实施例
(7、实施例)
以下记载本发明的实施例。该实施例是用以加强理解关于本发明的专利权利范围而记载的,并非意图来限定本发明的专利权利范围。
(本发明的化合物的合成)
(合成实施例1)
(4-((1E,3E)-4-(苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)-N,N-二甲基苯胺(PBB1)的合成)
依照下列合成流程图合成PBB1。
[化44]
合成流程图
使2-(溴甲基)苯并噻唑(和光代码;Alfa Aesar,H26120)与亚磷酸三甲酯(和光代码;200-09082、204-09085)加以反应,再将所得生成物与对(二甲基氨基)肉桂醛(和光代码;045-16441、041-16443、043-16442)加以反应而获得目标化合物。
PBB1:1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δppm:8.04(d,J=7.80Hz,1H),7.90(d,J=7.80Hz,1H),7.48(dd,J=7.80Hz,7.80Hz,1H),7.36-7.43(m,4H),6.89-6.98(m,3H),6.72(d,J=8.7Hz,2H),2.96(s,6H)
(合成实施例2)
(2-((1E,3E)-4-(4-(甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB2)的合成)
依照下列合成流程图合成PBB2。
[化45]
合成流程图
(步骤1:羧酸叔丁酯2-甲基-苯并噻唑-6-基酯(1)的合成)
在2-甲基-苯并噻唑-6-醇(3.27g,19.8mmol)的无水二甲基甲酰胺(150ml)溶液中,加入三乙胺(6.58ml,47.5mmol)、以及二碳酸二叔丁酯(10.8g,49.5mmol)的无水二甲基甲酰胺(48ml)溶液。将反应混合物搅拌16小时。将反应混合物浓缩,通过柱层析将残渣精制(乙酸乙酯/己烷=1:3)。以99%(5.23g)的产率获得作为淡褐色固体的期望生成物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.91(d,J=8.8Hz,1H),7.66(d,J=2.3Hz,1H),7.25(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),2.82(s,3H),1.57(s,9H)
(步骤2:羧酸2-{4-[4-(叔丁氧羰基-甲基-氨基)-苯基]-丁-1,3-二烯基}-苯并噻唑-6-基酯叔丁基酯(2)的合成)
在羧酸叔丁基酯2-甲基-苯并噻唑-6-基酯(1)(947mg,3.57mmol)的二甲基甲酰胺(15ml)溶液中,加入微粉状的氢氧化钠(892mg,22.3mmol)。将溶液搅拌10分钟,之后滴下添加4-N-Boc-4-N-甲基-肉桂醛(933mg,3.57mmol)的二甲基甲酰胺(6.2ml)溶液。将反应混合物搅拌3.5小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释,并用水洗净。将水相用乙酸乙酯萃取5次。将合并起来的乙酸乙酯相用硫酸钠干燥并且浓缩。以柱层析将残渣精制(乙酸乙酯/己烷=1:3→1:2)。以76%(1.12g)的产率获得作为鲜黄色固体的期望生成物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.33(bs,1H),7.67(d,J=8.8Hz,1H),7.27(d,J=8.5,Hz,2H),7.18(d,J=8.5Hz,2H),7.08(dd,J=15.4,10.5Hz,1H),7.04(bs,1H),6.84(d,J=15.4Hz,1H),6.90-6.78(m,1H),6.71(dd,J=15.2,10.5Hz,1H),6.61(d,J=15.5Hz,1H),3.26(s,3H),1.51(s,9H)
(另外,4-N-Boc-4-N-甲基-肉桂醛是依照日本公开专利公报第2007-106755号所记载的方法来合成。)
(步骤3:2-[4-(4-甲基氨基-苯基)-丁-1,3-二烯基]-苯并噻唑-6-醇(3)的合成)
将羧酸2-{4-[4-(叔丁氧羰基-甲基-氨基)-苯基]-丁-1,3-二烯基}-苯并噻唑-6-基酯叔丁基酯(2)(1.07g,26.3mmol),于二氯甲烷(15.8ml)中悬浮。加入三氟乙酸(15.8ml),将红色溶液搅拌2小时。将反应混合物浓缩,并将残渣溶解于水。通过添加饱和碳酸氢钠溶液来中和溶液。生成物沉淀,将此用水洗净3次,用乙醚洗净3次。以72%(587mg)的产率获得作为红茶色固体的期望生成物。
PBB2:1H NMR(400MHz,DMF-d7)δppm 9.56(bs,1H),7.72(d,J=8.7Hz,1H),7.39(d,J=2.2Hz,1H),7.37(d,J=8.6,Hz,2H),7.28(dd,J=15.5,8.9Hz,1H),7.03(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),6.95-6.81(m,2H),6.85(d,J=15.4,Hz,1H),6.64(d,J=8.4Hz,2H),5.65(bs,1H),2.83(s,3H)
ESI-MS:m/z 309[M+H]+
(合成实施例3)
(2-((1E,3E)-4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB3)的合成)
依照下列合成流程图合成PBB3。
[化46]
(步骤1:化合物(10)的合成)
在氩气氛下,在化合物(9)(30.45g,150.0mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(450mL)中,加入3,3-二乙氧基-1-丙烯(58.58g,450.0mmol)、氯化钾(11.18g,150.0mmol)、四丁基乙酸铵(13.57g,45.0mmol)、碳酸钾(31.10g,225.0mmol)以及乙酸钯(1.68g,7.5mmol)并升温至100℃,且搅拌过夜。过滤反应液,加入乙酸乙酯以及1N盐酸并搅拌。在反应液中加入碳酸氢钠水溶液进行中和,用乙酸乙酯萃取有机层。用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿)将残渣精制而获得3.31g的标题化合物(10)。
(步骤2:化合物(11)的合成)
在氩气氛下,将化合物(6)(5.98g,18.96mmol)的四氢呋喃溶液(166mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,758mg,18.96mmol)。将反应液升温至室温,搅拌30分钟后添加化合物(10)(2.94g,16.50mmol)。原料消失后,将反应液加到水中搅拌,滤取沉淀物。在过滤物中加入甲苯,在减压下蒸馏除去溶剂,并用甲苯悬浮洗净。通过滤取沉淀物并在减压下干燥而获得4.06g的标题化合物(11)。
(步骤3:化合物(12)的合成)
在化合物(11)(3.96g,11.67mmol)的乙醇溶液(76mL)中,加入乙酸(76mL)、铁(3.06g,54.79mmol)以及12N盐酸(16mL)并搅拌过夜。将反应液在冰浴下滴下至氢氧化钠水溶液中,滤取沉淀物。在过滤物中加入甲醇,搅拌并过滤。通过在减压下蒸馏除去滤液,并以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=20/1)将残渣精制而获得1.29g的标题化合物(12)。
(步骤4:化合物(13)的合成)
在氩气氛下,将化合物(12)(1284mg,4.15mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(21mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,183mg,4.57mmol)。将反应液升温至室温,搅拌30分钟后,添加碘甲烷(556mg,3.92mmol)。将反应液加到水中搅拌,并用氯仿萃取。将有机层用饱和食盐水洗净,并用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=97/3)将残渣精制而获得188mg的标题化合物(13)。
(步骤5:2-((1E,3E)-4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB3)的合成)
在氩气氛下,将化合物(13)(184mg,0.57mmol)的二氯甲烷溶液(2.9mL)冷却至-78℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,2.85mL,2.85mmol)。将反应液升温至室温,搅拌过夜。将1N氢氧化钠水溶液以及碳酸氢钠在冰浴下加入到反应液中进行中和后,滤取沉淀物。将过滤物用水以及乙醚洗净,加入甲醇搅拌后过滤。在减压下蒸馏除去滤液后,通过以柱层析(展开剂:氯仿/甲醇=97/3→19/1)将残渣精制而获得120mg的标题化合物。
PBB3:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:9.83(s,1H),8.09(d,J=2.29Hz,1H),7.71(d,J=8.70Hz,1H),7.69(dd,J=9.16Hz,2.29Hz,1H),7.32(d,J=2.75Hz,1H),7.22(dd,J=15.57Hz,10.53Hz,1H),6.87-7.00(m,3H),6.84(d,J=15.57Hz,1H),6.83(d,J=15.11Hz,1H),6.48(d,J=8.70Hz,1H),2.80(d,J=5.04Hz,3H)
(合成实施例4)
(2-((1E,3E)-4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-5,6-二醇(PBB4)的合成)
依照下列合成流程图合成PBB4。
[化47]
(步骤1:6-叔丁氧基羰基氧-2-甲基-苯并噻唑-5-基酯叔丁基酯(4)的合成)
在2-甲基-苯并噻唑-5,6-二醇(6.22g,34.3mmol)的无水二甲基甲酰胺(260ml)溶液中,加入三乙胺(23.2ml,172mmol)、二碳酸二叔丁酯(37.4g,172mmol)的无水二甲基甲酰胺(48ml)溶液以及4-二甲基氨基吡啶(838mg,6.86mmol)。将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物浓缩,以柱层析将残渣精制(乙酸乙酯/己烷=1:4)。以93%(12.26g)的产率获得作为淡褐色固体的期望生成物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.81(s,1H),7.72(s,1H),2.82(s,3H),1.564(s,9H),1.558(s,9H)
(步骤2:{4-[4-(5,6-二羟基-苯并噻唑-2-基)-丁-1,3-二烯基]-苯基}-甲基-氨基甲酸叔丁酯(5)的合成)
在6-叔丁氧基羰基氧-2-甲基-苯并噻唑-5-基酯叔丁酯(4)(2.17g,5.7mmol)的二甲基甲酰胺(30ml)溶液中,加入微粉状的氢氧化钠(1.42g,35.6mmol)。将溶液搅拌10分钟,之后滴下添加4-N-Boc-4-N-甲基-肉桂醛(1.5g,5.74mmol)的二甲基甲酰胺(4.2ml)溶液。将反应混合物搅拌4.5小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释,并用水洗净。将水相用乙酸乙酯萃取5次。将合并起来的乙酸乙酯相用硫酸钠干燥并且浓缩。以柱层析将残渣精制(乙酸乙酯/己烷=1:1)。以27%(667mg)的产率获得作为橙-黄色固体的期望生成物。
1H NMR(400MHz,DMSO-D6)δppm 9.51(bs,1H),9.42(bs,1H),7.51(d,J=8.5,Hz,2H),7.29(d,J=8.3,Hz,2H),7.285(s,1H),7.26(s,1H),7.23-7.10(m,2H),6.95(d,J=15.1Hz,1H),6.94(d,J=15.1Hz,1H),3.19(s,3H),1.40(s,9H)
(步骤3:2-[4-(4-甲基氨基-苯基)-丁-1,3-二烯基]-苯并噻唑-5,6-二醇(6)的合成)
将{4-[4-(5,6-二羟基-苯并噻唑-2-基)-丁-1,3-二烯基]-苯基}-甲基-氨基甲酸叔丁基酯(5)(614mg,1.45mmol),于二氯甲烷(8ml)中悬浮。加入三氟乙酸(8ml),将红色溶液搅拌2小时。将反应混合物浓缩,并将残渣溶解于水。通过添加饱和碳酸氢钠溶液来中和溶液。生成物沉淀,将此用水洗净3次,用乙醚洗净3次。以58%的产率(276mg)获得作为茶色固体的期望生成物。
PBB4:1H NMR(400MHz,DMF-d7)δppm 9.60(bs,2H),7.52-7.29(m,4H),7.27(dd,J=15.2,10.6Hz,1H),6.96(dd,J=15.2,10.3Hz,1H),6.91-6.81(m,2H),6.63(d,J=8.1Hz,2H),6.06(d,J=4.1Hz,1H),2.81(d,J=4.3Hz,3H)
ESI-MS:m/z 325[M+H]+
(合成实施例5)
(2-((1E,3E)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯基)-3-乙基-6-甲氧基苯并[d]噻唑-3-鎓(mPBB5)的合成)
通过与PBB5的合成方法类似的方法来合成。
(合成实施例6)
((E)-2-(4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB2.1)的合成)
通过与下列合成实施例10类似的方法来合成。
(合成实施例7)
((E)-2-(4-(4-(甲基氨基)苯基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB2.2)的合成)
通过与下列合成实施例10类似的方法来合成。
(合成实施例8)
((E)-2-(4-(4-氨基苯基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB2.3)的合成)
通过与下列合成实施例10类似的方法来合成。
(合成实施例9)
((E)-2-(4-(6-(二甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB3.1)的合成)
通过与下列合成实施例10类似的方法来合成。
(合成实施例10)
((E)-2-(4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB3.2)的合成)
依照下列合成流程图合成PBB3.2。
[化48]
(步骤1:化合物(16)的合成)
在氩气氛下,将2-(叔丁氧羰基氨基)-5-碘吡啶(15)(640mg,2.00mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(2.9mL)冰浴后,添加碳酸铯(1088mg,3.34mmol)以及碘甲烷(497mg,3.50mmol)并搅拌。确认原料消失后,在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=50/1→庚烷/乙酸乙酯=10/1)将残渣精制而获得575mg的标题化合物(16)。
(步骤2:化合物(17)的合成)
在氩气氛下,在化合物(16)(568mg,1.70mmol)的三乙胺溶液(1.66mL,11.90mmol)中,添加碘化亚铜(39mg,0.20mmol)、2-丙炔-1-醇(191mg,3.41mmol)以及双(三苯基膦)二氯化钯(II)(24mg,0.03mmol)并搅拌。确认原料消失后,在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=4/1→庚烷/乙酸乙酯=3/2)将残渣精制而获得400mg的标题化合物(17)。
(步骤3:化合物(18)的合成)
在氩气氛下,在化合物(17)(393mg,1.50mmol)的二甲亚砜溶液(7.50mL)中,加入三乙胺(501mg,4.95mmol)以及三氧化硫吡啶络合物(716mg,4.50mmol)并搅拌。确认原料消失后,在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=20/1→庚烷/乙酸乙酯=10/1)将残渣精制而获得315mg的标题化合物(18)。
(步骤4:化合物(19)的合成)
在氩气氛下,将化合物(6)(315mg,1.00mmol)的四氢呋喃溶液(10mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,48mg,1.20mmol)。将反应液升温至室温搅拌30分钟后,添加化合物(18)(312mg,1.20mmol)。原料消失后,在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=10/1→庚烷/乙酸乙酯=5/1)将残渣精制而获得340mg的标题化合物(18)。
(步骤5:(E)-2-(4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇(PBB3.2)的合成)
在氩气氛下,将化合物(18)(336mg,0.80mmol)的二氯甲烷溶液(4.0mL)冷却至-50℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,6.38mL,6.38mmol)。将反应液升温至室温并搅拌过夜。将1N氢氧化钠水溶液以及碳酸氢钠在冰浴下加入到反应液中进行中和后,滤取沉淀物。将过滤物用水以及异丙醚洗净。通过在过滤物中加入甲醇并搅拌后,滤取沉淀物在减压下干燥而获得130mg的标题化合物(4)。
PBB3.2:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:9.95(s,1H),8.19(d,J=2.29Hz,1H),7.78(d,J=8.07Hz,1H),7.48(dd,J=8.70Hz,2.29Hz,1H),7.36(d,J=2.29Hz,1H),7.18(d,J=16.03Hz,1H),7.13(q,J=4.58Hz,1H),6.97(dd,J=8.70Hz,2.29Hz,1H),6.85(d,J=15.57Hz,1H),6.48(d,J=8.07Hz,1H),2.81(d,J=4.58Hz,3H)
(合成实施例11)
((E)-5-(4-(6-(氨甲基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-3-烯-1-炔基)-N-甲基吡啶-2-胺(PBB3.2N)的合成)
依照下列合成流程图合成PBB3.2N。
[化49]
(步骤1:2-(N-(叔丁氧羰基)-N-甲基氨基)-5-乙炔基吡啶(化合物A’)的合成)
将5-碘吡啶-2-氨基作为起始物质,参考记载了类似物质的合成法的文献来合成(N-Boc化以及甲基化:WO2010/024769、乙炔化:C.B.Aarkeroy et al.,Dalton Trans.,2006,1627)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.47(d,J=2.0Hz,1H),7.75(d,J=8.8Hz,1H),7.68(dd,J=8.8Hz,2.0Hz,1H),3.41(s,3H),3.15(s,1H),1.53(s,9H)
另外,起始物质亦即2-氨基-5-乙炔基吡啶为参照文献(C.B.Aarkeroy et al.,Dalton Trans.,2006,1627)来合成。
(步骤2:6-(溴甲基)苯并噻唑-2-甲腈(13)的合成)
在四氯化碳(34mL)中,将6-甲基苯并噻唑-2-甲腈(CAS No.39785-48-3)(1.18g,6.77mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(1.22g,6.85mmol)以及偶氮二异丁腈(0.14g,0.85mmol)回流下加以反应1小时后减压浓缩,用硅胶柱层析将残渣精制而获得作为黄白色固体的标题化合物(1.17g,4.62mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.20(d,J=8.4Hz,1H),8.01(d,J=1.6Hz,1H),7.68(dd,J=8.4Hz,1.6Hz,1H),4.64(s,2H)
(步骤3:N-(2-氰苯并噻唑-6-基甲基)亚氨基二羧酸叔丁基甲酯(14)的合成)
将亚氨基二羧酸叔丁基甲酯(0.48g,2.8mmol)的DMF(6mL)溶液冰浴,加入60%氢化钠(0.11g,2.8mmol)搅拌30分钟。其次加入6-(溴甲基)苯并噻唑-2-甲腈(0.58g,2.3mmol)的DMF(6mL)溶液,于室温搅拌30分钟。在反应混合物中加入水并用乙酸乙酯萃取,以硅胶柱层析将粗生成物精制获得作为几乎无色的液体的标题化合物(0.71g,2.0mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.17(d,J=8.4Hz,1H),7.92(d,J=1.6Hz,1H),7.60(dd,J=8.4Hz,1.6Hz,1H),5.01(s,2H),3.85(s,3H),1.45(s,9H)
(步骤4:6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-羧酸甲酯(16)的合成)
在N-(2-氰苯并噻唑-6-基甲基)亚氨基二羧酸叔丁基甲酯(0.71g,2.0mmol)的甲醇(19mL)溶液中加入5M氢氧化钠水溶液(2.05mL,10.25mmol)于室温搅拌4日。用稀盐酸中和后,加入水并用乙酸乙酯萃取,用饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸馏除去溶剂,将残渣溶解于甲醇(25mL)中,加入1M盐酸(1.04mL,1.04mmol)于室温搅拌30分钟。再加入1M盐酸(1.04mL,1.04mmol)于室温搅拌30分钟,用乙酸乙酯稀释后进行水洗、干燥、减压浓缩而获得作为几乎白色的固体的标题化合物(0.62g,2.0mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.19(d,J=8.4Hz,1H),7.90(s,1H),7.50(d,J=8.4Hz,1H),5.0(br,1H),4.49(br d,J=5.2Hz,2H),4.09(s,3H),1.48(s,9H)
(步骤5:(6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-基)甲醇(17)的合成)
在6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-羧酸甲酯(1.02g,3.16mmol)的甲醇(52mL)溶液中加入硼氢化钠(359mg,9.49mmol)于室温搅拌1小时。在反应混合物中加入水并用乙酸乙酯萃取,用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸馏除去溶剂,获得作为淡黄白色固体的标题化合物(0.93g,3.16mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.92(d,J=8.4Hz,1H),7.80(s,1H),7.38(d,J=8.4Hz,1H),5.07(s,2H),5.0(br,1H),4.44(br d,J=6.0Hz,2H),2.97(br,1H),1.47(s,9H)
(步骤6:6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-羧醛(18)的合成)
在(6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-基)甲醇(1.65g,5.61mmol)的二氯甲烷(80mL)溶液中加入戴斯-马丁试剂(2.52g,5.94mmol),于室温搅拌16小时。以硅胶柱层析将反应混合物精制,获得作为白色固体的标题化合物(1.43g,4.89mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:10.16(s,1H),8.20(d,J=8.4Hz,1H),7.93(d,J=1.6Hz,1H),7.54(dd,J=8.4Hz,1.6Hz,1H),5.0(br,1H),4.50(br d,J=6.0Hz,2H),1.48(s,9H)
(步骤7:2-((E)-2-溴乙烯基)-6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑(19)的合成)
将(溴甲基)三苯基溴化膦(2.70g,6.19mmol)悬浮于THF(27.5mL),冷却于-78℃并在-55℃以下加入叔丁醇钾(703.5mg,6.27mmol)的THF(21mL)溶液,搅拌1小时。其次加入6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-羧醛(1.43g,4.89mmol)的THF(24.5mL)溶液,于-78℃搅拌约3.5小时。使反应液于0℃附近后加入饱和碳酸氢钠水溶液(30mL),其次加入水、乙酸乙酯进行分液。将有机层干燥,减压下浓缩后以硅胶柱层析精制获得作为白色固体的标题化合物(0.64g,1.73mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.95(d,J=8.4Hz,1H),7.77(br s,1H),7.40(br d,J=8.4Hz,1H),7.395(d,J=14Hz,1H),7.388(d,J=14Hz,1H),4.9(br,1H),4.43(br d,J=6.0Hz,2H),1.47(s,9H)
(步骤8:(E)-5-(4-(6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-基)-3-丁烯-1-炔基)-2-(N-(叔丁氧羰基)-N-甲基)氨基吡啶(20)的合成)
由2-(N-(叔丁氧羰基)-N-甲基氨基)-5-乙炔基吡啶(0.83g,3.57mmol)和2-((E)-2-溴乙烯基)-6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑(0.64g,1.73mmol),以与下述合成实施例33的步骤5同样的程序获得标题化合物(0.68g,1.31mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.49(d,J=1.6Hz,1H),7.96(d,J=8.4Hz,1H),7.81(d,J=8.8Hz,1H),7.78(br s,1H),7.70(dd,J=8.8Hz,2.4Hz,1H),7.40(brd,J=8.4Hz,1H),7.25(d,J=16.0Hz,1H),6.84(d,J=16.0Hz,1H),4.95(br,1H),4.45(br d,J=5.2Hz,2H),3.40(s,3H),1.54(s,9H),1.48(s,9H)
(步骤9:(E)-5-(4-(6-(氨甲基)苯并噻唑-2-基)-3-丁烯-1-炔基)-2-(甲基氨基)吡啶(PBB3.2N)的合成)
将(E)-5-(4-(6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑-2-基)-3-丁烯-1-炔基)-2-(N-(叔丁氧羰基)-N-甲基)氨基吡啶(0.28g,0.54mmol)加入到二氯甲烷(4.4mL)与三氟乙酸(4.4mL)的混合液中,于室温搅拌3.5小时后减压浓缩。在残渣中加入碳酸氢钠饱和水溶液,短暂搅拌后滤取固体,水洗数次后于25℃减压干燥而获得作为橙色粉末固体的标题化合物(168.5mg,0.527mmol)。
PBB3.2N:1H-NMR(400MHz,CD3OD)δppm:8.13(d,J=1.6Hz,1H),7.93(d,J=1.2Hz,1H),7.89(d,J=8.4Hz,1H),7.52-7.48(m,2H),7.16(d,J=16.0Hz,1H),6.94(d,J=16.0Hz,1H),6.50(dd,J=8.8Hz,0.4Hz,1H),3.94(s,2H),2.89(s,3H)
(合成实施例12)
(2-((1E,3E)-4-(4-氨基苯基)丁-1,3-二烯基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-5-醇(Core1-4)的合成)
[化50]
(步骤1:1-(苄氧基)-4-溴-2-甲氧基苯(2)的合成)
在1(15g,73.8mmol)的DMF(150mL)溶液中,加入K2CO3(30.5g,221mmol)以及溴化苄(18.9g,171mmol),于100℃搅拌2小时。通过加入水使反应终止,并用EtOAc萃取。将合并起来的有机相浓缩。精制粗生成物,获得2(17.6g,86%)。
(步骤2:1-(苄氧基)-4-溴-2-甲氧基-5-硝基苯(3)的合成)
将2(6.73g,24mmol)于-10℃加入到浓HNO3(20mL,418mmol)的冰醋酸(96mL)溶液中,搅拌2小时。过滤悬浮固体并干燥,获得3(7.6g,97%)。
(步骤3:5-(苄氧基)-2-溴-4-甲氧基苯胺(4)的合成)
在3(8g,23.7mmol)的乙醇(200mL)以及水(20mL)溶液中,于0℃滴下添加浓HCl(5mL)。在0℃向该溶液中加入铁粉(7.95g,142mmol)并于室温搅拌2小时。将反应块通过硅藻土床来过滤,用10N NaOH将滤液碱化,并以EtOAc萃取。将合并起来的有机相浓缩。精制粗生成物,获得4(5.1g,70%)。
(步骤4:N-(5-(苄氧基)-2-溴-4-甲氧基苯基)乙酰胺(5)的合成)
在4(5.1g,16.56mmol)的吡啶(30mL)溶液中,于0℃加入无水醋酸(1.56mL,16.56mmol),于室温搅拌1小时。将反应块在减压下浓缩,将获得的残渣用水稀释,并用EtOAc萃取。将合并起来的有机相浓缩。将粗生成物精制,获得5(5.0g,86%)。
(步骤5:(N-(5-(苄氧基)-2-溴-4-甲氧基苯基)乙硫酰胺(6)的合成)
在5(5.0g,14.3mmol)的甲苯(50mL)搅拌溶液中,加入吡啶(2.5mL,28.5mmol)、劳森试剂(7.5g,18.6mmol),将反应混合物于120℃搅拌2小时。将反应混合物在室温下冷却,除去溶剂。之后,加入水,用EtOAc萃取。将合并起来的有机相浓缩。将粗生成物精制,获得6(3.2g,61%)。
(步骤6:5-(苄氧基)-6-甲氧基-2-甲基苯并[d]噻唑(7)的合成)
在6(2.9g,7.9mmol)的NMP(200mL)溶液中于室温加入NaH(0.286g,1.2mmol)。将反应混合物于150℃搅拌2小时。之后,将反应在室温下冷却,以冰水淬冷并用EtOAc萃取。将合并起来的有机相浓缩。以柱层析将粗生成物精制,获得7(1.5g,66%)。
(步骤7:6-甲氧基-2-甲基苯并[d]噻唑-5-醇(8)的合成)
在7(0.92g,3.22mmol)以及二甲基苯胺(2.49g,20.9mmol)的二氯甲烷(35mL)溶液中,于-5℃加入AlCl3(2.36g,17.7mmol)。将反应物于-5℃搅拌10分钟,之后,加入冰水淬冷并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩。通过柱层析将粗生成物精制,获得8(0.52g,82%)。
(步骤8:5-(叔丁基二甲基硅氧基)-6-甲氧基-2-甲基苯并[d]噻唑(9)的合成)
在8(0.52g,mmol)的DMF(5mL)溶液中,于0℃加入咪唑(0.583g,8.6mmol)。将反应液于0℃搅拌10分钟,之后加入TBDMSCl(0.95g,6.3mmol)。将反应混合物于室温搅拌2.5小时。通过加入水使反应终止,并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩。通过柱层析将粗生成物精制,获得9(0.55g,66%)。
(步骤9:2-(溴甲基)-5-(叔丁基二甲基硅氧基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑(10)的合成)
在9(1g,3.23mmol)的CCl4(10mL)溶液中,于室温加入NBS(0.690g,3.88mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。通过柱层析将粗生成物精制,获得10(0.55g,44%)。
(步骤10:二乙基(5-羟基-6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(11)的合成)
将10(0.55g,1.4mmol)以及亚磷酸三乙酯(0.23g,1.4mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得11(0.31g,65%)。
(步骤11:6-甲氧基-2-((1E,3E)-4-(4-硝基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-5-醇(12)的合成)
在11(0.33g,0.99mmol)的DMF(3mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.1g,1.86mmol),于相同温度搅拌30分钟。向其中加入(4-硝基苯基)丙烯醛(0.11g,0.62mmol),搅拌30分钟。将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取。将合并起来的有机相浓缩干燥,获得12(210mg)。不进行精制,在其次的步骤中使用。
(步骤12:2-((1E,3E)-4-(4-氨基苯基)丁-1,3-二烯基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑-5-醇(Core1-4)的合成)
将12(0.55g,1.6mmol)、铁粉(0.73g,12.8mmol)以及饱和NH4Cl溶液(2mL)的EtOH(10mL)混合液,在80℃加热1小时。之后,将反应块冷却并通过硅藻土床来过滤。浓缩滤液,将获得的残渣用水稀释并以EtOAc萃取。将有机相浓缩干燥,获得450mg的Core1-4。将其中180mg以制备型HPLC处理,获得Core1-4(73mg)。
Core1-4:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.55(s,1H),7.39(d,J=8.0Hz,2H),7.31-7.20(m,2H),7.04-6.77(m,5H),4.8(bs,1H)3.94(s,3H)
(合成实施例13)
(N-(4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯基)乙酰胺(Core1-5)的合成)
依照下列合成流程图合成Core1-5。
[化51]
(步骤1:(E)-3-(4-硝基苯基)丙烯醛(B)的合成)
在4-硝基苯甲醛(25g,165mmol)以及乙醛(50mL,900mmol)的混合液中,于0℃~-5℃滴下添加20%氢氧化钾MeOH溶液(6mL)至获得碱性反应为止。至反应混合物固化为止,于相同温度搅拌反应液。向其中加入无水醋酸(80mL),将混合物于100℃加热30分钟。之后,将溶液注入温水(500mL)中,并加入浓HCl(32mL)。将获得的混合物于100℃加热20分钟。静置一晩,通过过滤收集结晶并用水洗净,获得B(20g,68%)。
(步骤2:2-(溴甲基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(2)的合成)
在1(5g,23.9mmol)的CCl4溶液(50mL)中,于室温加入NBS(5.11g,28.7mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得2(3.0g,43%)。
(步骤3:二乙基(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(3)的合成)
将2(3g,10.46mmol)以及亚磷酸三乙酯(2g,11.45mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得3(3.3g,92%)。
(步骤4:5,6-二甲氧基-2-((1E,3E)-4-(4-硝基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑(4)的合成)
在3(0.30g,0.85mmol)的DMF(3mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.085g,1.6mmol),并以相同温度搅拌30分钟。向其中加入(4-硝基苯基)丙烯醛(0.14g,0.79mmol),搅拌30分钟。将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取,将合并起来的有机相浓缩,并通过柱精制,获得4(0.21g,65%)。
(步骤5:4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯胺(5)的合成)
在4(0.05g,0.13mmol)的EtOH(1mL)溶液中,加入铁粉(0.06g,1.1mmol)以及饱和氯化铵水溶液(1mL)。将反应混合物回流30分钟。之后,将反应块冷却并通过硅藻土床(celite bed)来过滤。将滤液浓缩干燥,获得5(40mg,88%)。
(步骤6:N-(4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯基)乙酰胺(Core1-5)的合成)
在5(0.05g,0.15mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中,加入三乙胺(0.037g,0.37mmol)以及无水醋酸(0.029g,0.37mmol)。将反应混合液于室温搅拌1小时。将反应混合液以水稀释,并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩,并通过制备型HPLC来精制,获得Core1-5(0.02g,36%)。
Core1-5:1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.60-6.74(m,10H),3.98(s,6H),2.21(s,3H)
(合成实施例14)
(3-(4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯基氨基)丙-1-醇(Core1-11)的合成)
依照下列合成流程图合成Core1-11。
[化52]
(步骤1:(E)-3-(4-硝基苯基)丙烯醛(B)的合成)
在4-硝基苯甲醛(25g,165mmol)以及乙醛(50mL,900mmol)的混合液中,于0℃~-5℃滴下添加20%氢氧化钾MeOH溶液(6mL)至获得碱性反应为止。至反应混合物固化为止,于相同温度搅拌反应液。向其中加入无水醋酸(80mL),将混合物于100℃加热30分钟。之后,将溶液注入温水(500mL)中,并加入浓HCl(32mL)。将获得的混合物于100℃加热20分钟。静置一晩,通过过滤收集结晶并用水洗净,获得B(20g,68%)。
(步骤2:2-(溴甲基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(2)的合成)
在1(5g,23.9mmol)的CCl4溶液(50mL)中,于室温加入NBS(5.11g,28.7mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得2(3.0g,43%)。
(步骤3:二乙基(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(3)的合成)
将2(3g,10.46mmol)以及亚磷酸三乙酯(2g,11.45mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得3(3.3g,92%)。
(步骤4:5,6-二甲氧基-2-((1E,3E)-4-(4-硝基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑(4)的合成)
在3(0.30g,0.85mmol)的DMF(3mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.085g,1.6mmol),并以相同温度搅拌30分钟。向其中加入(4-硝基苯基)丙烯醛(0.14g,0.79mmol),搅拌30分钟。将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取,将合并起来的有机相浓缩,并通过柱精制,获得4(0.21g,65%)。
(步骤5:4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯胺(5)的合成)
在4(0.05g,0.13mmol)的EtOH(1mL)溶液中,加入铁粉(0.06g,1.1mmol)以及饱和氯化铵水溶液(1mL)。将反应混合物回流30分钟。之后,将反应块冷却并通过硅藻土床(celite bed)来过滤。将滤液浓缩干燥,获得5(40mg,88%)。
(步骤6:3-(4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯-1-基)苯基氨基)丙-1-醇(Core1-11)的合成)
在5(0.3g,0.88mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中,加入三乙胺(0.22g,2.21mmol)以及3-溴-1-丙醇(0.3g,2.21mmol)。将反应混合液于室温搅拌1小时。将反应混合液以水稀释,并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩,并通过制备型HPLC来精制,获得Core1-11(0.06g,17%)。
Core1-11:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.59(s,1H),7.45(s,1H),7.36-7.17(m,3H),6.91-6.79(m,3H),6.60(d,J=8.3Hz,2H),3.84(d,J=2.0Hz,6H),3.50(t,J=6.2,6.2Hz,2H),3.11(t,J=7.0,7.0Hz,2H),1.70(m,2H)
(合成实施例15)
(4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)-N-异丙基苯胺(Core1-15)的合成)
依照下列合成流程图合成Core1-15。
[化53]
(步骤1:(E)-3-(4-硝基苯基)丙烯醛(B)的合成)
在4-硝基苯甲醛(25g,165mmol)以及乙醛(50mL,900mmol)的混合液中,于0℃~-5℃滴下添加20%氢氧化钾MeOH溶液(6mL)至获得碱性反应为止。至反应混合物固化为止,于相同温度搅拌反应液。向其中加入无水醋酸(80mL),将混合物于100℃加热30分钟。之后,将溶液注入温水(500mL)中,并加入浓HCl(32mL)。将获得的混合物于100℃加热20分钟。静置一晩,通过过滤收集结晶并用水洗净,获得B(20g,68%)。
(步骤2:2-(溴甲基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(2)的合成)
在1(5g,23.9mmol)的CCl4溶液(50mL)中,于室温加入NBS(5.11g,28.7mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得2(3.0g,43%)。
(步骤3:二乙基(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(3)的合成)
将2(3g,10.46mmol)以及亚磷酸三乙酯(2g,11.45mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得3(3.3g,92%)。
(步骤4:5,6-二甲氧基-2-((1E,3E)-4-(4-硝基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑(4)的合成)
在3(0.30g,0.85mmol)的DMF(3mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.085g,1.6mmol),并以相同温度搅拌30分钟。向其中加入(4-硝基苯基)丙烯醛(0.14g,0.79mmol),搅拌30分钟。将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取,将合并起来的有机相浓缩,并通过柱精制,获得4(0.21g,65%)。
(步骤5:4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯胺(5)的合成)
在4(0.05g,0.13mmol)的EtOH(1mL)溶液中,加入铁粉(0.06g,1.1mmol)以及饱和氯化铵水溶液(1mL)。将反应混合物回流30分钟。之后,将反应块冷却并通过硅藻土床(celite bed)来过滤。将滤液浓缩干燥,获得5(40mg,88%)。
(步骤6:4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯-1-基)-N-异丙基苯胺(Core1-15)的合成)
在5(0.05g,0.15mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中,加入三乙胺(0.037g,0.37mmol)以及2-溴丙烷(0.045g,0.37mmol)。将反应混合液于室温搅拌1小时。将反应混合液以水稀释,并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩,并通过制备型HPLC来精制,获得Core1-15(0.023g,41%)。
Core1-15:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72–7.17(m,7H),7.10–6.55(m,6H),5.76(s,1H),3.84(s,6H),1.23(m,1H)1.16(dd,J=6.1,3.3Hz,6H)
(合成实施例16)
(4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)-N-(庚-1,6-二烯-4-基)苯胺(Core1-20)的合成)
依照下列合成流程图合成Core1-20。
[化54]
(步骤1:(E)-3-(4-硝基苯基)丙烯醛(B)的合成)
在4-硝基苯甲醛(25g,165mmol)以及乙醛(50mL,900mmol)的混合液中,于0℃~-5℃滴下添加20%氢氧化钾MeOH溶液(6mL)至获得碱性反应为止。至反应混合物固化为止,于相同温度搅拌反应液。向其中加入无水醋酸(80mL),将混合物于100℃加热30分钟。之后,将溶液注入温水(500mL)中,并加入浓HCl(32mL)。将获得的混合物于100℃加热20分钟。静置一晩,通过过滤收集结晶并用水洗净,获得B(20g,68%)。
(步骤2:2-(溴甲基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(2)的合成)
在1(5g,23.9mmol)的CCl4溶液(50mL)中,于室温加入NBS(5.11g,28.7mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得2(3.0g,43%)。
(步骤3:二乙基(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(3)的合成)
将2(3g,10.46mmol)以及亚磷酸三乙酯(2g,11.45mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得3(3.3g,92%)。
(步骤4:5,6-二甲氧基-2-((1E,3E)-4-(4-硝基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑(4)的合成)
在3(0.30g,0.85mmol)的DMF(3mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.085g,1.6mmol),并以相同温度搅拌30分钟。向其中加入(4-硝基苯基)丙烯醛(0.14g,0.79mmol),搅拌30分钟。将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取,将合并起来的有机相浓缩,并通过柱精制,获得4(0.21g,65%)。
(步骤5:4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯胺(5)的合成)
在4(0.05g,0.13mmol)的EtOH(1mL)溶液中,加入铁粉(0.06g,1.1mmol)以及饱和氯化铵水溶液(1mL)。将反应混合物回流30分钟。之后,将反应块冷却并通过硅藻土床(celite bed)来过滤。将滤液浓缩干燥,获得5(40mg,88%)。
(步骤6:4-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯-1-基)-N-(庚-1,6-二烯-4-基)苯胺(Core1-20)的合成)
在5(0.05g,0.15mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中,加入三乙胺(0.037g,0.37mmol)以及烯丙基溴(0.044g,0.37mmol)。将反应混合液于室温搅拌1小时。将反应混合液以水稀释,并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩,并通过制备型HPLC来精制,获得Core1-20(0.026g,41.2%)。
Core1-20:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.597.18(m,5H),6.93-6.81(m,3H),6.68(d,J=8.6Hz,2H),5.86(m,2H),5.24-5.06(m,4H),3.97(d,J=5.2Hz,4H),3.84(d,J=2.1Hz,6H)
(合成实施例17)
(N-(5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-基)乙酰胺(Core2-9)的合成)
依照下列合成流程图合成Core2-9。
[化55]
(步骤1:(E)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙烯醛(B)的合成)
在2,5-二溴吡啶(2.37g,10mmol)的THF(5mL)溶液中,于室温加入异丙基氯化镁(THF中2.0M,5mL,10mmol)。将获得的悬浮液搅拌1小时,之后,冷却于0℃。加入3-二甲基氨基丙烯醛(1.3mL,12.36mmol),将混合物在室温回温并搅拌2小时。通过在0℃加入冰使反应终止,并用2N HCl酸化。之后,用EtOAc稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得B(0.45g,21%)。
(步骤2:2-(溴甲基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(2)的合成)
在1(5g,23.9mmol)的CCl4(50mL)溶液中,于室温加入NBS(5.11g,28.7mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得2(3.0g,43%)。
(步骤3:二乙基(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(3)的合成)
将2(3g,10.46mmol)以及亚磷酸三乙酯(2g,11.45mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得3(3.3g,92%)。
(步骤4:2-((1E,3E)-4-(6-溴吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(4)的合成)
在3(0.50g,1.44mmol)的DMF(5mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.10g,1.96mmol),于相同温度搅拌30分钟。向其中加入B(0.27g,1.3mmol)并搅拌30分钟,将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取,将合并起来的有机相浓缩,并通过柱精制,获得4(0.512g,85%)。
(步骤5:5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯-1-基)吡啶-2-胺(5)的合成)
在密封管内加入4(0.5g,1.24mmol)以及氨水(10mL)的混合物,将反应混合物回流4小时。将反应混合物浓缩,并通过管柱精制,获得5(0.2g,47.6%)。
(步骤6:N-(5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯-1-基)吡啶-2-基)乙酰胺(Core2-9)的合成)
在5(0.2g,0.589mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中,加入三乙胺(0.148g,1.47mmol)以及无水醋酸(0.15g,1.47mmol)。将反应混合液于室温搅拌1小时。将反应混合液以水稀释,并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩,通过制备型HPLC来精制,获得Core2-9(0.04g,18%)。
Core2-9:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.62(s,1H),8.45(s,1H),8.09(d,J=8.7Hz,1H),8.00(dd,J=8.7,2.3Hz,1H),7.63(s,1H),7.49(s,1H),7.38-7.16(m,2H),6.98(m,2H),3.85(s,6H),2.10(s,3H)
(合成实施例18)
(3-(5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-基氨基)丙-1-醇(Core2-10)的合成)
依照下列合成流程图合成Core2-10。
[化56]
(步骤1:(E)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙烯醛(B)的合成)
在2,5-二溴吡啶(2.37g,10mmol)的THF(5mL)溶液中,于室温加入异丙基氯化镁(THF中2.0M,5mL,10mmol)。将获得的悬浮液搅拌1小时,之后,冷却于0℃。加入3-二甲基氨基丙烯醛(1.3mL,12.36mmol),将混合物在室温回温并搅拌2小时。通过在0℃加入冰使反应终止,并用2N HCl酸化。之后,用EtOAc稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得B(0.45g,21%)。
(步骤2:2-(溴甲基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(2)的合成)
在1(5g,23.9mmol)的CCl4(50mL)溶液中,于室温加入NBS(5.11g,28.7mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得2(3.0g,43%)。
(步骤3:二乙基(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(3)的合成)
将2(3g,10.46mmol)以及亚磷酸三乙酯(2g,11.45mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得3(3.3g,92%)。
(步骤4:2-((1E,3E)-4-(6-溴吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(4)的合成)
在3(0.50g,1.44mmol)的DMF(5mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.10g,1.96mmol),于相同温度搅拌30分钟。向其中加入B(0.27g,1.3mmol)并搅拌30分钟,将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取,将合并起来的有机相浓缩,并通过柱精制,获得4(0.512g,85%)。
(步骤5:3-(5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-基氨基)丙-1-醇(Core2-10)的合成)
在密封管内,将4(0.2g,0.49mmol)、3-氨基丙醇(0.3g,4.96mmol)、三乙胺(0.25g,0.2.48mmol)的DMF(5mL)混合液于120℃搅拌16小时。将反应混合物以水稀释,并用EtOAc萃取。将合并起来的有机相浓缩,并以制备型HPLC来精制,获得Core2-10(0.04g,20%)。
Core2-10:1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.87(s,1H),8.03(d,J=9.7Hz,1H),7.81(s,1H),7.56(s,1H),7.23(d,J=13.9Hz,2H),7.09(d,J=15.4Hz,1H),6.90(m,2H),6.66(d,J=15.5Hz,1H),3.99(d,J=2.5Hz,6H),3.82(t,J=5.8,5.8Hz,2H),3.53(t,J=6.7,6.7Hz,2H),1.97(m,2H)
(合成实施例19)
(N,N-二烯丙基-5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-胺(Core2-14)的合成)
依照下列合成流程图合成Core2-14。
[化57]
(步骤1:(E)-3-(6-溴吡啶-3-基)丙烯醛(B)的合成)
在2,5-二溴吡啶(2.37g,10mmol)的THF(5mL)溶液中,于室温加入异丙基氯化镁(THF中2.0M,5mL,10mmol)。将获得的悬浮液搅拌1小时,之后,冷却于0℃。加入3-二甲基氨基丙烯醛(1.3mL,12.36mmol),将混合物在室温回温并搅拌2小时。通过在0℃加入冰使反应终止,并用2N HCl酸化。之后,用EtOAc稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得B(0.45g,21%)。
(步骤2:2-(溴甲基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(2)的合成)
在1(5g,23.9mmol)的CCl4(50mL)溶液中,于室温加入NBS(5.11g,28.7mmol)以及催化剂量的AIBN。将Philips*IR 250W*灯以维持回流的方式,放置于离反应烧瓶一定的距离。将反应混合物回流2小时,之后用二氯甲烷稀释并以水洗净。分离有机相并浓缩。将粗生成物精制,获得2(3.0g,43%)。
(步骤3:二乙基(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)甲基膦酸酯(3)的合成)
将2(3g,10.46mmol)以及亚磷酸三乙酯(2g,11.45mmol)的混合物,在100℃加热2小时。通过柱层析将粗生成物精制,获得3(3.3g,92%)。
(步骤4:2-((1E,3E)-4-(6-溴吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)-5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑(4)的合成)
在3(0.50g,1.44mmol)的DMF(5mL)搅拌溶液中,于0℃加入甲醇钠(0.10g,1.96mmol),于相同温度搅拌30分钟。向其中加入B(0.27g,1.3mmol)并搅拌30分钟,将反应以水淬冷,并用柠檬酸酸化。之后,将反应混合物用EtOAc萃取,将合并起来的有机相浓缩,并通过柱精制,获得4(0.512g,85%)。
(步骤5:5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯-1-基)吡啶-2-胺(5)的合成)
在密封管内加入4(0.5g,1.24mmol)以及氨水(10mL)的混合物,将反应混合物回流4小时。将反应混合物浓缩,并通过柱精制,获得5(0.2g,47.6%)。
(步骤6:N,N-二烯丙基-5-((1E,3E)-4-(5,6-二甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯-1-基)吡啶-2-胺(Core2-14)的合成)
在5(0.2g,0.589mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中,加入三乙胺(0.148g,1.47mmol)以及烯丙基溴(0.18g,1.47mmol)。将反应混合液于室温搅拌1小时。将反应混合液以水稀释,并用二氯甲烷萃取。将合并起来的有机相浓缩,通过制备型HPLC来精制,获得Core2-14(0.03g,12%)。
Core2-14:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.16(d,J=2.5Hz,1H),7.93-7.85(m,1H),7.61(s,1H),7.47(s,1H),7.26(dd,J=15.3,10.6Hz,1H),7.04(dd,J=15.5,10.6Hz,1H),6.95-6.69(m,3H),5.86(m,2H),5.21-5.13(m,4H),4.16(d,J=5.2Hz,4H),3.84(d,J=1.8Hz,6H)
(合成实施例20-1)
(1-氟-2-(2-((1E,3E)-4-(6-(二甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)-2-羟基甲基-乙烷(F0-PBB3类似物)的合成)
依照下列合成流程图合成F0-PBB3类似物。
[化58]
(步骤1:化合物(30)的合成)
在氩气氛下,在化合物(23)(819mg,2.86mmol)中加入四丁基氟化铵(1.0M四氢呋喃溶液,3.15mL,3.15mmol)并加热回流。将反应液冷却至室温并加入水用乙醚萃取。用水洗净有机层,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去乙醚。在残渣中加入甲醇(4.3mL)并冰浴,加入4N盐酸/二氧六环(1.4mL)升温至室温后,搅拌过夜。在减压下蒸馏除去反应液,在反应液中加入四氢呋喃(4.0mL)以及咪唑(131mg,1.92mmol)并冰浴。在反应液中加入叔丁基二甲基氯硅烷(247mg,1.64mmol)并将反应液升温至室温后,搅拌过夜。在反应液中加入水并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=20/1→10/1)将残渣精制而获得199mg的标题化合物(30)。
(步骤2:化合物(31)的合成)
在氩气氛下,在化合物(28)(140mg,0.43mmol)的四氢呋喃溶液(4.3mL)中加入化合物(30)(180mg,0.86mmol)以及三苯膦(226mg,0.86mmol)并冰浴。在反应液中滴下偶氮二羧酸二异丙酯(174mg,0.86mmol)。将反应液于室温升温,并搅拌过夜后,在减压下蒸馏除去反应液。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=5/1→1/1)将残渣精制而获得200mg的标题化合物(31)。
(步骤3:化合物(6)的合成)
在化合物(31)(196mg,0.38mmol)的四氢呋喃溶液(5.7mL)中加入4N盐酸/二氧六环(1.9mL)并搅拌。原料消失后,将反应液冰浴,用碳酸氢钠水溶液中和后,用乙酸乙酯萃取反应液。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=2/1→1/4)将残渣精制而获得117mg的标题化合物(6)。
化合物(6):1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.20(d,J=2.29Hz,1H),7.80(dd,J=9.16Hz,1.83Hz,2H),7.72(d,J=2.29Hz,1H),7.30(dd,J=15.57Hz,10.08Hz,1H),7.14(dd,J=8.70Hz,2.29Hz,1H),7.01(dd,J=15.11Hz,10.53Hz,1H),6.91(d,J=15.57Hz,1H),6.88(d,J=15.57Hz,1H),6.70(d,J=9.16Hz,1H),5.07(t,J=5.50Hz,1H),4.55-4.85(m,3H),3.63-3.68(m,2H),3.07(s,6H)
(合成实施例20-2)
(1-氟-3-(2-((1E,3E)-4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)丙-2-醇(F0-PBB3)的合成)
能够通过与上述合成实施例20-1同样的方法来合成。
(合成实施例21)
((E)-1-氟-3-(2-(4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)丙-2-醇(F0-PBB3.2)的合成)
能够通过与上述合成实施例20-1同样的方法来合成。
(合成实施例22)
(2-((1E,3E)-4-(2-氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇(F1-PBB3)的合成)
能够通过与上述合成实施例20-1类似的方法来合成。
(合成实施例23)
((E)-2-(4-(2-氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇(F1-PBB3.2)的合成)
能够通过与上述合成实施例20-1类似的方法来合成。
(合成实施例24)
(2-((1E,3E)-4-(2-氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并呋喃-5-醇(F1-PBBf3)的合成)
能够通过与上述合成实施例20-1类似的方法来合成。
(合成实施例25)
((E)-2-(4-(2-氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并呋喃-5-醇(F1-PBBf3.2)的合成)
能够通过与上述合成实施例20-1类似的方法来合成。
(合成实施例26)
(2-((1E,3E)-4-(6-(二甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)喹啉-6-醇(PBQ3.0)的合成)
依照下列合成流程图合成PBQ3.0。
[化59]
(步骤1:化合物(21)的合成)
在氩气氛下,将化合物(18)(1213mg,4.00mmol)的四氢呋喃溶液(80mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,960mg,24.00mmol)。将反应液升温至室温,搅拌30分钟后,添加碘甲烷(3407mg,24.00mmol)。将反应液加到水中搅拌,用氯仿萃取。用饱和食盐水将有机层洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=97/3)将残渣精制而获得804mg的标题化合物(21)。
(步骤2:PBQ3.0的合成)
在氩气氛下,将化合物(21)(800mg,2.41mmol)的二氯甲烷溶液(80mL)冷却至-40℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,12.1mL,12.10mmol)。将反应液升温至5℃,并搅拌过夜。将氢氧化钠水溶液在冰浴下加入到反应液中进行中和后,用氯仿萃取有机层。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=19/1)将残渣精制。在精制物中加入甲醇并悬浮洗净,滤取沉淀物。通过将过滤物在减压下干燥而获得110mg的PBQ3.0。
PBQ3.0:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:9.96(s,1H),8.19(d,J=2.29Hz,1H),8.05(d,J=8.69Hz,1H),7.79(dd,J=9.15Hz,2.29Hz,1H),7.77(d,J=9.15Hz,1H),7.62(d,J=8.69Hz,1H),7.47(dd,J=15.10Hz,10.52Hz,1H),7.26(dd,J=9.15Hz,2.75Hz,1H),7.09(d,J=2.29Hz,1H),6.99(dd,J=15.10Hz,10.52Hz,1H),6.78(d,J=15.55Hz,1H),6.77(d,J=15.10Hz,1H),6.68(d,J=8.69Hz,1H),3.06(s,6H)
(合成实施例27)
(2-((1E,3E)-4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)喹啉-6-醇(PBQ3)的合成)
依照下列合成流程图合成PBQ3。
[化60]
(步骤1:化合物(17)的合成)
在氩气氛下,将化合物(8)(17,60g,56.9mmol)的四氢呋喃溶液(200mL)冰浴后,滴下叔丁基锂(1.61M己烷溶液,38.9mL,62.6mmol)。将反应液搅拌60分钟后,滴下化合物(16)(10.14g,56.9mmol)的四氢呋喃溶液(100mL)。将反应液升温至室温且原料消失后,在反应液中加入水,并用氯仿萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/乙酸乙酯=19/1)将残渣精制而获得5.60g的标题化合物(17)。
(步骤2:化合物(18)的合成)
在化合物(17)(5.00g,15.00mmol)的乙醇溶液(500mL)中,加入乙酸(250mL)、铁(3.94g,70.5mmol)以及12N盐酸(21mL)。将反应液升温至70℃,确认到原料消失后冰浴。在反应液中滴下氢氧化钠水溶液,且加入氯仿后,将反应液进行硅藻土过滤。将滤液用氯仿萃取,在减压下蒸馏除去有机层。通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=50/1)将残渣精制而获得3.01g的标题化合物(18)。
(步骤3:化合物(19)的合成)
在化合物(18)(1402mg,4.62mmol)的四氢呋喃溶液(40mL)中加入叔丁醇(200mL)以及二碳酸二叔丁酯(1109mg,5.08mmol)并升温至35℃搅拌过夜。在减压下蒸馏除去反应液,通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=24/1)将残渣精制而获得1078mg的标题化合物(19)。
(步骤4:化合物(20)的合成)
在氩气氛下,将化合物(19)(1074mg,2.66mmol)的四氢呋喃溶液(133mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,319mg,7.99mmol)。将反应液升温至室温,搅拌30分钟后添加碘甲烷(1133mg,7.99mmol)。将反应液加到水中搅拌,并用氯仿萃取。将有机层用饱和食盐水洗净,并用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=97/3)将残渣精制而获得701mg的标题化合物(20)。
(步骤5:PBQ3的合成)
在氩气氛下,将化合物(20)(670mg,1.60mmol)的二氯甲烷溶液(60mL)冷却至-40℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,8.02mL,8.02mmol)。将反应液升温至0℃,搅拌过夜。将反应液升温至10℃,搅拌60分钟。将甲醇以及碳酸氢钠在冰浴下加入到反应液中进行中和后,用二氯甲烷萃取有机层。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。以柱层析(展开剂:氯仿/甲醇=99/1→9/1)将残渣精制。在精制物中加入甲醇悬浮洗净,并滤取沉淀物。通过将过滤物在减压下干燥而获得120mg的PBQ3。
PBQ3:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:9.95(s,1H),8.08(d,J=2.29Hz,1H),8.04(d,J=8.69Hz,1H),7.77(d,J=9.15Hz,1H),7.69(dd,J=8.69Hz,2.29Hz,1H),7.62(d,J=8.69Hz,1H),7.46(dd,J=15.56Hz,10.98Hz,1H),7.26(dd,J=9.15Hz,2.75Hz,1H),7.08(d,J=2.75Hz,1H),6.92(dd,J=15.56Hz,10.98Hz,1H),6.81(q,J=5.03Hz,1H),6.75(d,J=15.55Hz,1H),6.74(d,J=15.10Hz,1H),6.47(d,J=9.15Hz,1H),2.80(d,J=5.03Hz,3H)
(合成实施例28)
((E)-2-(4-(6-(二甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)喹啉-6-醇(PBQ3.1)的合成)
依照下列合成流程图合成PBQ3.1。
[化61]
(步骤1:化合物(12)的合成)
在氩气氛下,将5-碘-2-氨基吡啶(11)(2200mg,10.0mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,1200mg,30.0mmol)。将反应液升温至室温搅拌30分钟。将反应液冰浴,添加碘甲烷(4258mg,30.0mmol)后,将反应液升温至室温。原料消失后,将反应液加到水中搅拌,将有机层用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=99/1→24/1)将残渣精制而获得2086mg的标题化合物(12)。
(步骤2:化合物(13)的合成)
在氩气氛下,在化合物(12)(2077mg,8.37mmol)的三乙胺溶液(8.17mL,58.61mmol)中,添加碘化亚铜(191mg,1.00mmol)、2-丙炔-1-醇(939mg,16.75mmol)以及双(三苯基膦)二氯化钯(II)(118mg,0.17mmol)并搅拌。确认原料消失后,过滤反应液,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=19/1→1/1)将残渣精制而获得1340mg的标题化合物(13)。
(步骤3:化合物(14)的合成)
在氩气氛下,在化合物(13)(1337mg,7.59mmol)的二甲亚砜溶液(37.9mL)中,加入三乙胺(2534mg,25.04mmol)以及三氧化硫吡啶络合物(3623mg,22.76mmol)并搅拌。确认原料消失后,在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=24/1→5/1)将残渣精制而获得849mg的标题化合物(14)。
(步骤4:化合物(15)的合成)
在氩气氛下,将化合物(8)(928mg,3.00mmol)的四氢呋喃溶液(30mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,144mg,3.60mmol)。将反应液升温至室温并搅拌30分钟后,添加化合物(14)(784mg,4.50mmol)。将反应液升温至40℃且原料消失后,在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=50/1)将残渣精制。在精制物中加入甲醇悬浮洗净,并滤取沉淀物。通过将过滤物在减压下干燥而获得583mg的标题化合物(15)。
(步骤5:PBQ3.1的合成)
在氩气氛下,将化合物(15)(329mg,1.00mmol)的二氯甲烷溶液(5.0mL)冷却至-40℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,5.00mL,5.00mmol)。将反应液升温至5℃,并搅拌过夜。将1N氢氧化钠水溶液以及碳酸氢钠在冰浴下加入到反应液中进行中和后,用乙酸乙酯萃取有机层。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。以柱层析(展开剂:氯仿/甲醇=99/1→17/1)将残渣精制。在精制物中加入甲醇悬浮洗净,并滤取沉淀物。通过将过滤物在减压下干燥而获得147mg的PBQ3.1。
PBQ3.1:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.09(s,1H),8.26(d,J=1.83Hz,1H),8.12(d,J=8.70Hz,1H),7.82(d,J=9.16Hz,1H),7.66(d,J=8.70Hz,1H),7.61(dd,J=9.16Hz,2.29Hz,1H),7.30(dd,J=9.16Hz,2.75Hz,1H),7.13(d,J=16.03Hz,1H),7.12(d,J=2.75Hz,1H),7.05(d,J=16.03Hz,1H),6.67(d,J=8.70Hz,1H),3.07(s,6H)
(合成实施例29)
((E)-2-(4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)喹啉-6-醇(PBQ3.2)的合成)
依照下列合成流程图合成PBQ3.2。
[化62]
(步骤1:化合物(8)的合成)
在氩气氛下,将6-甲氧基-2-甲基喹啉(7)(43.0g,248mmol)的四氢呋喃溶液(600mL)冷却至-70℃后,滴下叔丁基锂(1.61M己烷溶液,200mL,322mmol)。将反应液搅拌1小时,并滴下氯磷酸二乙酯(59.9g,347mmol)。将反应液搅拌1小时,加入水并搅拌过夜后,用乙酸乙酯萃取反应液。用饱和食盐水将有机层洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:乙酸乙酯→乙酸乙酯/甲醇=19/1)将残渣精制而获得27.2g的标题化合物(8)。
(步骤2:化合物(10)的合成)
在氩气氛下,将化合物(8)(928mg,3.00mmol)的四氢呋喃溶液(30mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,144mg,3.60mmol)。将反应液升温至室温并搅拌30分钟后,添加化合物(9)(937mg,3.60mmol)。将反应液升温至40℃,原料消失后,在反应液中加入水并用乙酸乙酯萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=7/1→3/1)将残渣精制而获得580mg的标题化合物(10)。
(步骤3:PBQ3.2的合成)
在氩气氛下,将化合物(10)(575mg,1.38mmol)的二氯甲烷溶液(7.0mL)冷却至-40℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,11.1mL,11.1mmol)。将反应液升温至5℃并搅拌过夜。将1N氢氧化钠水溶液以及碳酸氢钠水溶液在冰浴下加入到反应液中进行中和后,滤取沉淀物。以柱层析(展开剂:氯仿/甲醇=99/1→19/1)将过滤物精制。在精制物中加入甲醇悬浮洗净,并滤取沉淀物。通过将过滤物在减压下干燥而获得110mg的PBQ3.2。
PBQ3.2:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:10.09(s,1H),8.18(d,J=2.29Hz,1H),8.11(d,J=8.70Hz,1H),7.82(d,J=9.16Hz,1H),7.66(d,J=8.70Hz,1H),7.48(dd,J=8.70Hz,2.29Hz,1H),7.30(dd,J=9.16Hz,2.75Hz,1H),7.12(d,J=2.75Hz,1H),7.11(d,J=16.03Hz,1H),7.02-7.07(m,1H),7.04(d,J=16.03Hz,1H),6.47(d,J=8.70Hz,1H),2.80(d,J=4.58Hz,3H)
(合成实施例30)
(2-((1E,3E)-4-(4-氨基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇(pre2)的合成)
依照下列合成流程图合成pre2。
[化63]
(步骤1:化合物(6)的合成)
在氩气氛下,将二异丙基胺(5.06g,50.0mmol)的四氢呋喃溶液(75mL)冷却至-50℃后,滴下正丁基锂(1.6M己烷溶液,31.2mL,50.0mmol)。将反应液冷却至-65℃,滴下6-甲氧基-2-甲基苯并噻唑(5)(4.48g,25.0mmol)的四氢呋喃(25mL)溶液。在反应液中滴下氯磷酸二乙酯(4.31g,25.0mmol)。原料消失后,将反应液加到100mL的1M氯化氢溶液中并用氯仿萃取有机层。将有机层用无水硫酸钠干燥,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿)将残渣精制而获得6.30g的标题化合物(6)。
(步骤2:化合物(7)的合成)
在氩气氛下,将化合物(6)(380mg,1.21mmol)的四氢呋喃溶液(10mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,48mg,1.20mmol)。将反应液升温至室温并搅拌30分钟后,添加4-硝基肉桂醛(180mg,1.02mmol)。原料消失后,将反应液加到水中搅拌,并滤取沉淀物。在过滤物中加入甲苯并在减压下蒸馏除去溶剂,且用氯仿悬浮洗净。通过滤取沉淀物并在减压下干燥而获得275mg的标题化合物(7)。
(步骤3:化合物(8)的合成)
在化合物(7)(271mg,0.80mmol)的乙醇溶液(5.1mL)中,加入乙酸(5.1mL)、铁(212mg,3.80mmol)以及12N盐酸(1.1mL)搅拌过夜。在冰浴下将反应液滴下到氢氧化钠水溶液中,加入氯仿后过滤反应液。用氯仿萃取滤液,将有机层用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿)将残渣精制而获得165mg的标题化合物(8)。
(步骤4:2-((1E,3E)-4-(4-氨基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇(pre2)的合成)
在氩气氛下,将化合物(8)(160mg,0.52mmol)的二氯甲烷溶液(2.6mL)冷却至-78℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,2.60mL,2.60mmol)。将反应液升温至室温,搅拌过夜。将1N氢氧化钠水溶液在冰浴下加入到反应液中成为碱性后过滤。将1N盐酸以及碳酸氢钠加入到滤液中进行中和,并滤取沉淀物。在过滤物中加入氯仿悬浮洗净,并滤取沉淀物。在过滤物中加入甲醇悬浮洗净,并滤取沉淀物。通过将过滤物在减压下干燥而获得120mg的标题化合物。
pre2:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:9.80(s,1H),7.69(d,J=8.70Hz,1H),7.31(d,J=2.29Hz,1H),7.25(d,J=8.70Hz,2H),7.20(dd,J=16.03Hz,9.16Hz,1H),6.92(dd,J=8.70Hz,2.29Hz,1H),6.81-6.91(m,2H),6.81(d,J=16.03Hz,1H),6.56(d,J=8.70Hz,2H),5.52(s,2H)
(合成实施例31)
(5-((1E,3E)-4-(6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-胺(pre3)的合成)
依照下列合成流程图合成pre3。
[化64]
(步骤1:化合物(14)的合成)
在氩气氛下,将化合物(12)(184mg,0.57mmol)的二氯甲烷溶液(2.9mL)冷却至-78℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,2.85mL,2.85mmol)。将反应液升温至室温,搅拌过夜。将1N氢氧化钠水溶液以及碳酸氢钠在冰浴下加入到反应液中进行中和,在减压下蒸馏除去溶剂。用水将残渣悬浮洗净。通过滤取沉淀物并在减压下干燥而获得154mg的标题化合物(14)。
(步骤2:5-((1E,3E)-4-(6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-胺(pre3)的合成)
在氩气氛下,在化合物(14)(90.0mg,0.305mmol)的二甲亚砜溶液(2.58mL)中,添加咪唑(72.6mg,1.066mmol)以及叔丁基二甲基氯硅烷(73.5mg,0.489mmol)并搅拌过夜。在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=100/7)将残渣精制而获得52mg的标题化合物。
pre3:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.04(d,J=2.29Hz,1H),7.77(d,J=8.07Hz,1H),7.68(dd,J=8.70Hz,2.29Hz,1H),7.53(d,J=2.29Hz,1H),7.28(dd,J=15.57Hz,10.08Hz,1H),6.99(dd,J=8.70Hz,2.75Hz,1H),6.88-6.96(m,1H),6.86(d,J=15.57Hz,1H),6.85(d,J=15.57Hz,1H),6.47(d,J=8.70Hz,1H),6.35(s,2H),0.98(s,9H),0.23(s,6H)
(合成实施例32)
(2-((1E,3E)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯基)-3-乙基-6-羟基苯并[d]噻唑-3-鎓(pre6)的合成)
用与上述合成实施例5以及PBB5的合成方法类似的方法来合成。
(合成实施例33)
((E)-5-(4-(6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-3-烯-1-炔基)吡啶-2-胺(pre11)的合成)
依照下列合成流程图合成pre11。
[化65]
(步骤1:6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-羧酸乙酯(8)的合成)
在6-羟基苯并噻唑-2-羧酸乙酯(1.27g,5.69mmol)以及咪唑(0.5g,7.34mmol)的DMF(10mL)溶液中加入叔丁基二甲基氯硅烷(0.94g,6.2mmol)的DMF(3mL)溶液,于室温搅拌16小时后加入水,并用乙酸乙酯萃取。将萃取液水洗后用无水硫酸钠干燥,在减压下蒸馏除去溶剂。将获得的残渣以硅胶柱层析精制,获得作为褐色液体的6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-羧酸乙酯(0.97g,2.9mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.09(d,J=8.8Hz,1H),7.35(d,J=2.4Hz,1H),7.09(dd,J=8.8Hz,2.4Hz),4.54(q,J=7.2Hz,2H),1.48(t,J=7.2Hz,3H),1.01(s,9H),0.25(s,6H)
(步骤2:[6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-基]甲醇(9)的合成)
将氢化铝锂(87mg,2.3mmol)的THF(20mL)溶液冷却于-15℃,滴下6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-羧酸乙酯(0.77g,2.3mmol)的THF(10mL)溶液。于同温度搅拌约1小时后加入氢化铝锂(72.5mg,1.91mmol),并且搅拌30分钟。加入水(0.16mL)并短暂搅拌后加入5M氢氧化钠水溶液(0.16mL)接着加入水(0.48mL),搅拌后使用硅藻土将不溶物滤去。将滤液在减压下浓缩,以硅胶柱层析将残渣精制,获得作为褐色液体的[6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-基]甲醇(0.22g,0.74mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.84(d,J=8.8Hz,1H),7.33(d,J=2.4Hz,1H),7.01(dd,J=8.8Hz,2.4Hz),5.05(br s,2H)2.78(br s,1H),1.03(s,9H),0.25(s,6H)
(步骤3:6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-羧醛(6)的合成)
在[6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-基]甲醇(0.22g,0.74mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入二氧化锰粉末(1.2g)于40℃搅拌2.5小时,于室温搅拌16小时。使用硅藻土滤去不溶物,将滤液在减压下浓缩。以硅胶柱层析将获得的残渣精制,获得作为褐色液体的6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-羧醛(71.0mg,0.242mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:10.11(s,1H),8.09(d,J=8.8Hz,1H),7.37(d,J=2.4Hz,1H),7.13(dd,J=8.8Hz,2.4Hz),1.01(s,9H),0.27(s,6H)
(步骤4:2-[(E)-2-溴乙烯基]-6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑(7)的合成)
将(溴甲基)三苯基溴化膦(48.2mg,0.11mmol)悬浮于THF(含有作为安定剂的BHT。3mL),冷却于-78℃加入正丁基锂(1.6M己烷溶液,0.15mL),并搅拌1小时。其次加入6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-羧醛(20.2mg,0.0688mmol)的THF(2mL)溶液,于-78℃搅拌约30分钟,于0℃搅拌约1.5小时。在反应液中加入饱和氯化铵水溶液(3mL)搅拌10分钟,加入水、乙酸乙酯并分液。将有机层用饱和食盐水洗净后用无水硫酸钠干燥,在减压下浓缩后以硅胶柱层析精制而获得作为黄色液体的2-[(E)-2-溴乙烯基]-6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑与BHT的混合物(7.0mg)。若由1H-NMR的信号强度比算出BHT与标题化合物的含量,则推测标题化合物含有约5.5mg(0.015mmol)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:7.84(d,J=8.8Hz,1H),7.35(d,J=14.0Hz,1H),7.29(d,J=14.0Hz,1H),7.25(d,J=2.4Hz,1H),7.00(dd,J=8.8Hz,2.4Hz),1.00(s,9H),0.26(s,6H)
(步骤5:(E)-5-(4-(6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑-2-基)-3-丁烯-1-炔基)吡啶-2-胺(1)的合成)
将2-[(E)-2-溴乙烯基]-6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑与BHT的混合物(18.1mg,含有13.5mg的2-[(E)-2-溴乙烯基]-6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并噻唑)、2-氨基-5-乙炔基吡啶(8.7mg,0.074mmol)、碘化亚铜(0.7mg)以及双(三苯基膦)二氯化钯(2mg)加入到THF(1mL)与三乙胺(1mL)的混合液中,于70℃搅拌4小时。加入乙酸乙酯后将不溶物滤去,将滤液在减压下浓缩后以硅胶柱层析精制而获得作为黄褐色非晶形固体的标题化合物与其(Z)-异构体的混合物(9.4mg)。E/Z=约85/15(1H-NMR)。
pre11:1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.24(br d,J=2.0Hz,1H),7.84(d,J=8.8Hz,1H),7.53(dd,J=8.4Hz,2.0Hz),7.26(d,J=2.4Hz,1H),7.16(d,J=16.0Hz,1H),6.98(dd,J=8.8Hz,2.4Hz),6.73(d,J=16.0Hz,1H),6.47(dd,J=8.4Hz,0.4Hz),4.70(s,2H),1.01(s,9H),0.23(s,6H)
(合成实施例34)
((E)-叔丁基(2-(4-(6-氨基吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-基)氨基甲酸甲酯(pre12)的合成)
依照下列合成流程图合成pre12。
[化66]
由2-氨基-5-碘吡啶,如上述流程图所示地合成2-氨基-5-乙炔基吡啶(化合物A)。
由2-氨基-5-乙炔基吡啶(化合物A)(0.14g,1.2mmol)与2-((E)-2-溴乙烯基)-6-((叔丁氧羰基氨基)甲基)苯并噻唑(0.22g,0.60mmol),以与上述合成实施例33的步骤5同样的次序获得标题化合物(181.7mg,0.447mmol)。
Pre12:1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm:8.25(d,J=1.6Hz,1H),7.94(d,J=8.4Hz,1H),7.77(br s,1H),7.53(dd,J=8.8Hz,2.4Hz,1H),7.39(br d,J=8.4Hz,1H),7.17(d,J=16.0Hz,1H),6.83(d,J=16.0Hz,1H),6.47(dd,J=8.8Hz,0.8Hz,1H),4.9(br,1H),4.66(s,2H),4.44(br d,J=6.4Hz,2H),1.47(s,9H)
(合成实施例35-1)
(2-(2-((1E,3E)-4-(6-(二甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)-2-羟基甲基-乙基4-甲基苯磺酸酯的合成)
[化67]
(步骤1:化合物(23)的合成)
在氩气氛下,在2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇(22)(1322mg,10.0mmol)的二氯甲烷溶液(10mL)中加入吡啶(7910mg,100.0mmol)并冰浴后,加入对甲苯磺酰基氯(2860mg,15.0mmol)以及N,N-二甲基氨基吡啶(12mg,0.10mmol)搅拌。原料消失后,在反应液中加入水,并用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐酸水溶液、碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,通过在减压下蒸馏除去溶剂而获得2560mg的标题化合物(23)。
(步骤2:化合物(24)的合成)
在化合物(23)(1432mg,5.00mmol)的甲醇溶液(7.5mL)中加入4N盐酸/二氧六环(2.5mL)搅拌。原料消失后,在减压下蒸馏除去反应液,通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=1/4→乙酸乙酯)将残渣精制而获得标题化合物(24)1027mg。
(步骤3:化合物(25)的合成)
在氩气氛下,在化合物(24)(985mg,4.00mmol)的四氢呋喃溶液(4.0mL)中加入咪唑(272mg,4.00mmol)冰浴。在反应液中滴下叔丁基二甲基氯硅烷(603mg,4.00mmol)的四氢呋喃溶液(4.0mL)。原料消失后,在反应液中加入水并用乙酸乙酯萃取有机层萃取。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=7/1→4/1)将残渣精制而获得1182mg的标题化合物(25)。
(步骤4:化合物(27)的合成)
在氩气氛下,将化合物(26)(以上一次的试制报告书合成)(696mg,2.25mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(11mL)冰浴后,添加氢化钠(60%油,360mg,9.00mmol)。将反应液升温至室温搅拌30分钟。将反应液冰浴,并添加碘甲烷(1277mg,9.00mmol)后,将反应液升温至室温。原料消失后,将反应液加入到水中搅拌并滤取沉淀物。通过以柱层析(展开剂:氯仿→氯仿/甲醇=99/1)将过滤物精制而获得554mg的标题化合物(27)。
(步骤5:化合物(28)的合成)
在氩气氛下,将化合物(27)(550mg,1.63mmol)的二氯甲烷溶液(13mL)冷却至-70℃后,滴下三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液,16.3mL,16.30mmol)。将反应液升温至9℃,并搅拌过夜。将反应液冰浴,并加入氢氧化钠水溶液进行中和后,在减压下蒸馏除去有机层。通过滤取沉淀物并用水洗净后,在减压下干燥而获得484mg的标题化合物(28)。
(步骤6:化合物(29)的合成)
在氩气氛下,在化合物(28)(323mg,1.00mmol)的四氢呋喃溶液(10.0mL)中加入化合物(25)(721mg,2.00mmol)以及三苯膦(525mg,2.00mmol)并冰浴。在反应液中滴下偶氮二羧酸二异丙酯(404mg,2.00mmol)。将反应液于室温升温,搅拌过夜后,在减压下蒸馏除去反应液。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=3/1→1/2)将残渣精制而获得270mg的标题化合物(29)。
(步骤7:化合物(5)的合成)
在化合物(29)(200mg,0.30mmol)的四氢呋喃溶液(4.5mL)中加入4N盐酸/二氧六环(1.5mL)并搅拌。原料消失后,将反应液冰浴,用碳酸氢钠水溶液进行中和后,用乙酸乙酯萃取反应液。将有机层用水以及饱和食盐水洗净,用无水硫酸钠干燥后,在减压下蒸馏除去溶剂。通过以柱层析(展开剂:庚烷/乙酸乙酯=1/1→1/4)将残渣精制而获得134mg的标题化合物(5)。
化合物(5):1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm:8.21(d,J=2.29Hz,1H),7.79(dd,J=9.16Hz,2.29Hz,1H),7.75(d,J=9.16Hz,1H),7.73(d,J=8.24Hz,2H),7.52(d,J=2.75Hz,1H),7.39(d,J=8.24Hz,2H),7.31(dd,J=14.78Hz,10.08Hz,1H),6.85-7.06(m,4H),6.70(d,J=9.16Hz,1H),5.07(t,J=5.50Hz,1H),4.53-4.60(m,1H),4.20-4.35(m,2H),3.52-3.63(m,2H),3.07(s,6H),2.35(s,3H)
(合成实施例35-2)
3-(2-((1E,3E)-4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)-2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)丙基4-甲基苯磺酸酯(pre21)的合成
能够通过与上述合成实施例35-1同样的方法来合成pre21。
(合成实施例36)
(E)-3-(2-(4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)-2-(四氢-2H-吡喃-2-基氧基)丙基4-甲基苯磺酸酯(pre22)的合成
能够通过与上述合成实施例22~25类似的方法来合成。
(合成实施例37)
叔丁基5-((1E,3E)-4-(6-(乙氧基甲氧基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)-6-硝基吡啶-2-基(甲基)氨基甲酸酯(pre23)的合成
能够通过与上述合成实施例22~25类似的方法来合成。
(合成实施例38)
(E)-叔丁基5-(4-(6-(乙氧基甲氧基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-3-烯-1-炔基)-6-硝基吡啶-2-基(甲基)氨基甲酸酯(pre24)的合成
能够通过与上述合成实施例22~25类似的方法来合成。
(合成实施例39)
叔丁基5-((1E,3E)-4-(5-(乙氧基甲氧基)苯并呋喃-2-基)丁-1,3-二烯基)-6-硝基吡啶-2-基(甲基)氨基甲酸酯(pre25)的合成
能够通过与上述合成实施例22~25类似的方法来合成。
(合成实施例40)
(E)-叔丁基5-(4-(5-(乙氧基甲氧基)苯并呋喃-2-基)丁-3-烯-1-炔基)-6-硝基吡啶-2-基(甲基)氨基甲酸酯(pre26)的合成
能够通过与上述合成实施例22~25类似的方法来合成。
(放射性同位素标记化合物的合成)
(合成实施例41)
(4-((1E,3E)-4-(苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)-N-[11C]甲基-N-甲基苯胺([11C]PBB1)的合成)
通过与下述合成实施例42以及43所示的同样的方法来合成[11C]PBB1。
(合成实施例42)
(2-((1E,3E)-4-(4-([11C]甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇([11C]PBB2)的合成)
[化68]
将三氟甲磺酸[11C]甲酯于室温加入到含有2-((1E,3E)-4-(4-氨基苯基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇(pre2)(0.5~0.8mg)的丙酮(500mL)溶液中。在氮气氛下,于80℃除去丙酮并加入70%乙腈水溶液(800μL)。将混合液移至HPLC精制用容器(HPLC:CAPCELL PAK C18柱,10mm×250mm,SHISEIDO;移动相,乙腈/水/三乙胺=700/300/1,6mL/分钟)。将相当于[11C]PBB2的部份(fraction),回收至乙醇(300μL)中含有25%抗坏血酸(100μL)以及Tween80(75μL)的烧瓶中,在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣溶解于生理食盐水(3mL,pH7.4),作为注射溶液,获得[11C]PBB2(640-1340GBq)。
(合成实施例43)
(2-((1E,3E)-4-(6-([11C]甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇([11C]PBB3)的合成)
[化69]
将碘[11C]甲烷于室温加到含有5-((1E,3E)-4-(6-(叔丁基二甲基硅氧基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-胺(pre3)(1.5~2mg)以及氢氧化钾(10mg)的DMSO(300μL)溶液中。将反应混合液加热到125℃并维持5分钟。将反应容器冷却后,加入四正丁基氟化铵水合物(5mg)的水溶液(600μL),除去保护基。之后,加入HPLC溶剂(500μL)。将混合液移至HPLC精制用容器中(HPLC:CAPCELL PAK C18柱,10mm×250mm,乙腈/50mM甲酸铵=4/6,6mL/分钟)。将相当于[11C]PBB3的部份,回收至乙醇(300μL)中含有25%抗坏血酸(100μL)以及Tween80(75μL)的烧瓶中,在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣溶解于生理食盐水(3mL,pH7.4),作为注射溶液,获得[11C]PBB3(970-1990GBq)。
(合成实施例44)
(2-((1E,3E)-4-(6-([11C]甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-5,6-二醇([11C]PBB4)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法来合成[11C]PBB4。
(合成实施例45)
(2-((1E,3E)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯基)-3-乙基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-3-鎓([11C]mPBB5)的合成)
[化70]
将碘[11C]甲烷于-15℃加到含有2-((1E,3E)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯基)-3-乙基-6-羟基苯并[d]噻唑-3-鎓(pre6)(0.8~0.9mg)以及氢化钠(0.3mg)的DMF(300μL)溶液中。将反应混合液加热到80℃并维持5分钟。加入60%甲醇水溶液(800μL),移至HPLC精制用容器中(HPLC:CAPCELL PAK C18柱,10mm×250mm,移动层,甲醇/水/三氟乙酸=600/400/0.1,4mL/分钟)。将相当于[11C]mPBB5的部份,回收至乙醇(300μL)中含有25%抗坏血酸(100μL)以及Tween80(75μL)的烧瓶中,在减压下蒸馏除去溶剂。将残渣溶解于生理食盐水(3mL,pH7.4),作为注射溶液,获得[11C]mPBB5(300-560GBq)。
(合成实施例46)
((E)-2-(4-(4-(N-[11C]甲基-N-甲基氨基)苯基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇([11C]PBB2.1)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法,由Pre7合成[11C]PBB2.1。
(合成实施例47)
((E)-2-(4-(4-([11C]甲基氨基)苯基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇([11C]PBB2.2)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法,由Pre8合成[11C]PBB2.2。
(合成实施例48)
((E)-2-(4-(6-(N-[11C]甲基-N-甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇([11C]PBB3.1)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法来合成[11C]PBB3.1。
(合成实施例49)
((E)-2-(4-(6-([11C]甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇([11C]PBB3.2)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法,由Pre11合成[11C]PBB3.2。
(合成实施例50)
((E)-5-(4-(6-(氨甲基)苯并[d]噻唑-2-基)丁-3-烯-1-炔基)-N-[11C]甲基吡啶-2-胺([11C]PBB3.2N)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法,由Pre12合成[11C]PBB3.2N。
(合成实施例51)
(2-((1E,3E)-4-(4-氨基苯基)丁-1,3-二烯基)-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-5-醇([11C]Core1-4)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core1-4。
(合成实施例52)
(N-(4-((1E,3E)-4-(5-甲氧基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯基)乙酰胺([11C]Core1-5)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core1-5。
(合成实施例53)
(3-(4-((1E,3E)-4-(5-甲氧基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)苯基氨基)丙-1-醇([11C]Core1-11)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core1-11。
(合成实施例54)
(4-((1E,3E)-4-(5-甲氧基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)-N-异丙基苯胺([11C]Core1-15)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core1-15。
(合成实施例55)
(4-((1E,3E)-4-(5-甲氧基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)-N-(庚-1,6-二烯-4-基)苯胺([11C]Core1-20)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core1-20。
(合成实施例56)
(N-(5-((1E,3E)-4-(5-甲氧基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-基)乙酰胺([11C]Core2-9)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core2-9。
(合成实施例57)
(3-(5-((1E,3E)-4-(5-甲氧基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-基氨基)丙-1-醇([11C]Core2-10)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core2-10。
(合成实施例58)
(N,N-二烯丙基-5-((1E,3E)-4-(5-甲氧基-6-[11C]甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)丁-1,3-二烯基)吡啶-2-胺([11C]Core2-14)的合成)
通过与上述合成实施例45所示的同样的方法来合成[11C]Core2-14。
(合成实施例59-1)
(1-[18F]氟-2-(2-((1E,3E)-4-(6-(二甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)-羟基甲基-乙烷([18F]F0-PBB3类似物)的合成)
能够由F0-PBB3类似物的合成中间产物(参照表2)来合成[18F]F0-PBB3类似物。
(合成实施例59-2)
(1-[18F]氟-3-(2-((1E,3E)-4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)丙-2-醇([18F]F0-PBB3)的合成)
能够由Pre21合成[18F]F0-PBB3。
(合成实施例60)
((E)-1-[18F]氟-3-(2-(4-(6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-基氧基)丙-2-醇([18F]F0-PBB3.2)的合成)
能够由Pre22合成[18F]F0-PBB3.2。
(合成实施例61)
(2-((1E,3E)-4-(2-[18F]氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并[d]噻唑-6-醇([18F]F1-PBB3)的合成)
能够由Pre23合成[18F]F0-PBB3.2。
(合成实施例62)
((E)-2-(4-(2-[18F]氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并[d]噻唑-6-醇([18F]F1-PBB3.2)的合成)
能够由Pre24合成[18F]F1-PBB3.2。
(合成实施例63)
(2-((1E,3E)-4-(2-[18F]氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)苯并呋喃-5-醇([18F]F1-PBBf3)的合成)
能够由Pre25合成[18F]F1-PBBf3。
(合成实施例64)
((E)-2-(4-(2-[18F]氟-6-(甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)苯并呋喃-5-醇([18F]F1-PBBf3.2)的合成)
能够由Pre26合成[18F]F1-PBBf3.2。
(合成实施例65)
(2-((1E,3E)-4-(6-(N-[11C]甲基-N-甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)喹啉-6-醇([11C]PBQ3.0)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法来合成[11C]PBQ3.0。
(合成实施例66)
(2-((1E,3E)-4-(6-([11C]甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1,3-二烯基)喹啉-6-醇([11C]PBQ3)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法来合成[11C]PBQ3。
(合成实施例67)
((E)-2-(4-(6-(N-[11C]甲基-N-甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)喹啉-6-醇([11C]PBQ3.1)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法来合成[11C]PBQ3.1。
(合成实施例68)
((E)-2-(4-(6-([11C]甲基氨基)吡啶-3-基)丁-1-烯-3-炔基)喹啉-6-醇([11C]PBQ3.2)的合成)
通过与上述合成实施例42以及43所示的同样的方法来合成[11C]PBQ3.2。
(生物学的实施例)
(化合物以及试剂)
由Doujindo公司购入BSB以及FSB。由ABX公司购入PIB以及FDDNP。由Sigma-Aldrich公司购入二甲基氨基-苯乙烯基-苯并噻唑以及硫代黄素-T。由Waldeck公司购入硫代黄素-S。BF-227、BF-158、THK523以及BF-189(N-甲基-4-[6-(喹啉-2-基)己-1,3,5-三烯基]苯胺)则是接受由东北大学的提供。由Sigma-Aldrich公司购入包含有PBB5、BTA-1、BF-170以及姜黄素的其他β折叠键合化合物。商业性购入包含有花菁(cyanine)、吡啶、吡啶盐、苯并噻唑、恶嗪、硫堇以及多酚的潜在性淀粉样蛋白配体。由Sigma-Aldrich公司购入二甲亚砜(DMSO)。商业性购入其他化学试剂。
(动物模型)
通过小鼠普里昂蛋白质启动子(PrP)所驱动,且具有FTDP-17P301S变异的人类T34(具有1个N-末端插入的4重复Tau异构体)的异型Tg小鼠(亦称为PS19小鼠)是接受由宾夕法尼亚大学的提供。将PS19小鼠与C57BL/6背景品系回交。PS19小鼠请参照Yoshiyama,Y.et al.Synapse loss andmicroglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.Neuron53,337-351(2007).。将全部的小鼠依照「National Research Council’s Guide forthe Care and Use of Laboratory Animals」以及本案发明人等的施设指南来进行管理以及处理。本动物实验操作程序为经由放射线医学综合研究所的动物实验委员会(Animal Ethics Committees)所认证。
(解剖脑组织)
通过对阿尔茨海默症(AD)患者、尼曼匹克症患者、进行性核上眼神经麻痹症患者、大脑皮质基底核退化症患者、以及具有泛素阳性Tau阴性内含物的额颞叶变性症患者进行剖检而获得死后人脑。将组织在10%中性缓冲福尔马林中固定,埋入石蜡块里。并且,从小鼠采取脑,在含有4%多聚甲醛的磷酸缓冲液中固定。将该组织样品用含有30%蔗糖的磷酸缓冲液来冻结保护,在冷冻切片机(HM560;Carl Zeiss)内切片。
(生物学的实施例1)
(试管内荧光定量的结合分析法)
通过将合成肽(Peptide Institute)于37℃培养72小时而获得Aβ40纤维。将重组T40蛋白质,通过与0.1mg/ml肝素同时在37℃培养72小时而纤维化。将合成Aβ肽(Peptide Institute)在磷酸缓冲生理食盐水(PBS;pH7.4)中,以最终浓度成为100μM的方式溶解,并于37℃培养72小时。将获得的溶液稀释到50μM,加入等量的化合物(0~0.5mM,含有1%DMSO的PBS)。使其在37℃反应1小时后,对样品用微量盘分光计(Safire;Tecan)进行评价。将人类T40表现于大肠菌DE3株并精制,以30mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行透析。将以逆相HPLC而分离的重组Tau蛋白质(1mg/ml),在含有肝素(0.1mg/ml)的30mM Tris-HCl缓冲液中,于37℃自行聚合72小时。之后,将Tau纤维(1μM)与等量的本申请发明的化合物加以反应,与对Aβ40的结合分析同样地进行评价。使用Prism软件(GraphPad)来进行关于荧光定量数据的结合饱和曲线以及参数估测法。
(结果)
通过使用试管内所构筑的Aβ以及Tau纤维丝的荧光分析,明确了PBB1以及PBB5对于Tau病变的高亲和性。
[表3]
表:对于合成Aβ肽以及重组Tau蛋白质聚合物的荧光以及结合特性
表中,λex以及λem为在结合于Aβ40以及T40(由441个氨基酸残基所构成最长的Tau异构体)聚合物的化合物的荧光显微镜测定中,各自的最适激发以及检测波长。EC50(平均±SE)为饱和点中表示最大荧光强度减半的化合物的有效浓度。Aβ40原纤维的EC50对T40原纤维的EC50的比,表示于表中最右侧的字段。
(生物学的实施例2)
(试管内以及活体外荧光显微镜测定、以及活体外多光子成像)
将来自患者脑的6μm石蜡切片以及小鼠脑的20μm冷冻切片,于室温1小时,以溶解于50%乙醇的10-3%化合物(PIB、BF-158、FDDNP、BF-227、PBB1、PBB2、PBB3、PBB4、PBB5、姜黄素、FSB、硫代黄素-S、或是BF-189)染色。使用非激光(BZ-9000;Keyence Japan)以及共聚焦激光(FV-1000;Olympus)显微镜,取得来自这些化合物的荧光信号的成像图像。在共聚焦成像中,将激发/发光波长(nm)针对各化合物,如下来进行优化:405/420-520(PBB3、FSB、PIB、BF-227、BF-158、FDDNP、硫代黄素-S)、488/520-580(PBB2、PBB4)、515/530-630(PBB1、姜黄素)、以及635/645-720(PBB5、BF-189、DM-POTEB)。接着,为了抗原活性化,将试验样品以及邻接的切片以高压处理器处理,以AT8(Endogen)以及抗AβN3(pE)(焦谷氨酸化Aβ3-x)多株抗体进行免疫染色,并用该显微镜来解析。为了活体外成像,将10~12月龄的PS19以及非Tg WT小鼠,用1.5%(v/v)异氟烷麻醉,向尾静脉投与1mg/kg PBB1~4、0.1mg/kg PBB5或是10mg/kg FSB。在投与60分钟后将该小鼠断头。将脑以及脊髓组织进行取样,在冷冻切片机(HM560)内切成10μm厚度的薄片。将该切片使用显微镜成像,用FSB或是AT8标记,再用显微镜获得图像。
如以下的方式来进行活体外多光子成像。将溶解于含有20%DMSO的100μl生理食盐水中的1mg/kg PBB2以及PBB4,对PS19小鼠进行静脉内注射,投与60分钟后摘出脑以及脊髓。之后,将脊髓样品,使用多光子激光感光成像系统,通过来自脉冲激光(Mai Tai;Spectra-Physics)以800nm激发而产生的双光子荧光来进行试验。检测波长设定在540~590nm。
(结果)
图1以及图2中,表示包含老人斑以及Tau病变的AD脑,以及具有Tau凝集所致的特征但缺乏老人斑的非AD Tau病变脑切片的荧光图像。在AD脑中,PBB1~5强烈标记了NFT、神经纤维网线(neuropil threads)、以及老人斑周围的神经突起(plaque neurite)(图1),且强烈标记了尼曼匹克症中的匹克体(Pick bodies)和进行性核上眼神经麻痹症(PSP)以及大脑皮质基底核退化症(CBD)中的神经以及胶质原纤维病变等的非AD Tau病变的Tau聚集体(图2)。另一方面,PBB1~5以外的化合物,该等标记并不够充分(图1以及图2)。另外,现有的淀粉样蛋白色素硫代黄素-S以及FSB,已知不易通过血脑屏障(Zhuang,Z.P.等的文献.Radioiodinated styrylbenzenes andthioflavins as probes for amyloid aggregates.J.Med.Chem.44,1905-1914(2001).)。
在图3A,表示经使用PBB1~5的PS19小鼠中的NFT状Tau内含物的试管内以及活体外标记的结果。与非AD Tau病变脑的Tau病变的荧光标记结果相同,PS19小鼠的脑干以及脊髓中的NFT状内含物,虽然能被PBB1~5明确地辨识,但至今无法被在PET成像所使用的其他化合物辨识(图3A的a)。在活体外的标记中,FSB虽然可见对于PS19小鼠的Tau蓄积物的结合(图3A的b),但为此必须要有高量的投与量。与这些观察结果一致,活体外样品的双光子激光扫描荧光显微镜检查的结果,显示PS19小鼠的脊髓区块受到PBB2以及PBB4标记(图3A的b最底下)。上述所示的这些结果表示,PBB化合物可充分通过血脑屏障以及细胞膜。
针对其他化合物,也进行与上述说明对PBB1~5所进行的实验同样的试管内实验,得到同样的结果。该结果显示于图3B。
(生物学的实施例3)
(小鼠活体中的Tau蓄积的非侵入性近红外荧光成像)
(活体内以及活体外脉冲激光扫描成像)
使用小动物用荧光成像装置(small animal-dedicated optical imager(eXplore Optix;ART))来进行用异氟烷麻醉的12月龄非Tg WT以及Tau Tg小鼠的非侵入性扫描。通过635-nm脉冲激光二极管(激光输出为25~125mW,根据各实验进行调节;激光重复比例为80MHz;脉冲宽度为~100ps)来产生荧光,通过650-nm长波通滤光片以及高速响应光电倍增管来检测。在各个实验,每次都通过底座的精密垂直移动以及侧面照相机将头部上面与检测器的间的距离保持一定。将溶解于含有20%DMSO的100μl中的0.1mg/kgPBB5,对小鼠进行静脉内注射,以1.0mm的步宽以及每次扫描位置0.1~0.3秒的TPSF积分时间(每次对各个扫描进行优化)扫描小鼠头部。动态成像是经过240分钟来实施,以在基线(投与前)、以及注射后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300、以及360分钟的多次扫描而构成。荧光强度为依激光输出以及积分时间,在各次扫描间进行标准化。对各扫描位置,获得TPSF曲线,估算适合于指数曲线的时间常数。并且,对相当于前头叶、脑干、以及颈髓的头部进行基于感兴趣区的分析(ROI-based analysis)。将此等动物的脑,在活体内分析后摘出,用4%多聚甲醛固定,将20μm厚的冷冻切片用FSB以及AT8来染色。
(结果)
图4a表示活体内激光近红外荧光图像。将基准的自发荧光信号(中央图表),重叠在已剃毛的非Tg WT小鼠头部的可视光(左图表)图像上。在额叶皮质(FC)、脑干(BS)、以及颈髓(SC)的位置设定椭圆形感兴趣区(ROI)(右图表)。图4b表示在12月龄的WT小鼠(上段)以及PS19小鼠(下段)中,在PBB5(0.1mg/kg)的静脉内投与前、投与30分钟后、以及240分钟后的荧光强度图。强度图是以PBB5注射30后的FC ROI値来标准化的。近红外荧光在PBB5的投与后马上显著地增加,在30分钟时,在PS19小鼠的脑干以及脊髓ROI中的荧光强度超过在WT小鼠中的强度。并且,即使在240分钟以上,在PS19小鼠的脑干以及脊髓中,仍观察到PBB5的信号。
图4c~e表示WT小鼠(白:n=7)以及PS19小鼠(黒:n=7)的相对于FC的BS(c)以及SC(d)ROI的荧光强度比值。该比值,比起WT小鼠对PS19小鼠更有意义(图4c以及d:重复测量数据方差分析(2-way,repeated-measuresANOVA)(时间,F(11,132)=17.6,p<0.001;区域,F(1,12)=29.9,p<0.001;基因型,F(1,12)=23.6,p<0.001;图4e:*,p<0.05;**,p<0.01;邦弗朗尼事后检验法(Bonferroni’s post hoc analysis))。图4f表示对于TauTg小鼠的20-μm组织切片每单位面积的FSB阳性NFT状病变数量,在240分钟的SC以及BS对FC比值的散布图。对于在240分钟的PS19小鼠的SC对FC比值,与通过脑的FSB染色而评价的NFT状Tau病变有着有意义的相互关系(图4f)。这成为该比值作为Tau蓄积的活体内指针能够使用于光学性测定的根据。
图4g表示在11月龄的WT小鼠(上段)以及PS19小鼠(下段)中,PPB5的静脉内注射120分钟后的荧光强度(左)以及荧光寿命(右)图。Tau Tg小鼠的BS以及SC ROI与WT小鼠比较的下,显示荧光寿命的延长(箭头)。在WT以及Tg小鼠的FC ROI中,荧光强度虽然显著地增加,但该荧光寿命并无太大的变化。图4h表示11月龄WT小鼠以及Tg小鼠的注射120分钟后的SC以及FC亮点的TPSF曲线。与WT数据比较的下,在Tg SC中观察到荧光衰减的明显延迟。
图4i表示WT小鼠(白;n=7)以及Tg小鼠(黒;n=7)的注射120分钟后在FC、BS、以及SC ROI中的平均荧光寿命(*:p<0.05;邦弗朗尼事后检验法进行的重复测量数据方差分析(2-way repeated-measuresANOVA with Bonferroni’s post hoc analysis))。图4j表示相对于在Tg小鼠的20μm厚的组织切片中每单位面积的FSB阳性NFT状病变的数量,在注射120分钟后的BS以及SC ROI中的荧光寿命时间的散布图。PS19小鼠的脑干以及脊髓中的平均荧光寿命,与非Tg WT小鼠相比,有意义地增加,且在BS以及SC ROI中,与NFT病变的数量有着有意义的相互关系。因为认为TPSF曲线是由具有未结合以及非特异性结合的短荧光寿命化合物、以及具有依赖原纤维的成长而延长的荧光寿命的Tau病变结合化合物的信号所构成,以合乎此曲线的指数函数而获得的时间常数,作为对于Tau聚集体蓄积量的妥适的指标是有用的。
(生物学的实施例4)
(活体内双光子激光扫描荧光显微镜检查)
将12月龄的WT以及PS19小鼠用1.5%(v/v)异氟烷麻醉,将胸椎进行椎弓切除。将盖玻片置于脊髓组织上,用Narishige STS-A脊髓夹以及MA-6N头部固定连接器固定脊柱。将12mg/kg的磺基罗丹明101(MP Biomedicals)投与腹腔内,在15分钟后将1mg/kg PBB3投与静脉内,进行活体双光子荧光成像。对PBB3以及磺基罗丹明101的检测波长,分别设定在500~550nm以及573~648nm。
(结果)
在图5中表示实时双光子激光扫描图像。自PBB3注射3秒以内,PBB3的信号出现于预先用磺基罗丹明101所标记的血管内,在接下来的5分钟,该信号由血管扩散到脊髓组织(图5a~f)。之后,扩散的PBB3,未结合者由脊髓组织排出,但在同时显示出对Tau内含物明确的结合(图5g以及h的楔形记号)。另一方面,于WT小鼠中并未观察到来自像该结合化合物的信号。该结果表示PBB3通过血脑屏障,并迅速地标记脑内的Tau沉积物。
(生物学的实施例5)
(利用放射性标记化合物的PS19小鼠中Tau病变的放射自显影法以及PET成像)
(试管内放射自显影法)
将12~15月龄的非Tg WT以及PS19小鼠断头,将脑冷冻并于冷冻切片机(HM560)内切成厚度20μm的切片。将该切片载置于载玻片(MatsunamiGlass)上,到分析前保存于-80℃。同样地,从AD患者的脑取得大脑皮质切片。将组织切片,在含有20%乙醇以及[11C]PBB2、或是10%乙醇以及[11C]PBB3(37MBq/L,~1nM)的250mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中,于室温培养60分钟。在10μM的非放射性配体的存在下检测非特异性结合。将样品与[11C]PBB2或是[11C]PBB3进行反应,分别用含有20%或是10%乙醇的冰浴Tris-HCl缓冲液洗净2次各2分钟,并浸入冰水10秒。之后,将切片在温风下干燥,置于成像板(Imaging plate)(Fuji Film)。将成像板用BAS500系统(Fuji Film)扫描,获得放射自显影图(图6A的a)。
(活体外放射自显影法)
通过1~1.5%(v/v)异氟烷混合气的麻醉下(流量2ml/分),在12~15月龄的非Tg WT以及PS19小鼠的尾静脉,注射[11C]PBB2或是[11C]PBB3(~37MBq)。在注射45分钟后,将小鼠断头立刻摘出脑,并用粉末干冰冷冻。将冷冻的脑组织,通过低温管切成厚度20μm的切片。之后,获得放射自显影图(图6A的b)。并且,将放射自显影法后的PS19小鼠脑切片用FBS染色。
(小鼠的活体内PET(正电子放射断层造影术)成像)
使用microPET Focus 220动物扫描仪(Siemens Medical Solutions)来进行PET扫描,该动物扫描仪提供以0.851mm厚度(中心距离)95枚的切片,19.0cm轴向视野(FOV),以及7.6cm剖面内FOV。在扫描前,将9~15月龄的PS19以及非Tg WT小鼠用1.5%(v/v)异氟烷麻醉。在[11C]PBB2(28.3±10.3MBq)、[11C]PBB3(29.7±9.3MBq)、或是[11C]mPBB5(32.8±5.9MBq)的静脉内注射后,立刻以90分钟、3D列表模式(list-mode)、能量窗350-750keV来进行发射扫描。为避免该化合物的光消旋化,放射性化合物的注射以及扫描在昏暗下进行。将全部的列表模式数据依照3D正弦图分类,之后,通过Fourier-rebinning变换为2D正弦图(帧:10×1、6×5、和5×10分钟)。根据最大后验概率的重建(maximum a posteriori reconstruction)藉此获得在放射性化合物注射后30~60分钟以及60~90分钟的加总平均成像。并且,使用0.5-mm汉宁滤波器(hanning filter),通过滤波反投影法重建动态成像。参照MRI模板,在包含脑干以及纹状体的多个解剖学结构上,使用PMOD成像分析软件(PMOD Technologies)设定感兴趣体积(volume of interest(VOI))。对进行[11C]PBB3-PET扫描的12月龄PS19Tg小鼠子群,在静脉内注射[11C]Ac5216(34.6±8.8MBq)后的90分钟,进行TSPO的动态PET成像。[11C]Ac5216-PET扫描,在[11C]PBB3-PET扫描的1周内进行。(图6A的c)
(结果)
图6A的a表示PS19以及非Tg WT小鼠的小脑脑干部以及AD额叶皮质的试管内放射自显影图。通过[11C]PBB2以及[11C]PBB3,小鼠脑干以及AD灰质中的纤维凝集体病变受到强烈的放射标记。并且,[11C]PBB3的结合,由于非放射性PPB3的添加(10μM)而受到阻碍。图6A的b表示PS19以及非Tg WT小鼠的活体外放射自显影图、以及PS19脑切片的FBS染色成像图。箭头表示含有大量Tau内含物的脑干。通过[11C]PBB2以及[11C]PBB3,PS19小鼠的脑干以及脊髓所含有的Tau内含物受到放射标记。[11C]PBB3更加选择性地放射标记该Tau内含物。
图6A的c表示将[11C]PBB3的静脉内投与60~90分钟后的动态扫描数据取平均而得的矢状面以及冠状面PET图像、以及MRI图像。箭头以及星号分别表示脑干以及纹状体,楔形记号表示PS19小鼠的内侧脑干内的强烈放射标记。图6B的a以及b表示将[11C]PBB2投与60~90分钟后的动态扫描数据取平均而得的矢状剖PET图像。成功将PS19小鼠的Tau病变在活体内进行可视化。
图6A的d表示在PET扫描后由PS19小鼠摘出的脑切片的FSB染色图像(矢状面(左图)以及冠状面(中央图)的图像、以及纤维性Tau内含物的高倍率像(右图))。PET信号与PS19小鼠的NFT状Tau内含物的位置显示为一致。
图6A的e表示PS19小鼠以及WT小鼠的纹状体(ST)以及脑干(BS)中,时间-放射性曲线(左图)、和放射性的BS对ST的比(右图)(分别为n=5)。静脉内注射后,[11C]PBB3迅速地通过血脑屏障,未结合以及非特异性结合的[11C]PBB3半衰期约为10分钟,且立即从脑排出。并且,12月龄的PS19小鼠脑干中的[11C]PBB3信号,经过摄影时间(90分钟),仍维持着,这是与同月龄的非Tg WT小鼠的结果显著地不同(图6A的e,左图)。将缺乏Tau病变的纹状体(ST)作为参照区域,相对于该参照区域的目标脑干(BS)的比约在70分钟达到最大値(图6A的e,右图)。另一方面,在WT小鼠中,在60分钟内持续减少。45~90分钟的平均比,与12月龄的WT小鼠相比,在同月龄的PS19小鼠增加了40%。
图6B的c以及d,表示于图6B的a以及b所示的小鼠活体外放射自显影法图像。图中的箭头,表示PS19小鼠中的放射性标记的增大。图6B的e以及f,表示使用与获得放射自显影法图像的样品相同的样品的FSB染色图像。图6B的g表示WT小鼠的多个脑组织中的时间-放射性曲线。图6B的h表示在PS19小鼠(图中1)以及WT小鼠(图中2)(n=5)的摄影时间范围期间,脑干对纹状体的放射性比。
图7表示注射[11C]mPBB5的WT小鼠(左图)以及PS19Tg小鼠(右图)脑内中的冠状面PET图像。该图像是通过将注射30~90分钟后的动态数据取平均而得,并重叠于MRI模板上。该PET图像显示出与WT小鼠比较的下,在PS小鼠脑干中保持着多量的[11C]mPBB5。
(生物学的实施例6)
(包含人类海马体的AD脑的试管内放射自显影法)
用以比较[11C]PBB3以及[11C]PIB的对人类脑内Tau病变丰富的区域的结合,使用包含海马体的AD脑切片而获得试管内放射自显影图。
(人类活体内PET成像)
用以本研究而采用认知机能正常的受试者2人(72岁以及75岁;平均73.5岁),以及AD患者3人(64岁、75岁以及77岁;平均72岁)。所有的被实验对象都为男性,所有的AD患者都是根据国立神经疾病、沟通障碍以及脑中风/阿尔茨海默症相关疾病协会(National Institute of Neurological andCommunicative Diseases and Stroke/Alzheimer’s Disease and Related DisordersAssociation)(NINCDS-ADRDA)的基准来诊断的。将临床痴呆评量表(ClinicalDementia Rating scale)在正常的受试者的双方设为0、在AD患者中设在1~2的范围。将他们的认知功能通过简易智能状态测验(Mini-Mental StateExamination(MMSE))来评价。没有基于MRI的脑有异常的受试者。另一方面,AD患者中,可见新皮质以及海马的萎缩。本临床研究,是经由放射线医学综合研究所的伦理以及放射线安全委员会所认可的。从该被实验对象或是其家族得到了知情同意。PET分析法是通过轴向FOV为155mm、63枚的连续性2.46mm厚切片、以及具有剖面内分辨率为5.6mm而轴向解像度为5.4mm的Siemens ECAT EXACT HR+扫描仪(CTI PET Systems)进行的。为了测定组织衰减,进行10分钟的穿透扫描,在[11C]PIB(350±50MBq)的静脉内注射后的70分钟过程中,以3D模式收集动态发射扫描数据。由该动态扫描获得多个图像帧(3×20以及3×40秒、和1×1、2×3、5×6以及3×10分钟)。同样地,对相同的个人,在[11C]PIB-PET结束约2.5小时后开始使用[11C]PBB3的第二PET阶段。将[11C]PBB3(370±50MBq)用60秒注射到静脉内,用70分钟获得发射数据(帧:3×20以及3×40秒、和1×1、2×3、5×6以及3×10分钟)。[11C]PBB-PET扫描期间,在注射后10、20、30、40、50、60、70、80、90、100以及110秒、和2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60以及70分钟取得动脉血液样品,测定血浆中的放射活性量。用3、10、20、30以及60分钟的样品,通过HPLC来测定相当于未被代谢的血浆中[11C]PBB3的放射活性(Waters mBondapak C18柱,7.8mm×300mm;乙腈/甲酸铵移动相,梯度洗脱=40/60(0分钟)、52/48(6分钟)、80/20(7分钟)、80/20(8分钟)、40/60(9分钟)以及40/60(15分钟);流速6ml/分钟)。放射性化合物的注射以及持续扫描、和血浆分析法在昏暗下进行,以避免该化合物的光消旋化。
将各个MRI数据,使用PMOD软件包(PMOD Technologies)与PET图像同时记录。将VOI设定于同时记录的MR图像中,移到PET图像上。定义了小脑皮质、包含海马旁回以及海马的颞叶内侧、额叶皮质的基部侧、顶叶皮质的楔前叶、和半卵圆中心中的VOI。各VOI包含3个邻接切片,将数据结合,针对全VOI获得平均放射活性浓度。从注射用量/体重而标准化的时间积分局部放射性浓度(time-integrated regional radioactivity concentration)来计算标准摄取值(standardized uptake value(SUV))。积分区间是对30~70分钟的数据进行的。由于小脑可作为参照脑领域利用,针对各目标VOI,将小脑的SUV比(SUVR)作为老人斑或是Tau沉积的指标来测定。
(结果)
图8a表示用了10nM的[11C]PBB3(左)以及[11C]PIB(中央)的AD患者脑切片的放射自显影法。该切片包含海马(Hi)、海马傍回(PH)、梭状回(FF)以及白质(星号)。[11C]PBB3以及[11C]PIB的全结合(Total),分别由于非放射性PBB5(100μM)以及硫代黄素-S(10μM)的添加,在除了用[11C]PIB标记的白质以外,被显著地取代(NS)。于海马CA1区域以及海马足,虽然显示强烈[11C]PBB3信号,但未显示[11C]PIB信号。并且,在侧副沟侧面的皮质区域(黑圆点)中的[11C]PBB3结合,与[11C]PIB的结合相比,较多。该切片中的淀粉样蛋白原纤维的FSB染色,显示在CAI以及海马支脚(subiculum)(Sub),NFT是病变的活体,而在梭状回(FF)多为老人斑(右图)。这暗示了[11C]PBB3与AD脑内NFT的强烈的反应性。
图8b表示对相同的AD(上段)以及正常控制组(NC;下段)被实验对象进行MRI(左),和使用[11C]PBB3(中央)以及[11C]PIB(右)的PET成像。冠状剖面图像包含海马体(楔形记号)。与NC比较之下,在AD患者的海马体中,虽然[11C]PBB3信号有增加,但在[11C]PIB信号几乎没有变化。由此表示,[11C]PBB3与[11C]PIB并不相同,并且会与AD患者海马的NFT强烈结合。
(简称)
AD:阿尔茨海默症
AIBN:偶氮二异丁腈
AT8:抗磷酸化Tau抗体(anti-phospho-tau antibody)
BF-158:2-[(4-甲基氨基)苯基]喹啉
BF-170:2-(4-氨基苯基)喹啉
BF-189:N-甲基-4-[6-(喹啉-2-基)己-1,3,5-三烯基]苯胺
BF-227:2-(2-[2-二甲基氨基噻唑-5-基]乙烯基)-6-(2-[氟]乙氧基)苯并恶唑
BSB:(E,E)-1-溴-2,5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯
BTA-1:2-(4-甲基氨基苯基)苯并噻唑
DM-POTEB:2-[8-(4-二甲基氨基苯基)辛-1,3,5,7-四烯基]-3-乙基苯并噻唑-3-鎓
FDDNP:2-(1-{6-[(2-氟乙基)(甲基)氨基]-2-萘基}亚乙基)丙二腈
FSB:(E,E)-1-氟-2,5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯
FTDP-17:与17号染色体连锁的额颞叶痴呆症和帕金森症
MRI:核磁共振成像法
NFT:神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle)
NBS:N-溴琥珀酰亚胺
PET:正电子放射断层造影术
PIB:匹兹堡化合物B
T40:由441个氨基酸残基所构成最长的Tau异构体
TBDMSCl:叔丁基二甲基氯硅烷
Tg:转基因
THK523:2-(4-氨基苯基)-6-(2-氟乙氧基)喹啉
TSPO:转位分子蛋白
WT:野生型
产业上的可利用性
本发明的化合物能够用于阐明阿尔茨海默症、额颞叶变性症、痴呆症、以及其他神经退行性Tau病变等疾病患者的脑内所蓄积的Tau蛋白质的生成机制。并且,通过使用本发明的化合物,能够进行前述疾病的诊断、发病预测、以及前述疾病的治疗用候补化合物的筛选。并且,通过使用本发明的化合物,能够制定前述疾病的治疗战略。