其中以28μg对2μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000068和锌指核酸酶pDAS000075，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.04％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转染只有约10-30％的这些细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.38-0.12％。锌指介导的同源性定向修复的结果显著高于阴性对照实验，其中约50,000个原生质体中只有一个鉴定为具有红色荧光，由此导致0.00％的重组频率，如图20中所示。
图23显示共转化供体质粒和ZFN质粒的转染的结果。顶部图，其中以28μg对2μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000070和锌指核酸酶pDAS000074，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.07％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转化只有约10-30％的这些芸苔原生质体细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.64-0.21％。类似地，底部图，其中以28μg对2μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000070和锌指核酸酶pDAS000075，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.04％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转染只有约10-30％的这些细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.34-0.11％。锌指介导的同源性定向修复的结果显著高于阴性对照实验，其中约50,000个原生质体中只有一个鉴定为具有红色荧光，由此导致0.00％的重组频率，如图20中所示。
图24显示共转化供体质粒和ZFN质粒的转染的结果。顶部图，其中以28μg对2μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000072和锌指核酸酶pDAS000074，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.07％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转化只有约10-30％的这些芸苔原生质体细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.62-0.20％。类似地，底部图，其中以28μg对2μg的质粒DNA比共转化供体pDAS000072和锌指核酸酶pDAS000075，导致供体DNA构建物以约50,000个芸苔原生质体细胞中约0.05％的重组频率经锌指核酸酶介导整合在ETIP基因组基因座内。实际上，重组频率要高得多。在转染实验期间提供的约50,000个芸苔原生质体细胞中，实际上转染只有约10-30％的这些细胞。照此，锌指核酸酶介导供体DNA构建物整合在ETIP基因组基因座内的实际转染效率的范围为约0.44-0.14％。锌指介导的同源性定向修复的结果显著高于阴性对照实验，其中约50,000个原生质体中只有一个鉴定为具有红色荧光，由此导致0.00％的重组频率，如图20中所示。
转移选定的外植体，并在含膦丝菌素的再生培养基上培养。培养期后，将存活的外植体转移至伸长培养基和根诱导培养基进行培养和植物发育。将由已发育的根和芽结构组成的完整植物转移至土壤中，并在温室中进一步繁殖。组织培养过程利用如上文先前所述培养基和培养条件。从组织培养过程产生的植物的结果显示于下文表23中。
表23：组织培养过程的结果。
FACS分选方法直接可应用于筛选任何发荧光转基因序列，并用于分离在基因组基因座内ETIP区中的特定位点内经同源性介导的修复被发荧光转基因靶定的一部分任何原生质体(本文中油菜原生质体)细胞。
虽然本文中描述了某些例示性实施方案，但是本领域普通技术人员会认识和领会可以对例示性实施方案进行许多添加、删除、和修饰而不偏离所附权利要求的范围。另外，来自一个实施方案的特征可以与另一个实施方案的特征组合。
Claims (18)
1.一种包括分离包含目的多核苷酸的植物原生质体、自一群植物细胞生成植物的方法，该方法包括：
提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体，其中该群基本上没有包含荧光标志物且不包含目的多核苷酸的植物原生质体；其中该植物原生质体由藻酸钠封装；
自该群中的其余植物原生质体分出至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体，由此分离包含目的多核苷酸的植物原生质体；
自所述分离的植物原生质体再生植物；并
培养所述植物。
2.依照权利要求1的方法，其中分出至少一个原生质体包括利用流式细胞术。
3.依照权利要求1的方法，其中分出至少一个原生质体包括利用荧光激活细胞分选(FACS)。
4.依照权利要求1的方法，其中荧光标志物为自植物原生质体中的多核苷酸表达的荧光多肽。
5.依照权利要求1的方法，其中目的多核苷酸编码目的多肽。
6.依照权利要求5的方法，其中目的多肽为锌指核酸酶。
7.依照权利要求1的方法，其中该群植物原生质体得自植物组织。
8.依照权利要求1的方法，其包括分出包含目的多核苷酸和荧光标志物的多数原生质体。
9.依照权利要求1的方法，其中植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.通过分离包含整合入植物原生质体基因组的目的多核苷酸的植物原生质体再生的植物，该方法包括：
提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体；其中该植物原生质体由藻酸钠封装；
自该群包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体回收微愈伤组织，其中该至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体已经用目的多核苷酸和编码荧光标志物的多核苷酸转化；
自所述微愈伤组织再生植物；并
培养所述植物。
11.依照权利要求9的方法，其中目的多核苷酸和编码荧光标志物的多核苷酸均存在于用于转化至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的核酸分子中。
12.依照权利要求9的方法，其中目的多核苷酸和编码荧光标志物的多核苷酸整合在至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的基因组中。
13.依照权利要求12的方法，其中目的多核苷酸和编码荧光标志物的多核苷酸以位点特异性方式整合在至少一个原生质体的基因组中。
14.依照权利要求13的方法，其中目的多核苷酸和编码荧光标志物的多核苷酸通过利用锌指核酸酶以位点特异性方式整合。
15.一种用于生成转基因植物的方法，该方法包括：
提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体，其中至少一个原生质体包含位点特异性核酸酶，使得目的多核苷酸能够通过位点特异性核酸酶的识别位点处的同源重组整合在至少一个植物原生质体的基因组中且其中该植物原生质体由藻酸钠封装；
自该群中的其余植物原生质体分出至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体；
自至少一个原生质体再生转基因植物；并
培养所述转基因植物。
16.通过依照权利要求15的方法生成的植物，其中该植物生成由目的多核苷酸编码的目的多肽。
17.通过依照权利要求15的方法生成的植物，其中该植物包含由目的多核苷酸赋予植物的价值增加性状。
18.一种生成种子的方法，其包括FACS分选、培养/优化和再生、培养植物、回收种子。
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