CN104487884A - 扫描照明技术 - Google Patents

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Abstract

提供了用于生物材料的高速、高分辨率成像的成像系统。在示例性实施方式中，成像系统包括物镜部件、条发生器、数码相机、定位台和扫描镜。条发生器生成横跨安装在定位台上的底物的一部分被扫描的光条。定位台在大体上垂直于物镜部件的光学轴的特定方向上移动底物。相机收集通过物镜部件的底物的一部分的图像。当横跨底物的一部分对光条进行扫描并且在特定方向上移动底物时，扫描镜与定位台配合移动，以当相机收集图像时，使图像相对于相机保持静止。

Description

扫描照明技术
技术领域
本发明大体上涉及成像系统并且更具体地涉及在平面阵列中对生物材料进行高速、高分辨率成像的成像系统。
背景技术
从生物实验的图像中获得有用的数据需要高的空间分辨率、精确度和速率。这种图像通常需要以足够大的放大率来获得以使单个实验被清楚分辨。同时，图像需要覆盖足够大的视野以使得实验被正确识别。对于大型研究，成像和图像处理必需足够快速地进行以便商业上可实行。
步进重复成像器和时间延迟积分(TDI)成像器是能够用于对生物化学实验成像的两大成像系统。虽然对于一些应用而言，这两种类型的系统可以进行得相当好，但是对于其他应用而言，它们面临对整体吞吐量产生不利影响的一些结构性和功能性缺陷。例如，涉及大型生物化学实验研究(例如，大规模并行全基因组测序)的应用通常需要比步进重复和TDI成像系统当前能够提供的整体吞吐量高的整体吞吐量。
发明内容
根据本发明，提供了用于生物材料的高速、高分辨率成像的成像系统。在示例性实施方式中，成像系统包括物镜部件、行发生器(linegenerator)、数码相机、定位台和扫描镜。条发生器生成光条(a line oflight)，该光条被扫描横跨安装在定位台上的底物的一部分。定位台在大体上垂直于物镜部件的光学轴的特定方向上移动底物。相机收集通过物镜部件的底物的一部分的图像，其中，相机采用在内部扫描其电子传感器并产生表示二维图像的小部分的数字数据的串行读出的电路。当横跨底物的一部分扫描该光条并且在特定方向上移动底物时，扫描镜与定位台配合移动，从而在图像被相机收集时，使图像相对于相机保持静止。
通过参照以下详细说明与其附图更好地理解本发明。
附图说明
图1A是示出了根据一个实施方式在使用扫描照明的示例性成像系统中的一些部件的框图。
图1B是根据示例性实施方式的扫描镜角度时序图。
图1C是根据一个实施方式的显微镜视野内的成像区域的示例性细节图。
图2是根据一个实施方式以滚动读出模式工作的示例的图形。
图3是示例性曝光区域和读出区域的图形。
图4是根据示例性实施方式的镜角度、曝光时序和读出时序的图形。
图5是根据示例性实施方式的示例性分开读出相机传感器的图形。
图6A和图6B是根据示例性实施方式在滚动读出模式中的曝光区域和读出区域的并行操作的图形。
图7A和图7B是根据示例性实施方式在滚动读出模式中的曝光区域和读出区域的反并行操作的图形。
图8是根据一个实施方式使用扫描照明对底物成像的示例性方法。
图9A和9B示出了示例性测序系统。
图10示出了能够用于测序机和/或计算机系统中或与测序机和/或计算机系统结合的示例性计算装置。
具体实施方式
在本公开中，许多具体细节被阐述以提供对于本发明更透彻的理解。然而，本发明可以在不利用这些具体细节中的一个或多个的情况下实施对本领域的技术人员显而易见。在其他情况下，未对本领域技术人员所熟知的特征和程序进行描述以免混淆本发明。本公开描述可用于进行各种成像和/或扫描操作(例如，用于观察和/或记录生物化学实验和其他生物化学反应的操作)的扫描照明技术的实施方式。
概述
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法包括以下步骤：在成像系统中，利用数码相机收集底物的一部分的图像，其中该图像跨越相机中的传感元件的多个像素行；当相机收集底物的该一部分的图像时，执行以下步骤：横跨底物的一部分扫描光条从而曝光由图像所跨越的第一至少一行像素，同时使由图像跨越的第二至少一行像素保持黑暗，以及读出第一至少一行像素，同时继续横跨底物的一部分扫描该光条从而曝光第二至少一行像素。
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法还包括：移动成像系统的物镜部件下方的底物；改变扫描镜的角度，使得由物镜部件获取的底物的一部分的图像在底物移动时相对于相机保持静止。在一个方面，当底物在垂直于物镜部件的光轴的方向上移动时执行读出第一至少一行像素。在另一方面，与横跨底物的一部分扫描光条相配合来执行改变扫描镜的角度。在另一方面，改变扫描镜的角度包括在第一时间间隔期间横跨底物的一部分扫描该光条进行以及在第二时间间隔期间使扫描镜恢复至初始位置，其中该方法还包括在第二时间间隔期间中止横跨底物的一部分扫描该光条。在一些方面，第一时间间隔大于第二时间间隔。
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法还包括通过改变照明镜的角度来横跨底物的一部分扫描光条以将来自行发生器的光反射至底物的一部分上。在一个方面，改变照明镜的角度包括使照明镜倾斜的伺服机构，在另一方面，该方法还包括：移动成像系统的物镜部件下方的底物；以及改变扫描镜的角度使得在底物移动时通过物镜部件获取的底物的一部分的图像相对于相机保持静止，其中改变扫描镜的角度与改变照明镜的角度配合进行。
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法还包括在曝光第一至少一行像素的步骤与读出第一至少一行像素的步骤之间使第一至少一行像素保持黑暗。
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法包括操作相机，其中相机包括至少具有两部分的分开读出(split-readout)传感器，并且对光条进行扫描的步骤与读出步骤在传感器的每个部分中独立地执行。例如，在一个方面，一个部分中的扫描步骤和读出步骤与另一部分中的扫描步骤和读出步骤并行执行，而在另一方面，一个部分中的扫描步骤和读出步骤与另一部分中的扫描步骤和读出步骤反并行执行。
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法包括操作被配置成以相关双采样模式操作的相机。在一些实施方式中，读出步骤以滚动读出模式执行。在一些实施方式中，该光条具有适合于激发荧光的波长，同时相机中的像素通过具有与荧光发射相对应的波长的光曝光。
在示例性实施方式中，当相机收集底物的一部分的图像时，用于操作成像系统的方法还包括读出第二至少一行像素同时继续横跨底物扫描一行光从而曝光由图像跨越的第三至少一行像素，其中第三至少一行像素不同于第二至少一行像素。在一个方面，第三至少一行像素不同于第一至少一行像素。
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法包括操作以全帧模式操作的CMOS(“互补金属氧化物半导体”)相机和非CMOS相机中的一个。在一些实施方式中，相机以55％至90％的读出效率操作。在一些实施方式中，该相机以90％或更大的读出效率操作。在一些实施方式中，相机以每秒1,000线至每秒1,000,000线的线速率操作。在一些实施方式中，相机具有100,000像素至1亿像素的多个相机像素。
在示例性实施方式中，用于操作成像系统的方法还包括在成像系统的物镜部件之下以100μm/秒至1,000mm/秒的速度沿垂直于物镜部件的光学轴的方向移动底物。
在一些实施方式中，用于操作成像系统的方法使底物成像，该底物包括具有布置在其上的靶核酸的阵列。在其他实施方式中，该方法包括使底物成像，该底物包括作为成像目标的众多鲜明特征。
在示例性实施方式中，成像系统包括物镜部件、条发生器、相机、定位台和扫描镜。条发生器生成横跨安装(或者放置)在定位台上的底物的一部分扫描的光条。定位台沿基本上垂直于物镜部件的光学轴的特定方向移动底物。相机通过物镜部件收集底物的一部分的图像。当横跨底物的一部分扫描光条并且在特定方向上移动底物时，扫描镜与定位台配合移动，以在通过相机收集图像时使图像相对于相机保持静止。
在示例性实施方式中，成像系统还包括照明镜和计算机逻辑，其中图像跨越相机中的多个像素行，并且其中当相机收集底物的一部分的图像时：照明镜横跨底物的一部分扫描光条以曝光由图像跨越的第一至少一行像素，同时使由图像跨越的第二至少一行像素保持黑暗；以及计算机逻辑读出第一至少一行像素，同时照明镜继续横跨底物的一部分扫描光条以曝光第二至少一行像素。
在示例性实施方式中，成像系统还包括照明镜，该照明镜将来自条发生器的光条扫描至底物的一部分上，其中当横跨底物的一部分扫描光条并且在特定的方向上移动底物时扫描镜与照明镜配合移动。在一个方面，成像系统还包括：第一伺服机构，其改变照明镜的角度以横跨底物的一部分扫描光条；以及第二伺服机构，其与改变照明镜的角度相配合地改变扫描镜的角度。在一个方面，第二伺服机构在第一时间间隔期间改变扫描镜的角度，在第一时间间隔中，横跨底物的一部分扫描光条；并且第二伺服机构在第二时间间隔期间将扫描镜返回至初始位置，在第二时间间隔中，不横跨底物的一部分扫描光条，其中第二时间间隔比第一时间间隔更短。
在示例性实施方式中，成像系统还包括分色镜，其中分色镜至少被操作成：(a)将光条从照明镜反射至扫描镜上以照明底物的一部分；以及(b)使由物镜部件获取并由扫描镜反射的光通过相机。
在示例性实施方式中，成像系统包括相机，该相机包括具有可独立于彼此曝光并读出的至少两个部分的分开读出传感器。
在一些实施方式中，成像系统包括以全帧模式操作的CMOS相机和非CMOS相机中的一个的数码相机。在一些实施方式中，相机以具有55％至90％的读出效率操作。在一些实施方式中，该相机以90％或更大的读出效率操作。在一些实施方式中，相机以每秒1,000线至每秒1,000,000线的线速率操作。在一些实施方式中，相机具有100,000像素至1亿像素的多个相机像素。
在一些实施方式中，成像系统包括以从100μm/秒至1,000mm/秒的范围中的速率移动底物的定位台。
在一些实施方式中，成像系统被配置和操作成使底物成像，其中底物包括具有布置在其上的靶核酸的阵列。在其他实施方式中，底物包括作为成像目标的众多鲜明特征。
在示例性实施方式中，操作数码相机的方法包括以下步骤：(a)横跨目标扫描细光带(a thin strip of light)以逐行曝光数码相机的图像传感器中的像素；以及(b)在步骤(a)的曝光之后以滚动读出模式逐行读出像素。在一些方面，读出像素比横跨目标扫描细光带耗时更长。在一些方面，在曝光和读出之间像素保持黑暗。在一些方面，数码相机包括具有至少两个部分的分开读出传感器，其中步骤(a)和步骤(b)在传感器的每个部分中独立地执行。例如，一个部分中的步骤(a)和步骤(b)可以与另一部分中的步骤(a)和步骤(b)并行执行；在另一示例中，一个部分中的步骤(a)和步骤(b)可以与另一部分中的步骤(a)和步骤(b)反并行(anti-parallel)执行。在一些方面，以相关双采样模式操作相机。在一些方面中，细光带具有适合于荧光激发的波长，同时图像传感器中的像素通过具有与荧光发射相对应的波长曝光。在一些方面，细光带每次曝光两个或多个像素行。
应当注意，如本文中和所附权利要求中的使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”可包括复数对象，除非上下文清楚地另有规定。因此，除非上下文另有规定，否则例如，提及“附接位点(attachment site)”可以指多个这种附接位点，并且提及“用于序列确定的方法(a method for sequence determination)”可包括可由本领域的技术人员所使用的等效步骤和方法等等。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文中提及的所有出版物均出于描述和公开出版物中所描述的装置、构想和方法学的目的而通过引用并入本文，并且这些出版物能够与当前描述的发明结合使用。
在提供了数值范围的情况下，应理解，处于该范围和任何其他提及的范围的上限与下限之间的每个中间值、所提及的范围中的中间值或子范围均涵盖在本发明内。这种较小范围的上限和下限可以单独地包括在较小范围中，并且还可以涵盖在本发明内，从属于所提及的范围中的任何具体排除的限值。在所提及的范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的子范围还可以包括在本发明中。
选择的定义
“收集图像”和其语法等同物指的是一组相机像素被激活并且准备收集和整合图像的信号(例如，光)的相机操作模式。例如，当激活时，如果像素曝光于光中则相机像素收集光；如果相机像素没有曝光于光(例如，当像素处于黑暗中)中，那么即使其被激活并且准备收集和整合光信号，像素也不收集任何光。
“图像空间”是指被相机中的像素组覆盖的区域，并且“图像空间像素”是指相机像素。
“逻辑”是指指令组，当指令组被一个或多个计算装置的一个或多个处理器(例如，CPU)执行时，其被操作成执行一个或多个功能和/或以一个或多个结果的形式或者通过其他逻辑元件和/或通过控制机械装置(例如，伺服机构等)的操作的元件使用的输入数据的形式返回数据。在多种实施方式和实现方式中，任何给定逻辑可以被实现为一个或多个软件部件、一个或多个硬件部件、或一个或多个软件部件和一个或多个硬件部件的任意组合，其中，一个或多个软件部件能够通过一个或多个处理器(例如，CPU)执行，一个或多个硬件部件例如应用专用集成电路(ASIC)和/或现场可编程逻辑门阵列(FPGA)。任何特定逻辑的软件部件可以被实现为独立的软件应用、客户端-服务器系统中的客户端、客户端-服务器系统中的服务器、一个或多个软件模块、一个或多个函数库、和一个或多个静态和/或动态链接库，而不受限制。在执行过程中，任何特定逻辑的指令可以被实现为一个或多个计算机程序、线程、光纤和任何其他合适的运行时实体，其能够被示例化在一个或多个计算装置中的一个的硬件中并且能够分配计算资源，其中，计算资源可以包括但不限于存储器、CPU时间、存储空间和网络带宽。
“对象空间”是指对象(例如，底物)的区域，并由此“对象空间像素”是指对象(例如，底物)上的区域的单位。对象空间像素的尺寸通常通过图像空间像素(即，相机像素)的尺寸和在相机用于取对象空间的图像时所应用的放大倍数来确定。放大倍数是图像空间像素(即，相机像素)的尺寸与对象空间区域的实际尺寸的比率，其中，对象空间区域与如通过相机观察到的图像空间像素相对应。例如，16X的放大倍数允许使用8μm像素的相机来观察500nm的对象空间像素。在不同的实施方式中，对象空间像素的尺寸可以处于100至1000nm的宽度和100至1000nm长度之间；在优选的方面，对象空间像素的尺寸可以是300nm乘300nm，更优选为500nm乘500nm，甚至更优选为620nm乘620nm。在使用阵列芯片的一些实施方式中，对象空间像素的尺寸可以被选择为与阵列芯片上的附接位点的尺寸相同或者略大于其，由此仅单个离散的位点将适合对象空间像素。这确保了在操作中能够通过单个相机像素记录从阵列芯片上的附接位点发出的能量(例如，光)的强度。
“物镜部件”是指成像系统中的元件或元件集群，元件或元件集群包括一个或多个透镜并且被配置和操作成放大电磁(例如，光)信号。在一些实施方式中，物镜部件具有大数值孔径(NA)(例如，NA处于0.95与1.5之间的范围内)并且经由空气浸泡或液体浸泡(例如，水、油、或其他浸液)来执行成像。在多种实施方式中，物镜部件可以具有处于从2mm至25mm的范围内的焦距。
“滚动读出模式”是指每次连续地读出相机传感器中的像素行(每次一行)的操作模式。
参照靶核酸中的“序列确定”(还被称为“测序”)是指确定与靶核酸中的核苷酸的序列相关的信息。这种信息可以包括靶核酸部分和/或全序列信息的识别或确定。序列信息可以通过改变统计可靠性或置信度的程度来确定。在一个方面，术语“测序(sequencing)”包括确定身份和从靶核酸中的不同的核苷酸开始在靶核酸中排序多个连续核苷酸。
“底物”是指具有作为成像目标的众多鲜明特征的对象。例如，在一些实施方式中，底物包括已附接有靶核酸作为目标特征的表面非平面结构，诸如珠或凹陷(well)。在另一个示例中，在一些实施方式中，底物包括阵列芯片。“阵列芯片”(也称为“阵列”、“微阵列”、或者简称为“芯片”)是指固相支承物，该固相支承物优选但不排他地具有平坦的表面或者基本平坦的表面，该表面承载着已附接有靶核酸(例如，巨大分子)作为目标特征的附接位点。在阵列芯片上，附接位点可以被布置成有序图案或随机形式，并且通常被配置成具有适合于靶核酸的附接的尺寸(例如，长度、宽度、并且可能为深度或高度)。附接位点由此被空间定义，并且不与其他位点重叠；也就是说，附接位点在阵列芯片上彼此空间分离。当附接至附接位点时，靶核酸可以共价地或非共价地键合至阵列芯片。“随机阵列”(或者“随机微阵列”)是指靶核酸的身份(或者寡核苷酸或其多核苷酸的)至少在初期从它们在阵列芯片上的位置不可识别但可以通过阵列上的特定操作(诸如测序、混合解码探针等)确定的阵列芯片。(参见例如，美国专利第6,396,995号、第6,544,732号、第6,401,267号和第7,070,927号；公开WO2006/073504和WO2005/082098；以及美国公开第2007/0207482号和第2007/0087362号。并且在例如Schena编辑，2000，微阵列：实用方法，IRL出版社，牛津大学(Schena,Ed.2000,Microarrays:APractical Approach,IRL Press,Oxford)中回顾一些传统的微阵列技术)。底物的目标特征的类型和数量可以在不同的实现方式、操作环境和应用中有所不同。例如，在多种实施方式中，阵列芯片可以具有附接至其上的众多靶核酸，(a)其数量在1百万至1千5百万的范围；(b)对附接位点产生50％至95％或更大范围的靶核酸占用度；和/或(c)在阵列芯片上产生0.5/μm2至10/μm2或更大范围的平均靶核酸密度。另外，在一些实施方式中，底物可以被布置在流体装置中，诸如流滑件、流动池。流滑件通常开放于环境并且横跨底物的液体流动速率主要通过重力来确定。另一方面，流动池通常相对于环境围绕其底物并且提供封闭的液体路径，该封闭的液体路径被压力驱动系统(例如，包括多种类型的泵、阀、线路和其他流体连接)使用以使液体流入和流出流动池。一般来说，在不同的实施方式和实现方式中，底物可以用作为成像目标的多种且不同的特征实现在多种且不同的装置中；出于这种理由，描述在本段中的底物和其目标特征的示例应被视为示例性含义、而非约束性含义。
“靶核酸”是指来自基因、调控元件、基因组DNA、cDNA、RNA(包括mRNA、rRNA、siRNA和miRNA等)及其片段(即，测序、观察和/或其他研究的主体)的核酸。靶核酸可以是来自样本的核酸、或者二次核酸诸如放大和/或复制反应的产物。这种产物的示例为巨大分子。用于与核酸有关的“巨大分子”意味着具有可测量的三维结构的核酸，可测量的三维结构包括具有二次结构(例如，扩增子)的线性核酸分子、支链核酸分子和具有交互结构元件的单个序列的多个独立拷贝(例如，互补序列、回文序列或在核酸中导致三维结构元件的其他序列插入)。
用于扫描移动目标的成像系统
在一些实施方式中，本文中所述的成像系统被配置成通过使用快速相机扫描连续移动的目标(例如，底物)，其中快速相机不通过相机移动图像。例如，在一些实施方式中，用于DNA测序的成像系统可以用CMOS相机或科学级CMOS(sCMOS)相机配置。不同于CCD-阵列相机，因为全帧相机无法以TDI模式操作，所以该操作性限制的后果在于在获得过程中图像必需不相对于全帧相机的传感器阵列移动。通过提供当定位台在物镜部件下方移动底物(例如，阵列芯片)时可使图像在相机上保持静止的扫描镜(和/或另一光学装置)，本文所述的成像系统至少部分地解决了这种操作性限制。以此方式，本文所述的成像系统克服了全帧相机(例如，CMOS相机)的操作性限制同时获得这些相机的高速、高分辨率和低成本的优点。该成像系统的示例在与本申请于同一天提交的题为“具有可移动扫描镜的成像系统”的第61/656,701号美国临时专利申请中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文，如同在本文中完全阐述一样。
本文中描述的成像系统保留机械上期望的连续平台运动的用途，但在图像采集过程中相对于相机的传感器阵列定住底物的图像。在一些实施方式中，这可以通过使用与较重的定位台相比能够更加容易且准确地加速和减速的、轻量且伺服控制的扫描镜来完成。在一些实施方式中，用于检测扫描镜性能的装置和用于在行进中进行小型图像定位校正的装置也可以成为成像系统的一部分。由此，根据本文中的技术的成像系统能够在保持约50nm的对齐精度的同时获得550百万像素(或以上)的图像数据。通过耦接在具有合适的生物化学反应子系统的测序机中，这种成像系统允许非常高的测序吞吐量，例如，约每天100人类基因组当量的测序。
在一些实施方式中，成像系统为包括物镜部件、一个或多个相机、可移动定位台以及优选但不排他地包括镜筒透镜部件的荧光类系统。在这些实施方式中，成像系统被配置和操作成取整个底物(例如，阵列芯片)或其一部分的图像，其中，底物被安装或以其他方式放置在定位台上，并且在通过相机获取图像期间处于运动状态。根据本文中所述的技术，这种成像系统，允许使用确实很快的相机(例如，CMOS相机)来获得移动的底物的图像。为了便于系统操作的这种模式，本文中描述的技术提供布置在物镜部件与相机之间的光路径中的可移动(即，可倾斜的)扫描镜。部件的这种布置与传统的成像系统形成对比，其中，传统的成像系统一般采用沿着光路径完美对齐的物镜透镜和相机并因此不允许可移动部件位于该光路径的中间，因为这种可移动部件产生在传统的成像系统中被认为是不期望的影响。
值得注意的是，用于DNA测序的荧光类成像系统通常采用非常低的电平，因为荧光图像是暗淡的。因此，这种成像系统中的相机和光学器件需要尽可能高效且敏感，以将图像采集时间保持到最小。另外，照明强度必需保持低于可能使正被测序的靶核酸受损的点。这些因素是在设计用于对移动的靶核酸成像的荧光成像系统时需要考虑的一些因素。
快速相机和移动目标的成像
在一些实施方式中，本文中所述的成像系统被配置成结合可移动扫描镜使用快速相机，以在被成像底物移动期间实现静止图像的连续曝光。在一些实施方式中，相机像素的尺寸(长度和/或宽度)处于5μm至10μm的范围，优选但不排他地处于6μm至8μm的范围。
在多种实施方式中，本文中所述的成像系统被配置成通过使用不通过相机移动图像的快速相机扫描连续移动的底物(例如，阵列芯片)，快速相机例如为非-TDI相机和以全帧模式操作的其他相机(包括TDI相机)。CMOS相机是这种相机的示例性类型。CMOS相机通常使用有源像素传感器(APS)，有源像素传感器是由包含像素阵列的集成电路构成的图像传感器，其中，每个像素包括光电检测器和有源放大器。CMOS相机的一种示例是来自加利福尼亚州，米尔皮塔斯，飞兆成像公司(Fairchild Imaging,Milpitas,California)的SciMOS 2051型号。SciMOS 2051是能够用286MHz读出且小于两个电子典型读取噪声以100帧每秒拍摄5.5兆像素的图像的快速相机。
优选但不排他地，相机的高速通过线路速率定义，线路速率是相机的能够在一个单位的时间内通过相机读出的像素行的数量的操作特性。相机的线路速率可以根据以下等式(1)确定：
R line = P readout - frequency N pixels - per - line - - - ( 1 )
其中，“Rline(R线路)”是相机的线路速率，“Preadout-frequency(P读出频率)”是相机的像素读出频率(例如，能够在一个单位时间内读出的像素数量)，并且“Npixels-per-line(N像素每线路)”是相机的传感器行中的像素数量。例如，具有286MHz的读出频率和2560个像素每阵列传感器行的相机将具有Rline＝286MHz/2560≈105线路每秒的线路速率。
可选地，高速相机可以根据相机能够在单位时间内曝光的像素数量定义。例如，相机的速度可以通过相机每秒能够拍摄的帧数和视野中的像素数量的数学乘积定义。由此，具有以100帧每秒(fps)运行的5.5兆像素的视野(例如，2560个像素乘2560个像素的视野)的相机将能够曝光550兆像素每秒；由此，这种相机在本文中被称为“550”兆像素数码相机。这种相机的示例包括(但不限于)CMOS、sCMOS和相似的相机。在多种实施方式中，本文中描述的成像系统可以使用10百万像素至2500百万像素范围的相机。
在多种实施方式中，成像系统被配置成以扫描方式对移动的底物成像。在这种实施方式，底物通常安装(或以其他方式放置)在定位台上，定位台耦接至能够在相机拍摄底物(或其一部分)的图像时连续地将底物移动到物镜部件下方的一个或多个机构(例如，电机或执行器等)。定位台被配置和操作成沿着垂直于物镜部件的光学轴的方向移动底物。(应注意，这与自动对焦类机构的操作正交，其中，自动对焦类机构一般沿着物镜的光学轴线移动物体和/或整个物镜。)
根据本文中描述的技术，平台的运动与扫描镜的反向扫描运动配合以使得底物(或其一部分)的图像在相机上保持静止(稳定)一段提供足够曝光的时间。换言之，在平台移动期间，安装在其上的底物的静止图像被曝光到相机。曝光期间的图像稳定性通过扫描镜在物镜部件与相机之间的光路径中的运动来提供。由此，扫描镜和定位台以配合的反向扫描操作有效地耦接，以在被成像底物处于连续运动时保持图像静止/稳定。
在成像系统的示例性实施方式中，在操作中，在计算机系统执行逻辑以从相机读取曝光的一行或多行像素期间，定位台移动安装在其上的底物。同时，相同和/或不同的计算机系统执行逻辑以使扫描镜的时序与定位台的时序同步，以使得扫描镜进行反向扫描并且将在相机上保持静止的另一个图像，从而曝光另一组一行或多行相机像素。
在这种操作模式中，定位台的速率能够根据以下等式(2)来计算：
Vstage＝Spixel*Rline*η    (2)
其中，“Vstage(V平台)”是平台速率，“Spixel(S像素)”是对象空间像素的尺寸(例如，长度或宽度)，“Rline(R线路)”是相机的线路速率(例如，从相机读出像素行的速率)，并且“η”是从相机的总读出效率(例如，以能够从相机提取读出而不影响其他正在进行的曝光的时间的百分比来表示)。例如，在多种实施方式中，对象空间像素的尺寸(例如，长度和/或宽度)可以处于100nm至1000nm的范围，相机线路速率可以处于103线路每秒(Hz)至106线路每秒(Hz)，从相机的总读出效率可以处于10％至55％、55％至90％的范围或大于90％。由此，在多种实施方式中，定位台的速率可以处于0.1mm/s至1000mm/s(或更大)的范围。在示例性实施方式中，对象空间像素为620nm，相机线路速率105线路每秒(Hz)，并且来自相机的总读出效率为90％，这提供约55.8mm/s的平台速率。
根据本文中描述的技术，一个或多个计算装置和/或其多种逻辑被配置和操作成控制扫描镜和定位台的配合运动。由此，在一些实施方式中，定位台(以及安装在其上的底物)可以被配置成以恒定速率移动，在这种情况下，扫描镜的反向扫描运动也将处于适当的恒定速率。在其他实施方式中，定位台可以被配置成以非恒定的速率移动，在这种情况下扫描镜的反向扫描运动也是适当的非恒定速率。
在多种实施方式中，多种机构可用于便于定位台以给定的期望速率运动。这种机构可以包括促使运动的一个或多个部件(例如，线性电极、导螺杆、螺杆马达、速度螺杆等)和减小摩擦的一个或多个部件(例如，多种类型的轴承)。例如，一些实施方式可以提供具有空气轴承以移动定位台机构。空气轴承是在两个表面之间提供非常低摩擦的界面(例如，轴承间隙)的压缩空气的薄膜。因此，在这些实施方式中，定位台的底部表面不与另一个表面直接接触，而是悬浮在空气轴承间隙上方，这使得在轴承的表面之间所施加的空气压力足以支承定位台的负载(虽然空气从轴承间隙不断地逸出)。这种空气轴承在本文中所述的成像系统中的使用允许在10nm至20nm的对准公差内将静止图像锁定到相机上。在另一个示例中，一些实施方式可以使用具有数微米的重复性的金属轴承(例如，滚珠轴承、圆柱轴承、交叉滚子滚珠轴承等)。即使这种实施方式通常具有较大的对齐容差(例如，容差大于20nm)、较低的定位台速率，和/或每对象空间像素可以使用多个相机像素，在某些应用环境中这种实施方式仍然可以是商业上可行的。
如上面的等式(2)所示，总相机读出的效率(“η”)是确定成像系统的总吞吐量的一个参数。
根据本文中描述的技术，可通过使用扫描照明实现η＝90％(或更大)的读出效率。
具有扫描照明的成像系统
在一些实施方式中，快速CMOS相机采用相关双采样以实现低读取噪声并采用滚动读出模式以提高吞吐量。当与扫描移动目标对象的成像系统相结合时，与这些操作模式相关的技术细节存在关于图像获取技术的一些限制。例如，在滚动读出模式中，相机可在结束读出操作之后立即开始图像获取。因此，为了使相机保持最大容量和/或效率，优选地使从相机读出图像数据的时间片段(fraction)最大化。然而，在使用扫描镜对移动目标进行成像的成像系统中，扫描镜需要回到其初始位置，并且在这种“回扫(fly-back)”时间期间投影在相机上的图像是不稳定的。
为了解决这个问题，本文描述的技术提供了使用扫描照明，该扫描照明使可从相机传感器读出图像数据的时间片段最大化。例如，在一些实施方式中，成像系统包括光发生器和可成角度移动的照明镜，其中条发生器生成光条(例如，细光带并且照明镜沿与目标移动的轴线相同的轴线将光条扫描至移动目标(例如，诸如阵列芯片的底物)上。在“稳定的”图像时间(例如，当扫描镜使图像相对于相机保持静止时)期间，横跨移动的目标扫描光条以曝光在刚才已被曝光的那些像素行之前的一个或多个像素行。这允许成像系统在那些像素刚曝光之后连续地读出像素行，从而使相机容量和效率最大化。在到达稳定时间之后，在回扫时间间隔期间，当扫描镜恢复至其初始位置，光条被“截止”(例如，通过开关或通过设计的光圈)从而防止相机像素被曝光为非稳定图像，换句话说，只要光条的条的前进至少比像素行的读出快一点并且只要曝光时间足以获取静止(和/或可分辨)图像，那么在几乎90％-95％的时间内都能够从相机读出图像数据(或者如果扫描镜和照明镜的运动和时间精确地同步，那么甚至能够达到100％的时间)。例如，如果扫描镜在至少90％的扫描镜周期内都使图像在相机上保持静止(例如，当扫描镜回扫描时间小于该周期的10％时)，那么这种使用扫描照明的技术允许相机以至少η＝90％的整体读出效率操作。
具有扫描照明的示例性扫描成像系统
图1是根据示例性实施方式的扫描荧光成像系统100的视图。当底物被移动到显微镜物镜部件之下时，图1A的成像系统通过横跨底物扫描光条来照明底物(例如，阵列芯片)的一部分，同时底物的一部分的图像被临时定像(fix)到相机的传感器上。
在图1中示出的实施方式中，阵列芯片105承载靶核酸，例如，DNA大分子。定位台110相对于物镜部件115在y轴方向上移动阵列芯片105。定位台110是高精度、计算机控制的空气轴承台。物镜部件115是现成的物镜。在一些实施方式中，物镜部件可以是定制设计的、多元件光学部件。另外，在一些实施方式中，水浸泡可以用于增加物镜部件的数值孔径(NA)。
物镜部件115和镜筒透镜部件120将阵列芯片105的一部分的图像投影到相机125的传感器阵列上。镜筒透镜部件120是包括充当第二放大倍数物镜的一个或多个镜筒透镜的元件或元件组。相机125是优选但不排他地以全帧模式操作并且采用以低读取噪声、高分辨率和高成像速度为特征的传感器阵列的快速CMOS相机。
在图1A中示出的实施方式中，扫描镜130为在角运动范围中通过伺服旋转机构(未示出)倾斜的轻量的镜。随着扫描镜130在初始位置和结束之间来回倾斜，物镜部件115的视野内的区域在相机125上成像为图像107。当扫描镜130的运动配合定位台110的运动时，阵列芯片105上的固定区域(例如，视野106)在平台移动时通过相机成像。扫描镜130的旋转(例如，围绕垂直于图1A的平面的轴线)具有以图中所示的y方向扫描图像的效果。该结果被获得是因为成像系统100的放置有扫描镜130的准直部分中的倾斜对应于相机125的焦平面处的横向平移。
用于荧光图像的照明通过条发生器160以照明光条108的形式提供。光条108被引导至照明镜140并通过照明镜140反射，照明镜140放置在条发生器160和二向色分束镜150之间的光学路径中。在多种实施方式中，条发生器可以发射多个波长的光，这些光的波长可与可用于对例如400nm至800nm波长的光进行排序的多个荧光素兼容。在图1A中，条发生器160包括光源162(例如，一个或多个激光器或其他照明源)、一个或多个准直透镜164以及一个或多个负柱面透镜166。准直透镜164将从光源162发射的光转换成平行光束，并且负柱面透镜166将平行光束聚焦成光条。在多种实施方式中，以此方式生成的光条被配置成在放大之后具有与一个或多个相机像素行的长度和/或宽度相对应的长度和/或宽度。例如，根据图1A的实施方式，照明光条108的长度和宽度为相应的曝光光条109跨越相机125的传感器中的一个或多个像素行。
照明镜140是在角运动范围中通过伺服旋转机构(未示出)倾斜的轻量镜。随着照明镜140在初始位置和结束位置之间来回倾斜，通过条发生器160生成的照明光条108通过照明镜反射至二向色分束器150然后反射至扫描镜130，扫描镜130转而通过物镜部件115将其反射在阵列芯片105上。二向色分束器150在照明波长处反射而在荧光发射波长处传送；因此，分束器150将照明光条108反射至扫描镜130，并将荧光曝光光条109传送至相机125。应注意的是在每次询问多于一种类型的荧光标记的成像系统中，可以使用多个照明源(例如，各自发出单独的光谱的多个激光器)和二向色分束器。
照明镜140以允许照明镜的角运动在与定位台110移动阵列芯片105的方向相同的方向上(例如，y方向)有效地移动光条横跨阵列芯片105的方式放置在照明光条108的光学路径中。因为照明镜140的运动与扫描镜130和定位台110的运动同步和/或配合，照明镜的运动引起照明光条108被有效地移动或扫描横跨阵列芯片105的、位于物镜部件115的视野106内的一部分。
因为扫描镜130的运动与定位台110的运动相配合，故在平台移动的同时，阵列芯片105上由视野106覆盖的固定区域被相机125成像(例如，投影在相机上的图像107是稳定的)。围绕垂直于图1A的平面的轴线的旋转扫描镜130具有下述效果：(1)在y方向上将照明光条108扫描在阵列芯片105上(其与照明镜140的运动配合执行)，以及(2)同样在y方向上扫描阵列芯片105的一部分的图像107。
在操作中，相机125收集物镜部件115的视野106内的区域的图像107。(应注意在一些实施方式中相机可以以滚动读出模式操作，而在其他实施方式中其可以以全帧模式操作)。由相机125收集的图像107跨越多个相机像素行(本文中该图像也被称作“二维”图像)。因为光条108每次仅照明阵列芯片105的一部分的少量行，因此相应的曝光光条109在任何一次仅曝光由图像107跨越的一个或一些像素行而由图像跨越的其他像素行则保持在黑暗中。(应注意这种“在黑暗中的”像素可以是还没有被曝光的像素或者可以是已经被曝光但是还没有被读出的像素。)照明镜140、扫描镜130和定位台110的运动和时序以以下方式进行协调和同步，即照明光条108至少稍微领先于当前由成像系统100中的计算机逻辑(未示出)从相机125读出的那些像素行。例如，由阵列芯片105上的靶核酸响应于照明光条108的激发而发射的曝光光条109曝光相机125中的、(至少稍微)领先于当前通过计算机逻辑操作相机而读出的其他像素行的像素行。以此方式，图像数据可从相机读出同时其他图像数据通过相机传感器获取，从而提高整体相机读出效率η。
在一些实施方式中，成像系统可包括放置在扫描镜和相机之间的光学路径中的、并且可用于对相机的传感器阵列上的图像放置进行细微校正的一个或多个倾斜板，例如，通过使用用于在图像的x方向上校正的一个倾斜板和用于在图像的y方向上校正的一个倾斜板。倾斜板可由具有大致2.5cm的直径和3.5mm的厚度的玻璃制成。该板可被安装在伺服旋转机构上以进行快速且精确的移动。使用x方向作为示例，当光以非垂直入射角通过倾斜板时，其位置以通过以下等式(3)给出的量Δx偏移：
Δx = t sin θ - t n cos θ sin θ 1 - ( 1 n sin θ ) 2 - - - ( 3 )
其中，“t”为板的厚度，“n”为其折射率，以及“θ”为入射角。对于上面给定尺寸的玻璃板(n＝1.5)，5度倾斜产生约100μm的横向图像偏移。倾斜板也在y方向上保持相似的关系。基于上面的等式(3)，有关相对于相机的传感器阵列的图像对准的信息可用于提供驱动x方向的倾斜板和/或y方向的倾斜板的反馈信号。该对准信息的一个来源是对通过相机获得的图像进行分析的结果。在y方向上的对准信息的另一个来源可通过使用精确且快速测量扫描镜的倾斜角的一个或多个角度传感器来监测扫描镜的性能而获得。在一些实施方式中，该图像对准信息被发送到执行逻辑的计算装置，该逻辑控制扫描镜、定位台、一个或多个倾斜板的操作、并且优选地(但不是必需)控制包含在照亮被成像底物中的照明源和/或任何照明镜的操作。
在一些操作环境和应用中，成像系统可利用本文描述的用于扫描照明的技术而不使用可移动的定位台和/或可移动的扫描镜。例如，在一个替代的实施方式中，成像系统使用可移动的照明镜以横跨静止底物扫描照明光条并且相机操作成收集底物的一部分的图像。相机以允许曝光一些像素行同时从相机传感器读出一些其他像素行的模式(例如，滚动读出模式或全帧模式)操作。因为底物是静止的并且在图像获取期间不移动，故成像系统不需要采用可移动的扫描镜以使图像在相机上保持静止。照明镜的运动与从相机读出图像数据的计算机逻辑的操作以这样的方式协调且同步，即曝光光条(其响应于照明光条从底物反射)至少稍微领先于当前通过计算机逻辑从相机读出的那些像素行。该配合与时序同步可取决于几个因素，其包括但不限于为充分曝光所必需的时间、横跨底物的照明光条的扫描速度等。因为该因素主要取决于成像系统的具体使用，在该替代的实施方式中，用于本文描述的扫描照明的技术仍可用于提高相机的整体读出效率η，在一些操作环境中，虽然成像系统不采用可移动位置的平台对移动目标进行成像。
因此，使用可成角度移动的照明镜和扫描镜与可直线移动的定位台结合的实施方式(例如，图1A中的示出的实施方式)应被视为说明性的而不是限制性的意义。
扫描操作中的配合和同步
在一些实施方式中，成像系统使用可移动的照明镜以横跨底物(例如，阵列芯片)扫描光条，同时可移动的扫描镜随着定位台在显微镜物镜部件之下移动底物而将底物的一部分的图像临时固定在相机上。照明镜的运动与扫描镜和定位台的运动以允许照明镜的运动使得照明光条被有效地移动或扫描横跨底物在物镜部件的视野内的一部分的方式配合。
在示例性实施方式中，成像系统中的一个或多个计算装置执行计算机逻辑，计算机逻辑被配置和操作成使从曝光的相机像素行读出图像数据的操作的时序(timing)与照明镜、扫描镜以及目标底物所安装的定位台的运动同步。在操作中，随着由移动的照明镜反射的光条通过移动的扫描镜来横跨底物被扫描，定位台移动安装在其上的底物，同时计算装置执行读出逻辑以从相机读取一个或多个曝光的像素行。同时，相同的和/或不同的计算装置执行从移动照明镜、扫描镜以及定位台的系统元件接收输入数据的配合逻辑，其中，该输入数据的示例包括但不限于，指定照明镜当前的倾斜角的数据、指定扫描镜当前的倾斜角的数据以及指定定位台的位置和速率的数据。然后，配合逻辑使用输入数据以确定在照明镜、扫描镜以及定位台的运动和时序中是否需要任何校正，并且如果需要的话将任何必要的校正项发送至促进该运动的系统元件。
以此方式，配合逻辑使照明镜、扫描镜、定位台以及读出逻辑的操作同步。该同步的结果是当横跨底物扫描照明光时扫描镜保持底物(或其一部分)的图像相对于相机静止，同时读出逻辑从已经被曝光的像素行提取图像数据。在一些实施方式中，只要配合逻辑确保曝光光条领先于当前读出的像素行，照明镜和扫描镜未必需要以与使图像在相机上保持静止的扫描镜所需要的公差一样严格的公差进行操作。在其他实施方式中(例如，其要求非常高的图像系统吞吐量)，读出逻辑、照明镜和扫描镜之间的时间可在非常严格的公差内同步以确保可在所有时间或者几乎所有时间从相机读出图像数据。例如，在一些DNA测序实施方式中，成像系统需要以10-15nm的精度锁定通过相机获取的图像，这要求在照明镜、扫描镜、定位台和读出逻辑的各自时序之间的高度同步。
为了最大化可从相机提取图像数据的时间的分数，在一些实施方式中，照明镜、扫描镜和定位台以允许相机中的一个或多个像素行曝光而其他像素行保持在黑暗中的方式配合；一旦曝光完成，计算装置执行读出逻辑以读出曝光的像素行同时成像系统继续扫描横跨底物的一部分的光条以曝光相机中的其他像素行。因此，当曝光光条始终正好领先于正在读出的像素行时，并且即使当图像数据正在从其他像素行读出时相机始终曝光至少一些像素行，相机的整体读出效率η将为最大/最佳。
因为根据本文所述的技术，照明是以横跨目标底物的条的形式被扫描的，因此电荷被收集并整合在相机像素中仅发生在曝光光条扫过该像素的时间间隔内；在其余时间像素处于黑暗中由此不整合任何电荷，即使像素准备好这样做。因此，一旦曝光完成(例如，曝光光条刚刚扫过像素)，一行像素所积累的电荷可通过执行读出逻辑来读出，读出逻辑以滚动方式逐行读取像素。
扫描镜回扫
在使用伺服控制镜的实施方式中，照明镜和扫描镜的运动和时序之间的同步不一定需要在严格的公差内，但是照明镜需要在扫描镜的“稳定”时间间隔内(例如，在扫描镜保持图像相对于相机静止的时间间隔期间)完成其循环(例如，从其初始位置到其结束位置)。例如，在使用扫描镜对移动目标进行成像的成像系统中，扫描镜需要回到其初始位置，并且在这种“回扫”时间间隔期间投影在相机上的图像是不稳定的；因此，如果该成像系统采用如本文中所述的扫描照明，任何有助于照明的扫描的部件(例如，伺服控制的照明镜)需要在任何回扫时间间隔之前完成其循环。例如，在使用非TDI操作相机对移动目标进行成像的成像系统中，回扫时间间隔的含义为相机像素在扫描镜回扫间隔期间将不会被曝光但是已经曝光的像素可以被读出。
图1B示出了根据示例性实施方式的扫描镜角度时间的图形。
在图1B中，扫描镜的倾斜角相对时间t进行绘制。在170阶段期间(标记为“扫描”)，镜角度基本上随时间成直线地改变以使相机可在移动的底物上观察固定区域。在阶段175(标记为“回扫”)期间，扫描镜返回其起始角度(例如，在初始位置)为新的扫描做准备。该行为的一个后果是图像将不会在回扫时间间隔期间被获取。然而，虽然相机的传感器在扫描镜回扫期间将不会被曝光，但是可在任何时间从相机读出图像数据。
在一些DNA测序实施方式中，因为没有理由停止读出数据或减慢吞吐量，因此图像数据从相机连续地读出以最大化数据吞吐量(例如，图像转换成数字数据)。然而，在该实施方式中，由于荧光成像的光能级通常非常微弱，因此扫描时间间隔仍然必须足够长以建立充分的信噪比。
在回扫时间间隔期间，因为获取的图像不稳定，故成像系统将停止成像。因此，在多种实施方式中，多个机构可用于在回扫时间间隔期间防止图像曝光到相机。例如，在一些实施方式中，声光调制器(AOM)开关(或其他类型的快速开关)可用于打开和关闭生成反射在被成像底物上的照明光条的条发生器，在其他实施方式中，合适的光圈可被放置在照明光条的光学路径中，其中允许对照明光条进行过扫描(overscan)，但是在回扫时间间隔期间光圈通过阻挡视野外部的光条来防止光条照亮底物。在其他实施方式中，合适的快门可被放置在照明光条的光学路径中，其中在曝光间隔期间，快门保持打开，并且在扫描镜回扫时间间隔期间，快门保持关闭。
以此方式，本文所述的扫描照明的技术可避免由用于在成像系统对移动目标进行扫描的扫描镜的回扫时间间隔所引起的、相机读出效率的任何下降。
示例性扫描操作
图1C是根据图1A的示例性实施方式的物镜部件115的视野106内的对象空间区域的细节。在图1C中，阴影的矩形180表示当成像系统的扫描镜处于中档位置时成像在相机的传感器阵列上的视野205内的区域。矩形184和182(具有虚线边框)表示当扫描镜分别处于极限初始位置和极限结束位置时成像在相机的传感器阵列上的视野106内的区域。
在操作中，物镜部件被聚焦在沿y方向稳定移动的底物(例如，阵列芯片)上，并且扫描镜从其初始位置旋转至其结束位置。如果底物的速率与成像在相机上的视野106内的速度相同，则底物的对应于视野的部分的图像相对于相机保持不动，从而允许充分曝光到相机传感器上。
然而，关于图1C，图像仅在所成像的对象空间区域从由矩形184指示的初始位置移动到由矩形182指示的结束位置的过程中相对于相机处于静态。当扫描镜到达其极限端位置时，其必须随后回扫至其初始位置。回扫时间间隔能够被配置成扫描镜循环的仅一小部分，然而，如果需要，则连续成像的区域可以是连续的、或者甚至是重叠的。为了更好的效果，在每个成像的区域上由扫描镜耗费的时间量与相机的帧速率相当，从而允许充分的时间来将每个对象空间区域的图像曝光到相机上，而与此同时允许从相机读出已被成像并脱离视野的其他对象空间区域的图像数据。
为了将成像问题分解为可管理的小块，在一些阵列芯片实施方式中，阵列芯片的附接位点被划分成微米至毫米尺寸的视野。(如，在多个方面，典型的视野可以具有320-1600μm乘320-1600μm的范围的尺寸、500-600μm乘500-600μm的范围的尺寸、或者甚至具有1.6mm乘700μm的范围的尺寸)。典型的阵列芯片可以被划分成以多行和多列的矩形图案布置的数百或数千的视野。例如，视野的行和列可以包括基本沿水平维度和竖直维度分别对齐的轨道区域)。
在具有附接位点的视野的这种实施方式中，本文中描述的技术提供为逐个部分地对阵列芯片进行扫描和成像，其中每个部分为在长度上跨越一个或多个视野和在宽度上跨越一个或多个视野的列。在一个示例中，在定位台沿平面中的y方向和/或基本垂直于物镜部件的光学轴线的轴线移动阵列芯片期间，成像系统以具有扫描照明的扫描方式(如本文所述)对阵列芯片成像。在该示例中，成像系统在到达被成像视野的列的端部时停止成像以允许定位台返回阵列芯片并且对其进行定位以用于下一列视野的成像。在另一个示例中，在定位台在基本垂直于物镜部件的光学轴线的平面中以蛇形方式(例如，沿y轴线)来回移动阵列芯片期间，成像系统以扫描方式(如本文所述)对阵列芯片成像。在本示例中，成像系统在定位台以一个方向移动阵列芯片时对一列视野进行成像，并且随后在定位台以相反的方向移动/返回阵列芯片时对下一列/相邻列视野进行成像；换言之，成像系统通过以连续的蛇形方式有效地来回移动视野的列来对阵列芯片进行成像。
滚动读出模式和滚动曝光模式
在一些实施方式中，成像系统使用可以以相关双采样模式操作的CMOS相机以实现低读取噪声。此外，该系统中的相机还可以以滚动读出模式操作以提高吞吐量。图2示出了根据一个实施方式以滚动读出模式操作的示例的图形。
图2示出了数码相机的图像传感器205中的像素(例如，像素210)的一些代表性的行。(为了说明的目的，在图2中仅示出了几个像素列；但是，应注意像素列沿传感器205的整个宽度延伸，即，传感器是像素的行和列的网格。)在多种实施方式中，相机的图像传感器可包括250行和10,000行之间的任何行像素以及400列和10,000列之间的任何列像素，以具有100,000至1,0000,0000的像素总数。
在滚动读出模式中，图像数据以逐行形式从相机传感器读出。换言之，同时读出来自整行像素的数据。举例来说，同时读出来自图2中的行215的图像数据。然后，读出来自相邻的像素行的数据。根据本文所述的技术，行不是随机读出，而是使传感器以向上或向下扫掠或“滚动”的方式读出。例如，图2中的两个箭头表示两种可能性：在行215之后读出的下一个像素行将是正好在其之上的相邻行，或者正好在其之下的相邻行。滚动读出模式可在帧速率方面提供超过全局快门模式或快照模式高达二倍的增加。
在一些实施方式中，使用相关双采样(correlated double sampling)以实现低读取噪声是指在读出之后可立即开始图像获取。例如，相机传感器中的像素可在读出数据之后立即开始聚集有助于图像数据的光。但是，只要没有光落在相机传感器上，例如，其处于黑暗中并且没有曝光，则不产生图像噪音。这些操作细节导致新的曝光模式，其在具有曝光停滞时间(例如，这种回扫时间间隔)的成像系统中利用相关双采样以及滚动读出模式。
根据本文所述的技术，该新的曝光模式以照亮与相机传感器中的像素的一行或少数行相对应的对象空间区域(无论将要成像的是什么，例如，底物)为基础，其中照明在对象空间区域上扫描或“滚动”。该曝光模式在本文中被称作“滚动曝光模式”。由此，在一些实施方式中，成像系统以滚动曝光模式(其中横跨正在成像的底物扫描光条)和滚动读出模式(其中在曝光之后立即相继读出像素行)操作。曝光操作和读取操作之间的黑暗周期不增加图像噪音。该技术的基本原理在图3中示出，其示出了以滚动曝光模式和滚动读出模式操作的相机的曝光区域和读取区域。
图3示出了相机传感器305中的几个代表性的像素行。(为了说明的目的，在图3中仅示出了几个像素列；但是，应注意像素列沿传感器305的整个宽度延伸，即，传感器是像素的行和列的网格。)阴影行315当前正在曝光，即，行315中的像素正在记录图像数据。排线行320正在读出，即，行320中的图像数据正在转换成适于发送至计算装置并由计算装置进行操纵的电子位。行315与行320之间的行(例如行325)为黑暗的；这些行在先前的曝光期间具有聚集和整合的光信号，但是还未被读出。在黑暗中不再有光并且不再有噪音被加至行上，例如行325。行(例如行330和行335)中的像素准备收集图像数据(例如，聚集并集成光信号)；就曝光操作和读出操作的方向而言，这两个像素行都位于当前的读出行(例如，行320)之后并且位于当前的曝光行(例如行335)之前。
尽管图3示出了只有一个行315正在曝光，实际上几个(例如，1到10个或10个左右)像素行可同时曝光。正在曝光的像素行与横跨正在成像的对象空间区域(例如，底物的一部分)进行扫描的照明光条相对应。由此，与传统的荧光显微法不同，在传统的荧光显微法中通过显微镜物镜可见的整个区域被同时照亮，而根据本文所述的用于扫描照明的技术，照亮的对象空间区域仅与相机传感器中的一个像素行或几个像素行相对应。此外，读出操作在如上所述的滚动读出模式中每次前进一行。
例如，根据图3，横跨与相机传感器的包括行315(如由“曝光”箭头表示的)的曝光区域相对应的对象空间区域对照明光条进行扫描。相机传感器的读出区域(如由“黑暗”箭头表示)包括行320并且跟随在曝光区域之后。在一些实施方式中，曝光区域和读出区域可相对于彼此以不同速度横跨传感器“移动”。
曝光时间和读出时间的示例
图4示出了根据示例性实施方式的扫描镜角度、曝光时间和读出时间的图形。
类似于图1B，图4中的上部图形410示出了相对时间t绘制的扫描镜角度。图4中的下部图形420示出了曝光/读取的行数相对时间t的图形。像素行(例如，相机传感器的像素行)从“1”到“N”编号，并且清楚地绘制出用于行的时间序列以进行说明。图形420的垂直部分(平行于虚线)示出了在特定的时间间隔(例如，“扫描”时间间隔或“回扫”时间间隔)中，哪些像素行正在被曝光或读取。图形420中的水平部分(例如，如所示的行“x”)示出了用于特定行的曝光、黑暗和读出阶段。
如图4所示，扫描镜的倾斜角(其保持图像关于相机传感器静止)在“扫描”间隔中为时间的线性函数；该角度在“回扫”间隔期间重置到起始位置。相机传感器的曝光和读出行从传感器的一侧(行“1”)向另一侧(行“N”)扫掠然后以相反的方向(从行“N”回到行“1”)返回。虽然这起初看起来是违反直觉的，但是应理解，即使底物在与成像系统的物镜部件垂直的方向上移动，扫描镜仍然使底物(例如，阵列芯片)的一部分的图像“定格”在相机传感器上。由此，相机“看见”由移动的光条照亮的静止对象，其中，移动的光条每次覆盖与相机像素的一行(或几行)相对应的对象空间区域。在曝光的像素行的几行之后读出操作以滚动读出模式进行。
图4示出了曝光像素的第“N”行所需要的时间比读出存储在其中的图像数据所需要的时间短。由此，曝光操作占据所有可利用的扫描时间，即图像相对于相机传感器静止的时间。另一方面，读出操作基本上可连续地进行(在任何给定的扫描中，唯一的例外是在第一行的曝光时间开始之前出现的少量延迟。)
图4示出了用于单个行的曝光阶段、黑暗阶段和读出阶段。使用行“x”作为示例，曝光为照明持续“曝光”时间阶段432。(应注意在荧光图像中，以荧光激发波长对对象进行曝光而像素以荧光发射波长检测光)。“黑暗”时间阶段434紧接着曝光阶段432。在黑暗阶段434期间，信号与噪音都不在像素行“x”中聚集。行“x”的像素在“读取”时间阶段436期间被读出，“读取”时间阶段436在时间阶段434之后出现。因为曝光操作以比读出操作更高的速度进行，因此曝光操作和读出操作之间的时间阶段(例如，黑暗时间阶段)随着曝光光条横跨对象移动而增加。如图4所示，当传感器行以相反方向(例如，从行“N”回到行“1”)被曝光(用于新的图像)时，曝光阶段432、黑暗阶段434和读出阶段436在下一个扫描镜循环期间重复，这可在成像系统被配置成通过蛇形方式遍历对象来扫描对象(例如，底物)时发生。
分开读出相机传感器
在一些实施方式中，成像系统包括具有分开读出传感器的相机。分开读出传感器具有可独立于彼此进行曝光和读出的至少两个部分，其中传感器的一个部分中的曝光/读出操作可以关于传感器的其他部分中的曝光/读出操作并行或反并行执行。根据本文所述的扫描照明技术，在该实施方式中，分开读出传感器的每个部分利用单独的光条照明。单独的光条可以以多种方式生成。例如，单独的条发生器可用于生成用于每个单独的传感器部分的单独的光条，偏振可用于将光条引导至同一底物的不同部分上。在另一示例中，多个光学部件(例如，棱镜、半镀银镜等)可用于将光束从同一条发生器分成两个或两个以上单独的光条。
图5示出了根据示例性实施方式的分开读出相机传感器的图形。在图5中，2160像素乘2560像素的传感器被分成“部分1”和“部分2”。(图5的传感器中示出的像素数量对应于加利福尼亚州，苗比达(Milpitas)市，弗尔柴尔德成像公司(Fairchild Imaging)的SciMOS2051相机，并且仅被用作示例。其他相机可使用不同尺寸的分开读出传感器。)传感器的每个部分独立于其他部分被读出。分开读出传感器引起实现本文所述的滚动曝光模式和滚动读出模式的不同方式。
图6A和图6B示出了根据示例性实施方式使用分开读出相机传感器进行曝光区域和读出区域的并行操作的图形。图7A和图7B示出了根据示例性实施方式使用分开读出相机传感器进行曝光区域和读出区域的反并行操作的图形。图6A、图6B、图7A和图7B中的每个示出了相机传感器中的几个代表性的像素行。为了说明的目的，在图6A、图6B、图7A和图7B中的每个中仅示出了几个像素列；但是，应注意像素的列沿示出的传感器的整个宽度延伸，即，传感器是像素的行和列的网格。
除了图6A和图6B的传感器为具有两个部分的分开读出传感器之外，图6A和图6B中示出的传感器类似于图3中示出的传感器。曝光(标记为“曝光”)区域和读出(标记为“读取”)区域对(每个部分一对)在传感器的两个部分中以相同的方向移动。例如，曝光区域和读出区域对在图6A中的传感器的两个部分中自上而下移动并且在图6B中的传感器的两个部分中自下而上移动。这种操作模式在本文中被称作“并行”，因为传感器的成对的曝光区域和读出区域部分以相同方向移动。
图7A和图7B中示出的传感器类似于图6A和图6B的分开读出传感器。但是，在操作中，图7A和图7B的传感器中的曝光(标记为“曝光”)区域和读出(标记为“读取”)区域对在传感器的两个部分中以相反方向移动。例如，图7A示出了曝光区域和读出区域对在传感器的两个部分中彼此相对地移动，而图7B示出了曝光区域和读出区域对在传感器的两个部分中远离彼此移动。因为传感器部分中的曝光区域和读出区域对以相反方向移动，因此这种操作模式在本文中被称作“反并行”。
在一些实施方式中，图6A、图6B、图7A和图7B中所示的分开读出传感器的每个部分可具有与图4中所示的时序图类似的相关时序图。此外，图7A和图7B中的传感器的下部分的时序图可与图4中所示的时序图类似，但是具有行序“N”到“1”而不是“1”到“N”以说明传感器的两个部分中的曝光/读出操作的反并行性质。
虽然本公开中所述的照明、曝光和读出技术在具有停滞回扫时间间隔的可移动的扫描镜上使用，本领域的技术人员应认识到这些技术具有更广泛的适用性。例如，限制为小于全占空比图像获取的任何成像系统可受益于本文所述的技术。在另一示例中，本文所述的技术可在使用代替可移动的扫描镜进行扫描的旋转多面镜的成像系统中实现。
本文所述的扫描照明技术在使用以滚动曝光模式和滚动读出模式进行操作的数码相机、使用相关双采样、和/或防止全占空比图像获取的成像系统中是有用的。在示例性实施方式中，本文所述的技术可在使用基于荧光进行DNA测序的一个或多个CMOS相机的成像系统中实现；在本实施方式中，本文所述的技术有助于每天大约相当于100人类基因组数据的整体测序吞吐量。
示例性使用方法
图8示出了根据一个实施方式的用于对底物成像的示例性方法。出于说明的目的，下文中描述了如图8中被描述为通过包括成像系统的测序机执行的方法；然而，应理解，该方法的步骤能够通过多种不同类型的装置和成像系统执行。由此，图8中的方法并不限于通过任何特定类型的机器或装置执行，并且因此下文中的方法描述应为视为示例性含义、而非限制性含义。
在步骤802中，相机收集底物的一部分图像，其中图像在相机中跨越多个像素行。在一些实施方式中，定位台在垂直于物镜部件的光学轴线的平面中将底物移动到物镜部件下方，其中，底物包括作为成像目标的多个鲜明特征。在一些方面，底物包括具有布置在其上的靶核酸的阵列芯片，并且测序机包括成像系统，成像系统转而包括相机、定位台和物镜部件；相机可以是具有每秒1,000线至每秒1,000,000线的线速率的CMOS相机，并且定位台可以以100μm/s至1,000mm/s的速率移动底物。在一些方面，在底物处于运动期间，伺服机构改变扫描镜的角度以使通过物镜部件获得的底物部分的图像相对于相机保持静止。在一些方面，作为测序机的一部分或耦接至测序机的计算机装置执行用于与定位台配合来控制扫描镜的伺服机构的逻辑。例如，逻辑接收表示定位台的移动的反馈控制信息，并且使用该信息调节伺服机构的输入信号，伺服机构转而改变扫描镜的角度从而使扫描镜的运动和/或定时与定位台的运动和/或时序同步。
在步骤804中，当相机收集底物的一部分的图像时，成像系统连续且同时地执行(或导致被执行)步骤806、808和810在一些方面，当底物通过定位台移动时相机收集底物部分的静止图像。
在步骤806中，成像系统和/或其计算装置横跨正在成像的底物的一部分的扫描光条(或导致光条的扫描)，从而连续曝光由被收集图像所跨越的一个或多个像素行，而该图像所跨越的其他一个或多个行保持在黑暗中。在一些方面，横跨底物部分的光条的扫描与扫描镜的运动配合进行，扫描镜的运动使移动的底物的一部分的图像相对于相机保持静止。例如，耦合至成像系统的计算装置或者作为成像系统的一部分的计算装置执行使倾斜照明镜(其将光条从条发生器反射到扫描镜)的伺服机构与倾斜扫描镜的伺服机构配合的逻辑，从而使扫描镜的时序与照明镜的时序同步以引起光条在移动底物上的扫描。
在步骤808中，当横跨底物扫描光条时，作为测序机的一部分的计算装置或耦合至测序机的计算装置执行连续读出已被曝光且目前未获取到任何更多光的像素行的逻辑。例如，计算装置执行以滚动读出模式逐行读出曝光的像素行的逻辑。
操作中，步骤806和步骤808在步骤810中连续地同步，以使步骤808的读出操作读出正好(或即刻)位于由步骤806的曝光操作曝光的特定像素行之后的特定像素行。以此方式，图像数据从一些像素行的提取与其他(不同的)像素行中的另一图像的获取同时进行，从而提高了相机读出的效率，并因此提高了成像系统的总吞吐量。例如，在一些方面，曝光操作和读出操作的这种同步允许相机以55％至90％、90％至95％或甚至大于95％的读出效率操作。
测序系统和计算装置
在一些实施方式中，DNA样本(例如，表示整个人类基因组的样本或者表示外显子组的样本)的测序可以通过测序系统执行。图9A和图9B示出了示例性测序系统。
图9A和图9B是根据本文中所述的示例性实施方式的、配置成执行DNA测序的示例性测序系统900的框图。测序系统900能够包括多个子系统，例如，一个或多个测序机(如测序机990)、一个或多个计算机系统(如计算机系统997)和一个或多个数据存储库(如数据存储库995)。在图9A中示出的实施方式中，系统900的多种子系统能够通信地连接在一个或多个网络993上，网络993可以包括配置成便利远程系统之间的信息交换的封包交换或其他类型的网络基础结构装置(例如，路由器、交换机等)。在图9B中示出的实施方式中，测序系统900是测序装置，其中各种子系统(例如，测序机990、计算机997并且可能地，数据存储库995)是通信且操作性地耦接和集成在测序装置内的部件。
在一些工作环境中，图9A和图9B中示出的实施方式的数据存储库995和/或计算机系统997可以被配置在云计算环境内。在云计算环境中，包括数据存储库的存储装置和/或包括计算机系统的计算装置可以被分配和实例化成用作公用的和按需的；由此，云计算环境提供为服务有必要执行存储相关和/或计算任务的基础结构(例如，物理和虚拟机、原/块存储、防火墙、负载平衡器、聚合器、网络、存储簇等)、平台(例如，可以包括操作系统、编程语言执行环境、数据库服务器、网页服务器和应用服务器等的计算装置和/或解决方案堆)和软件(例如，应用、应用编程界面或API等)。
应注意，在多种实施方式中，本文中所述的技术能够通过多种系统和装置执行，其中，多种系统和装置包括多种配制和形成因素中的上面的子系统和部件(例如，测序机、计算机系统和数据存储库)中的一些或所有；由此，图9A和图9B中示出的示例性实施方式和配置应被视为示例性含义、而非约束性含义。
测序机被配置和操作成接收包括源自生物样本的片段的靶核酸的一个或多个底物，并且在靶核酸上进行测序。可以使用能够进行测序的任何合适的机器，其中，这种机器可以使用多种测序技术，多种测序技术包括但不限于通过杂交法测序、通过连接法测序、通过合成法测序、单分子测序和适合于通过使用本文中所述的成像系统从DNA生成测序读出结果的任何其他已知或以后开发的技术。在多种实施方式中，测序机能够测序靶核酸并且能够生成测序读出结果，其中，测序读出结果可以或可以不包括间隙并且可以或可以不是匹配成对(例如，配对末端)的读出结果。如图9A和图9B所示，测序机990测序底物992上的靶核酸并且获得测序读出结果994，测序读出结果994传输至数据存储库995以供(临时和/或永久)存储和/或通过一个或多个计算机系统997处理。根据本文中所述的技术，测序机990包括成像系统991，例如，图1A中示出的成像系统。
参照图9A和图9B，数据存储库995可以被实现在一个或多个存储装置(例如，硬盘驱动、光盘、固态硬盘驱动等)上，其中，一个或多个存储装置可以被配置为盘阵列(例如，SCSI阵列)、存储簇、或任何其他合适的存储机构。数据存储库的存储装置能够被配置为系统900的内部/整体部件或者可附接至系统900(例如，图9B中所示)的外部部件(例如，外部硬盘驱动或盘阵列)，和/或可以以例如，网格、一个存储簇、存储区域网络(SAN)和/或网络附接存储(NAS)(例如，图9A中所示)的适当的方式通信地互连。在多种实施方式和实现方式中，数据存储库可以被实现在存储装置上作为将信息存储为文件的一个或多个文件系统、将信息存储在数据记录中的一个或多个数据库和/或任何其他合适的数据存储机构。
计算机系统997可以包括一个或多个计算装置，其中，一个或多个计算装置包括通用处理器(例如，中央处理单元、或CPU)、存储器和能够随着配置数据和/或操作系统(OS)软件执行本文中所述的技术和方法中的一些或所有的计算机逻辑999。例如，在本文中所述的成像(例如，图像位置校正、伺服旋转控制、扫描镜旋转和控制、照明镜旋转和控制、芯片-定位台的移动和同步、反馈控制、图像数据读出等)中所涉及的任意方法能够通过包括能够配置成执行逻辑999以执行方法的多种步骤的处理器的计算装置完全或部分地执行。另外，虽然方法步骤可以表示为编号的步骤，但是应理解，本文中所述的方法的步骤能够同时执行(例如，通过在同一计算装置上或者在计算装置的簇中并行地执行的逻辑)或以不同的顺序执行。计算机逻辑999的功能可以被实现为单个集成模块(例如，实现在集成逻辑中)或者可以结合成可提供一些附加功能的两个或更多软件模块。
在一些实施方式中，计算机系统997可以是单个计算装置。在其他实施方式中，计算机系统997可以包括可通信地和/或操作性地互连在网格、簇或云计算环境中的多个计算装置。这种多个计算装置可以以不同的形成因素配置，其中，不同的形成因素诸如计算节点、叶片、或任何其他合适的硬件配置。出于这些理由，图9A和图9B中的计算机系统997应被视为示例性含义、而非约束性含义。
图10是示例性计算装置1000的框图，其中，作为测序机和/或计算机系统的一部分，示例性计算装置1000能够配置成执行指令以执行涉及成像的多种方法。
在图10中，计算装置1000包括经由一个或多个系统总线(如总线1075)直接或间接互连的若干部件。这种部件可以包括但不限于键盘1078、持久性存储装置1079(例如，硬盘、固态盘、光盘等)以及能够耦接有一个或多个显示装置(例如，LCD显示器、平板显示器、等离子屏幕等)的显示适配器1082。耦接至I/O控制器1071的外围设备和输入/输出(I/O)装置能够通过现有技术中已知的任意数量的方法连接至计算装置1000，包括但不限于一个或多个串行端口、一个或多个并行端口和一个或多个通用串行总线(USB)。外部接口1081(其可以包括网络接口可和/或串行端口)能够用于将计算装置1000连接至网络(例如，以太网或局域网(LAN))和/或连接至其他机器和装置。外部接口1081还可以包括能够从多种外部装置接收信息的若干个输入接口。经由系统总线1075的互连允许一个或多个处理器(例如，CPU)1073与每个连接的部件通信并且执行(和控制如下的执行)来自系统存储器1072和/或来自存储装置1079的指令，以及多种部件之间的信息交换。系统存储器1072和/或存储装置1079可以被实现为存储通过处理器1073执行的指令序列以及其他数据的一个或多个计算机可读非临时性存储介质。这种计算机可读非临时性存储介质包括但不限于随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、电磁介质(例如，硬盘驱动、固态驱动、拇指驱动、软盘等)、光学介质(如光盘(CD)或数字多功能盘(DVD))、闪存等等。多种数据值和其他结构化或非结构化信息能够从一个部件或子系统输出至另一个部件或子系统，能够经由显示适配器1082和合适的显示装置呈献给用户，能够经由外部接口1081在网络上发送至远程装置或远程数据存储库，或者能够(临时地和/或永久地)存储在存储装置1079上。
应理解，通过计算装置1000执行的任何方法和功能均能够通过模块或集成方式使用硬件和/或计算机软件以逻辑形式实现。当执行这种逻辑时，其被适配成执行涉及本文中所述的成像(例如，图像位置校正、伺服旋转控制、扫描镜旋转和控制、照明镜旋转和控制、芯片-定位台的移动和同步、反馈控制、图像数据读出等)的多种方法。
序列确定
本文中所述的成像系统可以用于多种生物化学分析。这种分析的一个示例是未知序列的靶核酸的序列确定。在多种实施方式中，多种测序方法学可用于使用本文中描述的成像系统确定核酸大分子的序列，其包括但不限于杂交方法(例如，美国专利第6,864,052号、第6,309,824号和第6,401,267号中所公开)、通过合成法的测序方法(例如，美国专利第6,210,891号、第6,828,100号、第6,833,246号、第6,911,345号的中所公开、Margulies等人(2005)的自然(Nature)437:376-380、以及Ronaghi等人的分析.生物化学.(Anal.Biochem.)242:84-89)、以及基于连接的方法(例如，美国专利第6,306,597号中所公开、以及Shendure等人(2005)的科学(Science)309:1728-1739)，其中，参照这些文献以提供教导。
在一些实施方式中，从布置在底物(例如，阵列芯片)上的靶核酸发出的荧光信号通过将它们成像到根据本文中所述的技术的相机的传感器阵列上而被记录。例如，在一些成像系统中，传感器阵列中的每个像素记录单独的荧光实验的结果，而在其他成像系统中每个实验使用多于一个的像素。
通常，生物化学底物允许数以百万计的待被并行地进行的生物化学实验。这种能力产生自用于以非常小的体积进行每个实验和用于将实验紧密绑定在一起的技术的发展。例如，在一些实施方式中，大量附接位点可以以有规则或随机图案方式配置在阵列芯片上，其中附接位点的数量可以优选地处于50亿至500亿的范围内，并且一般多处于如下的任何子范围内：使用有规则图案的实施方式中，两个相邻的附接位点的中心之间的间距可以处于250nm至1.5μm的范围内。在操作中，当大分子或其他靶核酸被布置在附接位点上时，多种实施方式优选地提供附接位点的60％至95％的单分子占用度；另外，多种实施方式中的产率(例如，以给定的成像运行发出信号的巨大分子或靶核酸的平均数量)可以优选地处于保持巨大分子或靶核酸的所有附接位点的35％至65％的范围内。
在一些实施方式中，DNA测序包括：对DNA样本进行化学处理、对经处理的样本进行物理分析以获得原始序列片段、以及使用计算算法将序列片段组装成完整的基因组。在用于DNA测序的一些方法中，多个化学处理和物理分析循环可用于在计算工作开始前建立原始序列数据。
在这种实施方式中，荧光成像用于通过设计生物化学反应来识别DNA碱基(A、C、G或T)以使得不同的彩色燃料(例如，红色、绿色、蓝色或黄色)对应于每一个。这种DNA实验对于每种颜色的图像可以随后通过物镜部件(例如，显微镜目标)取得。观察到的颜色指示特定化学处理步骤处的DNA碱基。从这种图像提取数据取决于记录由通过在底物(例如，芯片)上进行的数百万或者甚至是数十亿生物化学实验发出的荧光的颜色。
在一些实施方式中，本文中所述的成像系统可以用于整个人类基因组(例如，人类个体的基因组)的DNA测序。人类基因组测序的商业上的可行性部分取决于快速且精确地测序DNA的能力。因为它们支持大量并行DNA实验(例如，被高密度地布置在阵列芯片上)的处理，本文中所述的成像系统满足这些标准，并且能够促进快速且精确的基因组数据获得。
如结核本发明的优选实施方式详细描述的那样，在通过实施方式以许多不同形式满足本发明时，应理解，本公开应被解释成本发明概念的示例、而非旨在将本发明限制成本文中示出和描述具体实施方式。本领域的技术人员能够进行多种变型，而不背离本发明的精神。本发明的范围将由权利要求书及产生自本申请的其等同物定义。摘要和题目不应被解释成限制本发明的范围，因为它们的目的是为了让有关当局以及广大市民快速确定本发明的一般性质。权利要求书中遵循如下，即，除非使用术语“装置(means)”，否则其中记载的特征或元件均不应被解释为根据35U.S.C.§112,的装置加功能限定。
示例性测序平台
人类基因组的DNA测序的一个示例是由加利福尼亚州山景城的完整基因组测序公司(Complete Genomics,Inc.)商业开发的高精度的复合探针-锚定分子连接(combinatorial probe-anchor ligation；cPAL)测序。cPAL测序技术依靠独立地分析来自载入到图形化阵列芯片中的自组装DNA纳米球(“DNB”)的每个碱基。cPAL测序中的第一步骤是将随机分配的DNB载入到生物化学阵列芯片。DNB是串联体(concatemer)，其包含相同序列的适配子和表示靶核酸的DNA片段按顺序链接的多个拷贝；例如，在于2006年6月13日提交的、RadojeDrmanac等人的美国专利申请第11/451,691号中描述了这种多联体的生产，该美国专利申请的整体内容通过引用全部地记载于本文中。一组DNB包含能够全体地跨越整个人类基因组的DNA片段，但是当DNB第一次附接至阵列芯片上的附接位点时，在任何特定DNB经过的位置上不存在控制。另一方面，一旦DNB已附接至附接位点，则在所有后续液体处理步骤期间它们一直保持在那里并且不从一个位点移动到另一个位点。在后续处理步骤中，在阵列芯片上的DNB上方用多种试剂和缓冲液冲洗，并且用荧光成像系统记录来自DNB的荧光信号。
更具体地，cPAL测序技术包括以下步骤的循环。首先，锚定被杂交到DNB中的第一接口(通常刚好在适配子中的一个的5'或3'末端)。随后用锚定进行酶连接反应以完全简并例如标记有荧光染料的8-mer探针的探针群。探针可以具有例如约6-20个碱基的长度，优选地约7-12个碱基。在任何给定循环处，所使用的8-mer探针群被结构化成其位置中的一个或多个的身份与附接至8-mer探针的荧光团的身份相关，当采用7-mer探针时，用于识别刚好与适配子相邻的碱基的一组荧光团标记的探针可以具有以下结构：3'-F1-NNNNNNAp、3'-F2-NNNNNNGp、3'-F3-NNNNNNCp和3'-F4-NNNNNNTp(其中，“p”是可用于连接的磷酸盐)。在又一示例中，用于识别三个碱基进入来自适配子的靶核酸的碱基的荧光团标记的7-mer探针可以具有以下结构：3'-F1-NNNNANNp、3'-F2-NNNNGNNp、3'-F3-NNNNCNNp和3'-F4-NNNNTNNp。(应理解，这些都不是待被编录的基因组序列，而仅仅是出于示例性目的的结构示例。)对于所查询位置处的连接酶互补性判别的程度，荧光信号提供该碱基的身份。
在进行连接和四色成像后，锚定8-mer探针复合被剥离，并且开始新的循环。通过T4DNA连接酶，能够获得精确的序列信息直到来自连接结的六个或更多碱基，从而允许访问至少12个碱基对(bp)每适配子(来自5'和3'末端两者的六个碱基)，对于每4个适配子DNB总共48bp，对于每5个适配子DNB总共60bp等。
根据给定循环旨在查询哪个位置，构造不同的8-mer探针。具体地，8-mer探针内的单个位置与被标记的荧光团的身份相关。附加地，荧光团分子被附接至8-mer探针的相对于针对连接结的末端的相反末端。例如，锚定可以被杂交以使得其3'末端与靶核酸相邻。为了查询五个碱基进入靶核酸的位置，可以使用变质8-mer探针群，其中，探针与来自8-mer探针的5'末端的第五核酸相关，8-mer探针的5'末端是将连接到锚定的8-mer探针的末端。8-mer探针单独地标记有四个荧光团中的一种，其中，Cy5的荧光团与A相关，Cy3与G相关，德克萨斯红(Texas Red)与C相关，并且FITC与T相关。(虽然本示例描述了使用四个荧光团来查询单个碱基每个循环，但是应理解，每个循环可以使用8至16个荧光团或者更多，从而增加在任意一个循环期间能够被识别的碱基的数量。)
根据如下的多种因素可以选择cPAL或其他通过连接测序的方法的许多不同的变型，即：期望的测序提及、采用的苄基类型、用于每个库构建内的不同的适配子数量、每个循环查询的碱基数量、如何将DNB附接至阵列的表面、所期望的测序操作的速度、信号检测方法等等。
可以通过多种方式标记简并的(例如，8-mer)探针，包括直接或间接附接放射性部分、荧光部分、比色部分、化学发光部分等。用于标记DNA和构建DNA适配子的方法学的许多综述提供了可应用于构建本发明的寡核苷酸探针的指导。这种评论包括：Kricka(2002)，Ann.Clin.Biochem.，39:114-129，和Haugland(2006)；荧光探针和研究化学品手册(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals)，第10版(英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes,Inc.)，Eugene)；Keller和Manak(1993)，DNA探针，第2版(斯托克顿出版社，纽约，1993年)；以及Eckstein(1991),Ed.,寡核苷酸和类似物(Oligonucleotides and Analogues)：实用方法(A PracticalApproach)(IRL出版社，牛津)等。
在一个方面，一个或多个荧光染料被用作对于寡核苷酸探针的标记。标记还能够用量子点进行，正如通过引用并入本文的如下的美国专利和美国专利公开：第6,322,901号、第6,576,291号、第6,423,551号、第6,251,303号、第6,319,426号、第6,426,513号、第6,444,143号、第5,990,479号、第6,207,392号、第2002/0045045号、第2003/0017264号等。容易并入简并探针的市售的荧光核苷酸类似物包括，例如，瀑布蓝、瀑布黄、丹磺酰基、丽丝胺罗丹明B、海蓝、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、太平洋蓝、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、德克萨斯红、Cy荧光团、Alexa荧光团、荧光团等。还可以使用FRET串联荧光团。用于检测寡核苷酸的其他合适的标记可以使用荧光素(FAM)、地高辛(digoxigenin)、二硝基酚(DNP)、丹磺酰基、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六组氨酸(6xHis)、磷光体氨基酸(例如P-tyr、P-ser、P-thr)或任何其他合适的标记。
该测序循环的图像获取可通过包括本文中所述的成像系统的测序系统执行。数据提取可以通过执行由以编程语言(例如C/C++)编写的源代码编写的一系列二进制的计算装置执行，并且碱基呼叫和读出映射可以通过一系列Matlab和Perl脚本执行。例如，对于在待查询的靶核酸中的每个碱基(例如，对于12碱基，从各DNB的每个靶核酸部分的5'和3'末端读取6个碱基)，进行杂交反应、连接反应、成像和引物除去反应(primer stripping reaction)。为了确定在给定的位置处的流动装置上的阵列中每个DNB的身份，在进行生物测序反应后，使用对应于四种荧光的四种不同的波长对每个视野(“帧”)成像，例如使用8-mer。来自每个循环的图像均被存储在循环目录中，其中，来自各循环的图像可以被保存在循环目录中，其中，图像的数量为帧的数量的四倍(例如，如果采用四-荧光团技术)。循环图像随后可以被存储到分配用于下游处理的目录结构中。
数据提取通常需要两种数据类型：亮场图像以区分在阵列芯片中所有的DNB的位置；和在各测序循环的过程中获得的荧光图像集。计算装置执行数据提取软件以识别具有亮场图像的所有对象，然后对于这样的每个对象，计算每个测序循环的平均荧光值。对于任何给定的循环，存在四个数据点，对应于在不同的波长下拍摄的四个图像以查询该碱基是否为A、G、C或T。这些原始数据被合并，产生对于每个DNB的(可能间断的)测序读出结果。这些测序读出结果随后可以使用能够在包括一个或多个计算装置的一个或多个计算机系统上执行的多种技术和算法匹配至基准基因组。
选择的生物化学定义
本文中所述的多种实施方式可以使用通过涉及本领域的技术人员所实践的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学的传统技术制备的试剂、缓冲液和其他液体。这种传统的技术可以包括但不限于聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接以及使用标记检测杂交。适当技术的具体说明能够参照本文中的示例。然而，当然也能够使用其他等效程序。这种程序能够在标准实验室手册中找到，例如，Green等人编著(1999)，基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)(卷I-IV)；Weiner、Gabriel、Stephens编著(2007)，遗传变异：实验室手册(Genetic Variation:A Laboratory Manual)；Dieffenbach、Dveksler编著(2003)，PCR引物：实验室手册(PCR Primer:A LaboratoryManual)；Bowtell和Sambrook(2003)，DNA微阵列：分子克隆手册(DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual)；Mount(2004)，生物信息学：序列与基因组分析(Bioinformatics:Sequence and GenomeAnalysis)；Sambrook和Russell(2006，来自分子克隆的简明协议：实验室手册(Condensed Protocols from Molecular Cloning:A LaboratoryManual))；以及Sambrook和Russell(2002)，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(均来自冷泉港实验室出版社)；Stryer,L.(1995)生物化学(第四版)W.H.Freeman,NewYork N.Y.；Gait，“寡核苷酸合成：实用方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)”1984，IRL出版社，伦敦；Nelson和Cox(2000)，Lehninger，生物化学远离第三版(Principles of Biochemistry 3rd Ed.)，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；以及Berg等人(2002)生物化学，第五版，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，所有这些通过引用并入本文以用于所有目的。
“适配子(adaptor)”是指包括“适配元件”的设计结构，其中，一个或多个适配子可以被穿插在库结构的靶核酸内。包括在任何适配子中的适配元件或特征可以根据适配子的使用而广泛地变化，但是通常包括用于约束核酸内切酶识别和/或切割的位点，用于引物结合(例如，用于扩增库结构)或锚定引物结合(例如，用于对库结构中的靶核酸测序)的位点、切口酶位点等。在一些方面，适配子被设计成包括如下中的一个或多个：1)约20至约250个核苷酸、或约40至约100个核苷酸、或小于约60个核苷酸、或小于约50个核苷酸的长度；2)作为两个“臂”连接到靶核酸的特征；3)适配子的5'和3'末端处不同且独特的锚定结合位点以在相邻的靶核酸测序中使用；以及4)一个或多个约束位点。
“扩增子(amplicon)”是指多核苷酸扩增反应的产物。例如，自一条或多条起始序列复制得到的多核苷酸群。扩增子可以通过多种扩增反应来生成，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，线性聚合酶反应，基于核酸序列的扩增，循环依赖性扩增等等(参见如美国专利第4,683,195号、第4,965,188号、第4,683,202号、第4,800,159号、第5,210,015号、第6,174,670号、第5,399,491号、第6,287,824号和第5,854,033号；以及美国公开第2006/0024711号)。
“循环依赖性扩增(Circle dependent amplification)”或“CDA”是指双链环状模板的多重置换扩增，其使用退火到环状模板的两条链的引物以生成表示模板的两条链的产物，从而产生多杂交、引物扩展和链置换活动的级联。这导致了引物结合位点的数量的指数增加，并且一段时间内所生成的产物量的随之而来的指数增加。所使用的引物可以具有随机序列(例如，随机六聚体)或者具有具体序列以选择用于所期望产物的扩增。CDA产生一组串联体双链片段。
“循环依赖性复制(Circle dependent replication)”或“CDR”是指双链环状模板的多重置换扩增，其使用退火到环状模板的同一链的引物以生成宝石模板的仅一条链的产物。在CDR中，未生成附加的引物结合位点，并且产物的量仅随着时间而线性增加。所使用的引物可以具有随机序列(例如，一个或多个随机六聚体)或者具有具体序列以选择用于所期望产物的扩增。在没有结果产物的进一步修改的情况下，CDR经常产生具有串联的环状模板的链的多个拷贝的线性结构的创建，例如，模板的链的多个拷贝的线性多联体。
“互补”或“基本互补”是指核苷酸或核酸之间(例如，双链DNA分子的两条链之间或者单链核酸上的引物结合位点与寡核苷酸引物之间)的双链体的杂交、碱基配对或形成。互补核苷酸一般是A和T(或A和U)、或C和G。当核苷酸具有与至少大约80％(一般为至少大约90％至大约95％，并且甚至是大约98％至100％)的另一链配对的一个链(最佳地对齐且比较并且具有适当的核苷酸插入或缺失)时，两个单链RNA或DNA分子被称为基本互补。
“双链体(Duplex)”是指完全或部分互补的至少两个寡核苷酸或多核苷酸，并且在它们的核苷酸中的所有或大部分中其经历Watson-Crick型碱基配对，由此形成稳定的复合。术语“退火”和“杂交”可互换地使用以表示稳定的双链体的形成。参照双链体的“完美匹配”意味着制成双链体的多或寡核苷酸链形成彼此双链结构，以使得每条链中的每个核苷酸经历与另一条链中的核苷酸Watson-Crick型碱基配对。两个寡核苷酸或多核苷酸之间的双链体中的“错配”意味着双链体中的一对核苷酸未能经历Watson-Crick型碱基配对。
“荧光团”是指包含吸收特定吸收谱内的能量并以不同的(但是同样是特定的)发射谱再发射能量的官能团的或者由这样的官能团组成的分子。用作标记的优选的荧光团包括但不限于荧光素、瀑布蓝、六氯荧光素、四氯荧光素、TAMRA、ROX、FAM、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、4,4-二氟-5,7-联苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5,p-甲氧基苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-S-引达省-丙酸、6-羧基-X-若丹明、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基若丹明、德克萨斯红、曙红、4,4-二氟-5,7-联苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-丙酸、4,4-二氟-5,对乙氧基苯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-引达省3-丙酸和4,4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a,4a-二氮杂-S-引达省-丙酸,可以从马塞诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)获得的DyLight Fluor家族以及来自俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes)的Alexa Fluor家族。
“杂交”是指两条单链多核苷酸非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。所产生(并且通常)的双链多核苷酸是“杂合物(hybrid)”或“双链体”。“杂交条件”通常会包括低于大约1M、更通常的是低于大约500mM和低于大约200mM的盐浓度。“杂交缓冲液”是指缓冲盐溶液，诸如5％SSPE或者本领域已知的其他这种缓冲液。杂交温度可以低至5℃，但通常高于22℃，更通常的是高于大约30℃，并且通常超过37℃。杂交通常在严谨条件下进行，例如，探针会与其靶序列杂交的条件，但不会杂交到其他、非互补性序列的条件。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下是不同的。例如，较长的片段可能需要比短片段高的、用于具体杂交的杂交温度。因为其他因素(包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度)可能影响到杂交的严谨性，参数的组合比任何单独一项的绝对度量更为重要。严谨条件一般选择成比特定序列在限定的离子强度和pH的Tm低大约5℃。示例性的严谨条件包括在大约7.0至大约8.3的pH和至少25℃的温度下至少0.01M至不高于1M的钠离子浓度(或其他盐)的盐浓度。例如，5×SSPE(在pH 7.4下，750mM NaCl、50mM磷酸钠、5mM EDTA)和30℃温度的条件适合于等位基因特异性探针杂交。
“连接”是指在模板驱动的反应中在两条或更多条核酸(例如。寡核苷酸和/或多核苷酸)的末端之间形成共价键或联接(linkage)的过程。键或联接的本质可以广泛多样，并且可以酶促或化学地进行连接。如本文所用，连接一般以酶促法进行以在一条寡核苷酸的末端核苷酸的5'碳与另一核苷酸的3'碳之间形成磷酸二酯联接。在以下应用文献中描述了模板驱动链接反应：美国专利第4,883,750号、第5,476,930号、第5,593,826号和第5,871,921号。
本文中所使用的“多核苷酸”、“核酸”、“寡核苷酸”、“低聚糖”或语法等同术语通常指共价连接在一起的至少两个核苷酸。核苷酸由核碱基(或仅称为“碱基”)、五碳糖(例如，核糖或2'-脱氧核糖)以及形成核苷酸骨架的1-3个磷酸基团组成。碱基(例如，4个主要核苷酸碱基C、G、A、T和RNA中的碱基U中的一个)和糖共同地组成核苷。多核苷酸通常含有磷酸二酯键，但是在一些情况下，可以包括核酸类似物，其具有其他的骨架，例如，亚磷酰胺、二硫代磷酸酯或甲基亚磷酰胺连接，以及肽核酸骨架和链接。其他核酸类似物包括具有二环结构的那些类似物，包括锁核酸、带正电骨架、非离子型骨架和非核糖骨架。
“引物”是指天然或合成的寡核苷酸，在形成与多核苷酸模板的双链体后，其能够充当核酸合成开始的点，并且沿着模板从其端部中的一个延伸以形成延伸的双链体。在延伸过程中添加的核苷酸序列通过模板多核苷酸的序列确定。引物一般由DNA聚合酶延伸。
“Tm”是通常被定义为双链核酸分子群中有一半被解离成单链的温度。本领域熟知用于计算核酸的Tm的等式。如标准参考文献所示，Tm值的简单估算可通过如下等式来计算：Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])0.41(％[G+C])-675/n-1.0m，当核酸存在于0.5M或更少的阳离子浓度的水溶液中时，(G+C)含量处于30％与70％之间，“n”是碱基的数量，“m”是碱基对错配的百分比(参见例如，Sambrook J等人，“分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)”，第三版，冷泉港实验室出版社(2001))。其他参考文献包括更复杂的计算，其将结构以及序列特性考虑到Tm的计算(还参见，Anderson和Young(1985)，定量过滤杂交，核酸杂交(Quantitative Filter Hybridization，Nucleic Acid Hybridization)，以及Allawi和SantaLucia(1997)，生物化学(Biochemistry)36:10581-94)。
已参照具体实施方式解释了本发明。参照本说明，其他实施方式对于本领域的技术人员将是显而易见的。因此，除了由随附的权利要求书指定以外，并不是旨在限制本发明。

Claims (15)

1.一种用于操作成像系统的方法，所述方法包括：
在所述成像系统中经由数码相机收集底物的一部分的图像，其中所述图像跨越所述相机中的传感器元件的多行像素；
当所述相机收集所述底物的一部分的图像时，执行以下步骤：
横跨所述底物的一部分扫描光条从而曝光由所述图像跨越的第一至少一行像素，同时使由所述图像跨越的第二至少一行像素保持在黑暗中；以及
读出所述第一至少一行像素，同时继续横跨所述底物的一部分扫描所述光条从而曝光所述第二至少一行像素。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
在所述成像系统的物镜部件下方移动所述底物；
改变扫描镜的角度，使得当所述底物移动时，由所述物镜部件获取的、所述底物的一部分的图像相对于所述相机保持静止。
3.根据权利要求2所述的方法，其中
改变所述扫描镜的角度与横跨所述底物的一部分扫描所述光条配合执行。
4.根据权利要求2所述的方法，其中：
改变所述扫描镜的角度包括第一时间间隔和第二时间间隔，在所述第一时间间隔期间，横跨所述底物的一部分扫描所述光条，在所述第二时间间隔期间，所述扫描镜返回初始位置；以及
所述方法还包括在所述第二时间间隔期间中止横跨所述底物的一部分扫描所述光条。
5.根据权利要求4所述的方法，其中
所述第一时间间隔大于所述第二时间间隔。
6.根据权利要求2所述的方法，其中
当所述底物沿着垂直于所述物镜部件的光学轴的方向移动时，执行对所述第一至少一行像素的读出。
7.根据权利要求1所述的方法，其中
横跨所述底物的一部分扫描所述光条包括改变照明镜的角度以将光从条发生器反射至所述底物的一部分上。
8.根据权利要求7所述的方法，其中
改变所述照明镜的角度由被配置成使所述照明镜倾斜的伺服机构实现。
9.根据权利要求7所述的方法，还包括：
在所述成像系统的物镜部件下方移动所述底物；
改变扫描镜的角度，使得当所述底物移动时，由所述物镜部件获取的、所述底物的一部分的图像相对于所述相机保持静止。
10.根据权利要求1所述的方法，还包括
在曝光所述第一至少一行像素的步骤与读出所述第一至少一行像素的步骤之间使所述第一至少一行像素保持黑暗。
11.根据权利要求1所述的方法，其中
所述相机包括至少具有第一部分和第二部分的分开读出传感器，并且扫描所述光条和读出所述光条的步骤在所述分开读出传感器的每个部分中独立执行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中
所述第一部分中的扫描和读出步骤与所述第二部分中的扫描和读出步骤并行执行。
13.根据权利要求11所述的方法，其中
所述第一部分中的扫描和读出步骤与所述第二部分中的扫描和读出步骤反并行执行。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括
当所述相机收集所述底物的一部分的所述图像时，读出所述第二至少一行像素同时继续横跨所述底物扫描所述光条从而曝光由所述图像跨越的第三至少一行像素，其中所述第三至少一行像素不同于所述第二至少一行像素。
15.根据权利要求1所述的方法，其中
所述相机为以全帧模式操作的CMOS相机和非CMOS相机中的一种。
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