CN104662011A - 治疗线粒体疾病的色满衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节线粒体形态和/或OXPHOS酶的表达和/或细胞ROS的新型化合物。所述化合物为TroloxTM的衍生化合物，其中，羧酸基团被酰胺基所代替，且所述酰胺基的氮原子通过连接子与阳离子的氮原子连接。本发明的化合物被配置成药物组合物或化妆品组合物。本发明进一步涉及将本发明的化合物用以治疗或预防线粒体疾病、与线粒体功能障碍相关的病况，包括药物副作用，和/或肿瘤疾病的方法。本发明还涉及用于治疗或延缓皮肤老化的方法和兽医应用。

Description

治疗线粒体疾病的色满衍生物
发明领域
本发明涉及人类和动物疾病以及化妆品领域。本发明尤其涉及如TroloxTM衍生物的化合物，以用于治疗与线粒体功能障碍或线粒体缺陷(mitochondrial deficiencies)相关的病况(包括引起线粒体功能障碍的药物副作用)，和用于治疗肿瘤疾病以及用于抗皮肤老化的化妆品应用。
背景技术
线粒体为构成细胞“动力车间(powerhouses)”的基本细胞器。这些细胞器的缺陷常常导致具有高能量需求的器官(例如，肌肉和大脑)的各种严重的代谢性疾病。这被认为是最常见的先天性代谢异常群(其发生率为5000个人中至少有1个)。而且，因为线粒体触发程序性细胞死亡(细胞凋亡)，这些细胞器的缺陷所带来后果远超这些疾病，由此引起了我们的注意并涉及到了癌症和神经退行性疾病领域如已证实的阿尔茨海默症和帕金森症。许多常用药物(如NRTIs、某些抗生素和抗癫痫药物)能够引起线粒体功能障碍。目前，还没有有效的治疗手段能用于治疗或改善这些疾病状况。
线粒体的主要作用之一是氧化磷酸化(OXPHOS)。三磷酸腺苷(ATP)分子在细胞中充当能量“货币”或能量载体，真核细胞从线粒体进行的生物化学过程获得它们主要的ATP，包括柠檬酸循环，即从氧化型NAD+产生还原型NADH+H+，且在OXPHOS期间，NADH+H+重新氧化为NAD+。通过NADH+H+的氧化释放的电子穿梭于一系列被称作线粒体呼吸链的蛋白质复合物(复合物I、复合物II、复合物III和复合物IV)。这些复合物嵌入线粒体的内膜。处于链末端的复合物IV将电子转移至氧气，将氧气还原成水。将这些电子穿越所述复合物时释放的这些能量用于产生跨越线粒体内膜的质子梯度，由此产生跨越该内膜的电化学势。另一蛋白质复合物，复合物V(不直接与复合物I、II、III和IV关联)利用通过电化学梯度储存的能量将ADP转化为ATP。
在20世纪80年代后期人们已经意识到线粒体功能障碍对人类疾病的作用，当时发现母系遗传点突变以及发育期间自发性缺失与罕见的神经系统综合征有关联。线粒体功能障碍引起了各种疾病状态。一些线粒体疾病是由线粒体基因组的突变或缺失引起的。如果细胞中线粒体的阈值比例有缺陷，以及如果这样阈值比例的组织细胞中存在缺陷的线粒体，将导致组织症状或器官的功能障碍。实际上任何组织都可能受到影响，并可能出现多种症状，只是症状程度取决于所涉及的不同组织。线粒体疾病的一些例子为弗里德赖希共济失调(FRDA，Friedreich's ataxia)、Leber氏遗传性视神经病变(LHON，Leber's Hereditary Optic Neuropathy)、显性视神经萎缩(DOA，dominant opticatrophy)，线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS，mitochondrialmyopathy,encephalopathy,lactacidosis,and stroke)，肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF，Myoclonus Epilepsy Associated with Ragged-Red Fibers)综合征、Leigh综合征和氧化磷酸化障碍(oxidative phosphorylation disorders)。多数线粒体疾病涉及儿童，并表现出加速老化的迹象和症状，包括神经退行性疾病、中风、失明、听力障碍、糖尿病和心脏衰竭。
可用于患有这些线粒体疾病的患者的治疗非常少。药物艾地苯醌(CoQ10变体)已被批准用于治疗弗里德赖希共济失调(Bénit等，2010，Trends MolMed，16：210-7；Klopstock等，2011，Brain，134：2677-86)。另一种化合物，MitoQ10(辅酶)已被提议用于治疗线粒体疾病(US7,179,928)，但还未报道MitoQ10的临床结果。已开发出患有涉及Ullrich先天性肌营养不良症(Ullrich’s congenital muscular dystrophy)和Bethlem肌病(Bethlem’smyopathy)的第二线粒体疾病的成功治疗策略。这些肌肉疾病的致病机理涉及到线粒体通透性转换孔的不适当开放。这种行为可在采用了渗透性过渡孔隙脱敏剂CSA(permeability-transition-pore desensitizer CSA)治疗的患者中得以避免(环孢素A；Angelin等，2007，Proc Natl Acad Sci U S A，104：991-6；Merlini等，2008，Proc Natl Acad Sci U S A，105：5225-9)。
有关线粒体疾病的当前的临床试验的综述可以在网上找到(www.clinicaltrials.gov/ct2/results？term＝mitochondrial+disease)；这些包括用于治疗肌无力和线粒体疾病的CoQ10、用于MELAS的膳食补充剂(dietarysupplements)、用于线粒体疾病的EPI-743、用于肥胖症的人类生长激素、用于糖尿病的营养治疗、用于糖尿病的吡格列酮、用于MELAS的艾地苯醌和用于线粒体三功能蛋白缺乏症的维生素E。
WO2012/019032公开了通过给药维生素K类似物以治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状的方法，和/或调节、正常化或增强一种或多种能量生物指标的一种或多种能量的方法。
WO2012/019029公开了通过给药萘醌及其衍生物以治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状的方法，和/或调节、正常化或增强一种或多种能量生物指标的一种或多种能量的方法。
Distelmaier等(Antioxid Redox Signal.2012，June13(in press)，PMID22559215)公开了TroloxTM(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸)在健康人体皮肤成纤维细胞培养中降低了ROS的水平、增长了线粒体融合蛋白介导的线粒体成丝(increased mitofusins-mediated mitochondrial filamentation)水平和线粒体复合物I的表达水平、柠檬酸合成酶和OXPHOS酶的活性和细胞O2的消耗。
然而，本领域仍对调节线粒体功能的有效手段有所需求以使其能用于治疗线粒体疾病和/或与线粒体功能障碍相关的病况，以及用于治疗肿瘤疾病或化妆品应用。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种通式(I)所示的化合物：
其中，
-L为含有1-10个任选取代的选自碳、氮和氧的骨架原子的连接子(linker)；
-R1和R2各自独立地选自氢和C1-C6的烷基，或者R1和R2连在一起形成在酰胺氮原子与阳离子的氮原子之间的第二连接子，或者R1与连接子L上的骨架原子相连形成环结构，和/或R2与连接子L上的骨架原子相连形成环结构；以及
-R3选自氢和C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，或者当所述阳离子的氮原子为亚胺基的一部分(imine moiety)时，R3不存在；
-R4选自氢和C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一种或多种卤素原子或(卤代)烷氧基取代；且
-X-为药学上可接受的阴离子。
根据本发明所述的化合物优选为以下的化合物，
-L＝L1，R1–R2＝L1，R3＝H，R4＝H，X＝Cl；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L2，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L3，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L4，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
-L＝L5，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
-L＝L6，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
-L＝L3，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I；或
-L＝L7，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L8，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L9，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L10，R1–R1’＝L1，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
-L＝L11，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L13，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L14，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L15，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L11，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L16，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L17，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L16，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L18，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L20，R1＝H，R2＝H，R6–R6’＝L3，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L22，R1–R1’＝L1，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L23，R1–R1’＝L1，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L24，R1–R1’＝L3，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L25，R1–R1’＝L3，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L26，R1＝H，R2＝H，R6–R6’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl。
在一种优选的实施方式中，根据本发明所述的化合物为以下的化合物，
-L＝L5，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
-L＝L8，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L11，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl；或
-L＝L17，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L16，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L26，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl。
在另一种优选的实施方式中，根据本发明所述的化合物为以下的化合物：
-L＝L3，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I。
在第二方面中，本发明涉及含有本发明的化合物的药物组合物或化妆品组合物。
在第三方面中，本发明涉及本发明的化合物作为药物的应用。
在第四方面中，本发明涉及本发明的化合物在调节线粒体形态和OXPHOS酶的表达中的至少一种上的应用。
在第五方面中，本发明涉及本发明的化合物在治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状，或者与线粒体功能障碍有关的病况的症状上的应用，其中，优选所述化合物为以下的化合物：
-L＝L5，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
-L＝L8，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L11，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl；或
-L＝L17，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L16，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L26，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl。
优选地在第五方面中，所述线粒体疾病为选自由以下疾病组成的组中的疾病：肌阵挛性癫痫；肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)；Leber氏遗传性视神经病变(LHON)；神经病变共济失调和色素性视网膜炎(NARP，neuropathy ataxia and retinitis pigmentosa)；线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)；Leigh氏综合征(Leigh syndrome)；Leigh样综合征(Leigh-like syndrom)；显性视神经萎缩(DOA)；卡恩斯-塞尔综合征(KSS，Kearns-Sayre Syndrome)；母系遗传性糖尿病伴耳聋(MIDD，MaternallyInherited Diabetes and Deafness)；Alpers-Huttenlocher综合征；共济失调神经病谱(Ataxia Neuropathy spectrum)；慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO，ChronicProgressive External Ophthalmoplegia)；Pearson综合征；线粒体神经胃肠脑病(MNGIE，Mitochondrial Neuro-Gastro-Intestinal Encephalopathy)；Sengers综合征；3-甲基戊烯二酸尿症、神经性耳聋、脑病和Leigh样综合征的神经影像表现(MEGDEL，3-methylglutaconic aciduria,sensorineural deafness,encephalopathy and neuro-radiological findings of Leigh-like syndrome)；肌病；线粒体肌病；心肌症(cardiomyopathy)；和脑肌病(encephalomyopathy)、SURF1(由于复合物IV过度蛋白质缺乏的COX缺乏的Leigh氏综合征)以及至今未解决的包括了干扰的丙酮酸(pyruvate)氧化和ATP加PCr生产速度的基因缺陷单独的或结合的OXPHOS缺陷。
优选地在第五方面中，所述与线粒体功能障碍有关的病况选自由以下病况组成的组中的病况：弗里德希氏共济失调(FRDA，Friedreich's Ataxia)；肾小管酸中毒(renal tubular acidosis)；视网膜病、帕金森综合征；阿尔茨海默氏病；肌萎缩性侧索硬化(ALS，amyotrophic lateral sclerosis)；亨廷顿氏舞蹈病(Huntington's disease)；普遍性发育障碍(developmental pervasivedisorders)；听力衰退；耳聋；糖尿病；老龄化和导致线粒体功能障碍的药物副作用。
进一步优选地在第五方面中，将可测量的临床指标(clinical marker)用于评估利用本发明的化合物的治疗功效，由此，优选地，所述临床指标为选自由在全血、血浆、脑脊液(cerebrospinal fluid)或脑室液(cerebral ventricularfluid)中的乳酸(乳酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的丙酮酸(丙酮酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的乳酸盐/丙酮酸盐的比例；在全血、血浆或脑脊液、体液的有机酸中的氨基酸，尤其是丙氨酸、瓜氨酸和脯氨酸；血清和骨骼肌中的FGF21；磷酸肌酸水平、NADH(NADH+H+)或NADPH(NADPH+H+)水平；NAD或NADP水平；ATP水平；无氧阈(anaerobic threshold)；还原型辅酶Q(CoQred)水平；氧化型辅酶Q(CoQox)水平；总辅酶Q(CoQtot)水平；氧化型细胞色素C水平；还原型细胞色素C水平；氧化型细胞色素C/还原型细胞色素C的比例；乙酰乙酸盐水平、β-羟基丁酸盐水平、乙酰乙酸盐/β-羟基丁酸盐的比例、8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平；活性氧的水平；和耗氧量(VO2)水平、二氧化碳排放量(VCO2)水平和呼吸商(VCO2/VO2)。
在第六方面中，本发明涉及根据本发明的化合物在治疗、预防或抑制与肿瘤疾病相关的症状上的应用，其中，优选所述化合物为以下的化合物：
-L＝L3，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I。
优选地在第六方面中，所述肿瘤疾病为癌症，优选选自由基底细胞癌(basal cell carcinoma)、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌的组成的组中的癌症。
在第七方面中，本发明涉及一种用于治疗或延缓受试者皮肤进一步老化的美容方法，该方法包括给予受试者皮肤有效量的含有本发明的化合物的组合物，其中，所述化合物优选为以下的的化合物：
-L＝L5，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
-L＝L8，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L11，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L1，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl；或
-L＝L17，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L16，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L26，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝L1，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
-L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl。
在第八方面中，本发明涉及一种治疗、预防或抑制与线粒体疾病有关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状的方法，该方法包括：对受试者施用有效量的本发明的化合物。在该方法中，所述线粒体疾病优选为如上定义的疾病或所述病况优选为如上定义的病况。进一步优选地，在所述方法中，使用可测量的临床指标评估利用本发明化合物的治疗功效，其中优选地，所述临床指标为选自由在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的乳酸(乳酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的丙酮酸(丙酮酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的乳酸盐/丙酮酸盐的比例；磷酸肌酸水平、NADH(NADH+H+)或NADPH(NADPH+H+)水平；NAD或NADP水平；ATP水平；无氧阈；还原型辅酶Q(CoQred)水平；氧化型辅酶Q(CoQox)水平；总辅酶Q(CoQtot)水平；氧化型细胞色素C水平；还原型细胞色素C水平；氧化型细胞色素C/还原型细胞色素C的比例；乙酰乙酸盐水平、β-羟基丁酸盐水平、乙酰乙酸盐/β-羟基丁酸盐的比例、8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平；活性氧水平；以及耗氧量(VO2)的水平、二氧化碳排放量(VCO2)的水平和呼吸商(VCO2/VO2)组成的组中的一种或多种指标。
具体实施方式
本发明的第一个方面涉及6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(公知的商品名为TroloxTM)的衍生物。在本发明的化合物中，羧酸基被酰胺基代替，其中，所述酰胺基的氮原子通过连接子与阳离子的氮原子相连。这种阳离子的氮原子优选正规地由三价氮原子的质子化或烷基化(优选质子化或甲基化)而形成。所述三价氮原子优选为胺基(伯、仲或叔)或亚胺基(伯或仲)。阳离子的氮原子的反离子(X-)为带负电的离子，优选为单价负电荷离子，更优选为下文所示的阴离子。
本发明的化合物的合成不必包含对胺或亚胺的氮原子的质子化或烷基化。所述阳离子的氮原子也可以通过不同途径形成。即便如此，所述阳离子的氮原子仅“正规地”由胺或亚胺的氮原子的质子化或烷基化而形成。
本发明的化合物可以由通式(I)表示：
-其中，L为酰胺氮原子和阳离子的氮原子之间的连接子；
-R1和R2各自独立地选自氢(H)或C1-C6的烷基，或者R1和R2连在一起从而形成在酰胺氮原子与阳离子的氮原子之间的第二连接子，或者R1与连接子L的骨架原子相连形成环结构，和/或R2与连接子L的骨架原子相连形成环结构；
-R3选自氢(H)或C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，或者当所述阳离子的氮原子为亚胺基的一部分时，R3不存在；
-R4选自氢(H)或C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代；且
-X-为阴离子，优选为药学上可接受的阴离子。
所述通式(I)所示的化合物含有至少一个手性碳原子(立体中心)，即，TroloxTM-基2位上的原子。在2位碳原子具有S构型的化合物和具有R构型的化合物以及该不同的立体异构体的混合物均包含于本发明中。这样的混合物可以是一种构型对映体过量，或可以为外消旋的。根据本发明的化合物当存在额外的立体中心时(例如在连接子中)，其可以以S构型、R构型或者以两种构型的混合物存在。这样的混合物可以是一种构型对映体过量的，或可以为外消旋的。根据本发明的化合物，如果存在超过一种的立体中心，上述也独立地适用于每个立体中心。
当所述阳离子的氮原子为亚胺基的一部分时，所述连接子L含有至少一个双键，位于所述阳离子的氮原子和相邻的连接子的骨架原子之间。在此情况下，R3不存在。当所述阳离子的氮离子为亚胺基的一部分时，其通过单键与连接子相连，且R3存在。在R3存在的情况下，R3选自氢(H)或C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，优选R3为H或C1-C4的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，更优选R3为H或C1-C2的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代。卤素原子包括氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)和砹(At)，所述卤素原子优选为氟(F)。优选的烷氧基包括甲氧基和乙氧基。在卤代烷氧基中，烷氧基的至少一个氢原子被卤素原子代替，优选被F代替。合适的R3基团包括，优选限于H、甲基(Me)、三氟甲基(–CF3)、乙基(Et)、异丙基(iPr)、环丙基(-cPr)、亚甲基环丙基(-CH2cPr)、n-丙基(n-Pr)、2,2,2-三氟乙基(–CH2CF3)、甲氧基甲基(–CH2OCH3)。更优选R3为H或甲基，最优选R3为H。或者，R3优选为C1-C4的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，更优选R3为C1-C2的烷基，其中，所述烷基一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代。含有亚胺基的基团优选包括胍和脒，其中的一个氮原子被取代以通过连接子L形成与酰胺氮原子的连接。
R4为所述阳离子的氮原子上的取代基，其源自胺基或亚胺基的正规(formal)质子化或烷基化。因此，根据本发明的化合物(在存在所述阳离子氮原子和X-的情况下)为盐，优选为药学上可接受的盐。药学上可接受的盐为那些可以作为药物(drugs)或药品(pharmaceuticals)给药于人类和/或动物的盐。根据本发明的化合物的胺基或亚胺基的药学上可接受的盐为本领域技术人员公知，且可通过酸或烷基化试剂对所述化合物进行正规处理而形成。合适的酸包括有机酸或无机酸。无机酸的实例包括但不限于盐酸(HCl)、氢溴酸(HBr)、氢碘酸(HI)、硫酸(H2SO4)、硝酸(HNO3)、三氟乙酸(TFAH或CF3CO2H)和磷酸(H3PO4)。有机酸的实例包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸(mandelic acid)、磺酸和水杨酸。当本发明所列举的酸用于正规地制备所述盐时，R4为氢，且酸的种类决定反离子X。或者，所述盐可以通过烷基化试剂的正规处理而形成。合适的烷基化试剂包括但不限于C1-C6的卤代烷烃(例如，碘甲烷、碘乙烷、碘丙烷、丁基氯、氟丁烷、溴丁烷)、硫酸二甲酯、碳酸二甲酯、三氟甲烷磺酸甲酯、氟磺酸甲酯、氯磺酸甲酯、甲磺酸甲酯和苯磺酸甲酯。如上所述的，所述盐可以通过使用酸或烷基化试剂对非盐化合物进行深度处理(actualtreatment)而制得，或者通过本领域的其他方法和/或以下进一步示例的方法制备。
R4选自氢(H)或C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，优选R4为H或C1-C4的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，更优选R4为氢或C1-C2的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代。卤素原子包括氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)和砹(At)，所述卤素原子优选为氟(F)。优选的烷氧基包括甲氧基和乙氧基。在卤代烷氧基中，烷氧基的至少一个氢原子被卤素原子代替，优选被F代替。合适为R4基团优选为H、甲基(Me)、三氟甲基(–CF3)、乙基(Et)、异丙基(iPr)、环丙基(-cPr)、亚甲基环丙基(-CH2cPr)、n-丙基(n-Pr)、2,2,2-三氟乙基(–CH2CF3)、甲氧基甲基(–CH2OCH3)。更优选R4为H或甲基，最优选R4为H。X可以为任何阴离子，优选为生理学或药学上可接受的阴离子，更优选为单价阴离子。优选地，X选自F、Cl、Br、I、HSO4、NO3、TFA(CF3CO2)、甲酸根、乙酸根、丙酸根、乙醇酸根、丙酮酸根、草酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、富马酸根、酒石酸根、柠檬酸根、苯甲酸根、肉桂酸根、扁桃酸根、磺酸根和水杨酸根。优选X为Cl、I、TFA或甲酸根，更优选为Cl、I或TFA，最优选X为Cl。当所述阳离子的氮原子源自正规质子化，这种质子化优选使用盐酸(HCl)、三氟乙酸(TFAH或CF3CO2H)或甲酸(HCOOH)来完成，更优选使用HCl或TFAH来完成。正规甲基化则优选使用碘甲烷(MeI)完成。因此，在优选实施方式中，当X-＝I-时，R4＝Me，以及当X-＝Cl-、TFA-或甲酸根时，R4＝H。
除了如下文所描述的情况之外，R1和R2各自独立地选自氢(H)或C1-C6的烷基。优选地，R1为H或C1-C2的烷基，更优选R1为H或甲基(Me)，最优选R1为H。优选地，R2为H或C1-C2的烷基，更优选R2为H或甲基(Me)，最优选R2为Me。
在一种实施方式中，所述酰胺氮原子通过第二连接子与所述阳离子的氮原子连接。所述第二连接子定义作将所述酰胺氮原子上的R1和所述阳离子氮原子的R2相连接。因此，所述酰胺氮原子、所述阳离子的氮原子、所述第一连接子和所述第二连接子一起形成环结构，优选为4-10元环结构，更优选为5-8元环结构，最优选为6元环结构。在一种优选的实施方式中，所述第二连接子为–CH2–CH2–桥或–CH2–CH2–CH2–桥，最优选为–CH2–CH2–桥，其中，在所述酰胺氮原子与所述阳离子的氮原子之间存在两个或三个(优选为两个)碳原子。
在另一种实施方式中，所述酰胺氮原子与连接子的骨架原子相连，因此形成环结构，优选为4-10元的环结构，更优选为5-8元的环结构，最优选为6元环结构。为此，在所述酰胺氮原子上，与氮原子相连的连接子的骨架原子具有与R1连在一起的取代基R1’。在这种实施方式中，环结构不包括所述阳离子氮原子，反而包括所述连接子上的仅部分骨架。在优选的实施方式中，这种酰胺氮原子与连接子骨架原子之间的连接为–CH2–CH2–桥或–CH2–CH2–CH2–桥，更优选为–CH2–CH2–桥，其中，在所述酰胺氮原子与连接子的骨架原子之间存在两个或三个(优选为两个)碳原子。
在另一种实施方式中，所述阳离子的氮原子与所述连接子的骨架原子相连，因此形成环结构，优选为4-10元的环结构，更优选为5-8元的环结构，最优选为6元环结构。在此与该氮原子相连的连接子上的骨架原子具有取代基R2’，由此与所述阳离子的氮原子上的R2相连。在这种实施方式中，环结构不包括所述酰胺氮原子，取而代之仅包括所述连接子的部分骨架。在一种优选的实施方式中，这种所述阳离子的氮原子与所述连接子的骨架原子之间的连接为–CH2–CH2–桥或–CH2–CH2–CH2–桥，更优选为–CH2–CH2–桥，其中，在所述阳离子的氮原子与所述连接子的骨架原子之间存在两个或三个(优选为两个)碳原子。在所述酰胺氮原子上的R1和所述连接子上的R1’取代基之间以及在所述阳离子的氮原子的R2和所述连接子上的R2’取代基之间也可能存在连接。
在一种优选的实施方式中，本发明的化合物在水中的溶解性(用log(Pow)表达)为2.0-5.0，优选为2.5-4.5，更优选为3.0-4.0。log(Pow)(正辛醇与水之间分配系数的对数)为公知的水溶性测量法。具有3-4的log(Pow)值的化合物在充足水溶性(适于制备水性溶液或悬浮液)与充足亲油性(以确保所述化合物在细胞膜有效输送)之间是理想平衡。本领域技术人员将理解如何决定以上定义的L、R1、R2、R3、R4和X的组合以提供具有3-4log(Pow)值的化合物。测定化合物的log(Pow)值的合适试验为本领域技术人员所公知，且包括但不限于摇瓶法(shake-flask method)、ITIES、液滴法(droplet method)或使用HPLC。也可以使用QSPR算法预测化合物的log(Pow)。
连接所述酰胺氮原子与所述阳离子的氮原子的适当的连接子L优选为含有1-10个任选被取代的骨架原子的连接子，更优选为含有1-8个任选被取代的骨架原子的连接子。因此，L可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个任选取代的骨架原子。本发明中，骨架原子是指那些在所述酰胺氮原子与所述阳离子的氮原子之间构成最短链的原子。骨架可以为线型结构，但也可以为环结构的一部分。当骨架为环结构的一部分时，将所述骨架定义为所述酰胺氮原子与所述阳离子的氮原子之间的最短链。在这种情况下，所述骨架原子中的一个原子包括取代基R5，且所述骨架原子中的一个原子包括取代基R5’，优选两个不同的骨架原子包括R5和R5’，其中，R5和R5’相连形成环结构，优选为4-10元环结构，更优选为5-8元环结构，最优选为6元环结构。在这种实施方式中，所述酰胺的氮原子和所述阳离子的氮原子不包括于环结构中，而是仅包括了所述连接子的部分骨架。在一种优选实施方式中，这种在所述连接子的骨架原子(承载R5和R5’取代基)之间的连接为–(CH2)n–桥，其中，n＝1-6，优选为–CH2–CH2–桥或–CH2–CH2–CH2–桥，其中，在所述连接子的被取代的骨架原子之间存在1-6个，优选为2或3个碳原子。
在一种优选的实施方式中，所述骨架原子选自碳、氮和氧，优选选自碳和氮。根据本发明的这种优选实施方式的骨架可以定义为Cn-mNm，其中，n表示骨架上原子的总数，m表示骨架上氮原子的个数。每个n和m为非负整数。合适的连接子的n＝1-10且m＝0-4，优选n＝2-7且m＝0-3，更优选n＝4-7且m＝0-2。特别优选的连接子具有认定为Cn-mNm的骨架，其中n＝2且m＝0(C2)；n＝5且m＝1(C4N)；n＝3且m＝0(C3)；n＝4且m＝1(C3N)；n＝7且m＝2(C5N2)；n＝4且m＝0(C4)；n＝6且m＝1(C5N)；或n＝5且m＝0(C5)。最优选地，所有骨架原子为碳原子(m＝0)。
正如本领域技术人员能理解的是，为了满足化合价的需求，所述连接子的碳和氮骨架原子可以带有氢原子，可以被取代，或者在相邻骨架原子之间存在双键或三键。在本发明的上下文中，不把氢当作取代基。当氧作为连接子的骨架原子时，本领域技术人员能理解到氧骨架原子不带有氢原子、取代基或者双键或三键。在两个骨架碳原子之间可以存在三键。带有氢原子和/或取代基的骨架原子构成了所述连接子。在本发明的上下文中，“任选取代的”用于表示(骨架)原子可以带有一个或多个取代基，或者可以不带有取代基而是可以存在0-3个氢代替，以满足所述(骨架)原子的化合价需求。
合适的取代基包括但不限于：卤素、NH2、NHR6、N(R6)2、NHNH2、N3、NHC(＝O)R6、NHC(＝O)NHR6、NHC(＝O)NH2、NHC(＝O)OR6、OH、OR6、OC(＝O)R6、R6(例如，烷基、环烷基)、芳烷基(aralkyl)、烯基、炔基、芳基、杂芳基、OC(＝O)OR6、OC(＝O)NHR6、O(SO2)R6、O(SO2)OH、O(PO2)OH、SH、SR6、C(＝O)R6、烷基-NH2、烷基-OH、烷基-SH、C(＝O)CF3、C(＝O)OR6、C(＝O)OH、C(＝O)H、C(＝O)OR6、C(＝O)NH2、C(＝O)NMe2、C(＝O)N(R6)2、C(＝S)NH2、C(＝S)SH、CN、NC、CNO、ONC、OCN、SCN、SNC、CNS、S(＝O)R6、S(＝O)2R6、S(＝O)2(OH)、P(＝O)(OH)2或P(＝O)(OH)(OR6)。具有两个或两个以上剩余化合价的原子(例如，碳骨架原子)可以带有双键取代基，例如，氧基(oxo)(＝O)、亚胺基(＝NH或＝NR6)、硫基(＝S)、烷叉基(＝CH2或＝CHR6或＝C(R6)2)。另外，在相同原子或不同原子上的两个取代基可以相连以形成环结构。如果在单个骨架原子上的两个取代基连接成环结构，可以当作这种环结构通过螺结(spiro junction)与骨架相连。如果在不同的骨架原子上的两个取代基以环结构相连，该环结构的部分为(部分)骨架，且所述骨架被当作所述酰胺氮原子与所述阳离子的原子之间的最短链。正如以下进一步指出的，也可以通过将骨架原子上的取代基与所述酰胺氮原子上的R1或所述阳离子的氮原子上的R2相连以形成环结构。通过这样形成的环结构可以全部为碳或可以含有0-3个杂原子(例如，N、O、S和/或P)，以及可以含有0-3个双键。这些环结构上所有原子可以任选被取代。合适的环结构的例子为任选取代的环烷基、任选被取代的杂环烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。上文中，每个R6独立地为烷基，优选为C1-C6的烷基，更优选为C1-C2的烷基。R6中，一个或多个CH2基团可以各自独立地被O、S或NH中的一种替换，和/或一个或多个CH基团可以被N替换。
在本发明的上下文中，术语“烷基”是指饱和的脂肪族基团包括直链的、支链的、环状的基团以及它们的组合，其具有规定的碳原子数，或者如果无数量规定，优选具有高达12个碳原子。“直链烷基”或“线型烷基”是指既非环状也非支状的烷基基团，通常表示为“n-烷基”基团。烷基基团的一个子集为C1-C6的烷基，其包括的基团例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、正戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基以及其他含有1-6个碳原子的烷基基团，其中，C1–C6的烷基基团可以通过C1–C6的烷基基团上的任何化合价连接。
所述骨架原子优选的取代基为烷基，例如甲基(Me或–CH3)、羧基(–C(＝O)OH)、氧基(＝O)、伯胺基(–NH2)。
以下的L1至L26认定为优选的连接子。
在此，L1至L26的每个结构中左侧的虚线键表示连接子与所述酰胺氮原子之间的键，以及L1至L26的每个结构中右侧的虚线键表示连接子与所述阳离子的氮原子之间的键。描绘成化学式的所述连接子朝向相同的方向，即，L1至L26的每个化学式中左侧的侧键(pendant bond)表示连接子与所述酰胺氮原子之间的键，L1至L26的每个化学式中右侧的虚线键表示连接子与所述阳离子的氮原子之间的键。
R1的每次出现便在所述连接子与酰胺氮原子之间存在桥，其中，R1’与R1通过该桥连接，从而形成4-10元环结构，优选为5-8元环结构，最优选为6元环结构，该环结构是由所述酰胺氮原子、所述连接子骨架上的1-4个原子以及构成连接R1和R1’的桥的1-4个原子形成。同样地，R2的每次出现便在所述连接子与所述阳离子的氮原子之间存在桥，其中，R2’与R2通过该桥连接，从而形成4-10元环结构，优选为5-8元环结构，最优选为6元环结构，该环结构是由所述阳离子的氮原子、所述连接子骨架上的1-4个原子以及构成连接R2和R2’的桥的1-4个原子形成。同样地，R5和R5’的每次出现便在所述连接子上的一个骨架原子(带有R5)与所述连接子上的另一个骨架原子(带有R5’)之间存在桥，其中，R5’与R5通过该桥连接，从而形成4-10元环结构，优选为5-8元环结构，最优选为6元环结构，该环结构是由所述连接子骨架上的2-5个原子以及构成连接R5和R5’的桥的1-5个原子形成。因此，在连接子L10、L22、L23、L24和L25中，R1’通过桥与R1连接，优选为–CH2–CH2–桥或–CH2–CH2–CH2–桥，更优选为–CH2–CH2–桥。因此，在含有连接子L10(其中R1’和R1通过–CH2–CH2–桥连接)的化合物中，所述酰胺氮原子被嵌在六元环结构中，该六元环结构是由所述酰胺氮原子、所述连接子骨架上的两个碳原子和一个氮原子以及构成R1和R1’的桥的两个碳原子形成。所述酰胺氮原子与所述连接子L10骨架上的中心氮原子之间的这种–CH2–CH2–桥可以用L1表示。同样地，在连接子L18、L19和L21中，R2’通过桥与R2连接，优选为–CH2–CH2–桥或–CH2–CH2–CH2–桥，更优选为–CH2–CH2–CH2–桥。同样地，在连接子L20和L26中，R5’通过桥与R5连接，优选为–CH2–CH2–桥或–CH2–CH2–CH2–桥，更优选为–CH2–CH2–桥。
连接子L11、L12、L13、L14、L15、L18(只要R2–R2’不为–C(O)–)、L19(只要R2–R2’不为–CH2–)、L20(只要R5–R5’不为–CH2–)、L21(只要R2–R2’不为–CH2–CH2–)、L22(只要R1–R1’不为–CH2–CH2–)、L23(只要R1–R1’不为–CH2–CH2–)、L24(只要R1–R1’不为–CH2–)和L25(只要R1–R1’不为–CH2–)含有额外的立体中心。以上立体异构体(当表示连接子的结构时)用作说明而不是限制。正如以上进一步表示的，根据本发明的化合物中存在的每个立体中心可以独立地以它的每种立体异构形式(S或R)存在，或作为任何比例的两种异构体混合物。连接子L26含有双取代的环烷基，优选为双取代的环己基，因此其可以表现为顺式或反式的形式，优选为反式的形式。
根据本发明的一种实施方式，特别优选的连接子为L5、L8、L11和L12，更优选的连接子为L8和L11，且根据本发明的这种实施方式的连接子最优选为L11。根据这种实施方式另外优选的连接子为L16、L17、L19、L21和L26，更优选为L16和L19。因此，根据这种实施方式，优选的连接子为L5、L8、L11、L12、L16、L17、L19、L21和L26，更优选为L8、L12、L16、L17、L19、L21和L26，最优选为L16和L19。优选地，L19与R2–R2’＝L1或L3结合，最优选与R2–R2’＝L3结合。优选地，L21与R2–R2’＝L1或L3结合，最优选与R2–R2’＝L1结合。优选地，L26与R5–R5’＝L1或L3结合，更优选与R5–R5’＝L1结合，最优选与R5–R5’＝L1结合，其中，所述环烷基为反式-1,4-双取代的。特别优选为连接子L19与R2–R2’＝L3结合且R3＝H、Me、Et、iPr、CH2OCH3或CH2CF3的结合，更优选R3＝Me、Et、iPr或CH2CF3。
本发明的另一种实施方式中，特别优选的连接子为L7和L1，且更优选的连接子为L7。
根据本发明的优选的化合物指定为由通式(I)表示的化合物A-O，其中，
-对于化合物A：L＝L1，R1–R2＝L1，R3＝H，R4＝H，X-＝Cl-；
-对于化合物B：L＝L1，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物C：L＝L2，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物D：L＝L3，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物E：L＝L4，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝TFA-；
-对于化合物F：L＝L5，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝TFA-；
-对于化合物G：L＝L6，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝TFA-；
-对于化合物H：L＝L3，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X-＝I-；
-对于化合物I：L＝L1，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X-＝I-；
-对于化合物J：L＝L7，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物K：L＝L8，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物L：L＝L9，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物M：L＝L10，R1–R1’＝L1，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝TFA-；
-对于化合物N：L＝L11，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物O：L＝L12，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl-.
根据本发明的另外优选的化合物指定为由通式(I)表示的化合物P-AH，其中，
-对于化合物P：L＝L13，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物Q：L＝L14，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物R：L＝L15，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物S：L＝L11，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物T：L＝L16，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物U：L＝L17，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物V：L＝L16，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物W：L＝L18，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物X：L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物Y：L＝L20，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝L3，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物Z：L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物AA：L＝L22，R1–R1’＝L1，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物AB：L＝L23，R1–R1’＝L1，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物AC：L＝L24，R1–R1’＝L3，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物AD：L＝L25，R1–R1’＝L3，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物AE：L＝L26，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝L1，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-.
-对于化合物AF：L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L3，R3＝Me，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物AG：L＝L19，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝H，R4＝H；X-＝Cl-；
-对于化合物AH：L＝L21，R1＝H，R2–R2’＝L1，R3＝Me，R4＝H；X-＝HCOO-。
在一种实施方式中，本发明的化合物不为化合物D，且优选选自由化合物A-C和E-AH组成的组，更优选自由化合物A-C和E-P组成的组。
本发明的一种实施方式中，特别优选的化合物为化合物F、K、N和O。根据本发明的更优选的化合物为化合物K和N。根据本发明的这种实施方式的最优选的化合物为化合物N。根据本发明的这种实施方式的另外优选的化合物为化合物U、V、T、X、Z、AE、AF、AG和AH，更优选为化合物U、V、X、Z、AE、AF和AH，最优选为化合物V、X和AF。因此，根据这种实施方式，优选的化合物为F、K、N、O、U、V、T、X、Z、AE、AF、AG和AH，更优选为K、N、U、V、X、Z、AE、AF和AH，最优选为V、X和AF。
化合物F可以具有R构型、S构型或它们的混合物，优选化合物F为R对映体和S对映体的混合物，更优选为外消旋混合物。化合物K可以具有R构型、S构型或它们的混合物，优选化合物K为R对映体和S对映体的混合物，更优选为外消旋混合物。化合物N可以具有R,R构型、R,S构型、S,R构型、S,S构型或它们任意的混合物，优选化合物N为R,S非对映体和S,S非对映体的混合物，更优选为其1/1(mol/mol)的混合物。化合物O可以具有R,R构型、R,S构型、S,R构型、S,S构型或它们任意的混合物，优选化合物O为R,S非对映体和S,S非对映体的混合物，更优选为其1/1(mol/mol)的混合物。化合物U可以具有R构型、S构型或它们的混合物，优选化合物U具有R构型或S构型。化合物V可以具有R构型、S构型或它们的混合物，优选化合物V具有R构型。化合物T可以具有R构型、S构型或它们的混合物，优选化合物T具有R构型或S构型。化合物X可以具有R,R构型、R,S构型、S,R构型、S,S构型或它们任意的混合物，优选化合物X具有S,R构型。化合物Z可以具有R构型、S构型或它们的混合物，优选化合物Z为R对映体和S对映体的混合物，更优选为外消旋混合物。化合物AE可以具有R,反式-构型、R,顺式-构型、S,反式-构型、S,顺式-构型或它们任意的混合物，优选化合物AE具有R,反式-构型或S,反式-构型。化合物AF可以具有R,R构型、R,S构型、S,R构型、S,S构型或它们任意的混合物，优选化合物AF具有S,R构型。化合物AG可以具有R,R构型、R,S构型、S,R构型、S,S构型或它们任意的混合物，优选化合物AG具有S,S构型或S,R构型。化合物AH可以具有R构型、S构型或它们的混合物，优选化合物AH具有S构型。本发明中，所述构型的第一标示符(designator)(R或S)是标示Trolox基的2位，如果在根据本发明的化合物中存在另外的立体中心，将其构型由第二标示符确定。根据本发明的最优选的化合物为R构型的化合物V(R-V)，S,R构型的化合物X(S,R-X)和S,R构型的化合物AF(S,R-AF)。
本发明的另一种实施方式中，特别优选的化合物为化合物I和J，且更优选的化合物为化合物J。
本发明还包括所述化合物的所有立体异构体和几何异构体，包括非对映体、对映体和顺/反式(E/Z)异构体。本发明还包括任意比例的立体异构体和/或几何异构体的混合物(包括但不限于外消旋混合物)。
在一种实施方式中，根据本发明的化合物不为通式(I)表示的以下化合物，其中：
-L＝–(CH2)3–(L3)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；和/或
-L＝–(CH2)2–CHR1–CH2–NH–(CH2)4–，R1–R1’＝–(CH2)2–(L1)，R2＝H，R3＝–(CH2)2–CH3(丙基)，R4＝H；X＝Cl；和/或
-L＝–(CH2)3–(L3)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝TFA，其在TroloxTM基的2位为S构型。
所述化合物可以以前药形式给药。前药为相对自身为非活性的所述化合物的衍生物，但当被引入至使用它们的受试者中时，将通过在体内的化学或生物过程(例如，酶转化)转化为活性的化合物。合适的前药制剂包括但不限于本发明的化合物的肽缀合物(peptide conjugates)和本发明的化合物的酯类。在H.Bundgaard的Design of Prodrugs(New York：Elsevier，1985)、R.Silverman的The organic Chemistry of Drug Design and Drug Action(Boston:Elsevier、2004)、R.L.Juliano的Biological Approaches to the ControlledDelivery of Drugs(Annals of the New York Academy of Sciences，volume 507，New York:N.Y.Academy of Sciences，1987)和由The Academy in Washington在1977出版的E.B.Roche的Design of Biopharmaceutical Properties ThroughProdrugs and Analog(Symposium sponsored by Medicinal Chemistry Section，APhA Academy of Pharmaceutical Sciences，November 1976national meeting，Orlando，Florida)中提供了对合适的前药的进一步讨论。
本发明的各种化合物可以以其自身的形式作为治疗剂或化妆品施用，或者前药(将在体内转化为有效物质)的形式进行给药。
本发明的化合物适用于调节线粒体形态(即，线粒体分裂或线粒体成丝(mitochondrial filamentation))和/或调节OXPHOS酶的表达(即，稳态水平)，例如复合物I和复合物II。因此，本发明的一个方面涉及本发明的化合物在作为治疗方法和/或美容方法上的应用以调节线粒体形态和OXPHOS酶的表达中的至少一种。
在一种实施方式中，本发明的化合物的效果包括诱导线粒体成丝、预防或减少线粒体分裂以及增加OXPHOS酶的表达的一种或多种。这种实施方式的优选化合物为连接子为L5、L8、L11、L12、L16、L17、L19、L21和L26的化合物，优选这些化合物中的连接子为L8、L11、L16、L17、L19、L21和L26，且根据本发明的这种实施方式的最优选的连接子为L16和L19。更具体地，本发明的具有一种或多种这些效果的优选的化合物为化合物F、K、N、O、U、V、T、X、Z、AE、AF、AG和AH。根据本发明的具有一种或多种这些效果的更优选的化合物为化合物K、N、U、V、X、Z、AE、AF和AH。根据本发明的根据这种实施方式的最优选的化合物为化合物V、X和AF。
在另一种实施方式中，本发明的化合物的效果包括减少线粒体成丝、诱导线粒体分裂和减少OXPHOS酶的表达中的一种或多种。这种实施方式优选的化合物为连接子为L7和L1的化合物，且更优选地连接子为L7。更具体地，具有一种或多种这些效果的优选的化合物为化合物I和J，且具有一种或多种这些效果的更优选的化合物为化合物J。
在另一方面中，本发明涉及本发明的上述化合物作为药物的应用。所述药物可以用于医疗(人类)以及兽医(动物)应用。
在又一方面中，本发明涉及一种治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状的方法，该方法包括对受试者施用有效量的本发明上述化合物的一种或多种。或者，本发明涉及本发明上述的化合物在用于治疗、预防或抑制与线粒体疾病有关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状的方法中的应用。本发明的方法优选包括对受试者使用有效量的本发明上述化合物的一种或多种以及可接受的载体(carrier)、赋形剂(excipient)或媒介物(vehicle)，优选为药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。
用于治疗线粒体疾病和/或与线粒体功能障碍有关的病况的本发明的优选的化合物如上所定义的，包括有诱导线粒体成丝、预防或减少线粒体分裂和增加OXPHOS酶的表达的一种或多种效果的化合物。
在本发明的方法中，所述线粒体疾病和/或与线粒体功能障碍有关的病况优选特征在于具有OXPHOS缺陷的病况。每个细胞都需要能量。所以，能量的缺乏影响着每个细胞的活性。因此，原则上，每个细胞受次优含量(sub-optimal amount)的一种或多种OXPHOS复合物的影响。然而，次优的实际含量随着细胞的不同而变化。具有相对高能耗的细胞(例如，脑细胞和肌肉细胞)比具有较低能耗的细胞(静息T细胞(resting T-cells))通常需要更高含量的OXPHOS体系复合物。因此，受到与氧化磷酸化作用缺陷相关的所述缺陷影响的细胞通常但不一定为肌肉细胞或脑细胞。线粒体疾病在其临床表现(clinical manifestation)上是多向性的。各种组织，例如像胰腺、心脏、肝脏、眼、内耳、血液、结肠和肾脏可受到影响。另外，来自非临床上影响的组织的细胞像纤维母细胞组织也经常显示出线粒体缺陷。受OXPHOS缺陷影响的细胞可以通过给细胞提供本发明的化合物而得到治疗并获得较高含量的OXPHOS复合物。当OXPHOS容量低于常规细胞的(即来自于健康个体的相同种类的可比较的细胞)时，则细胞受OXPHOS缺陷影响。其容量通常在一段较长时间内较低。除了源自于具有OXPHOS缺陷的个体外，还存在多种确定细胞是否具有OXPHOS缺陷的方法，这些测试包括但不限于耗氧量、ATP生产能力和个体OXPHOS复合物的酶活性(Chretien和Rustin的J.Inherit Metab Dis.2003；_26_(2-3):189-98)。出人意料地发现，给予细胞本发明的化合物将获得较高含量的OXPHOS复合物(即细胞的线粒体)。
本发明的方法中，所述线粒体疾病优选自由以下疾病组成的组中的疾病：肌阵挛性癫痫；肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)；Leber氏遗传性视神经病变(LHON)；神经病变共济失调和色素性视网膜炎(NARP)；线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)；Leigh氏综合征；Leigh样综合征；显性视神经萎缩(DOA)；卡恩斯-塞尔综合征(KSS)；母系遗传性糖尿病伴耳聋(MIDD)；Alpers-Huttenlocher综合征；共济失调神经病谱；慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)；Pearson综合征；线粒体神经胃肠脑病(MNGIE)；Sengers综合征；3-甲基戊烯二酸尿症、神经性耳聋、脑病和Leigh样综合征的神经影像学表现(MEGDEL)；SURF1Leigh氏综合征；肌病；线粒体肌病；心肌症；和脑肌病以及单独的或结合的氧化磷酸化障碍。
在本发明的方法中，与线粒体功能障碍有关的病况优选为选自由以下病况组成的组的病况：弗里德希氏共济失调(FRDA)；肾小管酸中毒；帕金森综合征；阿尔茨海默氏病；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；亨廷顿氏舞蹈病；巴氏综合征(Barth syndrome，也称为II型3-甲基戊烯二酸尿症)；黄斑变性(macula degeneration)，优选为衰老性黄斑变性(age-related maculadegeneration)；普遍性发育障碍；听力衰退；耳聋；糖尿病；老龄化；妨碍(正常)线粒体功能的药物副作用，例如，由核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs，nucleoside analog reverse transcriptase inhibitors)、某些抗生素和抗癫痫药物引起的线粒体功能障碍；以及局部缺血(ischemia)和再灌注损伤(reperfusioninjury)，优选为在急性心肌梗塞(AMI)后、在包括产期中风(perinatal stroke)的中风后、在失血性休克后、在肠缺血后、在用于失败的经皮冠状动脉腔内成形术(PCTA)的急性冠脉手术(emergency coronary surgery)后、在对血管交叉夹紧(blood vessel cross clamping)(例如主动脉的，其导致骨骼肌肉的缺血)进行血管手术后、在胰腺管或胆管处理(ERCP)后的胰腺炎后和/或在器官移植后的缺血性再灌注损伤。
本发明的方法中，“受试者”、“个体”或“患者”理解为单个有机体，优选为脊椎动物，更优选为哺乳动物，最优选为人。
在本发明中将采用本发明所述的化合物和方法“治疗”疾病定义为将本发明的化合物的一种或多种给药(伴有或没有附加的治疗剂)，以降低或消除疾病或疾病的一种或多种症状，或者延缓疾病或疾病的一种或多种症状的进展，或者降低疾病或疾病的一种或多种症状的严重程度。在本发明中将采用本发明所述的化合物和方法“抑制”疾病定义为将本发明的化合物的一种或多种进行给药(伴有或没有附加的治疗剂)，以抑制疾病的临床表现，或抑制疾病不利症状的表现。治疗与抑制的区别在于：治疗发生在受试者显示了疾病的不利症状之后，而抑制发生在受试者显示疾病的不利症状之前。抑制可以为局部的、基本上全部的或全部的。因为许多线粒体疾病为遗传的，可用基因筛查鉴别患者的患病风险。随后可以将本发明的化合物和方法施用于处于将发展为所述疾病的临床症状的风险中的无症状患者，以抑制任何不利症状的出现。本发明所讨论的化合物的“治疗应用”定义为使用一种或多种本发明所述的化合物治疗或抑制疾病，如上所述的。化合物的“有效量”为当给药于受试者时足以降低或消除疾病的一种或多种症状的化合物的量，或者足以延缓疾病或疾病的一种或多种症状的进展的化合物的量，或者足以降低疾病或疾病的一种或多种症状的严重程度的化合物的量，或者足以抑制疾病表现的化合物的量，或者足以抑制疾病不利症状的表现的化合物的量。有效量可以一次或多次给药。
多种易得的可测量的临床指标可用于评估患有线粒体疾病的患者的代谢状态。当指标从病理学值移动到健康值时，这些指标也可以用作使用本发明的化合物的治疗功效的指示剂。这些临床指标包括但不限于，一种或多种能量生物指标(energy biomarkers)，例如在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的乳酸(乳酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的丙酮酸(丙酮酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的乳酸盐/丙酮酸盐的比例；在全血、血浆或脑脊液、体液的有机酸中的氨基酸，尤其是丙氨酸、瓜氨酸和脯氨酸，血清和骨骼肌中的FGF21、磷酸肌酸水平、NADH(NADH+H+)或NADPH(NADPH+H+)水平；NAD或NADP水平；ATP水平；无氧阈；还原型辅酶Q(CoQred)水平；氧化型辅酶Q(CoQox)水平；总辅酶Q(CoQtot)水平；氧化型细胞色素C水平；还原型细胞色素C水平；氧化型细胞色素C/还原型细胞色素C的比例；乙酰乙酸盐水平、β-羟基丁酸盐水平、乙酰乙酸盐/β-羟基丁酸盐的比例、8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平；活性氧的水平；和耗氧量(VO2)的水平、二氧化碳排放量(VCO2)的水平和呼吸商(VCO2/VO2)。这些临床指标中的多种指标将在运动生理学实验室进行常规测量，并提供了受试者代谢状态的便捷评估。本发明的一种实施方式中，患有线粒体疾病(例如，弗里德希氏共济失调、Leber氏遗传性视神经病变、显性视神经萎缩、Leigh氏综合征、SURF1、MERRF、MELAS或KSS)患者中的一种或多种能量生物指标改善到健康受试者平均水平的两个标准偏差内。本发明的另一种实施方式中，患有线粒体疾病(例如，弗里德希氏共济失调、Leber氏遗传性视神经病变、显性视神经萎缩、Leigh氏综合征、SURF1、MERRF、MELAS或KSS)患者的一种或多种能量生物指标改善到健康受试者平均水平的一个标准偏差内。运动不耐受(Exercise intolerance)也可以用作给定治疗的功效的指示，其中运动不耐受的改善(即运动不耐受降低)表明了给定治疗的功效。
多种代谢生物指标已被用来评估CoQ10的功效，且这些生物指标可用作能量生物指标在本发明的方法中进行监测。丙酮酸盐(葡萄糖的无氧代谢的产物)通过在厌氧环境中还原成乳酸或者通过依靠功能线粒体的OXPHOS的氧化新陈代谢被去除。所述OXPHOS的功能障碍可能导致循环中的乳酸盐和丙酮酸盐的去除不充分，且可以观察到乳酸盐/丙酮酸盐比例的提高(参见Scriver CR，The metabolic and molecular bases of inherited disease，7th ed.，New York:McGraw-Hill，Health Professions Division，1995；和Munnich等，J.Inherit.Metab.Dis.15(4):448-55(1992))。因此，血液乳酸盐/丙酮酸盐的比例(Chariot等，Arch.Pathol.Lab.Med.118(7):695-7(1994))广泛用作检测线粒体细胞病(再次参见Scriver CR，The metabolic and molecular bases ofinherited disease，7th ed.，New York:McGraw-Hill，Health Professions Division，1995；和Munnich等，J.Inherit.Metab.Dis.15(4):448-55(1992))和线粒体肌病毒性(Chariot等.，Arthritis Rheum.37(4):583-6(1994))的无创性测试。可以通过测量动脉酮体比率(乙酰乙酸盐/3-羟基丁酸盐：AKBR)测定肝线粒体的氧化还原状态的变化(Ueda等，J.Cardiol.29(2):95-102(1997))。尿排泄物中的8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)也常用作生物指标以评估在临床的和职业的环境中ROS诱导的DNA损伤的修复程度(Erhola等，FEBS Lett.409(2):287-91(1997)；Honda等，Leuk.Res.24(6):461-8(2000)；Pilger等，Free Radic.Res.35(3):273-80(2000)；Kim等，Environ Health Perspect112(6):666-71(2004))。
磁共振波谱(MRS)可用于诊断线粒体细胞病，并使用质子MRS(1H-MRS)显示脑脊液(CSF)和皮层白质乳酸盐的高度(elevations)(Kaufmann等，Neurology 62(8):1297-302(2004))。磷MRS(31P-MRS)可用于显示皮层磷酸肌酸(PCr)的低水平(Matthews等，Ann.Neurol.29(4):435-8(1991))和在运动后骨骼肌中PCr的恢复动力学的延迟(Matthews等，Ann.Neurol.29(4):435-8(1991)；Barbiroli等，J.Neurol.242(7):472-7(1995)；Fabrizi等，J.Neurol.Sci.137(1):20-7(1996))。通过直接生化测量也可证实患有线粒体肌病的患者具有低的骨骼肌PCr。
运动试验(Exercise testing)作为用于线粒体肌病的评估和筛选工具是特别有用的。线粒体肌病的标志性特点之一为最大全身耗氧量(VO2max)的降低(Taivassalo等，Brain 126(Pt 2):413-23(2003))。鉴于VO2max由心输出量(QC)和外周氧摄取量(动脉-静脉总氧含量)的差异决定，一些线粒体细胞病影响心脏功能可能使其传输改变；然而，大多数线粒体肌病显示出外周氧摄取量不足(A-VO2差异)和增强的氧输送力(高动力循环)的特征(Taivassalo等，Brain 126(Pt 2):413-23(2003))。这可以通过直接AV平衡(Taivassalo等，Ann.Neurol.51(1):38-44(2002))和无创地近红外光谱(Lynch等，Muscle Nerve 25(5):664-73(2002；van Beekvelt等，Ann.Neurol.46(4):667-70(1999))来测量缺乏运动引发的静脉血脱氧(a lack of exerciseinduced deoxygenation of venous blood)。
以下将对多种能量生物指标进行更详细的讨论。需要强调的是，当本发明讨论和列举了某些能量生物指标时，本发明不受限于仅列举的这些能量生物指标的调节、正常化或提高。
乳酸(乳酸盐)水平：由于丙酮酸盐水平增长并且丙酮酸盐将转化为乳酸盐以维持糖酵解能力，使得线粒体功能障碍通常导致了乳酸水平的不正常。由于呼吸链不能有效地处理还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reducednicotinamide adenine dinucleotides)，使得线粒体功能障碍也导致了NADH+H+、NADPH+H+、NAD或NADP水平的不正常。可以通过采取适当的体液(例如全血、血浆或脑脊液)的样品测定乳酸盐水平。实际上利用磁共振可以测量所需身体的任何量的乳酸盐水平，例如大脑的。
Kaufmann等，Neurology 62(8):1297(2004)描述了利用磁共振对MELAS患者的脑乳酸血症(cerebral lactic acidosis)的测量。在大脑的侧脑室的乳酸水平的数值呈现为两个突变即患有MELAS，mt.3243A>G和mt.8344A>G。商购设备例如YSI 2300STAT Plus葡萄糖乳酸分析仪(YSI生命科学，俄亥俄州)可以测量全血、血浆和脑脊液的乳酸盐水平。
NAD、NADP、NADH和NADPH水平：可以通过各种荧光、酶或或电化学技术(例如，US2005/0067303描述的电化学试验)对NAD、NADP、NADH(NADH+H+)或NADPH(NADPH+H+)进行测量。
耗氧量(vO2或VO2)、二氧化碳输出(vCO2或VCO2)和呼吸商(VCO2/VO2)：vO2通常在休息时(静息vO2)或最大运动强度(vO2max)时测量。两种数值最好均测量。然而，对于严重残疾的患者，测量vO2max是不切实际的。而利用源自各种供应商(例如，Korr医疗技术公司(KorrMedical Technologies,Inc.，盐湖城，犹他州)的标准设备便可容易地完成对两种形式vO2的测量。还可以容易地测量VCO2，并在相同条件下由VCO2与VO2的比例(休息或最大运动强度的VCO2/VO2)提供呼吸商(RQ)。
氧化型细胞色素C、还原型细胞色素C和氧化型细胞色素C与还原型细胞色素C的比例：细胞色素C参数(例如氧化型细胞色素C水平(Cyt Cox)、还原型细胞色素C水平(Cyt Cred)和氧化型细胞色素C与还原型细胞色素C的比例(Cyt Cox)/(Cyt Cred))可以通过体内近红外光谱测量。例如，参见Rolfe，P，"In vivo near-infrared spectroscopy,"Annu.Rev.Biomed.Eng.2:715-54(2000)和Strangman等，"Non-invasive neuroimaging usingnear-infrared light"B iol.Psychiatry 52:679-93(2002)。
运动耐受性/运动不耐受性：运动不耐受性定义为“由于呼吸困难或疲劳的症状使得执行涉及大骨骼肌的动力学运动的活动的能力下降”(Pina等，Circulation 107:1210(2003))。由于肌肉组织的破损和后续尿中肌肉肌红蛋白的排泄，使得运动不耐受通常伴随着肌红蛋白尿。运动不耐受性可以使用多种测量方法，例如精疲力竭之前在跑步机上走路或跑步的时间花费、精疲力竭之前在运动自行车上(固定自行车)的时间花费等。使用本发明的化合物或方法进行治疗可以致使运动耐受性提高约10％或更高(例如，达到精疲力竭的时间提高10％或更高，如10-11分钟)，致使运动耐受性提高约20％或更高，致使运动耐受性提高约30％或更高，致使运动耐受性提高约40％或更高，致使运动耐受性提高约50％或更高，致使运动耐受性提高约75％或更高，或者致使运动耐受性提高约100％或更高。虽然严格来讲，运动耐受性并非为能量生物指标，但对于本发明的目的，生物指标的调节、正常化或增强包括对运动耐受性的调节、正常化或增强。
类似地，对丙酮酸(丙酮酸盐)水平、乳酸盐/丙酮酸盐的比例、ATP水平、无氧阈、还原型辅酶Q(CoQred)水平、氧化型辅酶Q(CoQox)水平、总辅酶Q(CoQtot)水平、氧化型细胞色素C水平、还原型细胞色素C水平、氧化型细胞色素C/还原型细胞色素C的比例、乙酰乙酸盐水平、β-羟基丁酸盐水平、乙酰乙酸盐/β-羟基丁酸盐的比例、8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平和活性氧水平的常规或非常规数值的测试为本领域所公知的且可以用于评估本发明的化合物和方法的功效。(对于本发明的目的，生物指标的调节、正常化或增强包括对无氧阈的调节、正常化或增强)。
下面的表1说明了各种功能障碍对生化和能量生物指标具有的影响。其也指明了与给定的功能障碍有关的典型的物理效应(例如功能障碍的疾病症状或其他效应)。应该注意的是，该表中所列的任何能量指标，包括别处列举的能量生物指标，也可以通过本发明的化合物和方法进行调节、增强或正常化。RQ＝呼吸商；BMR＝基础代谢率(basal metabolic rate)；HR(CO)＝心率(心输出量)；T＝体温(优选测量核心温度)；AT＝无氧阈；pH＝血液pH(静脉的和/或动脉的)。
表1
按照本发明的方法治疗受线粒体疾病困扰的受试者可以引起受试者症状的减少或减缓，例如阻止疾病的进一步发展。
对线粒体疾病的局部或完全抑制可以致使一种或多种症状的严重程度得到减缓，否则受试者仍将经历。例如，对MELAS的局部抑制可以致使遭受的中风或癫痫发作次数的降低。
本发明所描述的任何一种能量生物指标或所述能量生物指标的组合提供了方便可测量的基准，通过该基准可以估计治疗疗法或抑制疗法的效力。此外，其他生物指标为本领域技术人员所公知的且可以被监测以评价治疗疗法或抑制疗法的功效的指标。
线粒体功能障碍是遗传性多系统疾病(multisystem disease)的常见原因，其常涉及到神经系统。尽管在线粒体疾病病理生理学上我们的认识具有重大进展，但这些病况的临床管理仍保留着很大程度上的支持性。利用系统化的方法(systematic approach)(Pfeffer等，2013，Nat，Rev.Neurol.(in press)PMID:23817350)我们鉴别了1039个用于治疗线粒体疾病的出版物，其中仅35个包括超过5个患者的观察结果。基于未经证实临床意义的生物指标取得的积极的结果的报告在非随机研究(nonrandomized studies)和非盲研究(nonblinded studies)中更为常见，这表明了出版物偏向积极的而非执行差的研究。虽然试验设计得以改善，但仍迫切需要开发新的线粒体疾病的生物指标。临床试验仅可信于它的结果，因此对结果测评的仔细和系统的选择是及其重要的。目前，对设计于患有线粒体疾病的患者中评估新药的临床试验的结果测评的选择仍效率较低且尚不能系统地处理。鉴于有效数据只能从试验(利用有效工具评估结果)中获得，因此首先应当关注于目标人群中的选择工具组的校验。利用对发表的文献的广泛检索，我们编制了具有结果测评的工具箱(toolbox)(基于对可能的工具的初步检索)(Koene等，2013，Dev，Med.Child Neurol.55:698-706)。随后，我们利用改编自美国食品和药品管理局的严格标准削减了该工具箱。今后几年，必须在具有各种线粒体疾病表型(mitochondrial disease phenotypes)的儿童上获得使用这些结果测评的更多经验，从而可以获得关于这些工具的可靠性结论。
因此，在一种优选的实施方式中，使用本发明的方法的治疗疗法或抑制疗法的功效可以使用列于Koene等(2013，supra)的表1中的一种或多种结果测评来确定，更优选使用列于Koene等(2013，supra)的表1的“常见核心组(Common core set)”中的一种或多种的结果测评来确定。
本发明的进一步方面涉及治疗、预防或抑制肿瘤疾病的方法，该方法包括对受试者施用有效量的一种或多种本发明的上述化合物。或者，本发明涉及本发明的上述的化合物在治疗、预防或抑制肿瘤症状的方法中的应用。本发明的方法优选包括对受试者施用有效量的一种或多种本发明的上述化合物，以及可接受的载体、赋形剂或媒介物，优选为药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。包括肿瘤细胞的每个细胞都需要能量。因此，能量的缺乏影响着每个细胞的活性且原则上，每个细胞受次优功能的线粒体的影响。然而，次优的实际含量随着细胞的不同而变化。比具有较低能耗的细胞(如静息细胞)具有相对较高能耗的细胞(如快速分裂的肿瘤细胞)通常需要较高含量的OXPHOS复合物。因此，肿瘤细胞比常规细胞对包括OXPHOS的线粒体功能的下调(down-regulation)更为敏感。因此，具有减少线粒体成丝、诱导线粒体分裂和减少OXPHOS酶的表达中的一种或多种效果的本发明的化合物将对肿瘤细胞的活性和增长具有比常规细胞更强的效果。因此，具有这些效果的化合物可用于缩减或抑制肿瘤细胞的生长或甚至杀死肿瘤细胞。
在治疗、预防或抑制肿瘤疾病的症状方法的一种优选实施方式中，肿瘤疾病或增生性疾病为癌症。在具体的实施方式中，所述癌症可以选自由以下组成的组：基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌。在其他实施方式中，所述癌症可以选自由以下组成的组：急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)、肾上腺皮质癌、艾滋相关癌症(AIDS-related cancers)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞癌、B细胞淋巴瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤(brainstem glioma)、脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌(bronchial adenomas/carcinoids)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、类癌瘤(carcinoid tumour)、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症(childhood cancers)、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髓增殖性疾病(chronic myeloproliferative disorders)、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneousT-cell lymphoma)、促结缔组织增生性小圆细胞瘤(desmoplastic small roundcell tumour)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌(extrahepatic bile duct cancer)、眼癌、眼内黑色素瘤/成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤(gastrointestinal carcinoidtumour)、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(germ cell tumour)、妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tumour)、胶质瘤(glioma)、胃类癌(gastric carcinoid)、头部和/或颈部癌症、心脏癌(heart cancer)、肝细胞(肝)癌、下咽癌(hypopharyngeal cancer)、下丘脑和视通路胶质瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、喉癌、白血病(急性淋巴细胞/急性髓性/慢性淋巴细胞/慢性髓性/毛细胞(hairy cell))、唇部和/或口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(与艾滋病有关的/伯基特(Burkitt)/皮肤T细胞/霍奇金/非霍奇金/原发性中枢神经系统)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、骨的恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、黑色素瘤、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、间皮瘤、转移性鳞状颈部癌(metastatic squamous neck cancer)、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征(multiple endocrine neoplasia syndrome)、多发性骨髓/血浆细胞瘤(multiple myeloma/plasma cell neoplasm)、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病(myelodysplastic/myeloproliferative diseases)、髓性白血病(myelogenousleukemia)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、骨髓增生性疾病、鼻腔和/或鼻旁窦癌(nasal cavity and/or paranasal sinus cancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌(oropharyngeal cancer)、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(ovarian epithelialcancer)、卵巢生殖细胞瘤(ovarian germ cell tumour)、胰腺癌、胰岛细胞癌(islet cell cancer)、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌(pharyngealcancer)、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤(pineal astrocytoma)、松果体生殖细胞瘤(pineal germinoma)、成松果体细胞瘤和/或幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumours)、垂体腺瘤、血浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤因肉瘤(Ewingsarcoma)、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征(Sezarysyndrome)、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌(默克尔细胞)、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、具有转移性隐匿原发性(metastatic occult primary)鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌(throat cancer)、胸腺瘤和/或胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(transitional cancer)、滋养细胞肿瘤、输尿管和/或肾盂癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)或肾母细胞瘤(Wilms tumour)。
本发明的又一个方面涉及本发明的化合物的化妆品应用。因此，本发明的化合物可以用于(在方法中)修复所治个体的皮肤，尤其具有老化皮肤的个体，无论是由于衰老或因过度日晒。两种情况均与在皮肤中的产生的自由基有关。在所述个体的细胞中，通过诱导线粒体成丝、预防或减少线粒体分裂以及增强OXPHOS酶的表达中的至少一种，在该个体的细胞中可以降低皮肤中自由基的作用并至少进一步延缓皮肤的老化。同样地，人们也可以使用本发明的组合物作为预防药，即，如果不进行治疗，至少能降低能作用于皮肤的自由基。因此，在本发明的这个方面，优选使用的本发明的化合物的作用包括诱导线粒体成丝、预防或减少线粒体分裂以及增强OXPHOS酶的表达中的一种或多种。具有这些作用的优选的化合物如上所示。
本发明的化合物也可以用于研究应用，例如体外、体内或者离体的(exvivo)实验以调节实验体系的一种或多种能量生物指标。这些实验体系可以为细胞样品、组织样品、细胞成分或细胞成分的混合物、局部器官、整个器官或生物体。这些研究应用可以包括但不限于，在本发明的一种或多种化合物存在/不存在下，在实验体系的新陈代谢状态下作为分析试剂的应用、说明生化途径的应用，或者评价其他试剂效果的应用。
另外，本发明的化合物可用于生化测试或分析。这些测试可以包括将本发明的一种或多种化合物与源自受试者的组织或细胞样品一起孵育，以评估受试者对所施用的一种或多种化合物的潜在响应(或者特定受试者子集(specific subset)的响应)，或者确定本发明的哪种化合物对特定受试者或特定受试者子集会产生最佳的效果。一种这样的测试或分析包括：1)获得源自受试者或受试者组的细胞样品或组织样品且它们中的一种或多种能量生物指标的调变情况是可以分析的；2)给药一种或多种本发明的化合物至该细胞样品或组织样品；3)在给药一种或多种化合物之后确定一种或多种能量生物指标的调变量(amount of modulation)，并与在给药一种或多种化合物之前的该能量生物指标状态相比。
另一种这样的测试或分析包括：1)获得源自受试者或受试者组的细胞样品或组织样品且它们中的一种或多种能量生物指标的调变情况是可以分析的；2)给药至少两种本发明的化合物至该细胞样品或组织样品；3)在给药至少两种化合物之后确定一种或多种能量生物指标的调变量，并与在给药至少两种化合物之前的该能量生物指标状态相比；和4)基于步骤3)确定的调变量，选择用于治疗、抑制或调节的化合物。
如上所述的，含有本发明的化合物的组合物可以制成药品或化妆品或施加于其他各种介质中，例如人类或动物的食物中，包括医疗食品(medicalfoods)和膳食补充剂。“医疗食品”为旨在用于存在特殊营养需求的疾病或病况的特殊饮食管理的产品。以举例的方式而非限制地，医疗食品可以包括通过喂食管(feeding tube)喂给的维生素和矿物质配方(简称为肠内给药)。“膳食补充剂”应理解为旨在补充人类饮食的产品，且其通常以丸剂、胶囊和片剂或类似制剂的形式提供。以举例的方式而非限制地，膳食补充剂可以包括以下成分中的一种或多种：维生素、矿物质、药草、植物萃取物类(botanicals)；氨基酸、旨在通过增加总的饮食摄入量补充饮食的膳食物质，以及前述任何物质的浓缩液、代谢物、组成成分、提取物或前述任意的组合。膳食补充剂也可以被掺入到食物中，其包括但不限于：食品棒、饮料、粉末、谷类、熟食品、食品添加剂和糖果；或其它旨在促进脑健康或预防或阻止涉及线粒体功能障碍的神经退行性疾病的进展的功能性食品。如果作为药用制剂给药，无论是预防还是治疗，所述组合物可以以任何数种方法给药于患者。所述组合物可以单独给药或与其他药剂或化妆品试剂结合给药且可以与它们的药物可接受载体一起给药。针对个体受试者、疾病的情况或阶段以及本领域技术人员显而易见的其他因素，可以变换具体制剂的有效用量和给药方法。在治疗过程的期间，可监测本发明组合物的浓度以确保维持所需的水平。本发明的组合物可以与其他生理学上可接受的物料(为可摄取的，包括但不限于食物)混合。
本发明所述的化合物可以通过与添加剂(例如药学上或生理学上可接受的赋形剂、载体和媒介物)配制成药物组合物或化妆品组合物。合适的药学上或生理学上可接受的赋形剂、载体和媒介物包括处理剂(processing agents)和药物递送改良剂(drug delivery modifiers)以及增强剂，例如，磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、葡萄糖(dextrose)、羟丙基-P-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡(low melting waxes)、离子交换树脂等，以及它们中任何两种以上的组合。其它合适的药学上可接受的赋形剂在"Remington's Pharmaceutical Sciences，"Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)和"Remington:The Science and Practice ofPharmacy，"Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，20th edition(2003)and 21"edition(2005)中进行了描述，并通过引用并入本发明。
药物组合物或化妆品组合物可以包括单位剂量制剂，其中，所述单位剂量为足够具有治疗或抑制效果的剂量或者为调节、正常化或增强能量生物指标的有效量。所述单位剂量为足以具有治疗或抑制效果的单次剂量，或为调节、正常化或增强能量生物指标的有效量。或者，在治疗或抑制疾病或者调节、正常化或增强能量生物指标的过程中，所述单位剂量可以为周期性给药的剂量。
含有本发明所述化合物的药物组合物或化妆品组合物可以为任何适用于给定的给药方法的形式，例如包括溶液、悬浮液或乳液。通常液体载体用于制备溶液、悬浮液和乳液。用于本发明的实施中的液体载体例如包括：水、生理盐水(saline)、药学上可接受的有机溶剂、药学上可接受的油或脂肪等，以及它们中的两种以上的混合物。所述液体载体可以含有其他合适的药学上可接受的添加剂，例如，增溶剂、乳化剂、营养物、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂等。合适的有机溶剂例如包括：一元醇(如乙醇)、多元醇((如乙二醇)。合适的油例如包括：大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油等。对于肠胃外给药，所述载体也可以为油酯，如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯等。本发明的组合物也可以为微粒、微胶囊、脂质体胶囊包封物(liposomal encapsulates)等形式，以及它们中的两种以上的组合。
可以使用定时释放(Time-release)或控制释放递送体系，例如，基质扩散控制系统(diffusion controlled matrix system)或可侵蚀系统(erodiblesystem)，例如在Lee，"Diffusion-Controlled Matrix Systems"，pp.155-198，以及Ron和Langer，"Erodible Systems"，pp.199-224，在"Treatise on ControlledDrug Delivery"，A.Kydonieus Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York 1992中所描述的。所述基质可以为可生物降解的材料，且该材料能够在原位和体内自发降解(例如通过水解或酶促裂解(如通过蛋白酶))。所述传递体系例如可以为天然存在的或合成的聚合物或共聚物，例如为水凝胶形式。具有裂解连接的示例聚合物包括聚酯类、聚原酸酯类(polyorthoesters)、聚酐类(polyanhydrides)、多糖类、聚磷酸酯类、聚酰胺类、聚氨酯类、聚酰亚氨碳酸酯类(poly(imidocarbonates))和聚磷腈类。
本发明的化合物可以以含有所需的常规无毒的药学上或生理学上可接受的载体、助剂和媒介物的单位剂量制剂的形式进行肠道给药、口服给药、肠道外(parenterally)给药、舌下给药、通过吸入给药(如作为雾或喷雾)、直肠给药或者局部(topically)给药。例如，合适的给药方式包括口服的、皮下的、经皮的、经粘膜的(transmucosal)、离子电渗的(iontophoretic)、静脉内的、动脉内、肌肉内的、腹膜内的、鼻内的(例如通过鼻粘膜)、硬膜下的(subdural)、直肠的、胃肠的等，以及直接给药于特定的或受影响的器官或组织。对于传递至中心神经系统，可使用脊髓给药和硬膜外给药(epidural administration)或脑室(cerebral ventricles)给药。局部给药也可以包括使用经皮给药(例如经皮贴剂或离子电渗设备)。本发明所用的术语肠道外的包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、胸骨内注射，或输注技术(infusion techniques)。将所述化合物与药学上可接受的载体、助剂和媒介物混合以适于所需的给药途径。口服给药为优选的给药途径，且适于口服给药的制剂为优选的制剂。本发明的应用中所述描述的化合物可以以固体形式、液体形式、气雾形式(aerosol form)给药，或者以片剂、丸剂、粉末混合物、胶囊、颗粒剂、注射剂、霜剂、溶液、栓剂、灌肠剂、结肠灌注剂(colonicirrigations)、乳液、分散剂、食品预混物的形式以及其他合适的形式给药。所述化合物也可以以脂质体剂型给药。所述化合物也可以作为前药给药，其中，所述前药在接受治疗的受试者内转化成治疗有效的形式。另外的给药方法为本领域所公知。
注射制剂(Injectable preparations)(例如无菌可注射的含水悬浮液或油性悬浮液)可以根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制而得。无菌注射制剂还可以为在无毒的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如为丙二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂可以为水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油(fixed oils)通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯(mono-or diglycerides)的。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备注射剂。
用于药物直肠给药的栓剂可以通过将药物与合适的无刺激的赋形剂混合制得，例如可可油和聚乙二醇(在室温下为固体但在直肠温度下为液体并因此在直肠中融化并释放所述药物)。
用于口服给药的固体剂型可以包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂混合，例如蔗糖、乳糖或淀粉。这些剂型也可以含有除了惰性稀释剂之外的物质，例如润滑剂(如硬脂酸镁)。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型也可以包含缓冲剂。另外片剂和丸剂可以制成有肠溶包衣(enteric coatings)。
用于口服给药的液体剂型可以包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂，且含有本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如水。这些组合物也可以含有助剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、环糊精和甜味剂、调味剂和芳香剂。
本发明的化合物也可以以脂质体形式给药。本领域公知的是，脂质体通常源自磷脂类或其它脂质类物质。脂质体是由分散在水介质(aqueousmedium)中的单层或多层水合液晶形成。可以使用任何能够形成脂质体的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的脂质。除了本发明的化合物之外，脂质体形式的本发明的组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，包括天然的和合成的。形成脂质体的方法是本领域已知的。例如参见Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，VolumeXIV，Academic Press，New Yofk，N.Y.，p.33et seq(1976)。
本发明还提供了含有可用于治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状的材料的制品(articles ofmanufacture)和试剂盒(kits)。所述制品包括带标签的容器。合适的容器例如包括：瓶(bottles)、小瓶(vials)和试管。所述容器可以由各种材料制成诸如玻璃或塑料。该容器装有具有活性试剂的组合物，该活性试剂可有效地治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状。所述组合物中的活性试剂为本发明的化合物中的一种或多种。容器上的标签优选指示所述组合物用于治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状，并且还可以指示在体内或体外使用的方法，例如上面描述的那些。
本发明还提供了含有本发明的一种或多种化合物的试剂盒。在这些实施方式中，本发明所述的试剂盒包括如上所述的容器。在其他实施方式中，本发明所述的试剂盒包括如上所述的容器和含有缓冲剂的第二容器。该试剂盒还可以包括从商业和用户立场出发所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器(syringes)和附有用于操作任何本发明所述的方法的说明书的包装。
在其他方面，所述试剂盒可以用于任何本发明所述的方法，例如包括：用于治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状的方法。
活性成分可以与载体材料一起生产得到单一剂型，而该活性成分的量则根据被施用到该活性成分的宿主和具体的给药方式而变化。然而，应理解的是，对任何特定患者的具体剂量水平将根据多种因素而变化，包括：所使用的具体化合物的活性、年龄、体重、体表面积、身体质量指数(BMI)、总体健康情况(general health)、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、联合用药，以及正在治疗的具体的疾病或将要治疗的病状的类型、进展和严重程度。通常制造所选择的单位剂量并进行给药，将在血液、组织、器官或身体的其他靶向区域提供药物给定的最终浓度。给定情况下的有效量可通过常规实验较容易地确定，并且在普通的临床医生或技术人员的技能和判断范围内。
可以使用的剂量的例子为本发明的化合物的有效量，其剂量范围为约0.1μg/kg至约300mg/kg，或约1.0μg/kg至约40mg/kg体重，或约1.0μg/kg至约20mg/kg体重，或约1.0μg/kg至约10mg/kg体重，或约10.0μg/kg至约10mg/kg体重，或约100μg/kg至约10mg/kg体重，或约1.0mg/kg至约10mg/kg体重，或约10mg/kg至约100mg/kg体重，或约50mg/kg至约150mg/kg体重，或约100mg/kg至约200mg/kg体重，或约150mg/kg至约250mg/kg体重，或约200mg/kg至约300mg/kg体重，或约250mg/kg至约30mg/kg体重。可以使用的其他剂量为约0.01mg/kg体重，约0.1mg/kg体重，约1mg/kg体重，约10mg/kg体重，约20mg/kg体重，约30mg/kg体重，约40mg/kg体重，约50mg/kg体重，约75mg/kg体重，约100mg/kg体重，约125mg/kg体重，约150mg/kg体重，约175mg/kg体重，约200mg/kg体重，约225mg/kg体重，约250mg/kg体重，约275mg/kg体重，或约300mg/kg体重。本发明的化合物可以以每日单次剂量(single daily dose)给药，或者每日总剂量(totaldaily dosage)可以以每日二、三或四次分剂量给药。
虽然本发明的化合物可以作为单独的活性药物或化妆品进行施用，它们也可以与其他用于治疗或抑制疾病的一种或多种药剂结合使用。与本发明的化合物结合用于治疗、预防或抑制与线粒体疾病有关的症状，或与线粒体功能障碍相关的病况的症状的代表性药剂包括但不限于，辅酶Q(CoenzymeQ)、维生素E、艾地苯醌、MitoQ、EPI-743、维生素K及其类似物、萘醌(naphtoquinones)及其衍生物、其他维生素和抗氧化剂化合物。
当另外的活性药剂与本发明的化合物组合使用时，所述另外的活性药剂可通常以治疗量(therapeutic amounts)使用，正如Physicians'Desk Reference(PDR)53rd版(1999)所指示的(在此作为参考引入本发明)，或者这种治疗有用的量为本领域普通技术人员所公知的。可以以推荐的最大临床剂量或更低的剂量施用本发明的化合物和其他治疗活性药剂。根据给药途径、疾病的严重性和患者的反应，本发明组合物中活性化合物的剂量水平可以根据给药途径、疾病的严重程度和病人的响应而变化以获得理想的治疗效果。当与其他治疗剂结合给药时，该治疗剂可以配置为单独的组合物并在同一时间或不同的时间施用，或者该治疗剂可以配置为同一组合物施用。
在本文及其权利要求中，动词“含有”及其变形词以其非限定性意义使用，意思是包括该词后的项目，但并不排除没有特别提及的项目。另外，在要素前采用不定冠词“一个(a)”和“一个(an)”并不排除存在超过一个的要素的可能性，除非文中清楚要求存在一个且仅一个该要素。因此，不定冠词“一个(a)”和“一个(an)”通常的意思是“至少一种”。
在此，本说明书中所列出的所有专利和参考文献通过引用将其全部内容并入本发明。
以下提供的实施例仅用于说明目的，而不在于以任何方式限定本发明的范围。
附图说明
图1、将细胞暴露在指定浓度的化合物F(KH001；图1a)、化合物K(KH002；图1b)或化合物N(KH003；图1c)中72小时后由免疫印迹法(western blotting)测定的复合物I和复合物II的蛋白质表达水平。CT为对照人类皮肤成纤维细胞株5120-C，P1为患者细胞株7206-S7，P2为患者细胞株5175-S7，CI为完全组装(fully assembled)的蛋白质复合物I，且C II为完全组装的蛋白质复合物II。
图2、将对照细胞株5120-C或患者细胞株5175-S7暴露在指定浓度的化合物N(KH003)中72小时后所测定的完全组装的复合物I(图2a)或复合物II(图2b)的蛋白质表达水平。
图3、将如图所示的患者细胞株，其复合物I的亚基(subunit)含有不同突变，并在浓度不断增长的化合物F(KH001；图3a)、化合物K(KH002；图3b)或化合物N(KH003；图3c)中培养。72小时后，测量CM-DCF的形成来间接指示细胞内ROS水平。N表示独立实验的次数，n表示每个实验中的样品数，以及veh(媒介物设置成100％)表示该细胞系仅用0.1％的DMSO处理。
图4、化合物N(KH003)对握力的体内作用是在Ndufs4基因敲除小鼠内如实施例4所描述的进行测试的。KO＝Ndufs4基因敲除小鼠；WT＝相应的野生型小鼠；媒介物＝无活性成分的对照注射剂；KH003＝以化合物N为活性成分的注射剂。
缩写词表
8-OHdG  8-羟基-2'-脱氧鸟苷
Ac  醋酸根
ACBT  ε-氨基己酸和Bis–Tris/HCl
ADP  二磷酸腺苷
AKBR  乙酰乙酸盐/3-羟基丁酸盐
ALS  肌萎缩性侧索硬化
AT   无氧阈
ATP  三磷酸腺苷
Boc  叔丁氧羰基
BMI  身体质量指数
BMR  基础代谢率
BN-PAGE  蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue Nativepolyacrylamide gel electrophoresis)
CM-H2DCFDA 5-(和-6)氯甲基-2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)
CO  心输出量
CPEO  慢性进行性眼外肌麻痹(Chronic Progressive ExternalOphtalmoplegia)
CSA  环孢素A
CT  对照人类皮肤原代成纤维细胞株(control human primary skinfibroblast cell line)
CYT C  细胞色素c
DCM  二氯甲烷
DIPEA  N,N-二异丙基乙胺
DMF  二甲基甲酰胺
DMSO  二甲基亚砜
DOA  显性视神经萎缩
EDCI  1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺
EDTA  乙二胺四乙酸
Et  乙基
FRDA  弗里德赖希共济失调
Gly  甘氨酰基
HEPES  4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HOBt  羟基苯并三唑
HPLC  高效液相色谱法
HR  心率
ITIES  两种不互溶的电解质溶液之间的界面
KSS  卡恩斯-塞尔综合征
LHON Leber氏遗传性视神经病变
Me  甲基
MEGDEL  3-甲基戊烯二酸尿症、神经性耳聋、脑病和Leigh样综合征的神经影像学表现
MELAS  线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作
MERRF  肌阵挛癫痫伴破碎红纤维
MIDD  母系遗传性糖尿病伴耳聋
MitoQ10  辅酶(mitoquinone)
MNGIE  线粒体神经胃肠脑病
MRS  磁共振波谱
NAD+  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
NADH  还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
NARP  神经病变共济失调和色素性视网膜炎
NMM  N-甲基吗啉
Orn  鸟氨酰基(或nithyl)
OXPHOS  氧化磷酸化作用
PBS  磷酸盐缓冲盐水
PCr  磷酸肌酸
PDR  医师案头参考(Physicians'Desk Reference)
PVDF  聚偏二氟乙烯
Qc  心输出量
QSPR  定量构效关系
ROS  活性氧
RQ  呼吸商
Su  琥珀酰亚胺
THF  四氢呋喃
TFA  三氟乙酸根
TFAH  三氟乙酸
VCO2  二氧化碳排放量水平
VO2  耗氧量水平
VO2max  全身耗氧量
Z  苄氧羰基
实施例
实施例1：化合物的合成
1.1、化合物F、K、N和O的合成
1.1.1、基本信息
除非另有说明，原料是从供应商处购买并直接使用。将CH2Cl2用氢化钙新鲜蒸馏。所有对空气和水分敏感的反应在干燥氮气的惰性气氛中进行。使用Acros硅胶(0.035-0.070mm，6nm)进行层析柱。
1.1.2、Trolox TM  2-胍基甘氨酰基氨基乙酰胺三氟乙酸盐(化合物F)
步骤A：在TroloxTM(1.2g，4.65mmol)的DMF(45mL)溶液中加入HOBt(0.691g，5.12mmol)，随后加入EDCI(0.981g，5.12mmol)。将混合物搅拌直至获得透明溶液。接着，逐滴加入DIPEA(0.891mL，5.12mmol)。将溶液冷却至4℃(冰浴)并加入Boc-乙二胺(0.811mL，4.88mmol)。将混合物在4℃搅拌5分钟，温热至室温并另外搅拌1h。然后将混合物用EtOAc(200mL)稀释并用柠檬酸水溶液(10重量％，2×60mL)洗涤。合并的水相用EtOAc(60mL)萃取，之后合并有机相并用H2O(60mL)、饱和NaHCO3水溶液(60mL)、水(60mL)和盐水(brine)(60mL)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。获得的中间体A(1.8g)不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：在中间体A(1.75g，4.46mmol)的EtOAc(25mL)溶液中加入新鲜制备的饱和HCl的EtOAc(45mL)溶液。将该溶液搅拌45min，期间形成白色沉淀。然后将悬浮液用Et2O(150mL)稀释并将得到的混合物另外搅拌30min。经过滤、用Et2O(2×30mL)洗涤并真空干燥收集固体。获得的中间体B(1.36g)不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤C：将中间体B(1.32g，4.0mmol)的DMF(40mL)溶液冷却至4℃(冰浴)。接着，逐滴加入DIPEA(1.5mL，8.8mmol)，随后分批加入Boc-Gly-OSu(1.1g，4.0mmol)。将该混合物温热至室温并搅拌1.5h。然后将混合物用EtOAc(250mL)稀释并用柠檬酸水溶液(10重量％，2×50mL)、H2O(50mL)、饱和NaHCO3水溶液(2×50mL)、水(50mL)和盐水(50mL)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。获得的中间体C(1.52g)不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤D：在中间体C(1.42g，3.16mmol)的EtOAc(20mL)溶液中加入新鲜制备的饱和HCl的EtOAc(40mL)溶液。将溶液搅拌1h，期间形成白色沉淀。然后将悬浮液用Et2O(120mL)稀释并将得到的混合物另外搅拌30min。经过滤、用Et2O(2×25mL)洗涤并真空干燥收集固体。获得的中间体D(925mg)不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤E：在中间体D(200mg，0.52mmol)的DMF(3mL)溶液中加入NMM(0.15mL，1.35mmol)，随后加入1,3-二-BOC-2-(三氟甲基磺酰)胍(223mg，0.57mmol)。将得到的混合物搅拌16h。接着，将混合物用EtOAc(15mL)稀释，用柠檬酸水溶液(10重量％，2×5mL)、H2O(5mL)、盐水(2×5mL)萃取，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱层析(EtOAc/庚烷2:1)提纯获得白色固体的中间体E(259mg)。
步骤F：将中间体E(144mg，0.24mmol)的TFA/DCM(1:1v/v，4mL)溶液搅拌2h。然后溶液用甲苯(2×10mL)稀释并真空浓缩。剩余物用H2O(2×10mL)汽提(stripped)并从H2O(3mL)中冻干，获得白色粉末的TroloxTM2-胍基甘氨酰基氨基乙酰胺三氟乙酸盐(123mg)。
化合物F的1H NMR(D2O,400MHz)：δ(ppm)＝3.74(s,2H),3.44-3.21(m,4H),2.72-2.60(m,1H),2.54-2.41(m,1H),2.35-2.25(m,1H),2.17(s,3H),2.16(s,3H),2.07(s,3H),1.88-1.77(m,1H),1.50(s,3H)。
1.1.3、Trolox TM  2-乙脒基甘氨酰氨基乙酰胺盐酸盐(化合物K)
步骤G：在中间体D(136mg，0.35mmol)的甲醇(4mL)溶液中加入NH3的甲醇液(7N，0.2mL)，随后分批加入乙基乙酰亚胺盐酸盐(ethylacetimidate hydrochloride)(65mg，0.53mmol)。将混合物搅拌15min。接着，在溶液中加入硅胶(400mg)并将得到的混合物减压浓缩。通过快速柱层析(9:1-8:2的DCM/甲醇)提纯，随后从H2O(3mL)中冻干，获得灰白色粉末的TroloxTM 2-乙脒基甘氨酰氨基乙酰胺盐酸盐(120mg)。
化合物K的1H NMR(D2O,400MHz)：δ(ppm)＝3.86-3.75(m,2H),3.46-3.23(m,4H),2.72-2.63(m,1H),2.51-2.47(m,1H),2.35-2.28(m,1H),2.29(s,3H),2.18(s,3H),2.16(s,3H),2.07(s,3H),1.87-1.78(m,1H),1.51(s,3H)。
1.1.4、Trolox TM 鸟氨酰胺盐酸盐(化合物N，Trolox TM ornithylamide hydrochloride)
步骤H：将Z-Orn(Boc)-OH(2.5g，6.8mmol)的DMF(7mL)溶液冷却至4℃(冰浴)，之后分批加入碳酸钾(0.94g，6.8mmol)。将得到的悬浮液搅拌5min，之后逐滴加入碘甲烷(0.51mL，8.2mmol)。将混合物温热至室温并搅拌2.5h。接着，加入H2O(10mL)并用EtOAc(3×10mL)萃取水相。将合并的有机层用Na2S2O5水溶液(2.5重量％，5mL)和盐水(5mL)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。获得的中间体H(2.43g)不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤I：在中间体H(2.4g，6.4mmol)的异丙醇(54mL)溶液中逐滴加入乙酸(0.4mL，7mmol)，随后加入碳钯(10重量％，0.68g，0.64mmol)在水(6mL)中的悬浮液。将得到的黑色悬浮液置于H2氛围中并搅拌3h。接着，将反应混合物用氮气吹扫5min，随后通过硅藻土过滤混合物。将滤液真空浓缩，获得为无色油的中间体I(1.76g)并不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤J：在TroloxTM(0.72g，2.8mmol)的DMF(22mL)溶液中加入HOBt(0.42g，3.1mmol)，随后加入EDCI(0.59g，3.1mmol)。将混合物搅拌直至获得透明溶液。接着，逐滴加入DIPEA(0.54mL，3.1mmol)。将溶液冷却至4℃(冰浴)并加入中间体I(900mg，2.94mmol)。将混合物在4℃搅拌5分钟，随后温热至室温并另外搅拌1h。然后将混合物用EtOAc(120mL)稀释并用柠檬酸水溶液(10重量％，2×40mL)洗涤。将合并的水相用EtOAc(40mL)萃取，之后合并有机相并用H2O(40mL)、饱和NaHCO3水溶液(40mL)、水(40mL)和盐水(40mL)洗涤，Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。通过快速柱层析(1:1的EtOAc/庚烷)提纯，获得为白色泡沫的中间体J(1.1g)。
步骤K：将中间体J(587mg，1.23mmol)的DMF(2.5mL)溶液冷却至4℃(冰浴)。接着，逐滴加入NaOH水溶液(1M，2.5mL，2.5mmol)。使溶液温热至室温并将混合物搅拌1h。然后，用H2O(15mL)和Et2O(15mL)稀释混合物。混合层后分离层。水相用EtOAc(15mL)洗涤，用饱和KHSO4水溶液酸化至pH＝2.5，并用EtOAc(2×10mL)萃取。合并剩余的两种有机相，用饱和NH4Cl水溶液(2×10mL)、盐水(10mL)洗涤，Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。获得的中间体K(490mg)不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤L：将中间体K(170mg，0.36mmol)的EtOAc(4mL)溶液用HCl(g)吹扫25min。接着，溶液用氩气吹扫15min，使得沉淀形成。将混合物用Et2O(20mL)稀释，搅拌15分钟，之后过滤收集形成的固体。将固体从H2O(3mL)中冻干，得到为灰白色固体的TroloxTM鸟氨酰胺盐酸盐(115mg)。
化合物N的1H NMR(1:1的非对映体混合物，D2O，400MHz)：δ(ppm)＝4.38-4.23(m,2×1H),3.01-2.93(m,2H),2.73-2.27(m,2H+2×3H),2.21(s,3H),2.19(s,3H),2.15(s,2×3H),2.05(s,2×3H),2.00-1.73(m,2×3H),1.68-1.51(m,2×1H),1.58(s,3H),1.55(s,3H),1.12-0.94(m,2×1H)。
1.1.5、Trolox TM 精氨酰胺盐酸盐(化合物O)
步骤M：在TroloxTM(0.49g，1.9mmol)的DMF(20mL)溶液中加入HOBt(0.29g，2.1mmol)，随后加入EDCI(0.40g，2.1mmol)。将混合物搅拌直至获得透明溶液。接着，逐滴加入DIPEA(0.37mL，2.1mmol)。将溶液冷却至4℃(冰浴)并加入H-Arg(PMC)-OtBu(1.0g，2.0mmol)。将混合物在4℃搅拌5分钟，然后温热至室温并另外搅拌1h。然后将混合物用EtOAc(100mL)稀释并用柠檬酸水溶液(10重量％，2×30mL)洗涤。将合并的水相用EtOAc(30mL)萃取，之后合并有机相并用H2O(30mL)、饱和NaHCO3水溶液(30mL)、水(30mL)和盐水(30mL)洗涤，Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。获得的中间体M(1.31g)不用进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤N：将中间体M(200mg，0.27mmol)的DCM/TFA(1:1v/v，3mL)搅拌30min。接着，混合物用甲苯(10mL)稀释并减压浓缩。残余物用甲苯(2×10mL)汽提并加入水中(10mL)。得到的悬浮液使用HCl水溶液(1M，55mL)酸化，用Et2O(10mL)稀释并剧烈搅拌15min。待层分离并用Et2O(2×10mL)洗涤水相。水相冻干获得为灰白色固体的TroloxTM精氨酰胺盐酸盐(120mg)。
化合物O的1H NMR(1:1的非对映体的混合物,D2O,400MHz)：δ(ppm)＝4.35(dd,J＝8.6,4.0Hz,1H),4.24(dd,J＝8.6,4.8Hz,1H),3.08(t,J＝7.2Hz,2H),2.76(t,J＝7.4Hz,2H),2.59-2.33(m,2×3H),2.23(s,3H),2.21(s,3H),2.16(s,2×3H),2.07(s,3H),2.06(s,3H),1.98-1.73(m,2×3H),1.62(s,3H),1.57(s,3H),1.57-1.30(m,2×1H),1.00-0.76(m,2×1H)。
1.2、化合物R-T、S-T、R-U、S-U、R-V、S-V、R,R-X、R,S-X、S,R-X、 S,S-X、外消旋Z、R,反式-AE、S,反式-AE、S,R-AF、S,R-AG、S,S-AG和S-AH 的合成。
1.2.1基本信息
将胺类与TroloxTM的EDCI/HOAt偶合的通用过程A：氮气氛围下，将TroloxTM(1当量)和胺(1当量)在DMF(干燥的，～0.2M)中的混合物中加入EDCI.HCl(1.1当量)和HOAt(0.1当量)。混合物在室温搅拌直至完全转化(LCMS)。混合物用H2O(20mL)稀释并用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的有机相依次用0.5M KHSO4(20mL)、饱和NaHCO3水溶液(20mL)和盐水(3×20mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。
BOC去保护的通用过程B：在中间体A(1当量)的DCM(～0.03M)溶液中加入4N HCl的二氧六环(36当量)溶液。将混合物在室温搅拌直至完全转化(LCMS)，浓缩，与DCM(2x)共蒸发，通过反相柱层析纯化(H2O+0.01％(w/w)的甲酸/MeCN)并冷冻干燥。
1.2.2、Trolox TM 哌啶-3-酰胺盐酸盐(化合物X，R,R-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(R)-TroloxTM(250mg)和(R)-3-氨基-1-N-Boc-哌啶(200mg)制备中间体Xa。中间体Xa(349mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物R,R-X(209mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm)：8.23(1H,s),7.55(1H,br s),7.30(1H,d,J＝8.4Hz),3.85–3.73(1H,m),2.99–2.90(1H,m),2.89–2.79(1H,m),2.73–2.64(1H,m),2.64–2.37(3H,m),2.23–2.14(1H,m),2.11(3H,s),2.07(3H,s),1.99(3H,s),1.79–1.67(1H,m),1.54–1.45(1H,m),1.44–1.26(3H,m),1.39(3H,s)。
1.2.3、Trolox TM 哌啶-3-酰胺盐酸盐(化合物X，R,S-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(R)-TroloxTM(100mg)和(S)-3-氨基-1-N-Boc-哌啶(80mg)制备中间体Xb。中间体Xb(143mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制备最终化合物R,S-X(68mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.25(1H,s),7.53(1H,br s),7.26(1H,d,J＝8.4Hz),3.78–3.64(1H,m),2.83–2.71(2H,m),2.63–2.34(4H,m),2.17–2.03(1H,m),2.09(3H,s),2.07(3H,s),1.99(3H,s),1.82–1.72(1H,m),1.72–1.55(2H,m),1.54–1.41(2H,m),1.36(3H,s)。
1.2.4 Trolox TM  4-二甲氨基丁酰胺盐酸盐(化合物V，R-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(R)-TroloxTM(100mg)和4-(二甲氨基)丁胺(46mg)制备最终化合物R-V。当反应达到完全转化时，将混合物用H2O(20mL)淬灭(quenched)，用饱和Na2CO3水溶液碱化直至pH约为9，并用EtOAc(3×40mL)萃取。将合并的有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。粗品用硅胶柱层析纯化(DCM/7N NH3的MeOH液)，用乙醚(5mL)溶解，并用1N HCl的乙醚液(1mL)处理。将混合物真空浓缩，与DCM(3x)共蒸出并冷冻干燥(H2O/MeCN)以获得最终化合物R-V(86mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):10.14(1H,s),7.53(1H,br s),7.46–7.38(1H,m),3.17–2.99(2H,m),2.98–2.87(2H,m),2.63(6H,s),2.57–2.35(2H,m),2.22–2.13(1H,m),2.10(3H,s),2.07(3H,s),1.99(3H,s),1.78–1.65(1H,m),1.50–1.29(4H,m),1.37(3H,s)。
1.2.5、Trolox TM  4-二甲氨基丁酰胺盐酸盐(化合物V，S-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(S)-TroloxTM(100mg)和4-(二甲氨基)丁胺(46mg)制备最终化合物S-V。当反应达到完全转化时，将混合物用H2O(20mL)淬灭，用饱和Na2CO3水溶液碱化直至pH约为9，并用EtOAc(3×40mL)萃取。将合并的有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。粗品用硅胶柱层析纯化(DCM/7N NH3的MeOH液)，用乙醚(5mL)溶解，并用1N HCl的乙醚液(1mL)处理。将混合物真空浓缩，与DCM(3x)共蒸出并冷冻干燥(H2O/MeCN)以获得最终化合物S-V(92mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):10.12(1H,s),7.53(1H,br s),7.42(1H,t,J＝5.92Hz),3.16–2.99(2H,m),2.98–2.86(2H,m),2.63(6H,s),2.58–2.35(2H,m),2.23–2.14(1H,m),2.11(3H,s),2.07(3H,s),1.99(3H,s),1.78–1.64(1H,m),1.53–1.29(4H,m),1.37(3H,s)。
1.2.6、Trolox TM 哌啶-3-酰胺盐酸盐(化合物X，S,R-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(S)-TroloxTM(5.49g)和(R)-3-氨基-1-N-Boc-哌啶(4.39g)制备中间体Xc。用硅胶柱层析法纯化(庚烷/EtOAc)后的中间体Xc(6.11g)用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B无需反相柱层析纯化制得最终化合物S,R-X(4.43g)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.95(2H,s),7.58–7.48(2H,m),4.03–3.88(1H,m),3.16–3.05(1H,m),3.03–2.93(1H,m),2.76–2.62(2H,m),2.60–2.37(2H,m),2.18–2.03(1H,m),2.08(3H,s),2.07(3H,s),2.00(3H,s),1.86–1.72(3H,m),1.72–1.45(2H,m),1.36(3H,s)。
1.2.7、Trolox TM 哌啶-3-酰胺盐酸盐(化合物X，S,S-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(S)-TroloxTM(100mg)和(S)-3-氨基-1-N-Boc-哌啶(80mg)制备中间体Xd。中间体Xd(158mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物S,S-X(122mg)。1H NMR(400MHz，DMSO):δ(ppm):8.24(1H,s),7.56(1H,br s),7.28(1H,d,J＝8.4Hz),3.82–3.69(1H,m),2.95–2.85(1H,m),2.85–2.73(1H,m),2.70–2.61(1H,m),2.61–2.35(3H,m),2.23–2.13(1H,m),2.11(3H,s),2.07(3H,s),1.99(3H,s),1.79–1.66(1H,m),1.53–1.42(1H,m),1.42–1.24(3H,m),1.39(3H,s)。
1.2.8、Trolox TM  1-甲基哌啶-4-酰胺甲酸盐(化合物AH，S-立体异构体)
向(S)-TroloxTM(100mg)和1-甲基哌啶-4-胺(46mg)在DMF(无水，2ml)中的混合物中加入PyBOP(249mg，1.2当量)。于室温搅拌一夜之后，将混合物用H2O(20ml)淬灭。加入饱和NaHCO3水溶液(30ml)并用EtOAc(3×30ml)萃取水相。将合并的有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。粗品通过反相柱层析纯化(H2O+0.01％(w/w)的甲酸/MeCN)并冷冻干燥以获得最终化合物S-AH(75mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.21(1H,s),7.57(1H,br s),6.91(1H,d,J＝7.32Hz),3.64–3.43(1H,m),2.62–2.27(4H,m),2.24–2.01(3H,m),2.14(3H,s),2.10(3H,s),2.07(3H,s),1.98(3H,s),1.78–1.62(2H,m),1.57–1.42(2H,m),1.42–1.29(1H,m),1.38(3H,s)。
1.2.9、Trolox TM  4-氨基环己酰胺盐酸盐(化合物AE，R,反式-立体异构 体)
步骤A：根据通用过程A使用(R)-TroloxTM(100mg)和N-Boc-反式-1,4-环己二胺(86mg)制备中间体AEa。中间体AEa(186mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物R,反式-AE(102mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.42(1H,s),7.57(2H,br s),6.92(1H,d,J＝8.3Hz),3.79–2.98(1H,m),2.84–2.69(1H,m),2.61–2.36(2H,m),2.19–1.91(1H,m),2.07(3H,s),2.06(3H,s),1.99(3H,s),1.89–1.65(4H,m),1.61–1.46(1H,m),1.40–1.05(4H,m),1.35(3H,s)。
1.2.10、Trolox TM  4-氨基环己酰胺盐酸盐(化合物AE，S,反式-立体异构 体)
步骤A：根据通用过程A使用(S)-TroloxTM(100mg)和N-Boc-反式-1,4-环己二胺(86mg)制备中间体AEb。中间体AEb(182mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物S,反式-AE(84mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.43(1H,s),7.57(2H,br s),6.93(1H,d,J＝8.4Hz),3.53–3.35(1H,m),2.86–2.72(1H,m),2.60–2.36(2H,m),2.21–1.92(1H,m),2.08(3H,s),2.07(3H,s),1.98(3H,s),1.90–1.66(4H,m),1.61–1.47(1H,m),1.41–1.08(4H,m),1.35(3H,s)。
1.2.11、Trolox TM  4-氨基丁酰胺盐酸盐(化合物T，R-立体异构体)
步骤A：使用(R)-TroloxTM(200mg)和N-Boc-1,4-丁二胺(150mg)制备中间体Ta。在氮气气氛下，向冷却(0℃)后的在DMF(无水，0.05M)中的反应物的混合物中加入EDCI.HCl(1.1当量)和HOAt(0.1当量)。将混合物于0℃搅拌1小时，然后使其达到室温并搅拌直至完全转化(LCMS)。将反应混合物倒入10当量(与DMF相比)的水中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机相依次用0.5M KHSO4(50mL)、饱和NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(3×50mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。中间体Ta(100mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物R-T(66mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.41(1H,s),7.34(2H,t,J＝6.0Hz),3.14–2.95(2H,m),2.72–2.59(2H,m),2,54(1H,s),2.47–2.34(2H,m),2,21–2.12(1H,m),2,09(3H,s),2,07(3H,s),1,99(3H,s),1.79–1.65(1H,m),1.45-1.27(4H,m),1.35(3H,s)。
1.2.12、Trolox TM  4-氨基丁酰胺盐酸盐(化合物T，S-立体异构体)
步骤A：使用(S)-TroloxTM(200mg)和N-Boc-1,4-丁二胺(150mg)制备中间体Tb。在氮气气氛下，向冷却(0℃)后的在DMF(无水，0.05M)中的反应物的混合物中加入EDCI.HCl(1.1当量)和HOAt(0.1当量)。将混合物于0℃搅拌1小时，然后使其达到室温并搅拌直至完全转化(LCMS)。将反应混合物倒入10当量(与DMF相比)的水中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机相依次用0.5M KHSO4(50mL)、饱和NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(3×50mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。中间体Tb(100mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物S-T(67mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.41(1H,s),7,37-7.30(1H,m),3.13–2.97(3H,m),2.68–2.61(2H,m),2.20–2.11(1H,m),2.09(3H,s),2.07(3H,s),1.99(3H,s),1.79–1.66(1H,m),1.46–1.23(4H,m),1.35(3H,s)。
1.2.13、Trolox TM  5-氨基戊酰胺盐酸盐(化合物U，R-立体异构体)
步骤A：使用(R)-TroloxTM(200mg)和1-Boc-氨基-1,5-戊二胺(162mg)制备中间体Ua。在氮气气氛下，向冷却(0℃)后的在DMF(无水，0.05M)中的反应物的混合物中加入EDCI.HCl(1.1当量)和HOAt(0.1当量)。将混合物于0℃搅拌1小时，然后使其达到室温并搅拌直至完全转化(LCMS)。将反应混合物倒入10当量(与DMF相比)的水中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机相依次用0.5M KHSO4(50mL)、饱和NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(3×50mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。中间体Ua(232mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物R-U(134mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm):8.51(1H,s),7.22–6.45(2H,broad s),6.29–6.16(1H,m),3.64–3.41(1H,m),2.89–2.72(1H,m),2.69–2.40(5H,m),2.19(3H,s),2.18(3H,s),2.08(3H,s),1.83–1.68(1H,m),1.55(3H,s),1.45–1.33(2H,m),1.33–1.21(1H,m),1.20–1.03(1H,m),0.80–0.58(2H,m)。
1.2.14、Trolox TM  5-氨基戊酰胺盐酸盐(化合物U，S-立体异构体)
步骤A：使用(S)-TroloxTM(200mg)和1-Boc-氨基-1,5-戊二胺(162mg)制备中间体Ub。在氮气气氛下，向冷却(0℃)后的在DMF(无水，0.05M)中的反应物的混合物中加入EDCI.HCl(1.1当量)和HOAt(0.1当量)。将混合物于0℃搅拌1小时，然后使其达到室温并搅拌直至完全转化(LCMS)。将反应混合物倒入10当量(与DMF相比)的水中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机相依次用0.5M KHSO4(50mL)、饱和NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(3×50mL)洗涤。有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。中间体Ub(242mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物S-U(164mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm):8.51(1H,broad s),6.26-6.23(2H,dd),3.64–3.37(1H,m),2.91–2.74(1H,m),2.72–2.61(3H,m),2.60–2.42(3H,m),2.19(3H,s),2.18(3H,s),2.08(3H,s),1.83–1.67(1H,m),1.55(3H,s),1.47–1.34(2H,m),1.34–1.22(1H,m),1.21–1.05(1H,m),0.80–0.62(2H,m)。
1.2.15、Trolox TM 1-甲基哌啶-3-酰胺盐酸盐(化合物AF，S,R-立体异构 体)
步骤A：使用(R)-3-氨基哌啶-1-羧酸叔丁基酯(200mg)制备中间体AFa。将底物溶解于THF(无水，0.1M)中并用冰浴冷却至0℃。将LiAlH4(5当量，2.4M在THF中)逐滴加入冷却后的溶液中。将反应混合物于0℃搅拌15分钟随后使其达到室温。然后将混合物回流直至完全转化(GCMS)。将混合物冷却至0℃并连续用水(0.2mL)、15％的NaOH溶液(0.2mL)和水(0.6mL)淬灭，并搅拌1小时。过滤除去沉淀物，并将4M HCl(在二氧六环中)加入至滤液中。真空浓缩滤液并在MeCN/MeOH中磨碎，得到白色固体。
步骤B：使用(S)-TroloxTM(60mg)和中间体AFa(45mg)制备最终化合物S,R-AF。两种反应物均溶解于DMF(无水，0.25M)中。加入三乙胺(2.5当量)和PyBOP(1.2当量)且将反应混合物在室温搅拌直至完全转化(LCMS)。混合物用H2O(20ml)淬灭。加入饱和NaHCO3水溶液(30ml)并用EtOAc(3×30ml)萃取水相。将合并的有机相用Na2SO4干燥、过滤并真空浓缩。粗品通过反相柱层析(H2O+0.01％(w/w)的甲酸/MeCN)提纯并冷冻干燥以获得最终化合物S,R-AF(34mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.19(1H,s),7.53(1H,broad s),7.14-7.12(1H,d),3.70(1H,broad s),2.59–2.36(2H,m),2.36–2.25(1H,m),2.24–2.11(2H,m),2,08(3H,s),2.07(3H,s),2.03(3H,s),1.99(3H,s),1.91–1.82(1H,m),1.81–1.68(1H,m),1.65–1.51(1H,m),1.50–1.40(3H,m),1.39–1.33(3H,m)。
1.2.16、Trolox TM 哌啶-4-酰胺盐酸盐(化合物Z，外消旋体)
步骤A：使用TroloxTM(500mg)和叔丁基氨基哌啶-1-羧酸(400mg)制备中间体Za。在氮气气氛下，向冷却(0℃)后的在DMF(无水，0.05M)中的反应物的混合物中加入EDCI.HCl(1.1当量)和HOAt(0.1当量)。将混合物在0℃搅拌1小时，然后使其达到室温并搅拌直至完全转化(LCMS)。将反应混合物倒入10当量(与DMF相比)的水中。形成白色沉淀并过滤。残余物用水在过滤器中洗涤并干燥。中间体Za(80mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物Z(60mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):8.32(1H,s),7.14–7.12(1H,d),3.78–3.63(1H,m),3.61–3.45(1H,m),3.13–3.02(1H,m),3.01–2.91(1H,m),2.83–2.65(2H,m),2.62–2.36(2H,m),2.24–2.13(1H,m),2.09(3H,s),2.07(3H,s),1.99(3H,s),1.86–1.68(2H,m),1.67–1.44(2H,m),1.43–1.24(1H,m),1.38(3H,s)。
1.2.17、Trolox TM 吡咯烷-3-酰胺盐酸盐(化合物AG，S,R-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(S)-TroloxTM(100mg)和(R)-3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(74mg)制备中间体AGa。中间体AGa(110mg)用于接下来的步骤而无需进一步提纯。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物S,R-AG(80mg)。1H NMR(400MHz，DMSO):δ(ppm):8.36(1H，broad s)，7.60–7.59(1H，d)，4.37–4.01(2H，m)，3.15–2.98(2H，m)，2.97–2.79(1H，m)，2.77–2.59(1H，m)，2.58–2.38(2H，m)，2.26–2.10(2H，m)，2.09(3H,s)，2.07(3H，s)，1.99(3H，s)，1.85–1.54(2H，m)，1.35(3H，s)。
1.2.18、Trolox TM 吡咯烷-3-酰胺盐酸盐(化合物AG，S,S-立体异构体)
步骤A：根据通用过程A使用(S)-TroloxTM(100mg)和(S)-3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(74mg)制备中间体AGb。中间体AGb(115mg)无需进一步提纯而用于接下来的步骤。
步骤B：根据通用过程B制得最终化合物S,S-AG(80mg)。1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm):9.11(2H，宽峰s),7.74–7.72(1H,d),7.52(1H,s),4.48–4.20(1H,s),3,33–3.18(2H,m),3.17–3.09(1H,m),3.08–2.99(1H,m),2.62–2.38(2H,m),2.22-2.12(1H,m),2.10(3H,s),2.06(3H,s),1.99(3H,s),1.82-1.62(2H,m),1.37(3H,s)。
实施例2：在健康细胞和患者细胞中，化合物对完全组装的复合物I和 复合物II的蛋白质表达水平的作用
2.1、方法和原料
2..1.1、线粒体和OXPHOS复合物的分离(Isolation)
为了确定化合物在正常人类皮肤成纤维细胞和患者皮肤成纤维细胞中对复合物I和复合物II的作用，将细胞用化合物F(300μM)、化合物K(300μM)或化合物N(10或100nM)进行处理。患者皮肤成纤维细胞源自在不同的复合物I亚基中具有突变的患者，以及对照细胞为源自健康对照的人类皮肤成纤维细胞。
在与化合物培养72小时后，通过胰蛋白酶处理并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS；Life Technologies，Bleiswijk，荷兰)洗涤两次获得所述细胞(大约2×106)。接着，将细胞悬浮液于287×g、4℃离心分离5min，并将细胞沉淀(cell pellets)迅速冷冻在液氮中。
在分离线粒体与OXPHOS复合物之前，将上述沉淀在冰中解冻并重新悬浮在10μl冰冷的PBS中。为了制备线粒体富集碎片(mitochondria enrichedfraction)，加入100μl(4mg/ml)洋地黄皂苷(digitonin)(Sigma，Zwijndrecht，荷兰)，并且将细胞悬浮液在冰上放置10min。洋地黄皂苷离解含有胆固醇的细胞膜。因此，其离解细胞膜和线粒体外膜，但不包括线粒体内膜。接着，加入1ml冰冷的PBS以稀释洋毛地黄皂苷，随后进行离心分离(10min；15,600×g；4℃)。离心分离之后，沉淀中便含有富集有丝状体(mitoplast)的细胞碎片。将上层清液去除，并将沉淀重新悬浮于100μl冰冷的PBS中。随后，加入1ml冰冷的PBS，并将悬浮液重新离心分离(5min；15,600×g；4℃)，随后去除上层清液并在100μl冰冷的PBS中悬浮沉淀，加入1ml冰冷的PBS并离心分离(5min；15,600×g；4℃)。用注射器和针头去除上层清液，并将含有丝状体碎片的沉淀储存一夜(-20℃)。
采用β-月桂基麦芽糖苷(β-lauryl maltoside)和氨基己酸从内膜中萃取出OXPHOS体系的复合物。β-月桂基麦芽糖苷为一种温和的清洁剂且可溶解线粒体膜，而氨基己酸可萃取复合物。pH为7时，氨基己酸是具有零静电荷的两性离子盐，并因此不影响电泳。所以，对于OXPHOS复合物的分离，将细胞沉淀在冰上解冻并溶解在100μl的含有1.5Mε-氨基己酸(Serva，Amsterdam，荷兰)和75mM Bis–Tris/HCl(pH 7.0)(Sigma)的ACBT缓冲液中。随后，加入10μl的20％(w/v)的β-月桂基麦芽糖苷(Sigma)，并将悬浮液在冰上放置10min。接着，将悬浮液离心分离(30min；15,600×g；4℃)，将含有分离的复合物的上层清液转移至干净试管中(L.G.Nijtmans，N.S.Henderson，I.J.Holt，Blue Native electrophoresis to study mitochondrial andother protein complexes，Methods 26(2002)327–334.)。
2.1.2蛋白质分析
使用Biorad蛋白质测定仪(Biorad，Veenendaal，荷兰)测定所分离的OXPHOS复合物中蛋白质的浓度。制备双份的0、2、4、6、8、10或15μl的1mg/ml的BSA(Sigma)的标准曲线。将5μl的ACBT/LM加入标准曲线的每个样品中，其包括150μl如2.1.1所描述的ACBT和15μl的20％的β-月桂基麦芽糖苷。将5x染料试剂浓缩液(Biorad)用Milli Q稀释5x，将2ml的稀释后的试剂加入至标准曲线的样品中或加入到5μl含有分离的OXPHOS复合物的样品中。在培养5-60min后，测量在595nm处的消光。
2.1.3BN-PAGE
采用蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)将五种OXPHOS复合物相互分离，从而无需使它们离解成亚基。该分离以分子量为基础。在电泳期间，采用Serva Blue G(Serva)以为蛋白复合物提供电荷以促进电泳迁移，从而无需离解该复合物。为了更好的分离复合物，所述电泳采用梯度凝胶。
根据制造商的说明书将非变性(native)PAGE 4-16％的Bis-Tris凝胶(LifeTechnologies)在XCell SureLock Mini-Cell(Life Technologies)中组装。将电泳槽(slots)用阴极缓冲液A冲洗(由50mM Tricine(Sigma)、15mM Bis-TrispH 7.0(Sigma)和0.02％Serva Blue G组成)。电泳槽装满阴极缓冲液B(由50mM Tricine和15mM Bis-Tris pH 7.0(Sigma)组成)。对每个样品，将蓝色非变性样品缓冲液以1:10的体积比加入。这种样品缓冲液由750mMε-氨基己酸、50mM Bis-Tris、0.5mM EDTA(Merck，Schiphol-Rijk，荷兰)、pH 70的5％Serva Blue G组成并且每个样品有20μg蛋白质负载在凝胶上。外隔室(outer compartment)用500ml阳极缓冲液(pH 7.0的50mM Bis-Tris)装满，内隔室(nner compartment)用阴极缓冲液A装满。将凝胶在50V跑30min，150V跑30min，随后用阴极缓冲液B代替阴极缓冲液A。将凝胶重新在150V跑胶直至蓝色前沿线到达凝胶的底部((L.G.Nijtmans，N.S.Henderson，I.J.Holt，Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other proteincomplexes，Methods 26(2002)327–334.)。
2.1.4、复合物I或复合物II的蛋白质检测
为了显现存在于BN-PAGE凝胶中的复合物I或复合物II的量，使用标准免疫印迹技术将蛋白质转移至PVDF膜(Millipore，Amsterdam,荷兰)并通过免疫染色检测。在印迹之后且在用1:1PBS稀释的Odyssey封闭缓冲液(Li-cor Biosciences，Cambridge，UK)封闭PVCF膜之前，PVDF印迹点用剥离缓冲液(stripping buffer)于60℃剥离15min。剥离缓冲液由PBS、0.1％的Tween-20(Sigma)和2％的SDS(Serva)组成。为了检测复合物I，采用最终浓度为1μg/ml的抗NDUFA9(39kDa)(Molecular probes，Leiden，荷兰)的单克隆初级抗体(monoclonal primary antibody)。为了检测复合物II，采用最终浓度为0.5μg/ml的抗复合物II的70kDa亚基的单克隆抗体(分子探针)。两种初级抗体均在PBS、0.1％Tween-20和2.5％Protifar Plus(Nutricia，Cuijk，荷兰)中稀释并使其于室温与复合物结合4小时或于4℃下与复合物结合过夜。随后将结合后的初级抗体以0.1μg/ml的最终浓度通过IRDye 800CW缀合抗小鼠抗体(Li-cor Biosciences)进行检测。在暗处将印迹点干燥2小时后，使用Odyssey红外成像系统检测IRDye。
2.1.5、统计分析
使用Origin Pro Plus软件(6.1版本；Origin Lab公司，Northampton，MA，USA)进行统计分析。使用不成对的独立学生的t检验与Bonferroni校正法来比较平均值。误差条表示标准偏差(SD)。
2.2结果
在复合物I亚基中含有突变的源自患者的细胞株中加入化合物F获得了增长的完全组装的复合物I的蛋白质水平(图1A)。在相同的源自患者的细胞株中，化合物K也增长了复合物I的蛋白质水平(图1B)。而且，在将10nM或100nM化合物N加入至源自患者的细胞后，发现复合物I的蛋白质水平存在剂量依赖性增长(dose-dependent increase)(图1C)。上述增长水平在图1中对复合物I(A图)和复合物II(B图)进行了量化。在源自患者的细胞株中加入不同浓度的化合物N后，观察到完全组装的复合物I水平呈现统计学上显著增长。在化合物N最高浓度时，发现完全组装的蛋白质复合物II水平也有所增长。这些数据表明化合物F、K和N的作用方式可涉及完全组装的复合物I和潜在的复合物II的蛋白质含量水平上的增长。
实施例3：在患者细胞中，化合物对CM-H 2 DCF-氧化活性氧(ROS)增 长水平的作用
3.1、方法和原料
CM-H2DCFDA为活性氧(ROS)的细胞可渗透性报道分子(reportermolecule)，在经细胞内酯酶去除其乙酸基后，便能转化成非荧光的和膜不可渗透的CM-H2DCF。通过被ROS氧化，CM-H2DCF转化成荧光CM-DCF。广泛接受的是，很多种的ROS都能够用于CM-H2DCF氧化，使其成为细胞氧化水平的合适报道分子。平均细胞CM-DCF荧光强度被认为是对细胞ROS水平的间接测量。
为了在不同患者的人类皮肤成纤维细胞中测量化合物对细胞内ROS水平的作用，将细胞在96孔板中以1500个细胞/孔的密度进行接种并与浓度逐渐增长的化合物F、K和N孵育。处理3天后，将培养基用最终浓度为1μM的CM-H2DCFDA(Life Technologies)按100μl/孔替换。该CM-H2DCFDA溶液是通过将1mM原液(CM-H2DCFDA溶解在DMSO(Sigma)中)以1:1000在pH 7.4的HT缓冲液中进行稀释而制得的。这种HT缓冲液由132mM NaCl、4mM KCl、1mM MgCl2、10mM HEPES、1mM CaCl2和5mM D-葡萄糖组成。
将含有CM-H2DCFDA的细胞培养皿在37℃或室温中正好放置10分钟。接着，用PBS将细胞洗涤两遍，并且除了4个空孔以外将100μl的1x HT-缓冲液加入至含有细胞的每个孔中。在另外4个空孔中，加入100μl的溶有(5pM)荧光素(Sigma)的HT缓冲液。将没有细胞的但有HT缓冲液或有HT缓冲液和荧光素的孔分别用于校正背景荧光或不均匀的光照。
采用BD Pathway 855系统测量CM-DCF荧光，使用的参数为：曝光：0.4；增益(Gain)：10；补偿：255。使用BD pathway校正程序对所有测量值校正任何背景荧光，并且进行平场校正以去除由BD pathway 855引入的不均匀光照。数值表示成平均CM-DCF强度/细胞像素点/孔，并且将源自患者的细胞株的数值计算成相对在仅用0.1％DMSO处理的对照细胞株C5120中的平均数值的百分比。
3.2.1化合物F、K和N的结果
为了确定所述化合物是否对细胞内ROS水平有作用，将具有已升高的ROS水平的一种或多种患者的细胞株(W.J.H.Koopman，S.Verkaart，H.J.Visch，S.E.van Emst-de Vries，L.G.Nijtmans，J.A.Smeitink，P.H.Willems，Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency:radical changes inmitochondrial morphology？，Am J Physiol Cell Physiol 293(2007)C22-C29)暴露于浓度逐渐增长的化合物F(图3A)、K(图3B)或N(图3C)中。对于三种化合物，都发现了化合物含量与ROS水平存在负相关性，这意味着浓度的增长将导致ROS水平降低(由CM-DCF的形成决定)。由于ROS水平太高可能导致线粒体分裂(W.J.H.Koopman，S.Verkaart，H.J.Visch，S.E.van Emst-de Vries，L.G.Nijtmans，J.A.Smeitink，P.H.Willems，HumanNADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency:radical changes in mitochondrialmorphology？，Am J Physiol Cell Physiol 293(2007)C22-C29；Distelmaier F.，Valsecchi，F.，Forkink，M.，van Emst-de Vries，S.，Swarts，H.，Rodenburg，R.，Verwiel，E.，Smeitink，J.，Willems，P.H.G.M.，Koopman，W.J.H.(2012)TroloxTM-sensitive ROS regulate mitochondrial morphology，oxidativephosphorylation and cytosolic calcium handling in healthy cells.Antioxidantsand redox signaling.(in press)，PMID 22559215)，所述化合物至少能够部分发挥其治疗效果以将ROS水平降回至生理水平。
3.2.2、其他化合物的结果
能够降低细胞内ROS水平的其他化合物列于表2。在DCFDA分析中，基本上如3.1所描述的，对于化合物降低具有升高的ROS水平的患者细胞株(S7-5175细胞，其为在NDUFS7基因中具有突变的成纤维细胞)的细胞内ROS水平的作用进行了测试。确定了所列出的每种化合物的剂量反应曲线，并计算了EC50(效力，potency)(即半最大响应的化合物浓度)如表2所示。
表2在DCFDA分析中化合物的效力
编码 化合物 DCFDA评估中的EC50*
KH001 消旋-F +
KH003 R,S-N/S,S-N(1/1) ++
KH004 R,S-O/S,S-O(1/1) +
KH137 消旋-Z ++
KH167 R-T +
KH168 S-T +
KH174 R,R-X ++
KH175 R,S-X ++
KH176 S,R-X +++
KH177 S,S-X ++
KH185 R-U ++
KH186 S-U ++
KH189 R-V +++
KH190 S-V +
KH193 R,反式-AE ++
KH194 S,反式-AE ++
KH204 S,R-AF +++
KH213 S-AH ++
KH217 S,R-AG ++
KH218 S,S-AG ++
*+表示EC50在10-100μM范围内；++表示EC50在1-10μM范围内；+++表示EC50在0.1-1μM范围内。
实施例4：化合物I和J对完全组装的复合物I蛋白质表达水平的作用
在健康对照细胞株中，化合物I和J引起了复合物I的表达的轻微下降，然而在患者细胞株上，所述化合物却引起复合物I的表达的显著下降，并且化合物J的作用比化合物I的作用强。
实施例5：化合物N对Ndufs4基因敲除小鼠握力的体内作用
动物及处理方法：通过Ndufs4杂合子雄性和雌性小鼠进行杂交得到Ndufs4基因敲除(KO)和野生型小鼠(Kruse SE等，2008，Cell Metab7:312–320)。用于这个项目的动物总数(n)如下：Vehicle WT：7，化合物N(KH003)WT：7，Vehicle KO：5，化合物N KO：5。将年龄为3、5和6周的动物进行测试。有的动物接受由无菌水组成的媒介(对照)注射剂，而有的则接受剂量体积为4ml/kg的且剂量为400mg/kg的化合物N。动物每天接受两次注射(每次注射2ml/kg)。在3周寿命期间开始注射并每天持续直至实验6周后出结果。
数据分析：所有数据表示为平均值+SEM。在20.0版本的SPSS上使用单因素方差分析(one-way ANOVA)将数据进行分析。使用Fisher’s PLSD事后分析法进一步分析显著的整体效果(即，基因型、治疗型和/或基因型与治疗型的相互作用)。
握力范例(Grip Strength Paradigm)：握力试验是用于测量啮齿类动物的肌肉力量的。其装置由一根杆构成，动物可以本能地抓住该杆。一旦该杆被抓住，实验者便轻轻拉回动物直至该动物被迫松开杆。动物在杆上施加的力量以Pond(p)(1p＝1克)计。握力试验重复5次并将施加的平均力用作定量读出值(quantitative readout)。所有测量使用以下公式进行体重校正：
握力得分＝((X周试验1+2+3+4+5)/5)/X周平均体重(g)(X周＝3周、5周或6周)。
测试方法：在测试天内，动物在其测试时间以前的30分钟接受它们的上午注射。注射后，将动物置于测试室接受30分钟的环境适应期。
结果：如图4所示，相比于媒介物的敲击动物(vehicle knockouts)(p<0.002)，采用化合物N的长期治疗使得用于测试的6周大KO动物的握力有显著提高。并且，采用化合物N治疗后的两个6周大的治疗组的KO动物与野生型动物相比不再有显著不同，这表明化合物N治疗显著提高了肌肉力量性能，使其在该时间点上比得上野生型的。在3周和5周大的治疗组不存在明显区别。
化合物S,R-X(KH176)获得了与化合物N相似的结果，其给药剂量要比化合物N的低于10倍，即剂量为40mg/kg且剂量体积的4ml/kg(2ml/kg注射剂，一天两次)(未显示数据)。

Claims (15)

1.一种通式(I)所示的化合物：
- 其中，
- L为含有1-10个任选取代的选自碳、氮和氧的骨架原子的连接子；
- R1和R2各自独立地选自氢和C1-C6的烷基，或者R1和R2连在一起形成在酰胺氮原子和阳离子的氮原子之间的第二连接子，或者R1与连接子L上的骨架原子相连形成环结构，和/或R2与连接子L上的骨架原子相连形成环结构；以及
- R3选自氢和C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代，或者当所述阳离子的氮原子为亚胺基的一部分时，R3不存在；
- R4选自氢和C1-C6的烷基，其中，所述烷基可以被一个或多个卤素原子或(卤代)烷氧基取代；且
- X-为药学上可接受的阴离子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，
- L＝–(CH2)2–(L1)，R1–R2＝–(CH2)2–(L1)，R3＝H，R4＝H，X＝Cl；或
- L＝–(CH2)2–(L1)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–(CH2)2NHC(O)CH2–(L2)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)3–(L3)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)2NHC(NH2)＝(L4)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
- L＝-(CH2)2NHC(O)CH2NHC(NH2)＝(L5)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
- L＝-(CH2)3NHC(NH2)＝(L6)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
- L＝-(CH2)3–(L3)，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I；或
- L＝-(CH2)2–(L1)，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I；或
- L＝-(CH2)2NHC(Me)＝(L7)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)2NHC(O)CH2NHC(Me)＝(L8)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)3NHC(Me)＝(L9)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)2NR1’C(NH2)＝(L10)，R1–R1’＝-(CH2)2–(L1)，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
- L＝-C(CO2H)(CH2)3–(L11)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-C(CO2H)(CH2)3NHC(NH2)＝(L12)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-C(CO2H)CH2–(L13)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-C(CO2H)(CH2)2–(L14)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-C(CO2H)(CH2)3–(L15)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-C(CO2H)(CH2)3–(L11)，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)4–(L16)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)5–(L17)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)4–(L16)，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR2’C(O)–(L18)，R1＝H，R2–R2’＝-(CH2)3–(L3)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR2’CH2–(L19)，R1＝H，R2–R2’＝-(CH2)3–(L3)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR5CH2NR5’C(Me)＝(L20)，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝-(CH2)3–(L3)，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR2’(CH2)2–(L21)，R1＝H，R2–R2’＝-(CH2)2–(L1)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)2CHR1’–(L22)，R1–R1’＝-(CH2)2–(L1)，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-(CH2)2CHR1’NHC(O)C(Me)–(L23)，R1–R1’＝-(CH2)2–(L1)，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CH2CHR1’–(L24)，R1–R1’＝-(CH2)3–(L3)，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CH2CHR1’NHC(Me)＝(L25)，R1–R1’＝-(CH2)3–(L3)，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR5(CH2)2CHR5’–(L26)，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝-(CH2)2–(L1)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR2’CH2–(L19)，R1＝H，R2–R2’＝-(CH2)3–(L3)，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR2’CH2–(L19)，R1＝H，R2–R2’＝-(CH2)2–(L1)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝-CHR2’(CH2)2–(L21)，R1＝H，R2–R2’＝-(CH2)2–(L1)，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，
- L＝–(CH2)2NHC(O)CH2NHC(NH2)＝(L5)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝TFA；或
- L＝–(CH2)2NHC(O)CH2NHC(Me)＝(L8)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–C(CO2H)(CH2)3–(L11)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–C(CO2H)(CH2)3NHC(NH2)＝(L12)，R1＝H，R2＝H，R3＝不存在，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–(CH2)5–(L17)，R1＝H，R2＝H，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–(CH2)4–(L16)，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–CHR2’CH2–(L19)，R1＝H，R2–R2’＝–(CH2)3–(L3)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–CHR2’(CH2)2–(L21)，R1＝H，R2–R2’＝–(CH2)2–(L1)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–CHR5(CH2)2CHR5’–(L26)，R1＝H，R2＝H，R5–R5’＝–(CH2)2–(L1)，R3＝H，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–CHR2’CH2–(L19)，R1＝H，R2–R2’＝–(CH2)3–(L3)，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl；或
- L＝–CHR2’(CH2)2–(L21)，R1＝H，R2–R2’＝–(CH2)2–(L1)，R3＝Me，R4＝H；X＝Cl。
4.根据权利要求2所述的化合物，其中，
- L＝–(CH2)3–(L3)，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I；或
- L＝–(CH2)2–(L1)，R1＝H，R2＝Me，R3＝Me，R4＝Me；X＝I。
5.一种药物组合物或化妆品组合物，所述药物组合物或化妆品组合物含有权利要求1-4中任意一项所述的化合物和生理学上可接受的载体。
6.权利要求1-4中任意一项所述的化合物作为药物的应用。
7.权利要求1-4中任意一项所述的化合物在调节线粒体形态和OXPHOS酶的表达中的至少一种上的应用。
8.权利要求1-4中任意一项所述的化合物在治疗、预防或抑制与线粒体疾病相关的症状，或与线粒体功能障碍有关的病况的症状上的应用，其中，优选所述化合物为权利要求3所述的化合物。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述线粒体疾病为选自由以下疾病组成的组中的疾病：肌阵挛性癫痫；肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)；Leber氏遗传性视神经病变(LHON)；神经病变共济失调和色素性视网膜炎(NARP)；线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)；Leigh氏综合征；Leigh样综合征；显性视神经萎缩(DOA)；卡恩斯-塞尔综合征(KSS)；母系遗传性糖尿病伴耳聋(MIDD)；Alpers-Huttenlocher综合征；共济失调神经病谱；慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)；Pearson综合征；线粒体神经胃肠脑病(MNGIE)；Sengers综合征；3-甲基戊烯二酸尿症、神经性耳聋、脑病和Leigh样综合征的神经影像表现(MEGDEL)；肌病；线粒体肌病；心肌症；和脑肌病、SURF1(由于复合物IV过度蛋白质缺乏的COX缺乏的Leigh氏综合征)以及至今未解决的包括了干扰丙酮酸氧化和ATP加PCr生产速度的基因缺陷的单独的或结合的OXPHOS缺陷。
10.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述与线粒体功能障碍有关的病况优选为选自由以下病况组成的组中的病况：弗里德希氏共济失调(FRDA)；肾小管酸中毒；帕金森综合征；阿尔茨海默氏病；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；亨廷顿氏舞蹈病；普遍性发育障碍；听力衰退；耳聋；糖尿病；老龄化；以及妨碍线粒体功能的药物副作用。
11.根据权利要求8-10中任意一项所述的化合物，其中，使用可测量的临床指标评估利用本发明的化合物的治疗功效。
12.根据权利要求11的化合物，其中，所述临床指标为选自由在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的乳酸(乳酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的丙酮酸(丙酮酸盐)水平；在全血、血浆、脑脊液或脑室液中的乳酸盐/丙酮酸盐的比例；在全血、血浆或脑脊液、体液的有机酸中的氨基酸，尤其是丙氨酸、瓜氨酸和脯氨酸；血清和骨骼肌中的FGF21；磷酸肌酸水平、NADH(NADH+H+)或NADPH(NADPH+H+)水平；NAD或NADP水平；ATP水平；无氧阈；还原型辅酶Q(CoQred)水平；氧化型辅酶Q(CoQox)水平；总辅酶Q(CoQtot)水平；氧化型细胞色素C水平；还原型细胞色素C水平；氧化型细胞色素C/还原型细胞色素C的比例；乙酰乙酸盐水平、β-羟基丁酸盐水平、乙酰乙酸盐/β-羟基丁酸盐的比例、8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平；活性氧的水平；以及耗氧量(VO2)水平、二氧化碳排放量(VCO2)的水平和呼吸商(VCO2/VO2)所组成的组中的一种或多种指标。
13.权利要求1-4中任意一项所述的化合物在治疗、预防或抑制与肿瘤疾病相关的症状上的应用，其中，所述化合物优选为权利要求4所述的化合物。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中，所述肿瘤疾病为癌症，优选癌症选自由基底细胞癌、骨癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌组成的组。
15.一种用于治疗或延缓受试者皮肤进一步老化的美容方法，该方法包括对受试者皮肤施用有效量的含有权利要求1-4中任意一项所述的化合物的组合物，其中，所述化合物优选为权利要求3所述的化合物。
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