CN104402963A

CN104402963A - 一种七叶皂苷钠的制备方法

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Publication number: CN104402963A
Application number: CN201410594483.2A
Authority: CN
Inventors: 刘享平; 石召华; 关小羽; 董慧君; 叶利春; 谢健
Original assignee: WUHAN AIMIN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Wuhan Aimin Pharmaceutical Co., Ltd
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-10-29
Also published as: CN104402963B

Abstract

本发明公开了一种七叶皂苷钠的制备方法，它是先将娑罗子用30％～70％乙醇溶液提取，提取液用截留分子量为10000-15000道尔顿的超滤膜过滤，滤液再先后上大孔树脂柱和聚酰胺树脂柱纯化，纯化后的七叶皂苷与氢氧化钠反应生成七叶皂苷钠，最后再结晶获得七叶皂苷钠纯品。本发明制备的七叶皂苷钠纯度达100％，其中七叶皂苷钠A的含量为30-40％、七叶皂苷钠B的含量为15-20％、七叶皂苷钠C的含量为25-30％、七叶皂苷钠D的含量为10-15％，七叶皂苷钠A、B、C、D占总皂苷的85-90％。毒性试验结果表明，本发明制备的七叶皂苷钠静脉注射给药小鼠LD₅₀为12.45mg/Kg，安全性较高。

Description

一种七叶皂苷钠的制备方法

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种七叶皂苷钠的制备方法。

背景技术

七叶皂苷又称七叶皂苷酸，为从七叶树科七叶树属植物种子提取得到的总皂苷、β-七叶皂苷或异七叶皂苷等的总称，属于三萜皂苷类。七叶皂苷的水溶解度较差，为增加其溶解度，常将其制成钠盐，七叶皂苷钠具有抗炎、抗水肿等多种功效，可用于脑水肿、创伤等疾病的治疗。

七叶皂苷主要含有4种成分。我国国家标准按液相色谱出峰前后，依次命名为七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D。其中七叶皂苷A和B是β-型七叶皂苷，其结构基本相同，因而七叶皂苷A和B可合并用结构式(1)表示；而七叶皂苷C和D也互为异构体，属于异性七叶皂苷，又称异七叶皂苷，可合并结构式(2)来表示。

目前国内多数厂家采用有机溶剂萃取来纯化七叶皂苷，再经过钠离子型阳离子交换树脂制备七叶皂苷钠，此方法产品收率和纯度低，生产周期长，且易造成有机残留，环境污染，不适宜大批量生产。

CN102659897A发明专利公开了一种七叶皂苷钠的制备方法，它是以娑罗子粉为原料，10％的乙醇提取，提取液离心后上大孔树脂柱，先用纯化水洗涤树脂，然后用95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩并再次离心后用中性氧化铝柱层析精制，最后再进行醇沉、干燥。采用该方法可以得到含量为100％左右的总皂苷，其中七叶皂苷钠A的含量为41-45％，七叶皂苷钠B的含量为33-35％，纯化周期约为60小时。

七叶皂苷钠具有一定的毒性，最常见的不良反应有静脉炎、过敏性休克、肝肾损害等，从而限制了它的临床应用。已有研究表明，控制七叶总皂苷的纯度和七叶皂苷A、B、C、D的比例能够有效降低七叶皂苷钠的毒性(齐鲁药事，2009，vol.28,No.5，薛云丽等)。

发明内容

本发明的目的是提供一种能降低毒性和不良反应的七叶皂苷钠制备方法，该方法得到的七叶皂苷钠不仅纯度高，而且纯化周期短。

本发明的技术方案是：

一种七叶皂苷钠的制备方法，包括以下步骤：

1)以娑罗子为原料，用30％～70％乙醇溶液进行提取，收集提取液；

2)提取液经高速离心后用截留分子量为10000-15000道尔顿的超滤膜过滤；

3)将滤液回收提取溶剂并加水溶解，然后上大孔树脂柱吸附，依次用纯水、20％～40％乙醇溶液、50％～70％乙醇溶液洗脱，收集50％～70％乙醇溶液的洗脱液；

4)将收集到的洗脱液减压回收溶剂至无醇味，加水溶解，过聚酰胺树脂柱，收集流出液，再以10～30％乙醇溶液洗脱；

5)将步骤4)中的洗脱液与流出液合并减压浓缩成浸膏，按浸膏体积的0.5～2倍加水溶解，用0.5～5％的氢氧化钠溶液调节pH值至8～11，再按水溶液体积的0.5～2倍加丙酮，搅拌，析出白色沉淀，过滤沉淀，干燥，即得。

优选地，步骤1)中，用50％乙醇溶液进行提取。

优选地，所述超滤膜为聚砜超滤膜。

进一步优选地，所述超滤膜的截留分子量为12000道尔顿。

优选地，步骤3)中，依次用纯水、30％乙醇溶液、60％乙醇溶液洗脱，收集60％乙醇溶液的洗脱液。

优选地，步骤5)中，按浸膏体积的1倍加水溶解，用2％的氢氧化钠溶液调节pH值至9，再按水溶液体积的1倍加丙酮，搅拌，析出白色沉淀，过滤沉淀，干燥，即得。

本发明中所涉及到的百分含量均是指重量含量，如30％～70％的乙醇溶液，指的是每100g溶液中含有乙醇30～70g；2％的氢氧化钠溶液，指的是每100g溶液中含有氢氧化钠2g。

本发明的有益效果是：

1)本发明制备的七叶皂苷钠纯度达100％，其中七叶皂苷钠A的含量为30-40％、七叶皂苷钠B的含量为15-20％、七叶皂苷钠C的含量为25-30％、七叶皂苷钠D的含量为10-15％，七叶皂苷钠A、B、C、D占总皂苷的85-90％。

2)毒性试验结果表明，本发明制备的七叶皂苷钠静脉注射给药小鼠LD₅₀为12.45mg/Kg，安全性较高。

3)本方法工艺简单，生产周期短，制备1.5Kg左右的七叶皂苷钠总共只需45小时。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细地说明，但不应理解为是对本发明保护范围地限制。

实施例1 超滤工艺研究

1)七叶皂苷钠A、B、C、D含量测定法

色谱条件与系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-磷酸溶液(取85％磷酸5.5ml，用水稀释至1000ml)(33:67)为流动相，调节pH值至2.1；检测波长为220nm。理论板数按七叶皂苷A峰计不低于3500，七叶皂苷A峰和七叶皂苷B峰、七叶皂苷B峰和七叶皂苷C峰的分离度均应符合规定。

测定法：精密称取七叶皂苷对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成每1ml含2.5mg的溶液，作为对照品溶液。精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图中有4个主成分峰，出峰顺序依次为七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D。另取本品适量，用甲醇稀释制成每1ml约含七叶皂苷钠2.5mg的溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定与对照品溶液中七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C、七叶皂苷D位置相对应峰的峰面积，用面积归一法求得各组分含量百分比。

2)总皂苷测定方法：

对照品配制：取七叶皂苷钠对照品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加冰醋酸溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

样品处理：精密量取样品5ml，置瓷蒸发皿中，在水浴上蒸干，加冰醋酸溶解，并移至50ml量瓶中，用冰醋酸分次洗涤蒸发皿，洗液并入量瓶中，加冰醋酸稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml，分别置25ml量瓶中，各加三氯化铁溶液(取三氯化铁0.15g，加冰醋酸50ml使溶解，在冷却状态下缓缓加硫酸50ml，混匀，经超声处理除去气泡，即得)稀释至刻度，摇匀，在60℃水浴中加热25分钟，并时时振摇，取出，迅速放冷至室温，照分光光度法(中国药典2010年版二部附录Ⅳ A)，立即在540nm的波长处测定吸收度，计算。

3)超滤操作压力

操作温度为35℃，分别采用压力为0.3、0.4和0.5MPa测试膜通量大小，压力在0.3～0.5MPa的平均通量分别为17.8L/(m2.h)和22.8L/(m2.h)和23.0L/(m2.h)。通量随工作压力增大而增加，操作压力0.4MPa以上对通量提升无明显效果，所以实际操作压力定为0.4MPa比较合理，此时的膜初始通量为22.8L/(m2.h)。

4)超滤膜材对比

操作温度35℃，压力0.5MPa，pH值5.8，截留分子量20KD，结果见表1。

表1超滤膜材对总皂苷含量和收率的影响

材质	平均通量L/(m2.h)	总皂苷含量	皂苷收率
				聚砜	23.0	50％	99％
聚酰胺	20.1	48％	99％
				醋酸纤维	25.0	40％	90％

从以上结果得出，选用聚砜超滤膜得到的总皂苷含量和收率最高。

5)超滤膜孔径对比：聚砜超滤膜，操作温度35℃，压力0.5MPa，pH值5.8，结果见表2。

表2超滤膜孔径对总皂苷含量和收率的影响

截留分子量	平均通量L/(m2.h)	总皂苷含量	皂苷收率
				6KD	12.2	60％	95％
12KD	20.1	58％	99％
				20KD	23.0	50％	99％
50KD	30.2	46％	99％

从以上结果得出，采用12KD的超滤膜得到的皂苷收率最高，且总皂苷含量相对较高。

6)超滤对皂苷品质影响(皂苷A、B、C、D成分面积比例)，结果见表3。

表3超滤工艺对七叶皂苷A、B、C、D含量的影响

从以上结果可以看出，与没有进行超滤的工艺相比，超滤工艺对总皂苷和皂苷A、B、C、D的含量均有较大影响。

实施例2

一种七叶皂苷钠的制备方法，其步骤如下：

1)取娑罗子50Kg，加入200Kg重量浓度为50％的乙醇溶液进行回流提取，提取时间是3小时，收集提取液；

2)提取液经高速离心脱渣后用截留分子量为12000道尔顿的聚砜超滤膜过滤，过滤的温度为35℃，压力为0.4MPa，料液pH值为5.8；

3)将滤液回收乙醇并加2倍体积的水溶解，然后上NKA型大孔树脂柱吸附，依次用纯水、30％乙醇溶液、60％乙醇溶液洗脱，收集60％乙醇溶液的洗脱液；

4)将收集到的洗脱液减压回收溶剂至无醇味，加2倍水溶解，过聚酰胺树脂柱，收集流出液，再以10％乙醇溶液洗脱5倍柱体积；

5)将步骤4)中的洗脱液与流出液合并减压浓缩成浸膏，按浸膏体积的1倍加水将浸膏溶解，用2％的氢氧化钠溶液调节浸膏水溶液的pH值至9，再按水溶液体积的1倍加丙酮，搅拌，析出白色沉淀，过滤沉淀，干燥，即得。

本发明制备的七叶皂苷钠总量为1.6Kg，其纯度达100.2％，其中七叶皂苷钠A的含量为33.7％、七叶皂苷钠B的含量为16.2％、七叶皂苷钠C的含量为26.7％、七叶皂苷钠D的含量为12.1％，七叶皂苷钠A、B、C、D占总皂苷的88.7％，生产周期为45小时。

实施例3

一种七叶皂苷钠的制备方法，其步骤如下：

1)取娑罗子50Kg，加入150Kg重量浓度为70％的乙醇溶液进行回流提取，提取时间是2小时，收集提取液；

2)提取液经高速离心脱渣后用截留分子量为10000道尔顿的聚砜超滤膜过滤，过滤的温度为40℃，压力为0.3MPa，料液pH值为5.0；

3)将滤液回收乙醇并加1倍体积的水溶解，然后上D101型大孔树脂柱吸附，依次用纯水、20％乙醇溶液、50％乙醇溶液洗脱，收集50％乙醇溶液的洗脱液；

4)将收集到的洗脱液减压回收溶剂至无醇味，加1倍水溶解，过聚酰胺树脂柱，收集流出液，再以30％乙醇溶液洗脱4倍柱体积；

5)将步骤4)中的洗脱液与流出液合并减压浓缩成浸膏，按浸膏体积的0.5倍加水溶解，用0.5％的氢氧化钠溶液调节pH值至8，再按水溶液体积的2倍加丙酮，搅拌，析出白色沉淀，过滤沉淀，干燥，即得。

本发明制备的七叶皂苷钠总量为1.45Kg，纯度达99.7％，其中七叶皂苷钠A的含量为31.2％、七叶皂苷钠B的含量为17.8％、七叶皂苷钠C的含量为25.8％、七叶皂苷钠D的含量为10.6％，七叶皂苷钠A、B、C、D占总皂苷的85.4％，生产周期为43小时。

实施例4

一种七叶皂苷钠的制备方法，其步骤如下：

1)取娑罗子50Kg，加入250Kg重量浓度为30％的乙醇溶液进行回流提取，提取时间是1小时，收集提取液；

2)提取液经高速离心脱渣后用截留分子量为15000道尔顿的聚砜超滤膜过滤，过滤的温度为50℃，压力为0.5MPa，料液pH值为6.5；

3)将滤液回收乙醇并加1倍水溶解，然后上AB-8型大孔树脂柱吸附，依次用纯水、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液洗脱，收集70％乙醇溶液的洗脱液；

4)将收集到的洗脱液减压回收溶剂至无醇味，加水溶解，过聚酰胺树脂柱，收集流出液，再以20％乙醇溶液洗脱；

5)将步骤4)中的洗脱液与流出液合并减压浓缩成浸膏，按浸膏体积的2倍加水溶解，用5％的氢氧化钠溶液调节pH值至11，再按水溶液体积的0.5倍加丙酮，搅拌，析出白色沉淀，过滤沉淀，干燥，即得。

本发明制备的七叶皂苷钠总量为1.3Kg，纯度达100.1％，其中七叶皂苷钠A的含量为31.7％、七叶皂苷钠B的含量为15.4％、七叶皂苷钠C的含量为28.1％、七叶皂苷钠D的含量为14.3％，七叶皂苷钠A、B、C、D占总皂苷的89.5％，生产周期为40小时。

实施例6毒性试验

1材料

1.1药品七叶皂苷钠，分别为实施例2、3、4。七叶皂苷A、B、C、D的比例见表4。使用时用生理盐水新鲜配制成所需浓度。

1.2动物昆明种小鼠，山东省实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字960101。

表4实施例2、3、4中七叶皂苷A、B、C、D的比例(色谱峰面积比，％)

	七叶皂苷钠A	七叶皂苷钠B	七叶皂苷钠C	七叶皂苷钠D
					实施例2	33.7％	16.2％	26.7％	12.1％
实施例3	31.2％	17.8％	25.8％	10.6％
					实施例4	31.7％	15.4％	28.1％	14.3％

2方法与结果

2.1对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响取体重24～28g雄性小鼠40只，随机分为4组，分别为生理盐水对照组、实施例2组、实施例3组、实施例4组，腹腔注射给药(0.5mL/25g体重)30min后，将30μL二甲苯涂于小鼠右耳廓致炎，致炎30min后脱臼处死小鼠，用直径9mm打孔器取下左右耳片，称重，以左右耳片重量差作为肿胀程度，结果见表5。

表5腹腔注射不同比例七叶皂苷钠对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

结果表明，不同比例的七叶皂苷钠样品2.5mg/kg腹腔给药均能明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀，且三个样品间无统计学差异。三个样品1.25mg/kg腹腔给药能明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀(P>0.05)。

2.2LD50测定健康小鼠，雌雄各半，按体重随机分组，每组10只。分别给小鼠尾静脉注射不同工艺及不同剂量的七叶皂苷钠，给药体积0.5mL/20g体重，

观察给药后小鼠死亡情况，结果见表6。

表6七叶皂苷钠四个样品静脉注射给药小鼠LD50测定(n＝10)

按Bliss统计法计算，给小鼠一次性静脉注射实施例2、3、4七叶皂苷钠的LD50分别为12.76mg/kg、12.38mg/kg、12.21mg/kg，平均为12.45mg/kg，而按照CN102659897A的专利方法制备的七叶皂苷钠的LD50仅为5.71mg/kg。

Claims

1.一种七叶皂苷钠的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述七叶皂苷钠的制备方法，其特征在于：步骤1)中，用50％乙醇溶液进行提取。

3.如权利要求1所述七叶皂苷钠的制备方法，其特征在于：所述超滤膜为聚砜超滤膜。

4.如权利要求1或3所述七叶皂苷钠的制备方法，其特征在于：所述超滤膜的截留分子量为12000道尔顿。

5.如权利要求1所述七叶皂苷钠的制备方法，其特征在于：步骤3)中，依次用纯水、30％乙醇溶液、60％乙醇溶液洗脱，收集60％乙醇溶液的洗脱液。

6.如权利要求1所述七叶皂苷钠的制备方法，其特征在于：步骤5)中，按浸膏体积的1倍加水溶解，用2％的氢氧化钠溶液调节pH值至9，再按水溶液体积的1倍加丙酮，搅拌，析出白色沉淀，过滤沉淀，干燥，即得。

7.一种七叶皂苷钠，含有七叶皂苷钠A、B、C、D，其中七叶皂苷钠A的重量含量为30-40％、七叶皂苷钠B的重量含量为15-20％、七叶皂苷钠C的重量含量为25-30％、七叶皂苷钠D的重量含量为10-15％，所述七叶皂苷钠A、B、C、D占七叶皂苷钠总重量的85-90％。