CN104507462A - 抑制黑色素生物合成的混合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的混合物，其用作化妆品和/或药物，并且特别用于抑制黑色素生物合成，并且本发明涉及包含所述混合物的化妆品制剂和/或药物制剂，其用于治疗色素沉着过度的皮肤损害例如但不限于日光斑、老人斑、黑斑病和黄褐斑，用于使得皮肤颜色均匀，用于对抗自由基形成以及用于对抗或预防皮肤老化体征例如皱纹和皮肤色调缺乏，并且通常用于改善皮肤审美条件。

Description

抑制黑色素生物合成的混合物

说明书

发明领域

本发明涉及化妆品和药物工业技术领域，并且特别的是，本发明涉及抑制黑色素生物合成的混合物。

技术水平

已知黑色素是最有助于确定人皮肤的色素沉着的物质。实际上，通常所说的黑色素或黑素是生物学上出现的黑色、棕色或淡红色色素，其赋予皮肤特征性颜色。

黑色素是由黑色素细胞产生的，黑色素细胞是存在于表皮基底层的特别的细胞。基本上，当黑色素细胞暴露于光并且特别是紫外辐射时，其通过生物化学过程产生黑色素。

相当复杂的黑色素生物合成过程产生自氨基酸酪氨酸的氧化，酪氨酸是黑色素的前体。

尽管黑色素在生物体中起重要作用，但是病例不是罕见的，其中包括一些因素引起的不希望的皮肤色素沉着过度，所述因素性质上可以是内源性或外源性的，例如衰老，疾病例如皮肤疾病或者日光暴露引起的皮肤斑。

因此，在这些病例和其它病例中，存在控制黑色素生物合成，并且特别是降低其生物合成或者其它的需求，以获得对皮肤的脱色素作用。

在这方面，现有技术已经提供了几个化合物，其主要是但不仅仅是基于抑制酪氨酸酶的酶活性的能力，所述酶与氧合作，以使得酪氨酸氧化为多巴醌。具有脱色素活性的其它化合物促进酪氨酸酶的蛋白质降解，然而再其它的抑制酪氨酸酶形成。

对于酪氨酸，据说其氧化在黑色素生物合成中是关键且起决定性的步骤，因为随后的步骤在人体中自然地发生。

抑制酪氨酸酶的酶活性的方法通常是基于多种黑色素合成中间体的氧化过程的直接抑制，并且其主要在于通过典型地竞争型机制而抑制其催化能力。

已知的酪氨酸酶抑制剂化合物属于多酚，其包括黄酮醇、黄酮、二氢黄酮、异黄酮醇、查耳酮、香豆素，以及曲酸、光甘草定(glabridin)，以及通常是甘草衍生物。

文献WO 2007/077260描述了当与多种其它物质联用时，二苯基甲烷及其衍生物的脱色素活性，所述多种其它物质的脱色素和UV辐射保护活性是已知的。

然而，现有技术中已知的最有效的脱色素物质是氢醌。氢醌通过细胞毒型机制起作用，尽管其作用同时引起黑色体生长的抑制，并且其还抑制多巴醌和二氧基苯基丙氨酸的形成，所述的二氧基苯基丙氨酸是酪氨酸经酶酪氨酸酶氧化得到的另一种化合物。

然而，氢醌的作用总是与潜在的高毒性和细胞毒性相关，这致使其在多个国家的化妆品领域禁止使用，所述国家包括欧盟、日本和南非。

此外，在一些欧洲国家包括意大利，其用途也已经在制药领域禁止。

因此，现有技术描述了能抑制皮肤色素黑色素产生的几个化合物，然而，需要解决其一直不令人满意的功效和具有不希望的副作用的风险或者甚至毒性和细胞毒性作用，高效(即能提供显著脱色素作用)的脱色素物质是需要的，所述物质的脱色素作用比已知物质更强，并且能降低或者甚至消除不希望的副作用，以及并且特别是毒性和细胞毒性作用。

发明概述

本发明潜在的技术问题是对于现有技术，提供能克服所述缺点并具有上述特征的脱色素产品。

根据本发明，所述问题已经通过包含乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的混合物解决，所述混合物用作化妆品和/或药物，特别是用于抑制黑色素生物合成。

有利的是，在完整组织的情况和受损组织的情况中，本发明的混合物均可以通过外部施用例如通过应用于皮肤或粘膜或者通过皮下注射而用于化妆品用途或药物用途。

有利的是，本发明的混合物在控制皮肤色素黑色素产生方面，可以用于预防、改善或治疗目的，特别是用于降低旨在作为真黑色素和褐黑素产生的黑色素产生，例如用于治疗黑色素沉着过度的皮肤损害，例如但不限于病理性、炎性或传染性的损害，用于预防和/或抵抗皮肤衰老体征，所述体征特别表现为肤色均匀度的变化、皱纹和皮肤色调(skin tone)的丧失，并且用于治疗暴露于UV辐射引起的皮肤太阳斑。

本发明令人惊奇地表明：当乙酰基葡糖胺与二苯基甲烷衍生物4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇组合时，其能发挥对黑色素生物合成的显著抑制作用，所述作用比所述两种活性成分单独使用时的作用显著更高。

特别地，本发明的混合物已经显示了乙酰基葡糖胺与4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的组合不但比上述化合物各自单独显示的作用显著更有效，而且其作用甚至与现有技术已知的最有效的脱色素物质氢醌的作用相当，并且如在用于对抗皮肤色素形成过程的剂量评价的，其未显示可察觉水平的细胞毒性。

优选地，基于混合物的总重量，本混合物包含重量浓度范围为0.05％至90％，更优选0.5％至10％，甚至更优选2％至5％的乙酰基葡糖胺。

优选地，基于混合物的总重量，本混合物包含重量浓度范围为0.05％至90％，更优选0.1％至5.0％，甚至更优选0.5％至2％的4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇。

还根据本发明，令人惊讶地发现：除了上述活性成分乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇之外，当亚油酸乙酯存在时，本混合物的作用进一步增强。

优选地，基于混合物的总重量，亚油酸乙酯以重量浓度范围0.1％至35％，更优选0.23％至20％，甚至更优选2％至15％存在于本发明的混合物中。

根据上述并还根据本发明，本混合物用于制备用于黑色素生物合成抑制治疗的化妆品制剂和/或药物制剂，并且更通常地，本混合物用于制备用于抑制黑色素生物合成的化妆品和/或药物。

因此，本发明还提供了包含上述混合物和生理学可接受的介质或载体的化妆品制剂和/或药物制剂，所述制剂特别用于抑制黑色素生物合成。

文中，术语混合物旨在表示在有或无亚油酸乙酯的条件下，上述活性成分乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的任何物理-化学、固体、液体或气体形式例如混合物、溶液、分散物、乳液、混悬液、气雾剂、溶胶、凝胶、泡沫形式的组合。

文中，术语制剂旨在表示适合于本混合物通过体外或皮下途径施用的任何产品，例如通常用于化妆品和或药理学的油膏剂、乳膏剂、软膏剂、糊剂、凝胶剂、乳状物、洗剂、喷雾剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、肥皂剂(soap)和类似形式。

当考虑下文一些优选但不是唯一的实施方案的详细描述，本发明进一步的特征和优点将变得更显而易见，提供所述实施方案是用于解释，并不是限制目的。

发明详述

本发明的混合物包含作为活性成分的乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇(也称作4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇或4-(1-苯基乙基)苯-1,3-二醇或4-(1-苯基乙基)间苯二酚或者4-(α-甲基苄基)间苯二酚)，其用于化妆品用途和/或作为药物，特别是用于抑制黑色素生物合成。

乙酰基葡糖胺是乙酰胺化的葡糖胺，其是能阻止酶酪氨酸酶糖基化，从而抑制所述酶成熟的氨基糖(酪氨酸酶是糖蛋白，其需要糖基化，以便活化)。

4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇是二苯基甲烷的衍生物，能用作酪氨酸酶催化活性的直接抑制剂，并且能同时用作氧化过程中优先于酪氨酸的底物(还关于酪氨酸酶)。4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的特征特别在于抗氧化剂和自由基清除活性，这也是乙酰基葡糖胺所显示的特征，并且由此，如同乙酰基葡糖胺，其在更广泛意义上，可用于对抗光-诱导的和衰老引起(chronological)的皮肤老化。

令人惊讶的是，本发明已经说明上述化合物的组合应用显示了很大的协同作用，并且提供在无细胞毒性水平要实现的对黑色素生物合成的显著抑制作用。

不希望受任何科学理论或论证的束缚，认为：乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇组合应用提供了通过协同作用机制控制黑色素生物合成过程，其中乙酰基葡糖胺抑制了酪氨酸酶糖基化过程，从而抑制了活性形式的该酶的生物利用度，同时4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇用于阻止其催化活性。

特别地，得到的乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇组合所示的试验数据可以获得高脱色素作用，所述作用比这些化合物各自单独使用时获得的作用更大。

根据上述预期，认为协同作用是通过两种化合物在调节黑色素生物合成过程的不同作用机制测定的。

特别地，认为乙酰基葡糖胺主要通过抑制酪氨酸酶糖基化，从而抑制酶的成熟，由此能降低其糖基化的活性形式的生物利用度而起作用，而认为4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇用作酶活性抑制剂并且由此用作酪氨酸酶催化活性抑制剂。

两种机制引起黑色素生物合成抑制，这不应考虑为两种化合物内在活性的简单总和，而应考虑为通过同步生化机制可能获得的作用，所述同步生化机制致使黑色素细胞产生的黑色素预料不到的显著降低。

事实上，已经显示当以25μg/mL、50μg/mL和75μg/mL的不同浓度试验时，单独使用乙酰基葡糖胺不能引起黑色素生物合成可察觉的降低，基于前面所述的三种浓度，其显示平均8％的降低。

相反，当以10μg/mL的浓度使用4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇时，其引起黑色素生物合成约50％的百分数降低。

令人惊讶的是，当将两种化合物乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇组合，并且分别以75μg/mL和10μg/mL的浓度一起使用时，在黑色素生物合成的抑制方面，可以将黑色素生成过程降低至多72％，其相应于与单独使用4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇相比的约44％的增加，并且相应于与4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇和乙酰基葡糖胺混合物相比的约25％的增加。

还根据本发明，已令人惊讶地显示当本混合物还包含亚油酸乙酯时，黑色素生物合成的抑制还显著增强。

特别地，已经显示除了上述浓度的乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇之外，还包含50μg/mL浓度的亚油酸乙酯的混合物引起黑色素生物合成抑制接近于82％，如关于相对于乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的组合分别以上述浓度即75μg/mL和10μg/mL提供的黑色素生物合成抑制能力计算，其具有约15％的黑色素生物合成抑制活性的增加。

因此，因为已经特别显示仅与4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇组合的亚油酸乙酯分别以50μg/mL和10μg/mL的浓度使用时，引起黑色素生物合成被抑制约50％，结果与上述4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的50％的百分数相当，那么，可以将上述化合物亚油酸乙酯考虑为本发明混合物的特别的协同剂。

此外，当亚油酸乙酯与单独的乙酰基葡糖胺组合，分别以50μg/mL和75μg/mL浓度使用时，将黑色素生物合成抑制约15％。

因此，根据本发明并且根据所报道的试验数据，已经显示当本混合物主要包含乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇时，可以实现对黑色素生成抑制能力的令人惊讶的增加，其比仅使用4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇获得的抑制增加约44％，并且与两种组分单独使用获得的抑制作用的总和相比，也还具有显著性，如果计算关于单独使用乙酰基葡糖胺获得的抑制，所述增加甚至是更大的，并且，当使用还含有亚油酸乙酯的本发明的混合物时，黑色素抑制的相对增加还进一步令人惊讶地增强，当单独使用时，亚油酸乙酯抑制黑色素合成的能力比包含相同亚油酸乙酯的本发明混合物的能力显著更低。

所有的组合物已经显示是无细胞毒性的。

根据下文所述的相同方法，当在无细胞毒浓度诱导时，氢醌抑制黑色素生物合成的能力是约40％。

因此，可以假定特异性协同作用机制，其中乙酰基葡糖胺引起糖基化的酪氨酸酶减少，从而活性-酪氨酸酶减少，并且同时促进蛋白酶体消化，这已经被亚油酸乙酯刺激。在所述情况下，还存在4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇对酪氨酸酶(其还是活性的和生物可用的)催化活性的抑制作用。

试验数据也支持的所述作用机制可以通过下述流程图表示。

试验部分

为了评价本混合物的黑色素生物合成的抑制，使用由称为B16的鼠黑色素瘤的次级培养物组成的体外试验模型。所述细胞株由具有成纤维样形态的细胞构成，其产生黑色素(来源：European Collection of Cell Cultures，ECACC)。

样品制备

对于该试验，将活性成分粉末以10％(w/w)溶解于乙醇和丙二醇(1:1)中，随后在高葡萄糖培养基DMEM+10％补充有抗生素(青霉素2000IU/mL、链霉素1000IU/mL、庆大霉素10mg/mL)的FBS中稀释至终浓度：

A)4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇：10μg/mL；

B)乙酰基葡糖胺：25μg/mL，50μg/mL，75μg/mL；

C)亚油酸乙酯：50μg/mL；

D)浓度为10μg/mL的4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇和浓度为75μg/mL的乙酰基葡糖胺；

E)浓度为10μg/mL的4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇，浓度为75μg/mL的乙酰基葡糖胺和浓度为75μg/mL的亚油酸乙酯。

F)浓度为5μg/mL的氢醌(无细胞毒浓度)

处理和暴露

在30代，将上述细胞以80,000细胞/孔的浓度接种于6-孔板上24小时。然后，加入包含上述样品的新鲜培养基。将未处理的细胞用作阴性对照，而将以5μg/mL的无细胞毒浓度的氢醌处理的细胞用作阳性对照，如上所示，在点F)。

将各样品一式两份进行试验。

暴露72小时后，将黑色素和细胞内蛋白质定量。

黑色素剂量

将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，然后用NaOH 0.1N裂解。将裂解液在60℃加热1小时，以使得黑色素溶解。

为了评价细胞裂解物中黑色素的量，用装配盘式读数器的比色计(Tecan Sunrise Remote Model)，在405nm波长处，读取分光光度计读数。

制备15-500μg/mL滴定的黑色素标准曲线。

测量总蛋白质

根据Bradford方法(Bradford M.，1975)进行蛋白质定量。在处理结束时，将细胞用无菌PBS在4℃洗涤两次，并且通过用400μL纯水在4℃处理15’而裂解。

将100μL染色剂5X加入到裂解物中。然后，以类似方式，以20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL和100μg/mL滴定而制备白蛋白的标准曲线。然后，一式三份，将200μL各样品、对照和标准品转移至96-孔板上。

用装配盘式读数器的比色计(Tecan，Sunrise)，在595nm处，读取读数。

数据解释

为了定量蛋白质和黑色素含量，构建白蛋白和黑色素的标准校正曲线，并且利用曲线拟合公式和相应的吸光度，计算样品中白蛋白和黑色素的浓度。

然后，计算各数据的平均值，并且对于每份样品，与阴性对照相比较，计算黑色素减少的百分数：

本发明的制剂实施例

制剂1：基于4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇和乙酰基葡糖胺用于局部使用的药用乳剂：

将包含2％重量的硬脂醇聚醚2、3％重量的硬脂醇聚醚21、10％重量的Ppg-15硬脂酰基醚、5％重量的硬脂酸、0.01％重量的(BHT)和2.50％重量的4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的混合物(所述的相A)加热至80℃。在所述的相A中加入加热至75℃的适量的水和防腐剂；最后，在产生的混合物中加入相B，相B由包含加热至40℃的5％重量的乙酰基葡糖胺和5％重量的乙醇的混合物构成，以得到制剂1。

制剂2.基于4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇、亚油酸乙酯和乙酰基葡糖胺的用于局部使用的乳剂：

用与制剂1类似的方式制备制剂2，除了相A还包含10％重量的亚油酸乙酯。

因此，根据本发明，利用适当的介质或载体，取决于所需的作用和用于将其应用至皮肤的化学-物理形式，可以将本混合物(以文中所述的不同组合以及以上述的不同重量比包含上述化合物)用于制备预期用于控制黑色素产生并且适合于治疗色素沉着过度损害(例如日光斑(lentigo solaris)、老人斑(age spots)、黑斑病(melasma)和黄褐斑(chloasma))的化妆品和/或药物制剂，其用于提供均匀肤色、用于对抗自由基形成，和用于对抗或预防皮肤老化体征例如皱纹和皮肤色调缺乏，并且通常用于改善皮肤审美条件。

在以上描述的过程中已经变得显而易见的本发明的优点可以通过以下概括：提供用作化妆品和/或药物并且特别是用于抑制黑色素生物合成的包含乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的混合物，以及含有本混合物的相应的化妆品和/或药物制剂，所述制剂用于治疗皮肤色素沉着过度的损害例如但不限于日光斑、老人斑、黑斑病和黄褐斑，用于提供均匀肤色，用于对抗自由基形成，和用于对抗或预防皮肤老化体征例如皱纹和皮肤色调缺乏，并且通常用于改善皮肤审美条件，在无细胞毒性条件下，其降低黑色素产生的效果是特别显著的。

因此，在效果方面和使用安全性方面，本发明代表了相对迄今已知的现有技术的重大创新性改善。

结论：与混合物中各组分单独使用时得到的效果相比，并且甚至与单独应用各组分得到的效果的总和相比，用本文解释和描述的不同实施方案中的本混合物已经令人惊讶地显示明显更大的作用-即协同作用，每种情况是在无细胞毒水平评价的。

本领域技术人员可以在解释和描述的实施方案中对本发明进行多种改变，以满足偶然和具体需要，另一方面，本发明保护范围所包含的全部同如下面权利要求书所定义的。

Claims (9)

1.包含乙酰基葡糖胺和4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的混合物，其用作化妆品和/或药物。

2.根据权利要求1的混合物，其中基于混合物的总重量，乙酰基葡糖胺的重量浓度为0.05％至0.90％，优选0.5％至10％，更优选2％至5％。

3.根据权利要求1或2的混合物，其中基于混合物的总重量，4-(1-苯基乙基)-1,3-苯二醇的重量浓度为0.05％至90％，优选0.1％至5.0％，更优选0.5％至2％。

4.根据前述任意一项权利要求的混合物，其还包含亚油酸乙酯。

5.根据权利要求4的混合物，其中基于混合物的总重量，亚油酸乙酯是的重量浓度为0.1％至35％，优选0.23％至20％，更优选2％至15％。

6.根据前述任意一项权利要求的混合物，其用于抑制黑色素生物合成。

7.根据前述任意一项权利要求的混合物，其用于治疗色素沉着过度的皮肤损害，包括日光斑、老人斑(老化的斑)、黑斑病、黄褐斑。

8.根据前述任意一项权利要求的混合物，其用于提供均匀肤色和/或对抗自由基形成和/或对抗或预防皮肤老化体征例如皱纹和皮肤色调缺乏。

9.化妆品和/或药物制剂，其包含根据前述任意一项权利要求的混合物和生理学上可接受的载体。