CN104530178A - 一种贝母素甲的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贝母素甲的制备方法。该方法包括如下步骤：(1)提取：用盐酸水溶液渗漉提取或用乙醇回流提取贝母，得提取液；(2)利用大孔吸附树脂对所述提取液进行分离纯化：依次用水、乙醇水溶液Ⅰ和乙醇水溶液Ⅱ进行洗脱，并收集所述乙醇水溶液Ⅱ的洗脱液，经浓缩得浓缩物；(3)利用中性氧化铝柱对所述浓缩物进行纯化：用95％的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液即得所述贝母素甲。本发明贝母素甲的制备方法工艺简单，可得到高纯度(大于90％)的贝母素甲；该工艺过程中所用的树脂、溶剂和洗脱剂均可以重复使用，无需甲醇、氯仿等有毒昂贵溶剂，工艺成本很低，适合工业化生产，可大规模的用于医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种贝母素甲的制备方法，属于中药化学或天然药物制备领域。
背景技术
百合科贝母属植物全球约有130种，广泛分布于北半球的亚、欧及北美洲的温带地区，我国有43种，19变种，主要分布于安徽、浙江、四川、新疆、甘肃、湖北、东北三省等，分为浙贝母、湖北贝母、平贝母、伊贝母和川贝母等多种药物品种，均含有贝母素甲，药物来源十分广泛。
贝母素甲(verticine,peimine)为2010年版《中国药典》中浙贝母的质量控制成分，是一种甾体生物碱，分子式C27H45NO3，结构式为：
贝母素甲是贝母平喘的主要药效成分之一，近年来研究表明，贝母素甲通过抑制细菌细胞膜上的主动外排泵来发挥作用，对耐药金黄色葡萄球菌具有较强的逆转作用；另外贝母甲素具有抑制肿瘤细胞增殖、转移，抑制甲状腺相关眼病患者眼眶成纤维细胞增殖等作用。
现有制备方法主要是柱层析技术和高速逆流色谱技术。其中：
柱层析技术(翟爱华，王丽杰，张东杰等.利用硅胶柱层析分离纯化平贝总碱的研究[J].食品科学，2009，30(1)：119-121.)是一种传统的天然产物提取方法，该法是指将贝母总碱与硅胶混匀，用干法装柱，上样，乙酸乙酯-甲醇-氨水为展开剂进行洗脱，合并相同流分，真空浓缩至干，80％甲醇回流2次，4～6℃放置，析出贝母素甲。该方法操作过程繁琐，同时需要消耗大量乙酸乙酯、甲醇、氨水等有毒、有刺激性气味且价格昂贵的溶剂，该方法规模较小，仅适合实验室中操作。
高速逆流色谱技术(CN 100526329C)，该法是指以浙贝母粗提物为进样物，以氯代烷烃、脂肪醇或脂肪酮、烯酸溶剂组成溶剂系统，经高速逆流色谱制备，所得馏分蒸干后，用氯仿溶解，水洗3次制得贝母素甲。该方法需要用到氯仿或四氯甲烷等有毒且价格昂贵的溶剂，该方法受仪器限制，每次进样量有限，规模较小，仅适合实验室中操作。
以上方法的产品收率较低，不但需要甲醇、氯仿等毒性试剂，而且有的生产成本较高，很难大规模工业化生产，仅适用于小规模的纯化，不能满足市场需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种贝母素甲的制备方法，该方法操作简便、无需使用甲醇、氯仿等毒性溶剂，分离量大，工艺简单、可以工业化大量生产，综合成本低。
本发明提供的贝母素甲的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：用盐酸水溶液渗漉提取或用乙醇回流提取贝母，得提取液；
(2)利用大孔吸附树脂对所述提取液进行分离纯化：依次用水、乙醇水溶液Ⅰ和乙醇水溶液Ⅱ进行洗脱，并收集所述乙醇水溶液Ⅱ的洗脱液，经浓缩得浓缩物；
所述乙醇水溶液Ⅰ是由乙醇和水组成，所述乙醇水溶液Ⅰ中乙醇的体积浓度为10％～50％；
所述乙醇水溶液Ⅱ是由乙醇和水组成，所述乙醇水溶液Ⅱ中乙醇的体积浓度为30％～80％；
(3)利用中性氧化铝柱对所述浓缩物进行纯化：用体积浓度为95％的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液即得所述贝母素甲。
上述制备方法中，所述贝母可为浙贝母、皖贝母或平贝母，具体可为浙贝母、皖贝母或平贝母的鳞茎。
上述制备方法，步骤(1)中，所述提取之前还包括将所述贝母进行干燥和粉碎的步骤；
所述干燥的温度为40～60℃，具体可为60℃；干燥时间为1～72小时，具体可为24小时；
所述粉碎中所用筛网的目数为10～40目，具体可为20目。
上述制备方法，步骤(1)中，所述渗漉提取为将所述贝母与所述盐酸水溶液先混合浸泡，浸泡时间小于等于48小时，具体可浸泡24小时；再用所述盐酸水溶液渗漉，渗漉时间小于等于72小时，可以0.1mL～10mL/(kg·min)的速度进行渗漉，具体可以3mL/(kg·min)的速度进行渗漉，渗漉至无生物碱反应，收集渗漉液即得所述提取液；
所述浸泡和所述渗漉中，每1kg所述贝母需要3～30L所述盐酸水溶液，其中浸泡时，每1kg所述贝母具体需要3L～10L所述盐酸水溶液，具体可为6L；渗漉时，每1kg所述贝母具体需要5L～30L所述盐酸水溶液，具体可为20L；
所述盐酸水溶液的摩尔浓度为0.01mol/L～0.5mol/L，具体可为0.1mol/L～0.2mol/L、0.1mol/L或0.2mol/L。
上述制备方法，步骤(1)中，步骤(1)中，所述乙醇回流提取为先将所述贝母与乙醇水溶液混合浸泡，浸泡时间小于等于24小时，加热回流提取1～3次，每次0.5～4小时，合并提取液即得所述提取液；
所述浸泡和所述加热回流提取中，每1kg所述贝母需要6～10L所述乙醇水溶液；
所述乙醇水溶液的体积浓度为30％～80％；
具体可按下述步骤操作：1kg所述贝母，先在8L体积浓度为60％的乙醇的水溶液中浸泡24小时，加热回流提取3次，第一次用8L体积浓度为60％的乙醇的水溶液，回流提取2小时，第二次用6L体积浓度为60％的乙醇的水溶液，回流提取2小时，第三次用6L体积浓度为60％的乙醇的水溶液，回流提取2小时；
所述乙醇回流提取还包括将所述提取液进行过滤，减压浓缩，并用摩尔浓度为0.01mol/L～0.5mol/L的盐酸水溶液溶解的步骤。
上述制备方法，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂、DA201大孔吸附树脂和HPD-100大孔吸附树脂中的任一种，具体可为D101大孔吸附树脂，它常用于此生物碱的吸附；
所述大孔吸附树脂的重量为所述贝母重量的1/2～1/10，具体可为1/5；
将所述提取液吸附于所述大孔吸附树脂上的步骤为：所述提取液以每小时1～10倍树脂床体积的速度流过所述大孔吸附树脂；
所述树脂床体积为所述大孔吸附树脂的填充体积。
上述制备方法，步骤(2)中，用水洗脱可除去无机盐和蛋白、多糖和粘液质等水溶性杂质，可以每小时1～10倍树脂床体积的速度流过所述大孔吸附树脂，与所述提取液流过的速度相同；所述水的用量为3～10倍树脂床体积，具体可为5倍树脂床体积；
用所述乙醇水溶液Ⅰ进行洗脱，可除去皂苷等大极性的杂质，所述乙醇水溶液Ⅰ的体积浓度为10％～50％，用量为3～10倍树脂床体积，具体可用5倍树脂床体积的、体积浓度为40％的乙醇水溶液进行洗脱；
用所述乙醇水溶液Ⅱ进行洗脱，可将所述大孔吸附树脂上吸附的所述贝母素甲洗脱下来，所述乙醇水溶液Ⅱ的体积浓度为30％～80％，具体可为45％～70％、45％～47％、47％～50％、45％、47％或50％；所述乙醇水溶液Ⅱ的用量为3～10倍树脂床体积，具体可为5～10倍树脂床体积、5倍树脂床体积或10倍树脂床体积；
所述树脂床体积为所述大孔吸附树脂的填充体积。
上述制备方法，步骤(3)中，所述洗脱液不发生生物碱的鉴定反应时，停止洗脱；所述生物碱的鉴定反应具体可为碘化铋钾反应。
上述制备方法，步骤(3)中，还包括将所述洗脱液进行减压浓缩和干燥的步骤。
本发明具有如下优点：
本发明贝母素甲的制备方法工艺简单，可得到高纯度(大于90％)的贝母素甲；该工艺过程中所用的树脂、溶剂和洗脱剂均可以重复使用，无需甲醇、氯仿等有毒昂贵溶剂，工艺成本很低，适合工业化生产，可大规模的用于医药领域。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、贝母素甲的制备
(1)提取：以浙贝母的鳞茎1kg为原料，在60℃干燥24小时后，粉碎过20目筛，然后与6L摩尔浓度为0.2mol/L的盐酸的水溶液混合装柱、并浸泡24小时，用0.2mol/L的盐酸水溶液，以3mL/(kg·min)的速度，渗漉至无生物碱反应(碘化铋钾沉淀反应)，收集渗漉液。
(2)大孔吸附树脂除杂、纯化：将上述收集得到的渗漉液以每小时2倍树脂床体积的速度流过D101大孔吸附树脂，所用树脂的重量为浙贝母重量的20％，然后用5倍树脂床体积的蒸馏水以每小时2倍树脂床体积的速度流过树脂，再用5倍树脂床体积的体积浓度为40％的乙醇水溶液以相同速度进行洗脱除杂，最后采用10倍树脂床体积的体积浓度为45％的乙醇水溶液以相同速度流过大孔吸附树脂，将树脂上吸附的贝母素甲洗脱下来，收集该部分洗脱液并浓缩。
(3)中性氧化铝柱纯化：将上述浓缩液上中性氧化铝柱层析，用体积浓度为95％乙醇水溶液除杂，洗脱至无生物碱反应(碘化铋钾沉淀反应)，将洗脱液减压浓缩，干燥后即得到贝母素甲粉末0.31克，按照《中国药典》(2010版274页，浙贝母项下高效液相含量测定方法)方法，以贝母素甲含量为98％的贝母素甲标准品建立标准曲线，测定该贝母素甲粉末的纯度为94％。
实施例2、贝母素甲的制备
(1)提取：以皖贝母的鳞茎1kg为原料，在60℃干燥24小时后，粉碎过20目筛，然后先在8L体积浓度为60％的乙醇的水溶液中浸泡24小时，然后用体积浓度为60％的乙醇水溶液于80℃下加热回流提取3次，第一次用8L体积浓度为60％的乙醇水溶液，回流提取2小时，第二次用6L体积浓度为60％的乙醇水溶液，回流提取2小时，第三次用6L体积浓度为60％的乙醇水溶液，回流提取2小时。过滤后收集并合并提取液。减压浓缩成浸膏，用摩尔浓度为0.2mol/L的盐酸水溶液溶解。
(2)大孔吸附树脂除杂、纯化：将上述溶于盐酸的提取液以每小时2倍树脂床体积的速度流过D101大孔吸附树脂，所用树脂的重量为皖贝母重量的20％，然后用5倍树脂床体积的蒸馏水以相同速度流过树脂，再用5倍树脂床体积的体积浓度为40％的乙醇水溶液以相同速度进行洗脱除杂，最后采用10倍树脂床体积的体积浓度为50％的乙醇水溶液以相同速度流过大孔吸附树脂，将树脂上吸附的贝母素甲洗脱下来，收集该部分洗脱液并浓缩。
(3)中性氧化铝柱纯化：将上述得到的浓缩液上中性氧化铝柱层析，用体积浓度为95％的乙醇水溶液除杂，洗脱至无生物碱反应(碘化铋钾沉淀反应)，洗脱液减压浓缩，干燥后即得到贝母素甲粉末0.35克，按照《中国药典》(2010版274页，浙贝母项下高效液相含量测定方法)方法，以贝母素甲含量为98％的贝母素甲标准品建立标准曲线，测定该贝母素甲粉末的纯度为92％。
实施例3、贝母素甲的制备
(1)提取：以平贝母的鳞茎1kg为原料，在60℃干燥24小时后，粉碎过20目筛，然后与6L摩尔浓度为0.1mol/L的盐酸的水溶液混合装柱，并浸泡24小时，继续用摩尔浓度为0.1mol/L的盐酸水溶液，以3mL/(kg·min)的速度，渗漉提取至无生物碱反应(碘化铋钾沉淀反应)，收集渗漉液。
(2)大孔吸附树脂除杂、纯化：以每小时2倍树脂床体积的速度流过D101大孔吸附树脂，所用树脂的重量为平贝母重量的20％，然后用5倍树脂床体积的蒸馏水以相同速度流过树脂，再用5倍树脂床体积的体积浓度为40％的乙醇水溶液以相同速度进行洗脱除杂，最后采用5倍树脂床体积的体积浓度为47％的乙醇水溶液以相同速度流过大孔吸附树脂，将树脂上吸附的贝母素甲洗脱下来，收集该部分洗脱液并浓缩。
(3)中性氧化铝柱纯化：将上述得到的浓缩液上中性氧化铝柱层析，用体积浓度为95％的乙醇水溶液除杂，洗脱至无生物碱反应(碘化铋钾沉淀反应)，洗脱液减压浓缩，干燥后即得到贝母素甲粉末0.25克，按照《中国药典》(2010版274页，浙贝母项下高效液相含量测定方法)方法，以贝母素甲含量为98％的贝母素甲标准品建立标准曲线，测定该贝母素甲粉末的纯度为91％。
Claims (8)
1.一种贝母素甲的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：用盐酸水溶液渗漉提取或用乙醇回流提取贝母，得提取液；
(2)利用大孔吸附树脂对所述提取液进行分离纯化：依次用水、乙醇水溶液Ⅰ和乙醇水溶液Ⅱ进行洗脱，并收集所述乙醇水溶液Ⅱ的洗脱液，经浓缩得浓缩物；
所述乙醇水溶液Ⅰ是由乙醇和水组成，所述乙醇水溶液Ⅰ中乙醇的体积浓度为10％～50％；
所述乙醇水溶液Ⅱ是由乙醇和水组成，所述乙醇水溶液Ⅱ中乙醇的体积浓度为30％～80％；
(3)利用中性氧化铝柱对所述浓缩物进行纯化：用体积浓度为95％的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液即得所述贝母素甲。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述贝母为浙贝母、皖贝母或平贝母。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取之前还包括将所述贝母进行干燥和粉碎的步骤；
所述干燥的温度为40～60℃，时间为1～72小时；
所述粉碎中所用筛网的目数为10～40目。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述渗漉提取为将所述贝母与所述盐酸水溶液先混合浸泡，浸泡时间小于等于48小时，再用所述盐酸水溶液渗漉，渗漉时间小于等于72小时，收集渗漉液即得所述提取液；
所述浸泡和所述渗漉中，每1kg所述贝母需要3～30L所述盐酸水溶液；
所述盐酸水溶液的摩尔浓度为0.01mol/L～0.5mol/L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乙醇回流提取为先将所述贝母与乙醇水溶液混合浸泡，浸泡时间小于等于24小时，加热回流提取1～3次，每次0.5～4小时，合并提取液即得所述提取液；
所述浸泡和所述加热回流提取中，每1kg所述贝母需要6～10L所述乙醇水溶液；
所述乙醇水溶液的体积浓度为30％～80％；
所述乙醇回流提取还包括将所述提取液进行过滤，减压浓缩，并用摩尔浓度为0.01mol/L～0.5mol/L的盐酸水溶液溶解的步骤。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂、DA201大孔吸附树脂和HPD-100大孔吸附树脂中的任一种；
所述大孔吸附树脂的重量为所述贝母重量的1/2～1/10；
将所述提取液吸附于所述大孔吸附树脂上的步骤为：所述提取液以每小时1～10倍树脂床体积的速度流过所述大孔吸附树脂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述水的用量为3～10倍树脂床体积；
所述乙醇水溶液Ⅰ的用量为3～10倍树脂床体积；
所述乙醇水溶液Ⅱ的用量为3～10倍树脂床体积。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，还包括将所述洗脱液进行减压浓缩和干燥的步骤。
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