CN104678045A - 苦桉祛疹凝胶药品的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其通过对苦桉祛疹凝胶中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱、广藿香所含的百秋李醇、大叶桉所含的桉油精用薄层色谱法进行鉴别检查，该方法具有操作简单、分离效果良好、专属性强等技术特点；对方中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱采用高效液相色谱法(HPLC)测定含量，该方法具有分离效果好，测定准确、灵敏、快速及专属性强等技术特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药制剂鉴别和含量测定方法，具体涉及苦桉祛疹凝胶的检测方法。
背景技术
我国把长江以南的东南沿海省域如浙江、福建、广东、海南、台湾以及江苏南部、云南南部和西南部海拔在1500米以下的谷地划为热带地区，属湿热气候，其主要特点为①气温高、热期长、日辐射强；②雨水多、湿度大；③雷暴多、台风频袭。热气候对民众健康影响较大，主要有热病、皮肤病、疲劳、烂脚和外伤、温水浸泡足和稻田足等。其中皮肤病是高发病种之一。在湿热环境下作业，由于大量出汗，皮肤持续受汗液浸渍，易发生皮肤病，如疖种、癣、痱子、阴囊皮炎和湿疹等。
中医药外用疗法治疗皮肤病源远流长，疗效可靠，在数千年的发展中，积累了大量的名方名药。如大叶桉外用治烧烫伤，蜂窝织炎，乳腺炎，疖肿，丹毒，水田皮炎，皮肤湿疹，脚癣，皮肤消毒。广藿香油是皮肤癣菌的特异性抑制剂，最小抑制浓度MIC在500(l/L)以下，能用于治疗皮肤霉菌病。临床表明中药具有许多西药不可比拟的优势，如适应症广、副作用少、耐药性低、综合药效突出。
一种苦桉祛疹凝胶，其处方中活性成分由下列重量份的原料组成：黄柏65-95份、蛇床子90-110份、苦参145-175份、地肤子65-95份、椿根皮65-95份、广藿香45-70份、大叶桉100-130份，临床用于治疗湿疹、皮炎、癣证等取得理想疗效，其对急性湿疹、亚急性湿疹、慢性湿疹、神经性皮炎、特应性皮炎、特应性皮炎、淤积性皮炎的疗效非常明显。但是，现有技术还没有该种苦桉祛疹凝胶的质量标准检测方法，无法在生产和使用中有效的保证产品质量，因此无法保证产品的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，该方法具有分离效果好，测定准确、灵敏、快速及专属性强等特点。
本发明的目的是这样实现的：一种苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其处方中活性成分由下列重量份的原料组成：黄柏65-95份、蛇床子90-110份、苦参145-175份、地肤子65-95份、椿根皮65-95份、广藿香45-70份、大叶桉100-130份，检测方法为：通过对苦桉祛疹凝胶中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱、广藿香所含的百秋李醇、大叶桉所含的桉油精用薄层色谱法进行鉴别检查；对苦桉祛疹凝胶中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱采用高效液相色谱法(HPLC)测定含量。
本发明所采用的方法对苦桉祛疹凝胶中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱、广藿香所含的百秋李醇、大叶桉所含的桉油精用薄层色谱法进行鉴别检查，该方法具有操作简单、分离效果良好、专属性强等技术特点；对方中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱采用高效液相色谱法(HPLC)测定含量，该方法具有分离效果好，测定准确、灵敏、快速及专属性强等技术特点。
附图说明
图1是本发明的黄柏鉴别图。
图2是本发明的蛇床子鉴别图。
图3、图4是本发明的苦参鉴别图，其中图3是苦参碱，图4是氧化苦参碱。
图5是本发明的广藿香鉴别图。
图6是本发明的大叶桉鉴别图。
图7是本发明的含量测定盐酸小檗碱对照品图。
图8是本发明的按测定盐酸小檗碱方法测定苦桉祛疹凝胶供试品图。
图9是本发明的按测定盐酸小檗碱方法测定阴性对照图。
图10是本发明的含量测定小檗碱线性相关图。
图11是本发明的含量测定蛇床子素对照品图。
图12是本发明的按测定蛇床子素方法测定苦桉祛疹凝胶供试品图。
图13是本发明的按测定蛇床子素方法测定阴性对照图。
图14是本发明的含量测定蛇床子素线性相关图。
图15是本发明的含量测定苦参碱与氧化苦参碱对照品图。
图16是本发明的按测定苦参碱与氧化苦参碱方法测定苦桉祛疹凝胶供试品图。
图17是本发明的按测定苦参碱与氧化苦参碱方法测定阴性对照图。
图18、19是本发明的含量测定苦参碱与氧化苦参碱线性相关图。
图20是本发明的苦参碱与氧化苦参碱含量测定所用溶剂的溶剂峰图。
具体实施方式
本发明是为苦桉祛疹凝胶建立的一个质量标准的检测方法，即黄柏、蛇床子、苦参、广藿香与大叶桉的鉴别方法和小檗碱、蛇床子素、苦参碱与氧化苦参碱的含量测定方法。
所检测的苦桉祛疹凝胶，其处方中活性成分由下列重量份的原料组成：黄柏65-95份、蛇床子90-110份、苦参145-175份、地肤子65-95份、椿根皮65-95份、广藿香45-70份、大叶桉100-130份。
实施例1
用以下处方制品为例：黄柏78.2g，蛇床子104.5g，苦参157.3g，地肤子78.2g，椿皮78.2g，广藿香55.5g，大叶桉111.8g，卡波姆20g，羟丙基甲基纤维素钠15g，丙二醇150g，甘油200g，无水硫酸钠2g，氢氧化钠2g，尼泊金乙酯1g，蒸馏水适量。以上七味，取苦参、地肤子、椿皮加12倍量水，浸泡30min，提取2次，每次2.0小时，滤过，合并滤液，浓缩到1∶1，备用；取黄柏、蛇床子加8倍量75％乙醇，提取2次，每次提取1.5h，回收乙醇，滤过，合并滤液，浓缩到1∶1，备用；取广藿香、大叶桉加12倍量水，浸泡1.5h，提取5小时，得挥发油。取上述水提液、醇提液、挥发油，混匀得合并药液备用。
另取羟丙基甲基纤维素钠、卡波姆、甘油、丙二醇，加水适量，搅匀，浸泡4-5小时，使充分溶胀，得凝胶基质。另取无水硫酸钠、氢氧化钠加入药液，将药液加入所制备凝胶基质中，加水至全量，搅拌均匀，即得。
性状：本品为凝胶，内容物为浅黄色至黄棕色凝胶，味苦。
一、对苦桉祛疹凝胶药物的黄柏、蛇床子、苦参、广藿香、大叶桉的鉴别方法如下：
(1)黄柏鉴别：取实施例1所制备苦桉祛疹凝胶加乙醇30ml，超声处理15分钟，放冷，滤过，滤液置于蒸发皿上水浴加热蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为供试品溶液。取黄柏对照药材1.0g，加乙醇10ml，超声15min，放冷，过滤，滤液置于蒸发皿上水浴加热蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为对照药材溶液。取盐酸小檗碱对照品适量，加乙醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，即得，作为对照品溶液。按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺黄柏的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺黄柏阴性对照溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液1μl，对照药材溶液3μl、对照品溶液5μl，缺黄柏阴性对照溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以以正丁醇-冰醋酸-水(7:1：2)为展开剂，展开，展距：9cm；取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与黄柏对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无此特征。
(2)蛇床子鉴别：取实施例1所制备苦桉祛疹凝胶5.0g，加乙醇30ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液置于蒸发皿上水浴蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为供试品溶液。取蛇床子对照药材1.0g，加乙醇10ml，超声30min，放冷，过滤，滤液置于蒸发皿上水浴蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为对照药材溶液。取蛇床子素对照品适量，加乙醇溶解制成每1ml含1mg的溶液，即得，作为对照品溶液。按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺蛇床子的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺蛇床子阴性对照溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，分别吸取上述四种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯(30∶1)为展开剂，饱和15min，展开，取出，晾干；展距8cm；，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无此特征；
(3)苦参鉴别：取实施例1所制备苦桉祛疹凝胶约5.0g，加入95％的乙醇溶液20ml，超声处理(35℃，超声40min，功率100W，频率40kHz)放冷，过滤，作为供试品溶液。另取苦参对照药材2.00g加入20ml，超声处理(35℃，超声40min，功率100W，频率40kHz)放冷，过滤，作为对照药材溶液。取苦参碱对照品，加入95％乙醇制成0.2mg/ml的溶液，作为对照品溶液。按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺苦参的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺苦参阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液8μl，对照药材溶液12μl，阴性液6μl，苦参碱对照品1.4μl点在同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-浓氨试液(8:12：16:1)为展开剂，展开，展距8cm，取出，晾干。喷以碘化必钾溶液显色。供试品色谱中，在与对照药材以及苦参碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液的色谱中，在与苦参碱对照品相应的位置上，没有对应的斑点。
取实施例1所制备苦桉祛疹凝胶约5.0g，加入95％的乙醇溶液20ml，超声处理(35℃，超声40min，功率100W，频率40kHz)放冷，过滤，作为供试品溶液。另取苦参对照药材2.00g加入20ml，超声处理(35℃，超声40min，功率100W，频率40kHz)放冷，过滤，作为对照药材溶液。取0.2mg氧化苦参碱对照品，溶于1.00mL95％的乙醇中，所得溶液即为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液8μl，对照药材6μl，阴性溶液8μl，对照品2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨水(5:0.6:0.3)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试剂显色。供试品色谱中，在与对照药材色谱以及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液的色谱中，在与对照品相应的位置上，没有对应的斑点。
(4)广藿香鉴别：
取实施例1所制备苦桉祛疹凝胶称取100g，加蒸馏水150ml，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，于挥发油测定器内滴加约1ml乙酸乙酯萃取挥发油，加热蒸馏约90分钟，吸取乙酸乙酯层作为供试品溶液。另取百秋李醇对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺苦参的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺苦参阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，分别供试品溶液10μl，对照药材溶液1μl，对照品百秋李醇1μl，阴性溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30-60℃)-乙酸丁酯–冰醋酸(95:5:0.2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液。对照药材色谱中显示黄色斑点；加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝紫色的斑点，阴性对照溶液无此特征。
(5)大叶桉鉴别：
取实施例1所制备苦桉祛疹凝胶内容物10.0g，加乙醚提取3次，时时振摇，每次10ml，合并乙醚溶液常温挥干，用1ml无水乙醇定容，即得供试品溶液。取大叶桉对照药材，按挥发油测定法提取挥发油，取挥发油0.1ml，加无水乙醇使成1ml，即得对照药材溶液。取桉精油0.1ml，加无水乙醇使成1ml，即得桉精油对照品溶液。阴性对照溶液的制备按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺大叶桉的阴性对照样品，取10.0g，按供试品溶液的制备方法，制成缺大叶桉的阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材2μl，桉精油对照品0.5ul，阴性对照溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(9.5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液的色谱中，在与对照药材相应的位置上，没有对应的斑点。
二、对苦桉祛疹凝胶药物的小檗碱、蛇床子素、苦参碱与氧化苦参碱的含量测定方法如下：
1、小檗碱的含量测定方法如下：
1.1仪器与试剂、检测波长、色谱条件
1.1.1仪器与试剂：高效液相色谱仪(Agilent 1100系列：Agilent G1316A泵、AgilentG1322A紫外检测器、Agilent G1313A自动进样器)；超声波振荡器(功率100W，频率40kHz)。盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200609)；乙腈为色谱纯(德国默克有限公司)；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯；苦桉祛疹凝胶(均按实施例1处方及制法制得)。
1.1.2检测波长的选择：关于盐酸小檗碱的含量测定在中国药典2010年版一部黄连项下(见285页)，盐酸小檗碱的检测波长为345nm，故本文检测波长采用345nm。
1.1.3色谱条件的选择：
按照2010年版一部黄柏下色谱条件进行盐酸小檗碱的含量测定。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50：50)(每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0)为流动相；检测波长为345nm；流速1.0ml/min。盐酸小檗碱的色谱峰分离良好，此方法具有良好的专属性(如图7～图8)。
1.2供试品溶液前处理方法
取苦桉祛疹凝胶约0.5g，精密称定，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液25ml，密塞，超声处理(功率100W，频率40kHz)30分钟，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按上述色谱条件对盐酸小檗碱进行检测，结果见表1。
表1苦桉祛疹凝胶不同提取时间盐酸小檗碱的含量
从表1结果看出，超声处理30分钟时，盐酸小檗碱的含量最高；当超声处理40分钟时，含量就有所下降。故采用超声处理30分钟为最优选。
1.3含量测定方法验证
1.3.1专属性试验
按处方比例及制法，制成缺黄柏的阴性对照样品，取相当于供试品的量，按供试品溶液的制备方法，制成缺黄柏的阴性对照溶液。按上述测定方法测定盐酸小檗碱含量，结果见图7和图9。从图中可以看出，缺黄柏的阴性对照溶液的图谱中，在与盐酸小檗碱图谱相应的位置上，没有对应的峰。
1.3.2准确度取已知含量的同一批(20130915)苦桉祛疹凝胶约0.25g，精密称定，称6份，分别置25ml量瓶中，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(每1ml含盐酸小檗碱2.01mg的甲醇溶液)1ml，按上述测定方法测定盐酸小檗碱含量，结果见表2。
表2回收试验测定结果(n＝6)
从表2结果看出，平均回收率为95.34％，RSD为0.03％，符合药典要求。
1.3.2.1重复性取同一批(20130915)苦桉祛疹凝胶约0.5g，精密称定，称6份，按上述测定方法测定盐酸小檗碱的含量，结果见表3。
表3重复性试验结果(n＝6)
从表3结果看出，RSD为0.4％，符合药典要求。
1.3.2.2中间精密度取同一批(20130915)苦桉祛疹凝胶约0.5g，精密称定，称6份，分别由A、B、C三人在不同的时间，用同一台设备，按上述测定方法测定盐酸小檗碱含量，结果见表4。
表4中间精密度试验结果(n＝6)
从表4结果看出，RSD为0.30％，符合药典要求。
1.3.3线性取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含有0.137mg的溶液，即得。分别精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液(0.137mg/ml)0.5ml、1ml、2ml、4ml、6ml、8ml加甲醇定容至10ml，分别精密吸取对照品溶液10μl，按上述方法测定，以测得峰面积积分值为纵坐标，对照品量为横坐标，绘制标准曲线(表5、图10)，得回归方程，Y＝5345.7x-33.494，相关系数r＝1，线性范围：0.0685～1.096μg.
表5盐酸小檗碱峰面积及含量表
从表5结果看出，盐酸小檗碱在0.0685～1.096μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，符合药典要求。
1.3.4稳定性试验精密称取同一批苦桉祛疹凝胶(20130915批)0.5021g，按上述测定方法，取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12小时连续进样检测，结果见表6。
表6稳定性实验测定结果
从表6看出，供试品溶液配制后24小时内测定，RSD为0.53％，符合药典要求。
1.3.5含量限度的确定
通过对9批小试产品、6批中试、2批工艺验证产品的含量测定结果，按照惯例，求出平均值后下调20％，得出本产品中盐酸小檗碱含量限度。结果见表7。
表7含量限度的确定
从表7得知，本产品中盐酸小檗碱的含量限度为6.381mg/g.
2、蛇床子素的含量测定方法如下：
2.1仪器与试剂、检测波长、色谱条件
2.1.1仪器与试剂：高效液相色谱仪(Agilent 1260系列：Agilent G1311B泵、AgilentG4212B紫外检测器、Agilent G1329B自动进样器)；超声波振荡器(功率100W，频率100kHz)。蛇床子素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110805-200508)；乙腈为色谱纯(德国默克有限公司，批号：30281-27409)；水为双蒸水。
2.1.2检测波长的选择：关于蛇床子素的含量测定在中国药典2010年版一部蛇床子项下(见296页)，蛇床子素的检测波长为322nm，故本文检测波长采用322nm。
2.1.3色谱条件的选择：
参考2010年版一部蛇床子项下色谱条件进行蛇床子素的含量测定。以水-乙腈(37∶63)为流动相；检测波长为322nm；流速：1.0ml/min。蛇床子素的色谱峰分离良好，此方法具有良好的专属性(如图11和图12)。
2.2含量测定方法验证
2.2.1专属性试验
按处方比例及制法，制成缺蛇床子素的阴性对照样品，取相当于供试品的量，按供试品溶液的制备方法，制成缺蛇床子的阴性对照溶液。按上述测定方法测定蛇床子素含量，结果见图11和图13。从图中可以看出，缺蛇床子的阴性对照溶液的图谱中，在与蛇床子素图谱相应的位置上，没有对应的峰。
2.2.2准确度取已知含量的同一批(20130915)苦桉消疹凝胶约0.5g，精密称定，称6份，分别置25ml量瓶中，分别精密加入蛇床子素对照品溶液(每1ml含蛇床子素0.1544mg的乙醇溶液)6ml，按上述测定方法测定蛇床子素含量，结果见表8。
表8回收试验测定结果(n＝6)
从表8结果看出，平均回收率为97.59％，RSD为2.903％，符合要求。
2.2.2.1重复性取同一批(20130915)苦桉消疹凝胶约1g，精密称定，称6份，按上述测定方法测定蛇床子素的含量，结果见表9。
表9重复性试验结果(n＝6)
从表9结果看出，RSD为2.684％，符合药典要求。
2.2.2.2中间精密度取同一批(20130915批)苦桉消疹凝胶约1g，精密称定，称6份，分别由A、B、C三人在不同的时间，用同一台设备，按上述测定方法测定蛇床子素含量，结果见表10。
表10中间精密度试验结果(n＝6)
从表10结果看出，RSD为2.579％，符合药典要求。
2.2.3线性取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含有0.0456mg的溶液，即得。分别精密吸取蛇床子素对照品溶液(0.0456mg/ml)1ml、2ml、3ml、4ml、6ml至10ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，吸取10μl，按上述方法测定，以测得峰面积积分值为纵坐标，对照品量为横坐标，绘制标准曲线(表11、图14)，得回归方程，Y＝150034X+23.36，相关系数r＝0.9993，线性范围：0.00456～0.02736mg/ml。
表11蛇床子素峰面积及含量表
从表11结果看出，蛇床子素在0.0685～1.096μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，符合药典要求。
2.2.4稳定性试验精密称取苦桉消疹凝胶(20130915批)1.0067g，按“发明内容：二(2.2)、含量测定项”下，拟订的含量测定方法，取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、18、24小时连续进样检测，结果见表12。
表12稳定性实验测定结果
从表12看出，供试品溶液配制后24小时内测定，RSD为0.204％，符合药典要求。
2.2.5含量限度的确定
通过对9批小试、6批中试、2批工艺验证产品的含量测定结果，按照惯例，求出平均值后下调20％，得出本产品中蛇床子素含量限度。结果见表13。
表13含量限度的确定
从表13得知，本产品中蛇床子素的含量限度为1.487mg/g.
3、苦参碱与氧化苦参碱的含量测定方法如下：
3.1仪器与试剂、检测波长、色谱条件
3.1.1仪器与试剂：高效液相色谱仪(Agilent 1260系列：Agilent G1311B泵、AgilentG4212B紫外检测器、Agilent G1329B自动进样器)；超声波振荡器(功率100W，频率100kHz)。苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110805-200508)；氧化苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110780-201007)；乙腈为色谱纯(德国默克有限公司，批号：30281-27409)；其余为分析纯。
3.1.2检测波长的选择：参考苦参碱及氧化苦参碱的含量测定在中国药典2010年版一部苦参项下(见188页)，苦参碱及氧化苦参碱的检测波长为220nm，故本文检测波长采用210nm。
3.1.3色谱条件的选择：
参考2010年版一部苦参下色谱条件进行苦参碱及氧化苦参碱的含量测定。以乙腈-无水乙醇-3％磷酸(83∶10∶7)为流动相；检测波长为210nm；流速：1.0ml/min。苦参碱及氧化苦参碱的色谱峰分离良好，此方法具有良好的专属性(如图15和图16)。
3.2含量测定方法验证
3.2.1专属性试验
按处方比例及制法，制成缺苦参碱及氧化苦参碱的阴性对照样品，取相当于供试品的量，按供试品溶液的制备方法，制成缺苦参的阴性对照溶液。按上述测定方法测定苦参碱及氧化苦参碱含量，结果见图15和图17。从图中可以看出，缺苦参的阴性对照溶液的图谱中，在与苦参碱及氧化苦参碱图谱相应的位置上，没有对应的峰。
3.2.2准确度取已知含量的同一批(20130915)苦桉消疹凝胶约1g，精密称定，称6份，分别置25ml量瓶中，分别精密加入苦参碱及氧化苦参碱对照品溶液(每1ml含苦参碱0.0596mg、氧化苦参碱0.0372mg的乙醇溶液)2.5ml，按上述测定方法测定苦参碱及氧化苦参碱含量，结果见表14、15。
表14苦参碱回收试验测定结果(n＝6)
从表14结果看出，平均回收率为103.39％，RSD为2.377％，符合药典要求。
表15氧化苦参碱回收试验测定结果(n＝6)
从表15结果看出，平均回收率为99.17％，RSD为2.449％，符合药典要求。
3.2.2.1重复性取同一批(20130915)苦桉消疹凝胶约2g，精密称定，称6份，按上述测定方法测定苦参碱及氧化苦参碱的含量，结果见表16、17。
表16苦参碱重复性试验结果(n＝6)
从表16结果看出，RSD为2.028％，符合药典要求。
表17氧化苦参碱重复性试验结果(n＝6)
从表17结果看出，RSD为2.490％，符合药典要求。
3.2.2.2中间精密度取同一批(20130915批)苦桉消疹凝胶约2g，精密称定，称6份，分别由A、B、C三人在不同的时间，用同一台设备，按上述测定方法测定苦参碱及氧化苦参碱含量，结果见表18、19。
表18苦参碱中间精密度试验结果(n＝6)
从表18结果看出，RSD为1.479％，符合药典要求。
表19氧化苦参碱中间精密度试验结果(n＝6)
从表19结果看出，RSD为2.835％，符合药典要求。
3.2.3线性取苦参碱及氧化苦参碱对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含有苦参碱0.0596mg、氧化苦参碱0.0372mg的溶液，即得。分别精密吸取苦参碱(0.0596mg/ml)及氧化苦参碱(0.0372mg/ml)的对照品溶液2ml、3ml、4ml、6ml至10ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，吸取10μl，按上述方法测定，以测得峰面积积分值为纵坐标，对照品量为横坐标，绘制标准曲线(表20、21、图18、19)，得苦参碱回归方程，Y＝8936.6X-196.74，相关系数r＝0.9993，线性范围：0.1192～0.3576mg/ml.得氧化苦参碱回归方程，Y＝8447.3X-81.22，相关系数r＝0.9991，线性范围：0.0744～0.2232mg/ml.
表20苦参碱峰面积及含量表
从表20结果看出，苦参碱及氧化苦参碱在0.1192～0.3576mg/ml范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，符合药典要求。
表21氧化苦参碱峰面积及含量表
从表21结果看出，苦参碱及氧化苦参碱在0.0744～0.2232mg/ml范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，符合药典要求。
3.2.4稳定性试验精密称取苦桉消疹凝胶(20130915批)2.0021g，按上述测定方法，取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、18、24小时连续进样检测，结果见表22、23。
表22稳定性实验测定结果
从表22看出，供试品溶液配制后24小时内测定，RSD为0.751％，符合药典要求。
表23稳定性实验测定结果
从表23看出，供试品溶液配制后24小时内测定，RSD为1.602％，符合药典要求。
3.2.5含量限度的确定
通过对9批小试、6批中试、2批工艺验证产品的含量测定结果，按照惯例，求出平均值后下调20％，得出本产品中苦参碱及氧化苦参碱含量限度。结果见表24、25。
表24苦参碱含量限度的确定
从表24得知，本产品中苦参碱的含量限度为0.0959mg/g.
表25氧化苦参碱含量限度的确定
从表25得知，本产品中氧化苦参碱的含量限度为0.0597mg/g。
Claims (9)
1.一种苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其处方中活性成分由下列重量份的原料组成：黄柏65-95份、蛇床子90-110份、苦参145-175份、地肤子65-95份、椿根皮65-95份、广藿香45-70份、大叶桉100-130份，检测方法为：通过对苦桉祛疹凝胶中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱、广藿香所含的百秋李醇、大叶桉所含的桉油精用薄层色谱法进行鉴别检查；对苦桉祛疹凝胶中的黄柏所含的小檗碱、蛇床子所含的蛇床子素、苦参所含的苦参碱与氧化苦参碱采用高效液相色谱法测定含量。
2.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于所述黄柏的鉴别方法为：取苦桉祛疹凝胶5.0g加乙醇30ml，超声处理15分钟，放冷，滤过，滤液置于蒸发皿上水浴加热蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为供试品溶液；取黄柏对照药材1.0g，加乙醇10ml，超声15min，放冷，过滤，滤液置于蒸发皿上水浴加热蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为对照药材溶液；取盐酸小檗碱对照品适量，加乙醇溶解制成每1ml含0.5mg的溶液，即得，作为对照品溶液；按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺黄柏的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺黄柏阴性对照溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液1μl，对照药材溶液3μl、对照品溶液5μl，缺黄柏阴性对照溶液5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7:1：2)为展开剂，展开，展距：9cm；取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与黄柏对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无此特征。
3.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于所述蛇床子的鉴别方法为：取苦桉祛疹凝胶5.0g加乙醇30ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液置于蒸发皿上水浴蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为供试品溶液；取蛇床子对照药材1.0g，加乙醇10ml，超声30min，放冷，过滤，滤液置于蒸发皿上水浴蒸干，残渣用乙醇溶解并定容至5ml，作为对照药材溶液；取蛇床子素对照品适量，加乙醇溶解制成每1ml含1mg的溶液，即得，作为对照品溶液。按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺蛇床子的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺蛇床子阴性对照溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，分别吸取上述四种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯(30∶1)为展开剂，饱和15min，展开，取出，晾干；展距8cm；，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无此特征。
4.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于所述苦参的鉴别方法为：取苦桉祛疹凝胶5.0g，加入95％的乙醇溶液20ml，超声处理放冷，过滤，作为供试品溶液；另取苦参对照药材2.00g加入20ml，超声处理放冷，过滤，作为对照药材溶液；取苦参碱对照品，加入95％乙醇制成0.2mg/ml的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺苦参的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺苦参阴性对照溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液8μl，对照药材溶液12μl，阴性液6μl，苦参碱对照品1.4μl点在同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-丙酮-浓氨试液(8:12：16:1)为展开剂，展开，展距8cm，取出，晾干。喷以碘化必钾溶液显色；供试品色谱中，在与对照药材以及苦参碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液的色谱中，在与苦参碱对照品相应的位置上，没有对应的斑点；
取苦桉祛疹凝胶5.0g，加入95％的乙醇溶液20ml，超声处理放冷，过滤，作为供试品溶液。另取苦参对照药材2.00g加入20ml，超声处理放冷，过滤，作为对照药材溶液；取0.2mg氧化苦参碱对照品，溶于1.00mL95％的乙醇中，所得溶液即为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液8μl，对照药材6μl，阴性溶液8μl，对照品2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨水(5:0.6:0.3)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试剂显色；供试品色谱中，在与对照药材色谱以及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液的色谱中，在与对照品相应的位置上，没有对应的斑点。
5.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于所述广藿香的鉴别方法为：取苦桉祛疹凝胶称取100g，加蒸馏水150ml，用水蒸气蒸馏法提取挥发油，于挥发油测定器内滴加约1ml乙酸乙酯萃取挥发油，加热蒸馏约90分钟，吸取乙酸乙酯层作为供试品溶液；另取百秋李醇对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺苦参的阴性对照样品，称取1.0g，按供试品溶液的制备方法，制得缺苦参阴性对照溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，分别供试品溶液10μl，对照药材溶液1μl，对照品百秋李醇1μl，阴性溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30-60℃)-乙酸丁酯–冰醋酸(95:5:0.2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液；对照药材色谱中显示黄色斑点；加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同蓝紫色的斑点，阴性对照溶液无此特征。
6.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于所述大叶桉的鉴别方法为：取苦桉祛疹凝胶10.0g，加乙醚提取3次，时时振摇，每次10ml，合并乙醚溶液常温挥干，用1ml无水乙醇定容，即得供试品溶液；取大叶桉对照药材，按挥发油测定法提取挥发油，取挥发油0.1ml，加无水乙醇使成1ml，即得对照药材溶液；取桉精油0.1ml，加无水乙醇使成1ml，即得桉精油对照品溶液；阴性对照溶液的制备，按处方比例及制法，取处方量的1/10制成缺大叶桉的阴性对照样品，取10.0g，按供试品溶液的制备方法，制成缺大叶桉的阴性对照溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材2μl，桉精油对照品0.5ul，阴性对照溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(9.5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照溶液的色谱中，在与对照药材相应的位置上，没有对应的斑点。
7.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于：所述小檗碱的含量测定：照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液＝50∶50的液体为流动相，且其中每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0；检测波长为345nm；流速1.0ml/min；理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000；对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含有100μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：取苦桉祛疹凝胶约0.5g，精密称定，精密加入甲醇-盐酸＝100∶1的混合溶液25ml，密塞，超声处理30分钟，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每克含盐酸小檗碱含量计，不得少于6.0mg。
8.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于：所述蛇床子素的含量测定：照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-乙腈＝37∶63的液体为流动相；检测波长为322nm；柱温为25℃；流速为1.0ml/min；理论板数按蛇床子计算应不低于5000；对照品溶液的制备：取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含0.0456mg的溶液，即得；供试品溶液的制备：精密称取苦桉消疹凝胶样品1.0067g，溶于25ml的95％乙醇中，称重，超声处理30分钟，冷却至室温，补足重量，过滤，精密移取2ml至10ml容量瓶，稀释至刻度，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每克含蛇床子素含量计，不得少于1.487mg。
9.根据权利要求1所述的苦桉祛疹凝胶药品的检测方法，其特征在于：所述苦参碱与氧化苦参碱的含量测定：照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂；以乙腈-无水乙醇-3％磷酸＝83∶10∶7的液体为流动相；检测波长为210nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；理论板数按蛇床子计算应不低于5000；对照品溶液的制备：取苦参碱及氧化苦参碱对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含0.1496mg和0.1556mg/ml的溶液，即得；供试品溶液的制备：精密称取苦桉消疹凝胶样品2.0190g，溶于25ml乙醇中，称重，超声处理(功率100W，频率100kHz)30分钟，冷却至室温，补足重量，过滤，精密移取2ml至10ml容量瓶，稀释至刻度，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；每克含苦参碱及氧化苦参碱含量计，不得少于0.0959mg/g和0.0597mg/g。
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|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105300997A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-03 | 贵州远程制药有限责任公司 | 一种治疗妇科炎症的药物制剂的检测方法 |
| CN114487151A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-05-13 | 湖南中医药大学 | 一种黄柏的鉴别方法及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1102342A (zh) * | 1994-04-29 | 1995-05-10 | 柳铁宏 | 苦参芩连片 |
| CN101513467A (zh) * | 2008-02-19 | 2009-08-26 | 赵朝群 | 皮肤病血毒制剂的质量控制方法 |
| CN102526427A (zh) * | 2012-02-20 | 2012-07-04 | 广西梧州三鹤药业有限公司 | 治疗胃肠疾病的中药组合物及质量检测方法 |
| CN103655821A (zh) * | 2012-08-30 | 2014-03-26 | 陕西欧珂药业有限公司 | 一种益气壮阳和填精补髓的中药制剂及其制备方法 |
| CN103908512A (zh) * | 2013-01-08 | 2014-07-09 | 国药控股深圳中药有限公司 | 用于治疗皮肤病的中药凝胶和中药洗剂的制备方法 |
-
2014
- 2014-12-18 CN CN201410796536.9A patent/CN104678045A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1102342A (zh) * | 1994-04-29 | 1995-05-10 | 柳铁宏 | 苦参芩连片 |
| CN101513467A (zh) * | 2008-02-19 | 2009-08-26 | 赵朝群 | 皮肤病血毒制剂的质量控制方法 |
| CN102526427A (zh) * | 2012-02-20 | 2012-07-04 | 广西梧州三鹤药业有限公司 | 治疗胃肠疾病的中药组合物及质量检测方法 |
| CN103655821A (zh) * | 2012-08-30 | 2014-03-26 | 陕西欧珂药业有限公司 | 一种益气壮阳和填精补髓的中药制剂及其制备方法 |
| CN103908512A (zh) * | 2013-01-08 | 2014-07-09 | 国药控股深圳中药有限公司 | 用于治疗皮肤病的中药凝胶和中药洗剂的制备方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 中华人民共和国卫生部药典委员会编: "《中华人民共和国药典 1985年版 一部》", 31 August 1985, article "黄柏" * |
| 中华人民共和国卫生部药典委员会编: "《中华人民共和国药典 1995年版 一部》", 31 August 1995, article "蛇床子" * |
| 任玲 等: "高效液相法测定心律宁片中苦参碱、氧化苦参碱的含量", 《黑龙江中医药》, no. 5, 10 October 2007 (2007-10-10) * |
| 周星 等: "妇科止带片中盐酸小檗碱的含量测定", 《保健医学研究与实践》, vol. 6, no. 1, 20 February 2009 (2009-02-20) * |
| 国家药典委员会编: "《中华人民共和国药典 2010年版 1部》", 31 January 2010, article "广藿香 蛇床子" * |
| 姜建芳 等: "薄层扫描法测定利咽颗粒中苦参碱的含量", 《中国医院药学杂志》, vol. 27, no. 12, 18 December 2007 (2007-12-18) * |
| 广东省食品药品监督管理局编: "《广东省中药材标准 第一册》", 30 November 2004, article "大叶桉" * |
| 陈立琼 等: "中药祛痘膏的制备与应用", 《香料香精化妆品》, no. 3, 30 June 2014 (2014-06-30) * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105300997A (zh) * | 2015-11-30 | 2016-02-03 | 贵州远程制药有限责任公司 | 一种治疗妇科炎症的药物制剂的检测方法 |
| CN105300997B (zh) * | 2015-11-30 | 2016-08-31 | 贵州远程制药有限责任公司 | 一种治疗妇科炎症的药物制剂的检测方法 |
| CN114487151A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-05-13 | 湖南中医药大学 | 一种黄柏的鉴别方法及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150603 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |