CN104422737B - 一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药质量检测领域，涉及一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，尤其是一种中药复方制剂防己黄芪汤指标性成分含量的快速检测方法。本发明方法，采用50%甲醇超声提取，应用HPIC-DAD法一次性同时测定防己黄芪汤中防己、黄芪和甘草中的防己诺林碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸5种成分的含量。解决了同时对防己黄芪汤中黄芪、防己和甘草三味药材进行质量控制的难题，避免了对5种指标性成分多次检测的时间和试剂耗费。本方法操作简便，工作效率和精度高。

Description

一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法

技术领域

本发明涉及中药质量检测领域，涉及一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，尤其是一种中药复方制剂防己黄芪汤指标性成分含量的快速检测方法。

背景技术

中药复方制剂防己黄芪汤出自《金匮要略》,张仲景“金匮要略·水气病篇”有皮、风水,说:“皮水为病,四肢肿,水气在皮肤中,四肢聂聂动者,防己黄芪汤主之。”该方为风湿在表，卫虚不固而症见脉浮身重，汗出恶风而设。全方主要由防己、黄芪、白术、甘草组成，有益气固表，健脾渗湿之功效。临床加减可用于治疗风湿性心脏病、风湿性关节炎、慢性肾炎和慢性肾小球肾炎等病症，此外在骨伤科方面也有临床运用。

所述的防己黄芪汤方中以防己祛风行水；黄芪益气固表,且能行水消肿,两者配伍,祛风不伤表,固表不留邪,且又行水气,而共为君药；臣以白术补气健脾祛湿,与黄芪为伍则益气固表之力增,与防己相配则祛湿行水之功倍；使以甘草,培土和中,调和药性；诸药相合,共奏益气祛风,健脾利水之效,使风邪得除,表气得固,脾气健旺,水湿运化,于是风水,风湿之表虚征,悉得痊愈。

现有技术公开了中药黄芪，补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，毛蕊异黄酮葡萄糖苷是其药材含量测定的指标性成分之一，文献如2010年《中华人民共和国药典》：283-284。

中药防己祛风止痛，利水消肿，防己诺林碱和粉防己碱是其药材含量测定的指标性成分，文献如2010年《中华人民共和国药典》：139-140。

中药甘草补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药，甘草苷和甘草酸是其药材含量测定的指标性成分，文献如2010年《中华人民共和国药典》：80-81。

目前，尚无全面控制中药复方制剂防己黄芪汤其质量的检测方法，现有技术中，仅能对该复方制剂中的某几种成分或2种成分采用高效液相色谱分别进行含量测定，来片面地反映防己黄芪汤的质量，如李伟等[防己黄芪颗粒的提取工艺研究.中药新药与临床药理.2006,17(2):137-154）]采用高效液相色谱-紫外检测测定防己黄芪颗粒中防己诺林碱和粉防己碱的含量，采用HPLC-ELSD检测测定防己黄芪颗粒中黄芪甲苷的含量。所述的检测方法尚不能对防己黄芪汤的质量的优劣进行全面有效地衡量。鉴于此，本申请的发明人拟建立一种检验效率高、定量准确的检测方法，以满足防己黄芪汤指标性成分含量的快速检测，进一步全面有效地衡量该复方制剂的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，尤其是一种快速检测中药复方制剂防己黄芪汤指标性成分含量的方法。本检测方法能一次性地快速检测所述复方制剂中的5种成分，可进一步全面有效地衡量该复方制剂的质量，弥补现有技术的不足。

本发明在对防己黄芪汤的组方进行研究分析的基础上，确定了该中药复方制剂的指标性成分，其中的黄芪和防己为方中首要的、针对主病起主要治疗作用的君药，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、防己诺林碱和粉防己碱在药材中含量较多，且为《药典》规定的检测指标，故选为指标性成分；白术在《药典》中仅有定性检查苍术酮，文献报道的白术内酯与防己黄芪汤治疗的疾病关联度不大，故暂不列入指标性成分；甘草中甘草酸和甘草苷均有文献报道药理作用为抗炎镇痛，其与防己黄芪汤治疗的疾病联系紧密，列入指标性成分。

具体的，本发明的一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，其特征在于，其包括步骤;

(1)制备对照品溶液：分别取防己诺林碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成含防己诺林碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的混合溶液作为对照品溶液;

(2)制备防己黄芪汤提取浓缩液：防己、黄芪等药味先以10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5h；再以12倍量水煎煮2次，每次1.5h，最后合并所有水提取液及醇提液，浓缩，浓缩为：0.8-1.3g浓缩液/g生药材；

（3）制备供试品溶液:取防己黄芪汤提取浓缩液，精密称定总重，置25m1量瓶中，加甲醇定容，超声处理，放冷至室温，补加甲醇定容，摇匀，高速离心，取上清液为供试品溶液；

（4）液相色谱仪测定:将混合对照品溶液稀释，注入液相色谱仪进行测定，用外标法测定5种组分的含量；

所述高效液相色谱仪的设定条件:DIKMADIAMONSIL(2)C18（250mm*4.6mm，5um）色谱柱；以甲醇为流动相A，0.2M乙酸铵、0.1%甲酸为流动相B，梯度洗脱:0-15min,10-14%A；15-20min,14%-24%A；20-25min,24%-30%A;25-40min,30%-50%A；40-50min,50%-100%A；50-55min,100%A;55-60min,100%-50%A；60-65min,50%-10%A；65-80min,10%A；流速为0.75m1/min；柱温为:30℃。检测波长：254nm和270nm。

检测结果显示：由于所采用的色谱分析条件，明显改善了现有技术所采用的单纯用酸性溶液作为流动相分析甘草苷、甘草酸、防己诺林碱和粉防己碱的灵敏度；本发明所采用的色谱分析条件其线性、精密度、重复性、重复性和加样回收均良好，且均符合2010版《药典》规定。

本发明检测方法的有益效果是；

解决了防己黄芪汤成分复杂所导致的提取问题，同时亦解决了测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸、防己诺林碱和粉防己碱这5种成分干扰多的问题，避免了对这5种成分必须多次进行检测所产生时间和试剂的耗费的缺陷，本方法简便、稳定可靠，明显提高了检测的工作效率和灵敏度，可以更加全面有效地控制防己黄芪汤的质量，以及控制具有主要治疗作用的防己、黄芪、甘草药材的质量。

本发明的检测方法可用于制定中成药质量控制的标准方法，尤其是所述的中成药中同时含有黄芪、防己和甘草药材。

附图说明

图1是本发明的防己黄芪汤中5种指标性成分的对照品混合溶液的色谱图；

图2是本发明的防己黄芪汤样品溶液的色谱图；

图3是本发明的防己黄芪汤中缺黄芪的阴性样品溶液的色谱图；

图4是本发明的防己黄芪汤中缺甘草的阴性样品溶液的色谱图；

图5是本发明的防己黄芪汤中缺防己的阴性样品溶液的色谱图；

图1至图3中，1是毛蕊异黄酮葡萄糖苷，2是甘草苷，3是防己诺林碱，4是粉防己碱，5是甘草酸。

具体实施方式

本发明实验中采用：

仪器与试药：Agilent1200高效液相色谱仪，G1315DDAD检测器，上海精科仪器有限公司FA1004N电子天平，甲醇为HPLC级，其他试剂为分析纯，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（上海永恒生物科技有限公司，批号：20120428）、甘草苷（上海永恒生物科技有限公司，批号：20100805）、甘草酸（上海永恒生物科技有限公司，批号：20130128）、防己诺林碱（上海永恒生物科技有限公司，批号：20110729）和粉防己碱（上海永恒生物科技有限公司，批号：20110928）。

实施例1

本实施例按下述步骤快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法

(1)制备对照品溶液：分别取防己诺林碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含防己诺林碱100ug、粉防己碱100ug、毛蕊异黄酮葡萄糖苷50ug、甘草苷100ug和甘草酸100ug的混合溶液作为对照品溶液;

(2)制备防己黄芪汤提取浓缩液：防己、黄芪等药味先以10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5h；再以12倍量水煎煮2次，每次1.5h(参照现有技术：中药新药与临床药理.2006，17（2）：137-154)，最后合并所有水提取液及醇提液，浓缩，浓缩为：0.8-1.3g浓缩液/g生药材；

（3）制备供试品溶液:取防己黄芪汤提取浓缩液0.6g，精密称定总重，置25m1量瓶中，加50%甲醇定容，超声处理30分钟，放冷至室温，补加50%甲醇定容至25m1，摇匀，高速离心12000转/分钟，15分钟，取上清液为供试品溶液；

（4）液相色谱仪测定:将混合对照品溶液稀释，进样10u1，注入液相色谱仪进行测定，用外标法测定5种组分的含量；

所述高效液相色谱仪的设定条件:DIKMADIAMONSIL(2)C18（250mm*4.6mm，5um）色谱柱；以甲醇为流动相A，0.2M乙酸铵、0.1%甲酸为流动相B，梯度洗脱:0-15min,10-14%A；15-20min,14%-24%A；20-25min,24%-30%A;25-40min,30%-50%A；40-50min,50%-100%A；50-55min,100%A;55-60min,100%-50%A；60-65min,50%-10%A；65-80min,10%A；流速为0.75m1/min；柱温为:30℃。检测波长：254nm和270nm。

表1进样量与峰面积积分值

表1

表2是各成分回归方程及相关系数。

表2

精密度试验:精密吸取对照品溶液10uL.重复进样6次，测定峰面积积分值，测定结果如表3所示，测定结果表明，各成分精密度均良好，能够满足测定需要。

表3是精密度测定结果。

表3

重复性试验:取防己黄芪汤提取物0.6g，按照供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，测定含量，测定结果如表4所示，测定结果表明，本方法的重复性良好。

表4是重复性测定结果。

表4

稳定性试验:取防己黄芪汤提取物0.6g，按照供试品溶液制备方法制备1份供试品溶液，分别在0,5,9,21,63,65小时进样1次，测定峰面积积分值，结果如表5所示，测定结果表明，供试品溶液在65小时内稳定性良好。

表5

回收率试验:采用加样回收法，取防己黄芪汤提取物0.3300g，精密称定总重(精密至lmg)，分别准确加入5种对照品，按照供试品溶液制备方法制备，并按含量测定方法进行测定，计算回收率，结果如表6所示，测定结果表明，各成分加样回收率均良好。

表6

本发明建立的快速检测方法，尤其是高效液相色谱-紫外检测法一次性高效检测防己黄芪汤中的5种指标性成分含量，具有操作简便，灵敏度高、精密度好，重复性高的特点，可进一步做为防己黄芪汤及同时或部分含有防己、黄芪、甘草的制剂质量控制的标准方法。

Claims (6)

1.一种快速检测中药复方制剂中指标性成分含量的方法，其特征在于，其包括步骤；

(1)制备对照品溶液：分别取防己诺林碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸对照品，精密称定，加甲醇制成含防己诺林碱、粉防己碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的混合溶液作为对照品溶液；

(2)制备防己黄芪汤提取浓缩液：防己、黄芪和白术及甘草中药材以10倍量70％乙醇回流提取2次，每次1.5h；再以12倍量水煎煮2次，每次1.5h，最后合并所有水提取液及醇提液，浓缩为：0.8-1.3g浓缩液/g生药材；

(3)制备供试品溶液:取防己黄芪汤提取浓缩液，精密称定总重，置25m1量瓶中，加甲醇定容，超声处理，放冷至室温，补加甲醇定容，摇匀，高速离心，取上清液为供试品溶液；

(4)液相色谱仪测定:将混合对照品溶液稀释，注入液相色谱仪进行测定，用外标法测定5种组分的含量；

所述高效液相色谱仪的设定条件为：

DIKMADIAMONSILC18(2)250mm*4.6mm，5μm色谱柱；以甲醇为流动相A，0.2M乙酸铵、0.1％甲酸为流动相B，梯度洗脱:0-15min,10-14％A；15-20min,14％-24％A；20-25min,24％-30％A；25-40min,30％-50％A；40-50min,50％-100％A；50-55min,100％A；55-60min,100％-50％A；60-65min,50％-10％A；65-80min,10％A；流速为0.75mL/min；柱温为:30℃，检测波长：254μm和270μm。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，作为对照品溶液的混合溶液每lmL含防己诺林碱100μg、粉防己碱100μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷50μg、甘草苷100μg和甘草酸100μg。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，取防己黄芪汤提取浓缩液，加50％甲醇定容。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的中药复方制剂选自防己黄芪汤。

5.权利要求1所述的方法在制定中成药质量控制的标准方法中的用途。

6.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的中成药中同时含有黄芪、防己和甘草药材。