CN104804060A - 一种七叶皂苷钠的制备方法、包含其的外用制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种七叶皂苷钠的制备方法、包含其的外用制剂及其应用。具体而言，涉及一种七叶皂苷钠的制备方法、外用制剂的制备及其在制备预防或治疗外伤导致的组织水肿的药物中的应用，其特征在于，所述方法包括提取和分离纯化步骤，所述提取为将娑罗子粉用0-80％的乙醇或甲醇溶液(优选乙醇)进行提取，所述分离纯化包括以无机钠盐水溶液为流动相进行离子交换层析。本发明方法制得产品纯度高、生产周期短、成本低及无环境污染等问题，符合制备天然、安全、高纯七叶皂苷的发展趋势。

Description

一种七叶皂苷钠的制备方法、包含其的外用制剂及其应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种七叶皂苷钠的制备方法包含其的外用制剂及其应用。具体而言，本发明涉及从中药娑罗子中提取七叶皂苷钠的制备技术及用该技术制备的七叶皂苷钠制备成外用型制剂药物(气雾剂/喷雾剂)的技术，并将其外用制剂应用到外伤导致组织水肿等损伤的治疗中。

背景技术

人体轻微外伤，包括各种挫伤、擦伤、扭伤等，常会引起患者伤处的水肿、疼痛和活动受限，给生活、工作带来不便，有些甚至因伤后处理不当容易引发严重后果。伤后24小时内的损伤，会引起局部组织渗出和肿胀、疼痛、制动等，皮肤创面损伤后局部抵抗力下降，容易继发细菌感染等，后者可以进一步加重病情。因此，损伤后创面的保护、防护感染以及消肿止痛是处理软组织损伤的基本原则。目前治疗这些轻微外伤的方法虽然很多，如使用红汞、紫药水、碘伏、乙醇等各种消毒剂；或者云南白药喷雾剂等。但是这些方法大部分功能单一，只能起到防止创面感染和创面的部分保护作用，止痛消肿效果差，而云南白药喷雾剂效果虽然较好，但是两个喷瓶的使用不方便携带和操作。

七叶皂苷又称七叶皂苷酸，为七叶树科植物七叶树(Aesculus hippocastanum L.也称为天师栗(Aesculus Wilsonii Rehd.)、梭椤树、梭椤子、猴板栗等)的干燥成熟果实娑罗子中提取得到的总皂苷、β-七叶皂苷或异七叶皂苷等的总称。目前在临床中应用最多的为总七叶皂苷(Total escin)，主要含有七叶皂苷A、B、C和D。在我国根据液相色谱出峰时间的先后，A-D的物质分别对应escin Ia、escin Ib、isoescin Ia及isoescin Ib。其中的七叶皂苷A和B是β-型七叶皂苷，其结构式如下式(1)所示。七叶皂苷C和D是七叶皂苷A和B的C21-羟基上乙酸酯转位到C28-羟基的异构体，是Crypto-型(异型)七叶皂苷，其结构式如下式(2)所示。

总七叶皂苷具有抗炎、抗渗出和改善血液循环等生物学特性，因此已经被广泛应用于治疗各种原因引起的脑水肿、创伤或手术所致肿胀、静脉回流障碍或烧伤等疾病。然而总七叶皂苷对于肌肉和粘膜具有较强的刺激作用，直接用于肌肉注射可见注射部位局部疼痛和肿胀。我们从七叶树的果实娑罗子中提取了七叶皂苷，用氯化钠与七叶皂苷成盐后解决了化合物的溶解性难题并降低了其血管痉挛的毒性，制备的气雾剂/喷雾剂便于携带给药。

目前国内多数厂家均采用有机溶剂法进行提取、再采用非极性溶剂(正丁醇、氯仿等)进行萃取分离或离子交换吸附后用有机溶剂洗脱的方法来制备七叶皂苷钠。例如:

CN101974061A公开了一种从婆罗子中提取纯化七叶皂苷的方法，其包括首先将牛蒡子用乙醚回流脱脂，将脱脂药渣加入8-15倍量95％乙醇超声提取2-3次，离心分离，活性炭脱色，超滤，将超滤液浓缩至醇浓度为15％-20％，加入大孔吸附树脂柱吸附，依次用水、60％乙醇洗脱，收集七叶皂苷流分，然后结晶、通过丙酮乙醚重结晶得到七叶皂苷。

CN102532241A公开了一种提纯七叶皂苷钠的方法，其包括以下步骤:将娑罗子粉用5-15倍量80-95％乙醇回流提取2-3次，加入大孔树脂柱吸附，50-70％乙醇溶液洗脱，洗脱液浓缩，得浓缩液；将浓缩液加入阳离子交换树脂柱，下柱液加入丙酮溶液充分搅拌，过滤得沉淀物；上述沉淀物用乙醇溶液溶解，过氧化铝短柱，过柱液减压回收乙醇，结晶，干燥即得七叶皂苷钠产品，含量不低于95％。

CN 102659897 A公开了一种七叶皂苷钠的制备方法，包括:将娑罗子粉与体积百分比为10％的乙醇溶液按料液比1:(3～12)千克/升的比例混合浸泡后提取，然后层析分离，层析时使用体积百分比为95％的乙醇溶液洗脱，流速80ml/min～100ml/min，然后浓缩、精制、结晶。

但是，采用上述方法，在加工过程中使用有机溶剂的量较大，残留较多，生产成本高。且易造成有机溶剂残留，可能会对环境造成一定的污染。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种工艺简单的七叶皂苷钠的制备方法，仅用水或醇提取，纯化选用无机盐水溶液为流动相的离子交换层析(色谱)，富集七叶皂苷，使洗脱体积减少，后期操作简单省时，降低成本，解决传统七叶皂苷钠制备方法中存在的成本高及环境污染等问题，符合制备天然、安全、高纯七叶皂苷的发展趋势。

具体而言，本发明的一个目的在于提供一种七叶皂苷钠的制备方法，所述方法包括提取步骤和分离纯化步骤，所述提取为将娑罗子粉用0-80％的乙醇或甲醇进行提取，和所述分离纯化包括以无机钠盐水溶液为流动相进行离子交换层析。此处需要指出的是，当浓度为0％时，使用水进行提取。

当使用低浓度醇时，浓度优选为5～20％。当使用中浓度醇时，浓度优选为20～50％。当使用高浓度醇时，浓度优选为50～80％。其中，所述提取为上述醇溶液进行多次提取，并且所述醇溶液的浓度不变或逐次递减。另外，在第一次提取后的提取的料液比可以比第一次提取的料液比低，以降低作为有机溶剂的乙醇的使用量。

从产率和提取效率的角度出发，所述提取优选进行三次。第一次提取时使用0～80％的乙醇溶液，料液比为1:3-1:8千克/升，优选1:5千克/升；第二次提取时使用0～80％的乙醇溶液，料液比为1:2-1:5千克/升；第三次提取时使用0～80％的乙醇溶液，料液比为1:1-1:4千克/升，其中如果第一、二次提取时料液比中液体量偏大时第三次提取可省略。

优选的是，作为实例，如用低浓度醇(20％)提取，第一次提取时使用15～20％的乙醇溶液，料液比为1:3-1:8千克/升，优选1:5千克/升；第二次提取时使用5～10％的乙醇溶液，料液比为1:2-1:5千克/升；第三次提取时使用0％～5％的乙醇溶液，料液比为1:1-1:3千克/升。但本领域技术人员也可以使用其它浓度和料液比。

作为实例，优选的是，所述提取包括下述步骤:将娑罗子粉与20％的乙醇溶液按料液比1:3-1:8重量体积比、优选1:5千克/升浸泡0.5-1.5小时、常规回流提取1-2小时；过滤后得到的滤渣再按料液比1:3加入10％的乙醇溶液常规回流提取1小时，过滤得滤渣，再按料液比1:2加入5％的乙醇溶液常规回流提取0.5小时，过滤、弃渣；提取的温度控制在45℃-80℃；合并三次滤液。

对于中浓度醇(50％)提取包括下述步骤:粉碎娑罗子，将其粉与50％的乙醇溶液按料液比1:5-1:8重量体积比混合浸泡0.5-1.5小时、常规回流提取1-2小时，过滤，留滤液；得到的滤渣再按料液比1:3-1:5加入50％的乙醇溶液常规回流提取1小时，过滤，留滤液；得到的滤渣再按料液比1:3加入20％的乙醇溶液常规回流提取0.5小时，过滤；弃渣。提取的温度控制在45℃-80℃。合并三次滤液，浓缩回收乙醇。

对于高浓度醇(80％)提取包括下述步骤:粉碎娑罗子，将其粉与80％的乙醇溶液按料液比1:5-1:8重量体积比混合浸泡0.5-1.5小时、常规回流提取1-2小时，过滤，留滤液；得到的滤渣再按料液比1:4-1:6加入50％的乙醇溶液常规回流提取1小时，过滤，留滤液、弃渣。若第一、二次提取液醇浓度大于50％，则不必提取第三次，因为实验证明，第三次提取的目标物含量很低。提取的温度控制在45℃-80℃。合并二次滤液。

提取后，对提取液进行分离纯化步骤。该分离纯化步骤可以依次包括脱色、浓缩回收乙醇、离子交换层析、精制和结晶步骤。其中，脱色、精制和结晶步骤可以酌情增减，只要离子交换层析以无机钠盐水溶液为流动相即可。

以下对该分离纯化的各步骤进行详细说明。

首先，将提取步骤的浓缩液进行脱色。脱色可以采用本领域已知的任何脱色方法，例如活性炭脱色或中性氧化铝脱色。将脱色液抽滤(离心)去沉淀(大规模生产时可静置澄清)，浓缩回收乙醇，上清过滤备用。

离子交换层析是本发明的关键步骤，其以无机钠盐水溶液为流动相。作为实例，流动相可以包括以pH4～7的无机钠盐缓冲液作为调整上样液pH液和洗脱液A，优选pH5.7的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，以0.5～2M强酸强碱盐+无机钠盐缓冲液作为洗脱液B，优选1M NaCl+10MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；

具体而言，离子交换层析步骤可以包括:装柱:将离子交换介质装入层析柱内(量大可以在装柱前用介质直接搅拌吸附样品后再装柱)，以平衡液平衡，将过滤的上清液上样，盐梯度洗脱，收集洗脱峰。

更具体而言，准备离子交换层析(色谱)介质，型号可选Q-Sepharose F.F.；DEAE-Sepharose F.F.；S-Sepharose F.F.；SP-Sepharose F.F.；Capto DEAE；Capto Q；Capto S等离子交换介质，将其装柱，柱大小和介质多少依需制备七叶皂苷钠量而定(量大可以在装柱前用介质直接搅拌吸附样品再装柱)。以平衡液平衡，上过滤的上清液样，盐梯度洗脱，收集洗脱峰。

离子交换层析步骤后进行精制、结晶。精制、结晶可以采用醇沉结晶或酸沉方式。

所述醇沉结晶可以包括以下步骤:(1)醇沉皂苷:向上清液中边搅边加入无水乙醇至75～85％，静置；(2)过(抽)滤:将沉淀物过(抽)滤至干，收集滤液；(3)浓缩回收滤液中乙醇，浓缩液中结晶出七叶皂甙钠，过滤或离心收集晶体；(4)向浓缩母液中加入适量无水乙醇，混匀；(5)浓缩回收乙醇，浓缩液中结晶出七叶皂甙钠，过滤或用3500rpm离心5分钟收集晶体；(6)合并收集晶体，加入无水乙醇脱水三次，继续抽滤至干，沉淀结晶物呈疏松状，色白；(7)装盘干燥:结晶物分装于烘盘内，厚度1-2cm，按常规真空干燥法在干燥箱内烘干。干燥条件:箱内温度设置为45℃～55℃、真空度达0.090MPa以上；即制备得七叶皂苷钠。

所述酸沉可以包括以下步骤:(1)调pH:在收集峰液中边搅拌边加入稀盐酸液或醋酸，调pH值到1-3，静置；按前述(2)过(抽)滤、(6)无水乙醇脱水、(7)装盘干燥制备得七叶皂苷钠。

通过本发明的制备方法制得的七叶皂苷钠经HPLC分析可知，其包括七叶皂苷钠A、七叶皂苷钠B、七叶皂苷钠C和七叶皂苷钠D。四个组分的峰面积百分比之和在90％以上。

本发明的另一目的在于提供一种外用制剂，所述外用制剂包括通过本发明的制备方法制得的七叶皂苷钠和药学上可接受的药物载体。其比例可由本领域技术人员根据具体剂型和所用辅料而定，但优选其重量比为1-5:12-30。

为便于使用起见，所述外用制剂为气雾剂或喷雾剂。但外用制剂也可以是其他剂型，例如膏剂、贴剂、凝胶剂、洗剂等等。

作为气雾剂或喷雾剂，其还可以包含麻醉药，优选为奴夫卡因。

对于所述气雾剂或喷雾剂，精密过滤后的药液测定其固定性物含量，应在1.0％(W/V)以上；过滤质量的监控取精密过滤的滤液200ml，用已称重的玻砂坩埚过滤，干燥2小时，称重，其重量增加≤0.01g。

作为用途，该外用制剂用于预防或治疗外伤导致的组织水肿。

本发明的又一目的在于提供本发明的制备方法制得的七叶皂苷钠和其制备的外用制剂在预防或治疗外伤导致的组织水肿的药物中的应用。

有益效果

本发明具有下述有益效果。

(1)本发明的七叶皂苷钠的制备方法简单，经该工艺提取的七叶皂苷钠符合国家药品监督管理局颁布的七叶皂苷钠国家药品标准(WS1-XG-003-99)。如以实施例为例，经该工艺提取的七叶皂苷钠经HPLC分析，七叶皂苷钠A、B、C、D峰面积占比为92.79％。七叶皂苷A和七叶皂苷B的峰面积占比分别44.96％和26.04％，符合“总七叶皂苷钠中含七叶皂苷A和七叶皂苷B应分别为25.0％～45.0％和20.0％～35.0％”的药用要求。

(2)提取时使用无醇水液或低浓度的醇，层析纯化时采用无机盐水溶液洗脱代替有机溶剂洗脱，减少了有机溶剂的使用量；洗脱体积减少，后期结晶简便，工期缩短，因此成本低廉。

(3)该七叶皂苷钠制备工艺选用无机盐水溶液为流动相的离子交换层析(色谱)技术，克服了传统七叶皂苷钠制备中采用有机溶剂法进行提取的技术易造成环境污染问题，符合制备天然、安全、高纯七叶皂苷的发展趋势。

(4)七叶皂苷钠在水剂中稳定，制备了其气雾剂和喷雾剂。

(5)通过动物实验证实喷雾剂和气雾剂对于大鼠软组织损伤模型具有良好的治疗作用。

本发明药物在用于动物实验中未发现不良反应及过敏反应。使用方法：将药液直接喷于患处。注意事项:勿喷于眼内；贮存:置于阴凉处保存。

附图说明

图1正常大鼠腿部肌肉组织HE染色，未见肌肉细胞损伤(坏死)及炎性细胞浸润。

图2模型组大鼠损伤组织HE染色，可见大片组织坏死，炎性细胞浸润明显，肌间纤维组织中的炎细胞和纤维细胞浸润明显。

图3云南白药治疗组大鼠损伤组织HE染色，局部可见小量的炎性细胞浸润，病灶比较小。

图4云南白药低剂量治疗组大鼠损伤组织HE染色，可见明显组织坏死，炎性细胞浸润较多，肌间纤维组织中的炎细胞和纤维细胞浸润较多。

图5云南白药中剂量治疗组大鼠损伤组织HE染色，可见局部组织坏死及部分炎性细胞浸润，肌间纤维组织中有少量的炎细胞和纤维细胞浸润。

图6云南白药高剂量治疗组大鼠损伤组织HE染色，局部可见少量炎性细胞浸润，病灶小。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明实施例仅用于说明技术方案，并不限定本发明的实质。

实施例1.七叶皂苷钠的制备:

称取500g娑罗子，粉碎，将其粉用2500ml的20％乙醇溶液浸泡1小时、常规回流提取1小时，温度控制在75℃，过滤，留滤液；向滤渣加入10％的乙醇溶液1500ml,常规回流提取1小时，温度控制在75℃，过滤，留滤液；向滤渣再加入5％的乙醇溶液1000ml，常规回流提取0.5小时，温度控制在80℃，过滤；弃渣。合并三次滤液，共3900ml。向滤液中边搅拌边加入活性炭至棕红色消失为止，静置20分钟，将脱色液在3500rpm离心15分钟，去沉淀，上清液用旋转蒸发浓缩回收乙醇，浓缩液用0.45μm膜抽滤，得滤液2250ml,备用。

选用SP-Sepharose F.F离子交换层析介质，将其装入45×300mm柱，柱床高100mm，连接到AKTA Purifier色谱仪(GE公司仪器)，以10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液pH5.69为平衡液平衡柱子，流速10ml/min,检测波长为220nm。

向滤液中加入115ml的200mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH5.69缓冲液，为上样液。待柱子平衡后上上样液，流速8ml/min；上完样后，用平衡液洗去末吸附的物；然后盐线性梯度洗脱，洗脱液A即平衡液:10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液pH5.69；洗脱液B：1M NaCl-10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液pH5.69；流速10ml/min，洗脱体积:1000ml,收集主洗脱峰321ml。

醇沉皂苷钠:(1)在收集峰液中边搅拌边加入乙醇溶液，使乙醇浓度达82％，密封4℃存放1小时，待沉淀完全，将沉淀物经抽滤至干；收集滤液；

减压旋转蒸发回收滤液中乙醇，待有七叶皂甙钠结晶出现时停止；静置待七叶皂甙钠析出。用3500rpm离心5分钟收集晶体和浓缩母液。

向浓缩母液中加入适量无水乙醇，混匀；减压旋转蒸发浓缩回收乙醇，浓缩液中结晶出七叶皂甙钠时停止，静置，3500rpm离心5分钟收集晶体。

合并收集的晶体，加入无水乙醇脱水，抽滤至干，弃上清，重复脱水洗涤两次，继续抽滤至干，沉淀物装于烘盘内，干燥箱内烘干，箱内温度设置为45℃～55℃。称重，得七叶皂苷钠15.6g。

七叶皂苷钠高效液相色谱法分析:

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录ⅤD)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-磷酸溶液(取85％磷酸5.5ml，用水稀释至1000ml)(33∶67)为流动相，调节pH值为2.1，检测波长为220nm。

供试品溶液制备:称取七叶皂苷钠2.0mg，加甲醇0.8ml溶解、过滤，备用,其浓度为2.5mg/ml。

仪器:Waters公司2695型HPLC仪，采用自动进样器进样20μl，流速1ml/min。分析图谱如图1所示。色谱图中有4个主成分峰，以出峰前后，分别为七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D，其面积占比分别44.96％、26.04％、15.31％和6.48％，四组分七叶皂苷钠面积占比之和为92.79％。符合“总七叶皂苷钠中含七叶皂苷A和七叶皂苷B应分别为25.0％～45.0％和20.0％～35.0％”的药用要求。

实施例2.七叶皂苷钠的制备:

称取500g娑罗子，粉碎，将其粉用2500ml的50％乙醇溶液浸泡1小时、常规回流提取1小时，温度控制在70℃，过滤，留滤液；向滤渣加入40％的乙醇溶液1500ml,常规回流提取1小时，温度控制在70℃，过滤，留滤液；向滤渣再加入30％的乙醇溶液1000ml，常规回流提取0.5小时，温度控制在70℃，过滤；弃渣。合并三次滤液，共3500ml。

向滤液中边搅拌边加入活性炭至棕红色消失为止，静置20分钟，将脱色液抽滤，去沉淀，抽滤液用旋转蒸发浓缩回收乙醇，浓缩液用0.45μm膜抽滤，得滤液1420ml,备用。

SP-Sepharose F.F离子交换层析柱及层析条件同实施例1。

上样液准备:向滤液中加入71ml的200mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH5.69缓冲液即可。

上样条件和洗脱条件除洗脱体积为800ml外余均同实施例1。收集主洗脱峰245ml。

醇沉皂苷钠操作同实施例1。得七叶皂苷钠16.1g。

HPLC分析方法同实施例1，分析结果:七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D的面积占比分别43.76％、29.31％、15.87％和6.32％，四组分七叶皂苷钠面积占比之和为95.26％。符合“总七叶皂苷钠中含七叶皂苷A和七叶皂苷B应分别为25.0％～45.0％和20.0％～35.0％”的药用要求。

实施例3.七叶皂苷钠的制备:

称取500g娑罗子，粉碎，将其粉用2500ml的80％乙醇溶液浸泡1小时、常规回流提取1小时，温度控制在70℃，过滤，留滤液；向滤渣加入50％的乙醇溶液2000ml,常规回流提取1小时，温度控制在70℃，过滤，弃渣。合并两次滤液，共3000ml。

向滤液中边搅拌边加入活性炭至棕红色消失为止，静置20分钟，将脱色液抽滤，去沉淀，抽滤液用旋转蒸发浓缩回收乙醇，浓缩液用0.45μm膜抽滤，得滤液940ml,备用。

SP-Sepharose F.F离子交换层析柱及层析条件同实施例1。

上样液准备:向滤液中加入47ml的200mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH5.69缓冲液即可。

上样条件和洗脱条件除洗脱体积为800ml外余均同实施例1。收集主洗脱峰240ml。

醇沉皂苷钠操作同实施例1；得七叶皂苷钠15.9g。

HPLC分析方法同实施例1，分析结果:七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D的面积占比分别43.82％、29.53％、15.67％和6.12％，四组分七叶皂苷钠面积占比之和为95.14％。符合“总七叶皂苷钠中含七叶皂苷A和七叶皂苷B应分别为25.0％～45.0％和20.0％～35.0％”的药用要求。

实施例4.七叶皂苷钠的制备

称取500g娑罗子，粉碎，将其粉用2500ml的蒸馏水浸泡1小时、常规回流提取1小时，温度控制在80℃，过滤，留滤液；向滤渣加入蒸馏水1500ml,常规回流提取1小时，温度控制在80℃，过滤，留滤液；向滤渣再加入蒸馏水1000ml，常规回流提取0.5小时，温度控制在80℃，过滤；弃渣。合并三次滤液，共4200ml。向滤液中边搅拌边加入活性炭至棕红色消失为止，静置20分钟，将脱色液在3500rpm离心15分钟，去沉淀，上清液用0.45μm膜抽滤，备用。

选用Q-Sepharose F.F离子交换层析介质，将其装入45×300mm柱，柱床高100mm，连接到AKTA Purifier色谱仪(GE公司仪器)，以10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液pH5.69为平衡液平衡柱子，流速10ml/min,检测波长为220nm。

向滤液中加入200ml的200mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH5.69缓冲液，为上样液。待柱子平衡后上上样液，流速8ml/min；收集穿过峰。

按实施例1中Q-Sepharose F.F离子交换层析条件进行七叶皂甙的分离纯化，上样为SP-Sepharose F.F层析的穿过液。洗脱体积:800ml,收集主洗脱峰248ml。

酸沉七叶皂甙钠:(1)调pH:向洗脱峰液中边搅拌边加入稀盐酸液，调pH值到1.4，液体变浑，静置；(2)抽滤，将将混悬液体抽滤至干，收集沉淀物；(3)洗涤:无水乙醇脱水洗涤三次，抽滤至干，收集过滤物；(4)装盘干燥:将过滤物放入干燥箱内50℃烘干，得七叶皂苷钠14.6克。

HPLC分析方法同实施例1，分析结果:七叶皂苷A、七叶皂苷B、七叶皂苷C和七叶皂苷D的面积占比之和为94.14％。符合“总七叶皂苷钠中含七叶皂苷A和七叶皂苷B应分别为25.0％～45.0％和20.0％～35.0％”的药用要求。

实施例5、气雾剂、喷雾剂制备方法

5.1气雾剂的制备

将搪瓷玻瓶洗净烘干，预热至120-130℃，趁热浸入塑料粘浆中，使瓶颈以下粘附一层塑料浆液，倒置，在150-170℃烘干15分钟，备用。阀门系统经消毒处理后备用。

将提取的七叶皂苷钠2.5g与奴呋卡因(终浓度0.25％)及其他常规辅料用适量的水/乙醇溶解后在室温下灌入气雾剂瓶内,再将阀门装上并轧紧,然后通过压装机压入70g的抛射剂HFA-134a(最好先将容器内空气抽去)既得。

5.2喷雾剂的制备

5.2.1喷雾剂产品配方

5.2.2生产工艺简述:

5.2.2.1将A相原料称量后，加入B相，溶解搅拌均匀。

5.2.2.2将C相原料分别称量后，溶解。

5.2.2.3在30℃下，将C相混合原料在搅拌下，缓慢加入到AB相混合原料中(过程中一定必须缓慢随时控制液体透明度)。

5.2.2.4然后加入D相原料继续搅拌均匀。

5.2.2.5最后加入E相原料和F原料，搅拌均匀后静置24小时，检验合格后，灌装，成品检验，入库备用。

实施例6、七叶皂苷钠喷雾剂对软组织损伤大鼠疗效观察

6.1造模方法

选体重150-200g的健康雄性大白鼠60只，适应性喂养1周，然后将大鼠随机分为6组(正常组、模型组、阳性药物治疗组、七叶皂苷钠高、中、低剂量治疗组)，除正常组以外的大鼠，固定架上固定四足后用电动理发推脱除腿部毛发，随后用自制撞击器(以10g砝码从50cm处自由落体掉下，撞击接触面直径约为0.8cm，撞击冲量为2kgm)在小腿中部外侧同一部位连续击打3次，造成大鼠腿部肌肉局部软组织挫伤。20分钟后，裸露的肌肉发红紫且肿胀起来形成局部淤血水肿。结果表明，出模率为100％且操作治疗过程中无动物死亡。

6.2大鼠软组织损伤模型的治疗

以云南白药喷雾剂(市售药，国药准字Z53021107，云南白药集团股份有限公司)为阳性对照药物，设立七叶皂苷钠低(0.5g/10ml)、中(1g/10ml)、高剂量组(2.0g/10ml)，分别在大鼠软组织损伤的红肿部位进行局部喷雾给药进行治疗。每日给药两次,给药日剂量分别为50mg、100mg和200mg。治疗四天后，迅速麻醉处死大鼠，立即取损伤治疗的中心部位组织，放入10％福尔马林中浸泡保存，送西安交通大学附属一医院病理科中国人民解放军西京医院病理科进行组织切片、染色及结果分析，观察炎症肿胀治疗效果。

Claims (10)

1.一种七叶皂苷钠的制备方法，其特征在于，所述方法包括提取和分离纯化步骤，所述提取是将娑罗子粉用0-80％的乙醇或甲醇溶液(优选乙醇)进行提取，所述分离纯化包括以无机钠盐水溶液为流动相进行的离子交换层析。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提取是使用0-80％的乙醇或甲醇溶液进行多次提取，并且所述乙醇或甲醇溶液的浓度不变或逐次递减；

优选的是，所述提取进行三次，第一次提取时使用0～80％的乙醇溶液，料液比为1:3-1:8千克/升，优选1:5千克/升；第二次提取时使用0～80％的乙醇溶液，料液比为1:2-1:5千克/升；第三次提取时使用0～80的乙醇溶液，料液比为1:1-1:4千克/升，其中如果第一、二次提取时料液比中液体量偏大第三次提取可省略；

更优选的是，所述提取包括下述步骤:将娑罗子粉与提取液按料液比1:3-1:8重量体积比、优选1:5千克/升浸泡0.5-1.5小时、常规回流提取1-2小时；过滤后得到的滤渣再按料液比1:3加入同第一次的提取液或比第一次醇浓度略低的提取液常规回流提取1小时，过滤后的滤渣再按料液比1:3加入同第二次的提取液或比第二次醇浓度略低的提取液常规回流提取0.5小时(若第一、二次提取液醇浓度大于50％，则不需要第三次提取)，过滤、弃渣；提取的温度控制在45℃-80℃；合并三次滤液。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化依次包括脱色、离子交换层析、精制和结晶步骤；

优选的是，所述脱色为活性炭脱色或中性氧化铝脱色，优选脱色后将脱色液离心去沉淀或静置澄清，上清过滤，浓缩回收乙醇；

更优选的是，所述流动相为pH4～7无机盐缓冲液作为平衡液和强酸强碱盐作为洗脱液，如以5～100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH4～7)作为样品缓冲液和平衡液A，优选pH5.7的10mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，以0.5～2M NaCl-5～100MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液作为洗脱液B，优选1M NaCl-10MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；线性梯度洗脱(A液从100％开始洗脱，逐步递减到洗脱完变成0％；B液从0％开始洗脱，逐步递加到洗脱完变为100％)，洗脱体积为柱床体积的2～5倍；

还优选的是，所述离子交换层析步骤包括:装柱:将离子交换介质装入层析柱内，以平衡液(A液)平衡，将过滤的提取上清液上样，用平衡液(A液)洗去末结合的组分，收集穿过峰(检测无目标物后弃去)；盐梯度洗脱:以平衡液为A液，以A液+NaCl为B液，线性梯度洗脱，起始比例:A:B＝100:0；终始比例:A:B＝0:100,洗脱时间依床体积和流速而定，收集洗脱峰,若吸附量大可以不装柱而用介质直接搅拌吸附，待吸附完全后(被吸附液中检测不到七叶皂甙)，滤去被吸附液，用平衡液洗去末吸附的杂质，装柱，按前述方法梯度洗脱或用B液搅拌洗脱三次，收集洗脱液。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述精制、结晶包括醇提或酸沉；

优选的是，所述醇提结晶包括以下步骤:(1)醇沉皂苷:向上清液中边搅边加入无水乙醇至75～85％，静置；(2)过(抽)滤:将沉淀物过(抽)滤至干，收集滤液；(3)浓缩回收滤液中乙醇，浓缩液中结晶出七叶皂甙钠，过滤或离心收集晶体；(4)向浓缩母液中加入适量无水乙醇，混匀；(5)浓缩回收乙醇，浓缩液中结晶出七叶皂甙钠，过滤或离心收集晶体；(6)合并收集晶体，加入无水乙醇脱水三次，继续抽滤至干，沉淀结晶物呈疏松状，色白；(7)装盘干燥:结晶物分装于烘盘内，厚度1-2cm，按常规真空干燥法在干燥箱内烘干，即制备得七叶皂苷钠；

所述酸沉包括以下步骤:(1)调pH：在收集峰液中边搅拌边加入稀盐酸液或醋酸，调pH值到1-3，静置；(2)按前述(2)抽滤或离心、收集沉淀物、(6)无水乙醇脱水、(7)装盘干燥制备得七叶皂苷钠。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述七叶皂苷钠包括七叶皂苷钠A、七叶皂苷钠B、七叶皂苷钠C和七叶皂苷钠D；

优选的是，所述七叶皂苷钠A、B、C、D组分峰面积占比之和为90％以上(HPLC法)，且A、B、C、D各组分峰面积的百分比符合药用标准。

6.一种外用制剂，所述外用制剂包括根据权利要求1～5中任一项方法制得的七叶皂苷钠和药学上可接受的药物载体，优选其重量比为1-5：12-30。

7.如权利要求6所述的外用制剂，其特征在于，所述外用制剂为气雾剂或喷雾剂；

优选的是，所述气雾剂或喷雾剂还包含麻醉药，优选为奴夫卡因。

8.根据权利要求7所述的外用制剂，其特征在于，对于所述气雾剂或喷雾剂，精密过滤后的药液测定其固定性物含量，应在1.0％(W/V)以上；过滤质量的监控取精密过滤的滤液200ml，用已称重的玻砂坩埚过滤，干燥2小时，称重，其重量增加≤0.01g。

9.如权利要求6所述的外用制剂，其特征在于，所述外用制剂用于预防或治疗外伤导致的组织水肿。

10.权利要求1～5中任一项方法制得的七叶皂苷钠在制备用于预防或治疗外伤导致的组织水肿的药物中的应用。