CN102827242A - 一种棱角丝瓜甙a的提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本方法提供一种棱角丝瓜甙A的提纯方法，其特征在于包含以下步骤：（1）以棱角丝瓜全草为原料，加生物酶酶解3-5天，酶解原料加甲醇，采用连续逆流超声提取，得提取液；（2）将提取液加入超滤膜系统，得透过液；（3）将透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，乙醇水溶液洗脱，收集目标成分，减压浓缩，离心，将清液干燥，得粗提物；（4）将上述粗提物采用高速逆流色谱法进行分离纯化，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0.04%TFA为溶剂系统，以上相为固定相，下相为流动相，即得到高纯度的棱角丝瓜甙A。本发明方法成本低、制备量大，易于放大生产。
Description
技术领域
本发明属于天然植物技术领域，涉及一种棱角丝瓜甙A的提纯方法。
背景技术
棱角丝瓜甙A（Acutoside A），又名齐墩果酸3-槐糖甙，分子式为C42H68O13，分子量为780.99。棱角丝瓜甙A是葫芦科(Cucurbitaceae) 棱角丝瓜 Luffa acutangula Roxb.的全草中分离得到的一种三萜苷类化合物。现代研究表明，棱角丝瓜甙A具有免疫促进作用。体外对人淋巴细胞有增生作用。在100～1ng/mL浓度时,对人体T淋巴细胞有增生作用。
经检索，尚未发现适宜于大量制备棱角丝瓜甙A的工业化方法的专利或文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种棱角丝瓜甙A的提纯方法，成品棱角丝瓜甙A含量高、生产成本低，可适用于工业化生产。
本发明是通过如下技术方案实现的：
（1）以棱角丝瓜全草为原料，加生物酶酶解3-5天，酶解原料加6-10倍量50-65%甲醇，采用连续逆流超声提取，在超声装置的超声波作用下，提取时间30-60min，提取2-3次，提取温度50-60℃，过滤，得提取液；
（2）将提取液加入超滤膜系统，得透过液；
（3）将透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV体积百分比为65-85%的乙醇水溶液洗脱，收集目标成分，减压浓缩，得粗提物；
（4）将上述粗提物采用高速逆流色谱法进行分离纯化，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0.04%TFA为溶剂系统，以上相为固定相，下相为流动相，即得到高纯度的棱角丝瓜甙A。
所述生物酶可选果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的任一种，用量为原料重量的0.08-0.1%。
所述超声频率为40-50KHz。
所述超滤膜为中空超滤膜，材质为聚醚砜，截留分子量为2000-6000道尔顿。
所述溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0.04%TFA的体积比为（5-8）：（11-13）：（2-4）：（20-24）。
本发明的有益效果是：采用连续逆流超声提取，提取率高，耗时短，且避免目标产品的损失，是一种低耗能环保的提取方法；聚酰胺树脂吸附洗脱，提高了产品的纯度；采用高速逆流色谱法进行棱角丝瓜甙A的分离纯化，分离能力强、分离时间短、样品损失小、产品质量高等优点。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。
实施例1：
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过20目筛，加16g的纤维素酶混合均匀，酶解5天，酶解原料加140L65%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为50℃，提取时间为60min，超声频率为40KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用5000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV85%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例5：11：2：20混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为850rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25℃，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98.2%。
实施例2：
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过40目筛，加20g的果胶酶混合均匀，酶解4天，酶解原料加120L50%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为60℃，提取时间为40min，超声频率为45KHz，提取2次，过滤，合并提取液，再用6000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV65%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例8：13：4：24混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为850rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25℃，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98.6%。
实施例3：
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过20目筛，加18g的淀粉酶混合均匀，酶解3天，酶解原料加200L55%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为55℃，提取时间为60min，超声频率为50KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用3000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV70%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例7：12：3：22混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为820rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25℃，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为99.0 %。
实施例4：
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过60目筛，加17g的纤维素酶混合均匀，酶解4天，酶解原料加150L60%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为55℃，提取时间为50min，超声频率为45KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用6000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV70%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例6：11：3：23混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为820rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25℃，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98.4%。
实施例5：
取20kg棱角丝瓜全草粉碎过40目筛，加18g的纤维素酶混合均匀，酶解4天，酶解原料加150L60%甲醇，采用连续逆流超声提取，温度为55℃，提取时间为30min，超声频率为45KHz，提取3次，过滤，合并提取液，再用2000道尔顿的中空聚醚砜超滤膜过滤，透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV80%乙醇洗脱有效成分，收集目标成分减压浓缩，离心，将离心液干燥，得到粗提物。取乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、0.04%TFA按比例6：13：2：22混合，静置分层，两相分别超声脱气30分钟，取上相为固定相，下相为流动相，将固定相以4ml/min的流速泵入高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为850rpm，将流动相以3ml/min的流速泵入，分离柱的温度调至25℃，将棱角丝瓜甙A粗提物溶于等体积上相和下相组成的溶剂中作为样品溶液备用，待分离柱达到平衡，将样品溶液注入进样阀中，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图将同组分收集液合并，低温真空浓缩至干，得到棱角丝瓜甙A，经HPLC检测、核磁共振进行结构确认，棱角丝瓜甙A的含量为98.2%。
Claims (5)
1.一种棱角丝瓜甙A的提纯方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）以棱角丝瓜全草为原料，加生物酶酶解3-5天，酶解原料加6-10倍量50-65%甲醇，采用连续逆流超声提取，在超声装置的超声波作用下，提取时间30-60min，提取2-3次，提取温度50-60℃，过滤，得提取液；
（2）将提取液加入超滤膜系统，得透过液；
（3）将透过液减压浓缩至无醇，加水分散，加入聚酰胺树脂柱吸附，用6BV体积百分比为65-85%的乙醇水溶液洗脱，收集目标成分，减压浓缩，得粗提物；
（4）将上述粗提物采用高速逆流色谱法进行分离纯化，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0.04%TFA为溶剂系统，以上相为固定相，下相为流动相，即得到高纯度的棱角丝瓜甙A。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述生物酶可选果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的任一种，用量为原料重量的0.08-0.1%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述超声频率为40-50KHz。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述超滤膜为中空超滤膜，材质为聚醚砜，截留分子量为2000-6000道尔顿。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述溶剂系统乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-0.04%TFA的体积比为（5-8）：（11-13）：（2-4）：（20-24）。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121219 |