CN104523751A - 一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法 - Google Patents

一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，利用体外淋巴细胞培养方式，经过小反刍兽疫的诱导制备抗小反刍兽疫病毒转移因子。本发明是以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素（PHA）和小反刍兽疫诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗小反刍兽疫特异转移因子。这种发明方法不仅操作简便，减小工作强度，而且生产的天然纯生物活性物质可预防本疾病的发生，提高机体的免疫力。

Description

一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法
技术领域
 本发明涉及一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，属于预防兽医学，免疫学领域。
背景技术
小反刍兽疫（pestedes petits ruminants，PPR）俗称羊瘟，又名小反刍兽假性牛瘟（pseudorinderpest）、肺肠炎（pneumoent- eritis）、口炎肺肠炎复合症（stomatitis pneumoenteritis compl- ex），是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征，死亡率高。
转移因子（TF，Transfer Factor）又称传输因子，可以作为细胞免疫促进剂，是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，这种物质将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体的细胞免疫功能；同时促进B淋巴细胞分泌作用，能够诱导免疫细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的抵抗力，这种转移因子分子量小、无毒、活性强、无抗原性、不起过敏反应等优点，对于治疗动物病毒性疾病、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤、真菌性疾病时，可以起辅助治疗作用。
尽管目前已经有一些抗小反刍兽疫的药品和制剂，但由于现有的药品制剂针对性不强，疗效有限，而且治疗性的制剂多是在发病之后才应用的，不能起到根本的治疗作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于：以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1）首先选择健康羔羊，在无菌的条件下采取羊脾脏或羊抗凝血，制成单层淋巴细胞；
2）淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；
3）经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，即制成体外抗小反刍兽疫病毒转移因子。
步骤1）中脾淋巴细胞制备过程中胰酶浓度为0.3-0.35%，pH为7.0-7.5，用量为组织体积量的4-6倍。
步骤3）中促进羊脾细胞或羊血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为100-200mg/L。
本发明提供的体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，采用体外制备方法，减少了生物个体因素的影响，提高了体内制备的特异性、回收率和纯度，这样在临床使用时减少了对机体不必要应激反应，同时起到应有的效应。这种制备方法采用了牛瘟弱毒株作为抗原，不仅可以预防小反刍兽疫也可以防治牛瘟，扩大了抗小反刍兽疫病毒转移因子的使用范围，采用弱毒株作为抗原制备转移因子，不仅因为弱毒株制备容易，来源较多，而且弱毒株免疫原性好，免疫期长，保护率高，安全性高，制备的转移因子出产率高，效能好。
具体实施方式
实施例1
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1） 首先选择健康羔羊，在无菌的条件下采取羊脾脏或羊抗凝血，制成单层淋巴细胞；
2） 淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；
3）经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，即制成体外抗小反刍兽疫病毒转移因子。
步骤1）中脾淋巴细胞制备过程中胰酶浓度为0.3-0.35%，pH为7.0-7.5，用量为组织体积量的4-6倍。
步骤3）中促进羊脾细胞或羊血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为100-200mg/L。
实施例2
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1.选择健康无传染病羔羊，采血部位消毒，用20mL的无菌注射器，心脏采集血液，加入浓度为1mg/mL的肝素钠5mL，制成抗凝血。
2.淋巴细胞分离：抗凝血与淋巴细胞分离液（购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作）按1：1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min，收集中间的白色层；然后用Hanks液反复清洗淋巴细胞3-4次，5000r/min离心15min，收集沉淀，用含25%的胎牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）80mL充分混匀，然后分装于100mL的细胞培养瓶中，置于5% CO2，37℃恒温箱中或者转瓶机中培养，经过2天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层。
3.单层淋巴细胞进行传代培养：首先将长成单层淋巴细胞层用0.3%的胰酶37℃短时间消化，吹打分散，加入pH7.0的Hanks液终止，再洗2-3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% CO2，37℃恒温培养。每天观察一次，长成单层为止。
4.当单层淋巴细胞长成后，更换成含8%犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）的维持液，同时加入浓度为180mg/L的植物血凝素，小反刍兽疫弱毒株800血凝单位每毫升进行诱导培养。经过4天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
5.上清液利用超声波细胞破碎仪（工作状态：3s/3s，300-400W，10 min）破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
6.过滤除菌，分装，4℃保存。
7.成品检验：
多肽含量的测定：用Folin-酚法或分光光度法测定多肽，多肽含量0.75g/L。
蛋白质的测定：采用20%磺基水杨酸方法，提取液没有发生浑浊和沉淀现象，呈阴性，不含蛋白质。
无菌检测：根据《中华人民共和国兽药典2011版》进行检测，没有细菌生长。
核糖含量测定：利用分光光度法测定，含量为0.32 g/L。
外观及pH值测定：黄色澄明液体，酸度值为7.0-7.5之值。
实施例3
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1.选择健康无传染病羔羊，采血部位消毒，用20mL的无菌注射器，静脉取血，加入浓度为1mg/mL的肝素钠5mL，制成抗凝血。
2.淋巴细胞分离：抗凝血与淋巴细胞分离液（购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作）按1：1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min，收集中间的白色层；然后用Hanks液反复清洗淋巴细胞3-4次，5000r/min离心15min，收集沉淀，用含25%的胎牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）80mL充分混匀，然后分装于100mL的细胞培养瓶中，置于5% CO2，37℃恒温箱中或者转瓶机中培养，经过3天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层。
3.单层淋巴细胞进行传代培养：首先将长成单层淋巴细胞层用平H7.2的0.32%的胰酶37℃短时间消化，吹打分散，加入pH7.0的Hanks液终止，再洗2-3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% CO2，37℃恒温培养。每天观察一次，长成单层为止。
4.当单层淋巴细胞长成后，更换成含8%犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）的维持液，同时加入浓度为100mg/L的植物血凝素，牛瘟弱毒株800血凝单位每毫升进行诱导培养。经过3天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
5.上清液利用超声波细胞破碎仪（工作状态：3s/3s，300-400W，10 min）破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
6.过滤除菌，分装，4℃保存。
实施例4
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1.选择健康无传染病羔羊，采血部位消毒，用20mL的无菌注射器，心脏取血，加入浓度为1mg/mL的肝素钠5mL，制成抗凝血。
2.淋巴细胞分离：抗凝血与淋巴细胞分离液（购买北京普利生物有限公司，按使用说明操作）按1：1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min，收集中间的白色层；然后用Hanks液反复清洗淋巴细胞3-4次，5000r/min离心15min，收集沉淀，用含25%的胎牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）80mL充分混匀，然后分装于100mL的细胞培养瓶中，置于5% CO2，37℃恒温箱中或者转瓶机中培养，经过4天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层。
3.单层淋巴细胞进行传代培养：首先将长成单层淋巴细胞层用pH7.0的0.35%的胰酶37℃短时间消化，吹打分散，加入pH7.0的Hanks液终止，再洗2-3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% CO2，37℃恒温培养。每天观察一次，长成单层为止。
4.当单层淋巴细胞长成后，更换成含8%犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）的维持液，同时加入浓度为120mg/L的植物血凝素，牛瘟弱毒株900血凝单位每毫升进行诱导培养。经过2天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
5.上清液利用超声波细胞破碎仪（工作状态：3s/3s，300-400W，10 min）破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
6.过滤除菌，分装，4℃保存。
实施例5
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以脾脏为基础原料，制备单层淋巴细胞，经小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1.选择健康无传染病羔羊，在无菌条件下摘取脾脏，然后用灭菌生理盐水冲洗表面的血液及内脏表面液体，用酒精消毒表面，剔除脏器表面脂肪组织和筋膜，用无菌眼科剪和眼科镊从脾脏内部取部分组织，置于30mL的烧杯中，然后将其剪碎成直径小于0.1cm的块，再用pH7.2的Hanks液清洗3次碎组织中的血液及杂质。尽可能保证组织干净。
2.脾细胞制备：上次碎组织加入4倍量的pH为7.5、浓度为0.34%的胰酶，放入37℃的水浴锅中消化20min，每5min摇动一次，以便组织充分消化，直到组织变成透明，周边发毛为止，说明消化完全，可以取出烧杯，吸取胰酶液，加入预热维持液pH为7.2的Hanks液，用吸管吹打70次充分使组织分散，然后经过滤留取滤液。
3.淋巴细胞培养：采用血球计数板计数，取滤液10ul，稀释100倍，然后显微镜下观察，与血细胞计数规则一样，确定稀释倍数；将用DEME液稀释后的滤液分装于细胞培养瓶中，培养条件：5%CO2、37℃恒温箱上培养，每天观察两次，在显微镜下观察是否形成单层细胞，确定传代培养。
4.传代培养成当单层淋巴细胞后，更换成含8%犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）的维持液，同时加入浓度为160mg/L的植物血凝素，小反刍兽疫弱毒株950血凝单位每毫升进行诱导培养。经过4天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
5.上清液利用超声波细胞破碎仪（工作状态：3s/3s，300-400W，10 min）破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
6.过滤除菌，分装，4℃保存。
实施例6
一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，以脾脏为基础原料，制备单层淋巴细胞，经小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1.选择健康无传染病羔羊，在无菌条件下摘取脾脏，然后用灭菌生理盐水冲洗表面的血液及内脏表面液体，用酒精消毒表面，剔除脏器表面脂肪组织和筋膜，用无菌眼科剪和眼科镊从脾脏内部取部分组织，置于30mL的烧杯中，然后将其剪碎成直径小于0.1cm的块，再用pH7.2的Hanks液清洗3次碎组织中的血液及杂质。尽可能保证组织干净。
2.脾细胞制备：上次碎组织加入4倍量的pH为7.3、浓度为0.33%的胰酶，放入37℃的水浴锅中消化20min，每5min摇动一次，以便组织充分消化，直到组织变成透明，周边发毛为止，说明消化完全，可以取出烧杯，吸取胰酶液，加入预热维持液pH为7.2的Hanks液，用吸管吹打70次充分使组织分散，然后经过滤留取滤液。
3.淋巴细胞培养：采用血球计数板计数，取滤液10ul，稀释100倍，然后显微镜下观察，与血细胞计数规则一样，确定稀释倍数；将用DEME液稀释后的滤液分装于细胞培养瓶中，培养条件：5%CO2、37℃恒温箱上培养，每天观察两次，在显微镜下观察是否形成单层细胞，确定传代培养。
4.传代培养成当单层淋巴细胞后，更换成含8%犊牛血清DMEM（购买Invitrogen Corporation，按使用说明操作）的维持液，同时加入浓度为140mg/L的植物血凝素，牛瘟弱毒株800血凝单位每毫升进行诱导培养。经过4天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液。
5.上清液利用超声波细胞破碎仪（工作状态：3s/3s，300-400W，10 min）破碎后，离心取上清，经0.22um滤膜过滤，收集滤液，即为小反刍兽疫转移因子提取液。
6.过滤除菌，分装，4℃保存。
实验例
动物保护试验
取90只断奶羔羊健康羊，随机分成对照、试验、空白三组，每组30只，在新环境中适应三天，自由采食，攻毒剂量为2.0*108CFU/只，攻毒后第三天试验组开始接种实施例2制备的抗小反刍兽疫病毒转移因子，每只肌注0.5ml/只，每天一次，对照组注射生理盐，空白全程生理盐水，观察临床症状和死亡率作为指标反应本品的临床应用效果。结果显示：对照组发病率100%和死亡率100%，空白组没有变化，试验组发病率35%，而死亡率3%。
动物安全试验
取健康小白鼠120只，随机分成空白、注射组、口服三组，每组30只，空白口服和注射蒸馏水10ml/只，注射组注射实施例2制备的抗小反刍兽疫病毒转移因子10ml/只，口服组灌服本品10 ml/只，观察小白鼠的变化。结果显示三组都无异常变化。说明本品安全，无不良反应。
皮肤刺激性试验
取30只小白兔，分成对照、皮下注射、皮内注射3组，采用脱毛剂对家兔脊柱两侧被毛脱去，保证皮肤的完整性，然后注射实施例2制备的抗小反刍兽疫病毒转移因子1 ml/只，对照组注射生理盐水，分成单次给药、多次给药观察皮肤的变化。结果显示，注射生理盐水的10只中，有6只发生红肿，一天消肿，试验组中各有2只发生，10小时内全部消肿。
通过以上实验例总结，我们可以得到本发明所提取的抗小反刍兽疫病毒转移因子不仅能安全高效的抑制小反刍兽疫，还能够保护正常机体细胞免受小反刍兽疫的感染，提高机体的免疫力。本品的体外制备方法是可行的，产品可以起到预防本病的作用，同时也可以预防牛瘟疾病的发生，在临床上应广泛推广。

Claims (3)

1.一种体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于：以羊脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，从而获得体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子，具体步骤如下：
1）首先选择健康羔羊，在无菌的条件下采取羊脾脏或羊抗凝血，制成单层淋巴细胞；
2）淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用；
3）经牛瘟弱毒株或小反刍兽疫弱毒株和植物血凝素诱导培养单层淋巴细胞，即制成体外抗小反刍兽疫病毒转移因子。
2.根据权利要求1所述的体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于：步骤1）中脾淋巴细胞制备过程中胰酶浓度为0.3-0.35%，pH为7.0-7.5，用量为组织体积量的4-6倍。
3.根据权利要求1所述的体外制备抗小反刍兽疫病毒转移因子的方法，其特征在于：步骤3）中促进羊脾细胞或羊血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为100-200mg/L。
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