CN114853870A - 一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法及注射液 - Google Patents
一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法及注射液 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，包括以下步骤：采集新鲜羊血，抗凝处理后，进行细胞沉降、分离；收集淋巴细胞层，并对收集的淋巴细胞用Hank's液稀释，制备淋巴细胞种子悬液备用；将淋巴细胞种子悬液进行细胞悬浮培养，得到淋巴细胞液；将淋巴细胞液进行细胞破碎，破碎后的细胞分别用微孔滤膜和超滤膜进行过滤和超滤，超滤液为所获取的转移因子溶液；本发明还提供了一种注射液，即将转移因子溶液进行无菌过滤，然后加入甘露醇和生理盐水配制成注射液。本发明以羊白细胞为培养基质，采用细胞悬浮培养工艺进行扩大培养，制备的转移因子溶液即注射液可以适合大规模生产，极大的提高其产量。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法及注射液。
背景技术
转移因子(Transfer factor，TF)是由动物蛋白细胞中具有免疫获悉的T淋巴细胞所释放的一类小分子可透析物质，可溶于水，能诱导机体免疫细胞活化，增强机体免疫力，对于细胞免疫功能与体液免疫功能的增高和低下具有双向免疫调节作用，具有无毒性、无抗原性、无过敏性、无热源性、无种属特异性的特点，其活性不被胰蛋白酶、核糖核酸酶所破坏。转移因子具有使用安全、作用迅速、无抗原性同时作为免疫激发剂和辅助制剂可显著提高对动物疾病的预防和控制效果，临床上既能口服也能注射应用。
细胞悬浮培养技术主要是以人工培养为基础，并将动物细胞放置在反应器中对其进行大规模以及高效率的培养，用于生物制品生产的技术。随着细胞培养技术的不断发展，这种细胞悬浮培养技术已能用于病毒大规模的培养，并在国外疫苗生产中普遍被应用。由于该生产工艺具有生产效率比高、质量与生物安全易控制等优点，细胞悬浮培养被广泛应用于蛋白质相关药物研发、疫苗生产、干细胞移植及人造组织器官培养等各个领域。
目前市场上兽用生物制品领域的转移因子产品多为口服液、注射液，常用的制备方法是将动物脾脏进行绞碎、破坏细胞结构使胞内转移因子释放到浆液中，再将浆液中的转移因子进行分离精制最终得到转移因子产品。其中的反复冻融法和透析法是实现对转移因子的分离纯化的主要步骤。上述两类方法操作简单，但生产周期长，操作费用高，劳动强度大，生物安全不易控制，且TF提取率不高，难以进行工业化规模和批量地生产。
在兽用生物制品领域，转移因子实际的生产中，多采用猪脾脏作为制备转移因子的原材料。用脾脏作为原料进行转移因子制备，转移因子的质量受动物机体本身的健康状况影响。此外还要考虑采集的脾脏是否带有外源微生物的感染，具有一定的风险性。因此有必要开发一种转移因子(TF)的制备新方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，弥补了现有转移因子常采用脾脏作为原料制备技术的不足，此外，该方法采用悬浮细胞培养技术，将羊外周淋巴血淋巴细胞通过分离并进行体外悬浮培养，能够实现缩短生产周期，提高转移因子纯度，以及进行规模化和批量生产。
本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：采集新鲜羊血，抗凝处理后，进行细胞沉降、分离；收集淋巴细胞层，并对收集的淋巴细胞用Hank's液稀释，制备淋巴细胞种子悬液备用；
步骤2：将淋巴细胞种子悬液进行细胞悬浮培养，得到淋巴细胞液；
步骤3：将淋巴细胞液进行细胞破碎，破碎后的细胞分别用微孔滤膜和超滤膜进行过滤和超滤，超滤液为所获取的转移因子溶液。
进一步地，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
进一步地，所述超滤膜的截留分子量为5000道尔顿。超滤膜的作用是进行对提取的转移因子溶液进行超滤浓缩。
进一步地，步骤1所述淋巴细胞种子悬液的中淋巴细胞密度为2.5x104个/ml。
进一步地，所述细胞悬浮培养采用细胞生物反应器。
进一步地，所述细胞悬浮培养的培养温度为37℃，培养基pH值为7.2～7.5，培养转速为20rmp，培养时间为24小时。
本发明还提供了上述羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法所制备转移因子溶液配制的注射液。
进一步地，将步骤3所得转移因子溶液进行无菌过滤，然后加入甘露醇和生理盐水配制成注射液。
进一步地，所述注射液中的多肽含量不低于1.5mg/ml，核糖含量不低于45ug/ml。
本发明采用羊血作为转移因子制备的原料而非其它动物血液，原因是首先羊血的采集量比较大，每头成年健康羊可以采集1-3L的血液原液，相较于牛、马等大体型动物，来源相对丰富。其次是羊的静脉位于颈部皮下，且血管较粗，采集血液相较于猪等皮下脂肪较厚的动物，更容易采集到血液。因此，我们选用了羊血替代现有的利用脾脏制备转移因子工艺，该新的制备转移因子方法获得的转移因子，经体内体外试验均证实安全有效。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明提供了一种能高效生产转移因子的制备方法，该制备方法以羊白细胞为培养基质，采用细胞悬浮培养工艺进行扩大培养，培养条件和质量可控，制备的淋巴细胞可以实现批量化培养，由培养的淋巴细胞提取转移因子可以极大的提高产量，提取的淋巴因子溶液可作为多种制剂制备的原料，推广应用范围广。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。
实施例1
一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：淋巴细胞种子悬液的制备：
(1)新鲜羊血的采集：供体羊应符合现行《中华人民共和国兽药典》关于生产、检验用动物标准。羊消毒后，将采血针插入羊颈静脉，无菌采血至采血瓶内，采血量为300～500毫升，采血瓶内提前放入已灭菌的3.8％枸橼酸钠抗凝剂100毫升，可以得到抗凝血。
(2)细胞沉降、分离：在上述抗凝血中加入抗凝血1倍体积的生理盐水混匀后，分装到各个分液漏斗(1L)中，于超净工作台上自然沉降24小时。24小时后扳开分液漏斗开关去除分液漏斗最底层的红细胞。
(3)淋巴细胞种子悬液制备：收集淋巴细胞层，并取样用Hank's液稀释，进行细胞计数。根据细胞计数结果，将淋巴细胞制成2.5x104个/ml的淋巴细胞种子悬液，2℃～8℃保存备用。
步骤2：将淋巴细胞种子悬液进行细胞悬浮培养，得到淋巴细胞液。具体方法包括：
1、生产用细胞培养基制备：
细胞培养基成分由Hank's缓冲液和水乳解蛋白培养基两部分组成。使用前单独配制，每1000毫升生产用细胞培养基包含500毫升灭菌后的Hank's缓冲液和500毫升过滤除菌的水乳解蛋白培养基，具体配制方法如下：
水解乳蛋白培养基：精确称取十二水合磷酸氢二钠0.18g、磷酸二氢钾0.08g、无水葡萄糖1.2g、水解乳蛋白5.5g、青霉素0.25g、链霉素0.25g，溶于500ml去去离子水中，经0.22um滤器滤过除菌后于2～8℃保存备用。
2、生产用细胞生物反应器灭菌：
将细胞生物反应器上的过滤器用蒸汽消毒30分钟后，采用蒸汽对生物反应器及其管道消毒30分钟。打开反应器的投料口投入灭菌的Hank's液，并接pH电极和溶氧电极。从辅料接口接入上述制备的灭菌的水解乳蛋白培养基，并调节pH值至7.2～7.5范围内。
3、细胞接种和培养条件确定：
本发明在利用悬浮细胞培养提取的羊白细胞过程中，由于白细胞并不是由成熟的细胞系培育而来，其体外培养和体内生长的条件和营养需求存在一定的差异，导致在前期的细胞培养中，出现细胞死亡、聚团等问题。后期通过调节培养温度、转速、培养基的pH值以及细胞密度，最终使细胞可以实现悬浮培养。
由于细胞培养的主要影响因素是培养温度、培养基pH值和培养的转速，我们在细胞培养条件的确定中，对影响细胞培养的几个关键因素进行了试验，具体试验结果如下：
表1细胞培养温度对细胞生长的影响
表2细胞培养基pH值对细胞生长的影响
表3细胞培养转速对细胞生长的影响
分析与结论：
由于细胞培养适宜条件的确定，最终体现在细胞生长速度和数量。因此，根据表1至表3细胞培养结果，通过对细胞培养条件的试验，因此，最佳的培养条件为：培养温度为37℃，培养基pH值为7.2，培养转速为20rmp，培养时间为24小时。
按照以上确定的最适宜培养条件，我们将淋巴细胞种子悬液通过接种口无菌接入生物反应器中。生物反应器中通入5％二氧化碳，于37℃、20rmp条件下，培养24小时。
步骤3：将淋巴细胞液进行细胞破碎，破碎后的细胞分别用微孔滤膜和超滤膜进行过滤和超滤，超滤液为所获取的转移因子溶液。具体步骤包括：
收集步骤2中培养的淋巴细胞液，将收集到的淋巴细胞用超声波破碎仪破碎40分钟或者连续两次通过高压匀浆机进行细胞破碎。破碎后的细胞先用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤，超滤获得的液体即为转移因子溶液。
实施例2
一种转移因子注射液，将实施例1所得转移因子溶液(采用最佳培养条件进行培养后所得)，采用0.22μm的滤芯将收集的转移因子溶液进行无菌过滤。然后加入甘露醇和生理盐水，甘露醇：生理盐水：转移因子溶液按照体积比2:2:6配制成多肽含量不低于1.5mg/ml，核糖含量应不低于45ug/ml的转移因子溶液注射液。
实施例3
1、转移因子注射液质量标准检测
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。按《兽药质量标准生物制品卷》2017年版转移因子口服液质量标准中多肽含量测定方法进行测定，我们对制备的3批转移因子注射液，与3批对照品(购买自青岛易邦生物工程有限公司猪脾脏转移因子注射液)进行了多肽含量测定，本发明制备的转移因子多肽含量每毫升多不低于1.5mg，符合兽药质量标准的要求，且多肽含量高于对照品(结果见表4)。
表4本发明方法制备的转移因子口服液与商品化猪脾转移因子注射液多肽含量的检测对比
按《兽药质量标准生物制品卷》2017年版转移因子注射液质量标准中核糖含量测定方法进行测定，对制备的3批转移因子注射液进行与3批对照品(购买自青岛易邦生物工程有限公司猪脾脏转移因子注射液)进行了核糖含量测，结果显示3批自制的转移因子注射液每毫升核糖含量不低于45ug，高于兽药质量标准的要求(结果见表5)，且蛋白质反应呈阴性反应。
表5本发明方法制备的转移因子口服液与商品化猪脾转移因子注射液多肽含量的检测对比
2、制备的成品转移因子注射液安全性检验
(1)用鸡检验
7日龄SPF雏鸡20只，随机分成两组，每组10只。试验组按照1ml/只鸡的给药剂量(即5倍的正常使用剂量)，于颈部皮下注射转移因子注射液，对照组按照1ml/只鸡注射0.85％(m/v)生理盐水，连用2日，自第1日注射开始，连续观察14日，鸡群无不良反应。
(2)用猪检验
25～35日龄健康仔猪10头，随机分成2组，每组5头。试验组按照6ml/头猪的给药剂量(即3倍的正常使用剂量)，于颈部注射移因子注射液，对照组按照6m1/头猪注射0.85％(m/v)生理盐水，连用2日，自第1日注射开始，连续观察14目，猪只无不良反应。
3、制备的成品转移因子注射液效力检验
本发明采用免疫法检验对制备的移因子注射液与商品化猪脾转移因子注射液效力对比实验，试验方案如下：
21～28日龄SPF雏鸡30只，随机分成3组，每组10只。试验鸡按1羽份/只的剂量点眼免疫50ul鸡新城疫活疫苗(Clone30株)。具体试验分组如下：
试验组1在免疫疫苗的同时按照0.2ml/只鸡的给正常使用剂量注射本发明所述制备的转移因子注射液；
试验组2在免疫疫苗的同时按照使用说明书注射青岛易邦生物工程有限公司生产的的猪脾转移因子注射液；
对照组在免疫疫苗的同时按照0.2m1/只鸡注射0.85％(m/v)生理盐水。
所有试验鸡在疫苗免疫后第21日采集鸡外周血并分离血清，进行鸡新城疫HI抗体检测，试验结果参见表6。
表6转移因子注射液效力对比试验结果
试验结果分析与结论：
试验组1和试验组2鸡新城疫HI抗体几何平均值分别比对照组鸡新城疫HI抗体几何平均值高1.51og2和0.81og2。说明注射转移因子注射液组的鸡只可以明显增强疫苗的免疫效果，提高鸡只免疫力。
4、转移因子溶液超滤浓缩试验
转移因子是由免疫活性的T淋巴细胞分泌产生的一类可以透析的多肽与多核苷酸复合物，分子量小于10000道尔顿。为了更好的得到纯度高、杂质少以及生物学活性高的小分子多肽，用不同截留分子量的超滤膜进行超滤，并对得到的转移因子进行了检验，比较不同截留分子量的转移因子的生物学活性。具体检验方法如下：
制备4种转移因子注射液A、B、C、D，制备方法同实施例2，4种转移因子注射液其余条件相同，不同之处在于超滤膜选用。
转移因子注射液A：截留分子5000道尔顿超滤膜超滤浓缩制备；
转移因子注射液B：截留分子7000道尔顿超滤膜超滤浓缩制备；
转移因子注射液C：截留分子10000道尔顿超滤膜超滤浓缩制备；
转移因子注射液D：未经过超滤膜超滤浓缩制备；
对以上试验组，进行转移因子注射液的效力比对试验，试验方案如下：
21～28日龄SPF雏鸡40只，随机分成4组，每组10只。试验鸡按1羽份/只的剂量点眼免疫50ul鸡新城疫活疫苗(Clone30株)。具体试验分组如下：
试验组1在免疫疫苗的同时按照0.2ml/只鸡的给正常使用剂量注射制备的转移因子注射液A；
试验组2在免疫疫苗的同时按照0.2ml/只鸡的给正常使用剂量注射制备的转移因子注射液B；
试验组3在免疫疫苗的同时按照0.2ml/只鸡的给正常使用剂量注射制备的转移因子注射液C；
试验组4在免疫疫苗的同时按照0.2ml/只鸡的给正常使用剂量注射制备的转移因子注射液D；
所有试验鸡在疫苗免疫后第21日采集鸡外周血并分离血清，进行鸡新城疫HI抗体检测，试验结果参见表7。
表7不同截留分子量的转移因子注射液效力对比试验结果
结果显示截留分子量为5000道尔顿的超滤膜超滤得到的转移因子生物学活性最高。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (9)
1.一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采集新鲜羊血，抗凝处理后，进行细胞沉降、分离；收集淋巴细胞层，并对收集的淋巴细胞用Hank's液稀释，制备淋巴细胞种子悬液备用；
步骤2：将淋巴细胞种子悬液进行细胞悬浮培养，得到淋巴细胞液；
步骤3：将淋巴细胞液进行细胞破碎，破碎后的细胞分别用微孔滤膜和超滤膜进行过滤和超滤，超滤液为所获取的转移因子溶液。
2.根据权利要求1所述的一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
3.根据权利要求1所述的一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为5000道尔顿。
4.根据权利要求1所述的一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，其特征在于，步骤1所述淋巴细胞种子悬液的中淋巴细胞密度为2.5x104个/ml。
5.根据权利要求1所述的一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，其特征在于，所述细胞悬浮培养采用细胞生物反应器。
6.根据权利要求5所述的一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法，其特征在于，所述细胞悬浮培养的培养温度为37℃，培养基pH值为7.2～7.5，培养转速为20rmp，培养时间为24小时。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种羊外周血淋巴细胞转移因子溶液的制备方法所制备转移因子溶液配制的注射液。
8.根据权利要求7所述的一种注射液，其特征在于，将步骤3所得转移因子溶液进行无菌过滤，然后加入甘露醇和生理盐水配制成注射液。
9.根据权利要求8所述的一种注射液，其特征在于，所述注射液中的多肽含量不低于1.5mg/ml，核糖含量不低于45ug/ml。
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| CN110339211A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-10-18 | 商丘美兰生物工程有限公司 | 一种快速生产转移因子的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 孔庆波等: "犬、猪转移因子对犬淋巴细胞体外转化增殖影响的比较研究", 《畜牧兽医科学》, vol. 21, no. 6, pages 26 - 62 * |
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