CN104380085A - 用于检测分析物或分类样本的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测样本中的一种或多种分析物和/或用于分类样本的方法和系统。具体来说，本发明涉及可用于实时检测分析物，且依赖于使一种或多种类型的传感器分子流过微流体装置的方法和系统，所述传感器分子各自包含结合一种或多种分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在+50％福斯特距离内。

Description

用于检测分析物或分类样本的方法和系统
发明领域
本发明涉及用于检测样本中的一种或多种分析物和/或用于分类样本的方法和系统。具体来说，本发明涉及可用于实时检测分析物且依赖于使一种或多种类型的传感器分子流过微流体装置的方法和系统，所述分子各自包含结合一种或多种分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离(Forster distance)内。
发明背景
生物发光共振能量转移(BRET)天然存在于如维多利亚水母(Aequorea victoria)和海洋海肾(Renilla reniformis)等海洋生物体中(Morin和Hastings,1971)。BRET是一种形式的福斯特共振能量转移(RET)，其是指能量从激发态供体非放射性转移至基态接受体。存在两种常用的BRET原理形式，即BRET1和BRET2。两者均使用海肾荧光素酶(RLuc)作为能量供体。在BRET1中，底物是天然腔肠素(coelenterazine，CLZ)或腔肠素h(CLZh)。RLuc和黄色荧光蛋白(YFP)分别是能量供体和接受体，在475nm下产生峰值供体发射且在535nm下产生峰值接受体发射。在BRET2中，YFP置换为GFP2且使用修饰的CLZ底物，即腔肠素-400a或(CLZ400a)。峰值供体发射和接受体发射分别变换成395nm和515nm(Dacres等,2009a,b；Pfleger和Eidne,2006)。近来已建立第三种BRET形式，即BRET3。它使用CLZh作为底物且使用RLuc8作为能量供体并使用mOrange作为接受体，从而导致光谱分辨率提高(De等,2009)。
RET是一种比值测量技术，其可消除由归因于在板中的不同孔之间的测定体积、测定条件和信号衰减变化的光输出波动引起的数据可变性。基于RET的反应是均质的，通常在无固相连接下发生在溶液中。这允许在不进行分离下检测呈如液体、气体乃至颗粒等不同形式的分析物。避免固相连接使如表面等离子体共振(SPR)的许多基于表面的技术中使用的表面再生的过程得以消除(Fang等,2005)，且连同快速反应速率一起允许它用于在线监测。
然而，迄今为止，BRET的使用尚局限于使用精密检测设备的研究实验室。在包括化学、生物学、医学、感测和材料的许多领域中，微流体技术正引起关注。它们超过常规技术的优势包括试剂消耗降低、反应速率快速、分析时间短、以及适合于自动化和批量生产(Holden和Cremer,2005)。
在微流体技术方面已存在实质性研究和发展。实例包括利用荧光收集的集成生物芯片设计(EP 2221606)、使用拉曼光谱学进行芯片上生物感测(WO 2009/020479)、用于使用表面等离子体共振技术检测GPCR配体结合的生物感测装置(WO 2009/018467)、利用镜子作为光反射器的光检测芯片(US 2011/0037077和US 2008085552)、具有柱筒形式的测定装置(WO 2009/044088)、基于化学发光的微流体生物芯片(US 2002/0123059)等。这些装置中的许多具有以下缺点：由于集成多个部件而使每个芯片的成本较高；由于需要表面再生而不能进行实时监测；以及试剂的反应缓慢；检测灵敏度有限或信号漂移。
此外，在电子鼻和电子舌的领域中存在大量背景技术，所述电子鼻和电子舌使气体或液体样本与一系列固态传感器接触以检测分析物和/或分类样本。电子鼻和舌已受归因于传感器的选择性有限的不良性能、不良灵敏度、传感器饱和和缓慢再生以及传感器随时间漂移困扰。
因此，需要检测分析物和基于样本含有的分析物分类所述样本的其它方法，特别是可实时执行并且灵敏度增加，且不遭受由于需要再生感测表面的停工时间，以及抵抗传感器漂移的混杂影响的方法。配置一系列以电光学方式与检测系统联用的生物源性传感器的多通道微流体系统提供对这些问题的一种新型解决方案。
发明概述
本发明者已鉴定一种检测样本中的分析物的改进方法。
在一个方面，本发明提供一种检测样本中的分析物的方法，所述方法包括
i)使以下各物流过包括一个或多个微通道的微流体装置，
a)所述样本，
b)包含结合所述分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
c)所述化学发光供体的底物，
ii)在所述装置中混合所述传感器分子、样本和底物，以及
iii)使用电光学感测装置检测所述化学发光供体对所述底物的修饰，
其中当所述分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
在优选实施方案中，传感器分子未固定于装置。
在另一优选实施方案中，方法可用于实时检测分析物。
在另一优选实施方案中，传感器分子和底物通过不同微通道进入装置。在替代性实施方案中，传感器分子和底物通过相同微通道进入装置，然而，在这个实施方案中，优选的是传感器分子和底物在临进入微通道之前(例如10秒、更优选1秒或小于1秒)混合。
在优选实施方案中，化学发光供体结构域和接受体结构域的福斯特距离是至少5.6nm或至少6nm。在另一优选实施方案中，化学发光供体结构域和接受体结构域的福斯特距离在约5.6nm与约10nm之间，或在约6nm与约10nm之间。
在另一优选实施方案中，分析物结合传感器分子或从传感器分子释放导致BRET比率变化≥15％、≥20％、≥30％、≥35％、约15％至约50％、或约15％至约40％的最大观察BRET比率。BRET比率变化15％或大于15％会增加分析物检测的信噪比。这导致任何给定取样时间的检测限都优越且更准确编码分析物的浓度水平。或者，在固定检测限下，BRET比率的较大变化促使信号积分时间较短且因此检测更快速。
在另一优选实施方案中，由电光学感测装置检测的量子产率小于约8％、或小于约5％或小于约2％。
在另一优选实施方案中，接受体结构域具有的斯托克斯位移(Stokes Shift)在约50nm与约150nm之间。在实施方案中，接受体结构域具有约100nm的斯托克斯位移。
本发明的方法的一优势是它是高度时间分辨的。因此，在优选实施方案中，方法是在约1s至约100s内执行。
样本可呈能够流过微流体装置的任何形式。实例包括但不必限于液体、气体、乳液或混悬液。在实施方案中，样本是已用气体预平衡的液体。
在一个实施方案中，混悬液是或包含无细胞组合物。在替代性实施方案中，混悬液包含细胞。
在实施方案中，穿过微流体装置的流动速率在约1μl/小时至约10ml/小时、或1μl/小时至约1ml/小时、或1μl/小时至约1.5ml/小时、或约20μl/小时至约0.5ml/小时之间，且优选流动速率在约200μl/小时至约1ml/小时之间。
在优选实施方案中，包含样本、传感器分子和底物的微通道的区段的流动速率和长度使得样本、传感器分子和底物在区段中持续至少约5秒、至少约10秒、至少约15秒、至少约20秒、约5秒至约50秒、或约10秒至约30秒。
在一个实施方案中，例如当传感器分子包含如G偶联蛋白质受体的蛋白质受体时，在步骤ii)之后，传感器分子的浓度在约1nM至约10μM之间或在约1nM至约1μM之间。在另一实施方案中，例如当传感器分子包含可裂解肽源性或周质结合蛋白时，在步骤ii)之后，传感器分子的浓度在约0.1μM至约10μM之间。
在实施方案中，穿过微流体装置的流动是连续流动、批式流动或停止流动。
样本、传感器分子和底物可使用机械、电动、声学或其它适合手段加以主动混合。在优选实施方案中，混合是通过在垂直于穿过包含样本、传感器分子和底物的微通道的流动方向的维度上进行扩散来达成。举例来说，样本、传感器分子和底物的高效混合(≥20％)可便利地通过主要被动扩散(非湍流)过程来达成。典型条件包括流动速率约为至多每小时1,000微升，共用微通道长度为约10mm或大于10mm，以及当堆积输入物彼此接触在共用通道中流动时，它们的高度总和为约200微米或小于200微米(垂直于流动方向测量)。
可通过任何适合手段使样本、传感器分子和底物流过微流体装置，所述手段如但不必限于以下一项或多项：泵送、真空、水力、抽吸、电动、化学渗透、毛细管力、声学、电磁、压电学。泵送机制可用紧凑、小型化以及微米尺寸泵实现。在优选实施方案中，样本、传感器分子和底物是通过例如以抽取模式使用注射泵进行抽吸(负压)来流过微流体装置。
在实施方案中，各微通道具有约1μm2至约1mm2的横截面积。
在另一实施方案中，用于样本、传感器分子和底物的微通道各自具有宽度≥300μm和高度≥60μm、宽度≥600μm和高度≥30μm或宽度≥1200μm和高度≥15μm。在实施方案中，高度不大于约1mm或约0.5mm。在另一实施方案中，高度是约15μm至约1mm或约15μm至约0.5mm。在另一实施方案中，宽度不大于约1.5mm。在另一实施方案中，宽度是约300μm至约1.5mm或约300μm至约1.2mm。
用于底物、传感器分子和样本的输入微通道的长度尽可能短，优选小于10mm，且更优选小于5mm。
允许底物、传感器分子和样本混合和反应所处的共用微通道的长度可在5mm与100mm之间，或在10mm与100mm之间，优选在20mm与50mm之间，且可为线形的、蛇形的或直弯曲几何形状的任何适合组合。在替代性实施方案中，共用微通道可被完全免除且传感器分子、底物和样本可在或不在主动混合下直接引入反应室中。
在另一实施方案中，步骤iii)是在体积约1pl(即皮升或一万亿分之一升)至约200μl的反应室中进行，且优选体积是0.5μl至约8μl、或0.5μl至约2μl。
在另一实施方案中，步骤iii)包括处理至少一个来自电光学感测装置的信号以确定分析物是否不存在或存在于样本中，且如果存在，那么任选测定样本中的分析物的浓度。
在实施方案中，结合分析物的结构域是蛋白质(其可为肽)或核酸。在优选实施方案中，结构域是蛋白质。在实施方案中，蛋白质是结合一种或多种分析物(配体)的天然存在的蛋白质或蛋白质的保留分析物(配体)结合活性的变体。实例包括但不必限于受体、气味结合蛋白、信息素结合蛋白、酶、配体载体或细菌周质结合蛋白。在实施方案中，受体是G蛋白偶联受体，如气味受体或味觉受体。在另一实施方案中，气味受体或味觉受体来自线虫或脊椎动物或是其突变体。
在实施方案中，化学发光供体结构域是生物发光蛋白质。实例包括但不必限于荧光素酶、β-半乳糖苷酶、内酰胺酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶或β-葡萄糖苷酶。荧光素酶的实例包括但不必限于海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、腔肠动物荧光素酶、北美萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、苹绕实蝇(railroad worm)荧光素酶、细菌荧光素酶、长腹水蚤(Gaussia)荧光素酶、水母发光蛋白(Aequorin)、蕈蚊(Arachnocampa)荧光素酶或其任一个的生物活性变体或片段、或其两个或更多个的嵌合体。在优选实施方案中，海肾荧光素酶变体是RLuc2或RLuc8。
在实施方案中，底物是荧光素(如甲壳虫荧光素)、钙、腔肠素或腔肠素的衍生物或类似物。
在优选实施方案中，接受体结构域是荧光接受体结构域。
在另一实施方案中，荧光接受体结构域是蛋白质。实例包括但不必限于绿色荧光蛋白(GFP)、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Venus、mOrange、Topaz、GFPuv、去稳定化EGFP(dEGFP)、去稳定化ECFP(dECFP)、去稳定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、海肾GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白或藻胆蛋白(Phycobiliprotein)或其任一个的生物活性变体或片段。
在替代性实施方案中，荧光接受体结构域是非蛋白质。实例包括但不必限于Alexa Fluor染料、Bodipy染料、Cy染料、荧光素(fluorescein)、丹磺酰、伞形酮、荧光微球体、发光微球体、荧光纳米晶体、海蓝(Marina Blue)、级联蓝(Cascade Blue)、级联黄(CascadeYellow)、太平洋蓝(Pacific Blue)、俄勒冈绿(Oregon Green)、四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)、若丹明、得克萨斯红(Texas Red)、稀土元素螯合物或其任何组合或衍生物。
在实施方案中，方法进一步包括提供生物发光蛋白质的辅因子。辅因子的实例包括但不必限于ATP、镁、氧、FMNH2、钙或其任何两个或更多个的组合。
在优选实施方案中，
i)生物发光蛋白质是荧光素酶或生物活性变体或片段，和/或
ii)底物是荧光素、腔肠素或腔肠素的衍生物或类似物，和/或
iii)接受体结构域是绿色荧光蛋白(GFP)、Venus、mOrange或其任一个的生物活性变体或片段。
在另一优选实施方案中，
i)荧光素酶是海肾荧光素酶，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，
ii)荧光素酶是海肾荧光素酶2，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，
iii)荧光素酶是海肾荧光素酶8，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，
iv)荧光素酶是海肾荧光素酶2，接受体结构域是Venus，且底物是腔肠素，
v)荧光素酶是海肾荧光素酶8，接受体结构域是Venus，且底物是腔肠素，
vi)荧光素酶是海肾荧光素酶8.6-535，接受体结构域是mOrange，且底物是腔肠素，或
vii)荧光素酶是海肾荧光素酶8，接受体结构域是mOrange，且底物是腔肠素。
更优选地，
i)荧光素酶是海肾荧光素酶，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，
ii)荧光素酶是海肾荧光素酶2，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，
iii)荧光素酶是海肾荧光素酶8，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，
iv)荧光素酶是海肾荧光素酶8.6-535，接受体结构域是mOrange，且底物是腔肠素，或
v)荧光素酶是海肾荧光素酶8，接受体结构域是mOrange，且底物是腔肠素。
甚至更优选地，
i)荧光素酶是海肾荧光素酶，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，
ii)荧光素酶是海肾荧光素酶2，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a，或
iii)荧光素酶是海肾荧光素酶8，接受体结构域是GFP2，且底物是腔肠素400a。
在实施方案中，方法包括使用同一微流体装置，例如使用如图14b和14c中所示的装置同时或依序检测两种或更多种不同分析物。
在实施方案中，微流体装置包括以下一个或多个集合
a)三个输入微通道，每一个各自用于传感器分子、底物和样本，或
b)两个输入微通道，一个用于底物且另一个用于传感器分子和样本的预混合物，或
c)两个输入微通道，一个用于传感器分子且另一个用于底物和样本的预混合物。
在另一实施方案中，至少一个微通道包括体积与至少一个其它微通道不同的反应室。
在另一实施方案中，至少一个微通道包括两个或更多个体积相同或不同的反应室。
在优选实施方案中，电光学感测装置具有至少两个可检测重叠或非重叠波长的不同波长通道。在替代性实施方案中，电光学感测装置具有单一波长通道，其中在这个实施方案中，供体淬灭来自接受体的发射。
在实施方案中，电光学感测装置包括纤维束或液体光导管。在实施方案中，纤维束或液体光导管的直径在约1mm与约10mm、或约1mm与约6mm之间。在实施方案中，电光学感测装置进一步包括快门框。
在实施方案中，电光学感测装置包括分叉光导管且不包括分色镜。
在优选实施方案中，传感器分子存在于无细胞提取物中。在替代性实施方案中，传感器分子是由细胞表达(例如存在于细胞的表面上或由细胞分泌)且以细胞完整处于其中的细胞混悬液形式提供。
方法可用于拣选细胞。因此，在实施方案中，使分析物暴露在细胞的表面上且方法进一步包括使包含分析物的细胞转向穿过不同于样本中缺乏分析物的细胞的微通道，以及收集包含分析物的细胞和/或收集缺乏分析物的细胞，其中如果收集两种细胞类型，那么将它们收集在分开的容器中。
在另一方面，本发明提供一种用于检测样本中的分析物的微流体系统，所述系统包括
i)至少一个适于容纳(或包含)包含结合所述分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子的储集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
ii)包括一个或多个微通道的微流体装置，
iii)用于在所述装置中混合所述传感器分子、所述样本和所述化学发光供体结构域的底物的部件，
iv)用于检测所述分析物与所述传感器分子的结合的反应室，和
v)电光学感测装置，
其中当所述分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
在优选实施方案中，传感器分子未固定于微流体装置。
在另一优选实施方案中，系统可用于实时检测分析物。
在另一优选实施方案中，传感器分子和底物通过不同微通道进入装置。
在另一优选实施方案中，微流体装置包括至少两个输入微通道，其中一个输入微通道用于使传感器分子流入装置中。
如熟练收件人将了解，关于本发明的方法的各优选实施方案也涉及本发明的系统和/或可如何操作系统。
在实施方案中，电光学感测装置包括至少两个不同波长通道。
在特别优选实施方案中，电光学感测装置能够同时或快速连续检测两个不同波长通道。举例来说，电光学感测装置能够在小于1秒内检测两个不同波长通道。
在另一实施方案中，微流体装置被设计成使得能够检测两种或更多种分析物。在实施方案中，装置包括用于使各不同传感器分子流入装置中的单独微通道。
在实施方案中，混合发生在反应室中。
本发明也可用于分类样本。出于这个目的，不必已知样本中的哪个(哪些)分析物实际上结合一种或多种传感器分子。因此，在另一方面，本发明提供一种分类样本的方法，所述方法包括
i)使以下各物流过包括一个或多个微通道的微流体装置，
a)所述样本，
b)包含结合一种或多种分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
c)所述化学发光供体的底物，
ii)在所述装置中混合所述传感器分子、样本和底物，
iii)使用电光学感测装置检测由所述化学发光供体对所述底物的修饰，
iv)处理至少一个来自所述电光学感测装置的信号并使电光学反应的样式与一种或多种目标样本的一种或多种预定特征相关联，以及
v)基于所述反应样式的相关性分类所述样本，
其中当所述一种或多种分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
在优选实施方案中，以上方法包括两种或更多种不同传感器分子，其各自结合不同分析物(其可为不同组的分析物)或分析物范围，且步骤v)包括基于各分析物或分析物范围的存在、不存在或浓度分类样本。
在实施方案中，一种或多种分析物是未知的。
在另一实施方案中，方法可用于实时分类样本。
在另一实施方案中，传感器分子未固定于装置。
在另一实施方案中，传感器分子和底物通过不同微通道进入装置。
也提供一种用于分类样本的微流体系统，所述系统包括
i)至少一个适于容纳(或包含)包含结合一种或多种分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子的储集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
ii)包括一个或多个微通道的微流体装置，
iii)用于在所述装置中混合所述传感器分子、所述样本和所述化学发光供体结构域的底物的部件，
iv)用于检测所述分析物与所述传感器分子的结合的反应室，和
v)电光学感测装置，
其中当所述一种或多种分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
在实施方案中，系统包括两种或更多种不同传感器分子，其各自结合可为不同组分析物的不同分析物或分析物范围。
在实施方案中，系统包括两种或更多种不同传感器分子，其各自在不同位点处和/或以不同亲和力水平结合相同分析物。
在另一实施方案中，一种或多种分析物或分析物范围是未知的。
在另一实施方案中，系统可用于实时分类样本。
在实施方案中，传感器分子未固定于装置。
在另一实施方案中，传感器分子和底物通过不同微通道进入装置。
在另一实施方案中，微流体装置包括至少两个输入微通道，其中一个输入微通道用于使传感器分子流入装置中。
在另一方面，本发明提供一种筛选结合目标分子的化合物的方法，所述方法包括
i)使以下各物流过包括一个或多个微通道的微流体装置，
a)候选化合物，
b)包含所述目标分子、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子，其中在存在和/或不存在所述候选化合物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
c)所述化学发光供体的底物，
ii)在所述装置中混合所述传感器分子、所述候选化合物和底物，
iv)使用电光学感测装置检测由所述化学发光供体对所述底物的修饰，
v)处理至少一个来自所述电光学感测装置的信号以确定所述候选化合物是否结合所述传感器分子，以及
vi)如果化合物结合所述传感器分子，那么选择所述化合物，
其中当所述候选化合物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
在优选实施方案中，方法可用于实时检测候选化合物与传感器分子的结合。
在另一优选实施方案中，传感器分子未固定于装置。
在另一优选实施方案中，传感器分子和底物通过不同微通道进入装置。
在优选实施方案中，方法进一步包括确认候选化合物结合目标分子的结合结构域而非传感器分子的其它结构域。如熟练人员将了解，这可使用本领域中广泛多种技术的任一个来进行，所述技术如使用管柱上的目标分子来捕捉候选化合物；竞争性结合测定；在与目标分子一起孵育候选化合物之后使用凝胶色谱确定是否改变目标分子的迁移等。
候选化合物和目标分子可为相同类型的物质，例如两者均可为核酸、蛋白质(包括肽)或小分子。在一个实施方案中，目标分子是蛋白质，如但不限于受体、气味结合蛋白、信息素结合蛋白、酶、配体载体或细菌周质结合蛋白。目标分子可为天然存在的分子或其突变体/变体。
在另一方面，本发明提供一种用于筛选结合目标分子的化合物的微流体系统，所述系统包括
i)至少一个适于容纳(或包含)包含所述目标分子、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子的储集器，其中在存在和/或不存在候选化合物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
ii)包括一个或多个微通道的微流体装置，
iii)用于在所述装置中混合所述传感器分子、所述候选化合物和所述化学发光供体结构域的底物的部件，
iv)用于检测所述候选化合物与所述传感器分子的结合的反应室，和
v)电光学感测装置，
其中当所述候选化合物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
在优选实施方案中，系统可用于实时检测候选化合物与传感器分子的结合。
在另一优选实施方案中，传感器分子未固定于装置。
在另一优选实施方案中，传感器分子和底物通过不同微通道进入装置。
在另一实施方案中，微流体装置包括至少两个输入微通道，其中一个输入微通道用于使传感器分子流入装置中。
本发明者也已鉴定一种不遭受BRET2的低发光特性的杂交BRET(BRETH)检测系统。因此，在另一方面，本发明提供一种检测样本中的分析物的方法，所述方法包括
i)在腔肠素存在下使所述样本与传感器分子接触，所述传感器分子包含
a)结合所述分析物的结构域，
b)海肾荧光素酶，和
c)绿色荧光蛋白2，以及
ii)确定所述生物发光蛋白质与所述接受体分子之间的生物发光共振能量转移(BRET)是否改变，
其中当所述分析物结合所述结构域时，所述生物发光蛋白质相对于所述接受体分子的空间位置和/或偶极定向被改变。
当然，以上方法可容易地用于使用微流体装置的本发明的方法中。
在另一方面，本发明提供一种分离的传感器分子，其包含结合一种或多种分析物的结构域、海肾荧光素酶和绿色荧光蛋白2。
本发明者已鉴定结合2-戊酮的多肽，且因此这些多肽可用于检测这个化合物。
因此，在另一方面，本发明提供一种检测样本中的2-戊酮的方法，所述方法包括
i)使所述样本与作为秀丽隐杆线虫(C.elegans)str-112(SEQ ID 41)或str-113(SEQ ID NO:42)的多肽或其结合2-戊酮的变体接触，以及
ii)检测任何所述多肽是否结合于2-戊酮。
如熟练人员将了解，存在一旦已鉴定新型配体/多肽结合对，即可被配置的庞大系列的不同测定。在一个实施方案中，本发明的方法用于检测样本中的2-戊酮。
在实施方案中，str-113的变体是str-114/str-113融合物(SEQ IDNO:43)。
在实施方案中，多肽经过可检测标记。所述可检测标记的多肽的实例包括但不限于提供为SEQ ID NO 13、14、18、27、28和30的多肽。
2-戊酮是由细菌产生，且因此以上方法可用于检测例如细菌性感染或污染。
因此，在另一方面，本发明提供一种检测样本中的细菌的方法，其包括使用本发明的方法检测2-戊酮。
在实施方案中，细菌是埃希氏菌属(Escherichia sp.)，如大肠杆菌(E.coli)。
除非另外明确陈述，否则本文任何实施方案都应被视为向任何其它实施方案施加必要的变更。
本发明在范围上不受限于本文所述的特定实施方案，所述实施方案仅意图出于例示目的。功能等效产物、组合物和方法明确在如本文所述的本发明的范围内。
在整篇本说明书中，除非另外明确陈述或上下文另外要求，否则提及单一步骤、物质组成、成组步骤或成组物质组成应视为涵盖那些步骤、物质组成、成组步骤或成组物质组成中的一个和复数个(即一个或多个)。
在下文中，本发明是借助于以下非限制性实施例且参照附图加以描述。
附图简述
图1-用于执行要求保护的方法的显示微流体芯片(微芯片)和BRET检测系统的通用布置。DM＝分色镜，BP＝带通滤光器(波长中心以nm计，宽度以nm计)。
图2-通过以下方式监测的凝血酶裂解GFP2-RG-RLuc融合蛋白传感器分子：(A)在添加和不添加2单位凝血酶下在添加5μM天然腔肠素至GFP2-RG-RLuc融合蛋白中后，杂交BRET系统的光谱变化以及(B)对纯化的His标记BRET蛋白的SDS-PAGE分析。每个泳道装载2.5μg蛋白质。从左至右；分子量标记(KDa)、RLuc、GFP2、GFP2-RG-RLuc、在30℃下与54nM凝血酶一起孵育90分钟之后的GFP2-RG-RLuc；条件与先前泳道相同，例外之处是凝血酶已在室温下与2单位水蛭素(hirudin)一起预孵育10分钟的GFP2-RG-RLuc。
图3-在添加5μM天然腔肠素后，1μM融合蛋白；在用54nM凝血酶处理(90分钟，30℃)之后或在用2单位水蛭素预处理(10分钟，室温)之后用54nM凝血酶处理(90分钟，30℃)之后，GFP2-RG-RLuc的凝血酶裂解之后的标准化BRETH比率变化(平均值±S.D.，n＝3)。对照由1μM RLuc和GFP2蛋白组成。p≤0.001指示高度显著差异，p＝0.33指示变化不显著。
图4-用于芯片上检测的实验设置。(a)杂交BRET反应的示意图，以及(b和c)用于BRET信号检测的微流体芯片系统(Clz＝天然腔肠素，DM＝分色镜，BP＝带通，PMT＝光电倍增管)。
图5-随如图4b中标记的离Y形接合点的距离x而变的在添加腔肠素底物后GFP2-RG-RLuc凝血酶传感器蛋白质的生物发光强度(AU)以及BRETH比率。符号+和▽分别表示RLuc和GFP2通道的生物发光背景。○和×分别表示RLuc和GFP2通道的生物发光强度。◆表示BRET比率。融合蛋白浓度是3.0μM。天然腔肠素浓度是58.6μM；各水性流动速率是20μl/h；使用20×物镜；GFP2和RLuc通道的滤光器带通分别是515nm–555nm和430nm–455nm；内部门控时间200ms用于数据撷取。
图6-随水性物流的总流动速率(a)和凝血酶传感器浓度(b)而变的BRETH比率。(a)凝血酶传感器蛋白质浓度是3.0μM且天然腔肠素浓度是58.6μM；(b)天然腔肠素浓度是58.6μM；各水性流动速率是20μl/h；使用20×物镜；GFP2和RLuc通道的滤光器带通分别是515nm-555nm和430nm-455nm；内部门控时间200ms用于数据撷取。
图7-微流体和微板格式中的BRETH凝血酶传感器的校准曲线(平均值±SD，n＝5)。所有微流体测量结果都在x＝2.1mm处获得。○和□分别表示微芯片测量和微板测量的数据。主图显示在低凝血酶浓度下的数据，而插图显示相应全范围测量结果。线条是线性回归，其是y＝0.835x+1.019(R2＝0.996)(对于微芯片数据)和y＝0.1797x+1.001(R2＝0.995)(对于微板数据)。对于微芯片方法，融合蛋白浓度是3.0μM且天然腔肠素浓度是58.6μM，各水性流动速率是20μl/h。对于微板方法，融合蛋白和天然腔肠素浓度分别是1μM和5μM。
图8-被动混合设计的实例(a)具有线性接触区的Y形(b)狭窄蛇形，(c)宽蛇形，(d)螺旋状，(e)具有尺寸变化和挡板的Y形通道，和(f)具有狭窄蛇形接触区的三个进口。
图9–本发明的芯片和芯片上光学检测系统的特定实例的示意图。PMT-光电倍增管。PDMS-聚二甲基硅氧烷芯片基质。
图10–样本数据指示通过GFP2-RG-RLuc凝血酶传感器的BRET2比率变化检测凝血酶。a.在不存在凝血酶下的GFP(绿色–顶部)和海肾荧光素酶(蓝色-底部)通道发射强度。b.在与270pM凝血酶一起孵育传感器之后的GFP(绿色-底部)和海肾荧光素酶(蓝色-顶部)通道发射强度。c.无凝血酶和270pM凝血酶条件的BRET2比率。
图11-在图9的微流体装置中使用GFP2-RG-RLuc凝血酶传感器，通过BRET2测量来检测凝血酶的灵敏度(蓝线)相较于来自可商购获得的板读取器仪器的结果(红线)的直接比较。
图12-在混合凝血酶生物传感器(1μM)与含有凝血酶(540nM)和腔肠素400a底物(12.5μM)的制剂后，用两进口微流体装置测量的BRET2比率。
图13-本发明的系统的子系统的实例。
图14–单传感器和多传感器芯片设计的实例。
图15–当三个微流体流接触时，被动或基于扩散的试剂混合的区域的实例。
图16–电光学检测系统的实例。
图17-两个BRET光学检测元件的设计，(a)双凸面微透镜在反应室的底部用于收集来自反应室内部的许多BRET点源的荧光且聚焦于多模光纤(核心200μm)上，(b)平凸面微透镜也充当反应室的底部。然而，在顶部上的非球面微小镜子(微机械加工在套圈上)将收集来自BRET点源的顶部的荧光且准直于微透镜上。类似于(a)，平凸面微透镜将接着将荧光聚焦至光纤的核心中。
图18-融合于RLuc2和GFP2的ODR-10受体构建体中的共振能量转移的原理。GFP2被插入ODR-10的第三细胞内环中且RLuc2在C末端(OGOR2)处。丁二酮结合导致OGOR2生物传感器的构象变化，从而导致距离增加或BRET2组分之间的偶极矩定向变化。Clz400a＝腔肠素400a底物。
图19-在添加5μM Clz400a至20nM传感器中后，OGOR和OGOR2传感器的生物发光强度。
图20-在芯片上将12.5μM Clz400a混合至1μM传感器中后，OGOR和OGOR2传感器的生物发光强度。
图21-在与含1μM丁二酮的水或仅水对照一起孵育之后，96孔板的各孔中的OGOR2的BRET2信号(平均值±SD，n＝3)。
图22-微孔板格式中的OGOR2的BRET2信号的丁二酮浓度反应曲线。
图23-在与含10fM丁二酮的PBS或作为对照的仅PBS一起孵育之后，用芯片上微流体OGOR2信号测定检测的BRET2信号变化(平均值±SD，n＝3)。
图24-关于芯片上(微流体)测定测量的OGOR2剂量反应。
图25-历经一定范围的流动速率在芯片上接触OGOR2后，使用实时微流体测量检测的BRET2信号的平均变化。含1 fM丁二酮的PBS或仅PBS和12.5μM Clz400a底物(在四个不同流动速率下，BRET2比率的平均值±SD)。
图26-在使OGOR2(290nM)与1飞摩尔浓度丁二酮的PBS溶液以及与12.5μM腔肠素400a接触后，用三进口微流体装置在不同共用流动速率下测量的BRET2比率。
图27-融合于BRET2组分GFP2和RLuc2的MBP受体构建体的BRET的原理。麦芽糖结合导致BRET2标记的MBP受体的构象变化，从而使BRET2组分更紧密邻近，从而导致从RLuc2至GFP2的能量转移的效率增加。Clz400a＝腔肠素400a底物。
图28-0.1mM各种糖对GFP2-MBP-RLuc2传感器的BRET2比率的影响。在28℃下与水(灰色棒条)或0.1mM所述糖一起孵育30分钟之后，在添加16.7μM腔肠素400a至1μM GFP2-MBP-RLuc2或W140A突变体(阴影线棒条)中之后，记录BRET2比率(平均值±SD，n＝3)。通过水反应对BRET2比率进行标准化。**P<0.01且P*<0.05。
图29-在添加16.67μM腔肠素400a后，1μM GFP2-MBP-RLuc2对0.1mM麦芽糖的反应时间(分钟，平均值±S.D.，n＝3)。在与麦芽糖一起孵育任何时期之后的BRET2反应是通过在与水一起孵育相同时期之后的BRET2反应加以标准化。
图30–(A)FRET对BRET2。相较于FLIPmal-2μ的FRET反应(平均值±SD，n＝3)，在添加16.67μM腔肠素400a后，1μMGFP2-MBP-RLuc2融合蛋白的BRET2反应(平均值±SD，n＝11)的麦芽糖浓度依赖性(530/485-nm比率)。根据由Fehr等(2002)呈现的数据重新绘制FLIPmal-2μ的剂量-反应曲线。相对于log[激动剂]对反应来拟合数据。BRET2EC50＝0.4μM且FRET EC50＝3.2μM。(B)微流体芯片上针对麦芽糖的基于BRET2的MBP测定相对于使用微板测定的比较。
图31-用于从无(A)和有(B)线上光纤开关的微流体芯片系统收集数据的实验设置。BP-带通，PMT-光电倍增管；NA-数值孔径。
图32-在无(A)和有(B)光学开关下，对于三次操作收集的实时Rluc/Clz400a生物发光信号。
图33-在无和有光学开关下，Rluc/Clz400a和GFP通道的平均生物发光信号比较。
图34-显示通过液体光导管与光检测器联用的直径增加的BRET反应室(h＝2mm)的布置的实例。
图35-狭窄口径相对于宽口径BRET检测室/光学系统的性能比较。在两种情况下，BRET发射均从流过微流体通道的OGOR2传感器的1/100稀释液测量。(a)狭窄口径系统(腔室尺寸h＝2mm；纤维核心直径＝1mm，NA＝0.48)。(b)宽口径系统(腔室尺寸 h＝2mm，光导管核心直径＝5mm，NA＝0.59)。
图36-说明使用基于更宽直径BRET反应室(4mm)和宽口径液体光导管的更高效光捕捉系统，利用高度稀释的OGOR2传感器检测1μM丁二酮。(a)100倍传感器稀释液。BRET2比率的丁二酮依赖性降低＝13.7％以及(b)50倍传感器稀释液，BRET2比率的丁二酮依赖性降低＝14.7％。误差棒表示3个实验的标准偏差(N＝3)。
图37-使用分叉光导管且无分色镜的单一微流体通道和BRET光收集系统的实例。可添加额外组的分叉光导管连同滤光器和数对光检测器一起以适合于一个或多个其它微流体通道和/或BRET反应室。
图38-具有有助于多通道测量的快门框的光学构造
图39-用分叉光导管或分色镜检测的BRET信号的强度的比较。a、b：分叉光导管，反应室尺寸h＝1mm，有和无反射盖。c、d：伴有分色镜的单一光导管，反应室尺寸h＝2mm(即a、b的体积加倍)。所有版面都显示在t＝0时启始流动之后，信号随时间增加。版面a和c蓝色信道，版面b和d绿色通道。
图40-适于测量来自快门框的BRET输出的多分叉光导管布置。
图41-在单一分色镜上汇合的多分叉光导管相对于发散至两个单独滤色器中的分叉光导管的比较。在蓝色(RLuc；1、3)和绿色(GFP；2、4)通道中收集的相对光强度。1、2：根据图38和40的具有分配给不同微流体通道的输入端和通过优化分色滤光器导向一对PMT的输出端的多分叉光导管。3、4：根据图37的具有分配给不同光谱通道的输出端的分叉光导管。
图42-使用真空光电倍增管技术的超低光度光检测器的实例。来源：Hamamatsu
图43-使用固态技术建构的超低光度光检测器的实例。尺寸以mm计。来源：Hamamatsu
图44-在两个不同流动速率下操作的三进口微流体装置中层流和扩散混合的直接可视化。三种水性输入物中的两者用蓝色或红色食物色素着色。用以抽取模式工作的单一注射泵操作装置。流动方向：右至左。
图45-基于垂直堆叠的物流的被动混合实例设计。通道的宽度从600μm起始直至2mm，厚度是20-60μm。长度具有灵活性，从20mm起始直至100mm，角度是45度(其可历经从0°至接近于约170°的宽范围加以变化，或实际上与微流体芯片的平面成某一角度)。
图46-BRET比率测量结果的比较。误差棒反映标准偏差(n＝3)。
图47-用于多路检测的微流体芯片设计实例。在顶部处的进口被指定用于底物，而在底部处的三个进口用于引入传感器1、样本和传感器2。
图48-用于并行检测的微流体芯片设计实例。流动方向是底部至顶部。流动速率是150μl/h和1500μl/h。从底物进口引入红色食物染料，且从传感器进口引入蓝色染料。无食物色素用于样本进口。
图49-通过处于抽取模式的单一抽吸泵操作的三进口微流体装置。处于抽吸模式的泵在装置出口处产生负压。样本、传感器和底物物流被吸入共用通道(显示为蛇形布置)且加以被动混合。使BRET反应室刚好位于出口之前。此处使用的泵是注射泵，也可使用广泛多种泵送方法。
图50-用于使用以抽取模式工作的注射泵进行并行独立操作的构造。一实例是其中四个传感器通道是通过使用四个单独注射器来独立并行操作。这使得能够在不同流动速率下操作传感器通道以满足一定范围的不同要求。
图51-a.来自以抽吸模式用多分叉光导管和优化分色镜操作的芯片上凝血酶传感器的RLuc和GFP信号。反应室H＝1mm。b.来自“a”的BRET2信号。c.基于相等滞留时间说明具有相同直径和不同高度的腔室的预期信号。
图52-在微流体形式中达成的特异性麦芽糖检测。比较BRET2-MBP传感器对0.1mM麦芽糖、葡萄糖和蔗糖的BRET2反应。
图53-在N末端处具有GFP2且在C末端处具有RLuc2的BRET2凝血酶传感器已被修饰来模拟纤维蛋白溶酶的κ-酪蛋白靶标序列：XKZX，其中Z＝K、Y、V或E。
图54-在5μM腔肠素存在下，使用GFP2-FL1-RLuc2传感器在PBS、奶c)和d)或橙汁(a和b)的各种稀释液中产生的BRET2信号强度和比率
图55-在5μM腔肠素A存在下，使用GFP2-FL1-RLuc2传感器在未稀释全乳中产生的BRET2信号的时间过程。a.强度。b.BRET2比率。
图56-GTR2蛋白在凝血酶裂解缓冲液或(a)血清、(b)橙汁或(c)奶的各种稀释液中的生物发光强度(GFP2通道-515nm带通30nm)。
图57-GTR2蛋白在凝血酶裂解缓冲液或(a)血清、(b)橙汁或(c)奶的各种稀释液中的BRET2比率。
图58-使用GTR2检测凝血酶裂解缓冲液、稀释的奶、橙汁或血清中的凝血酶蛋白酶活性(2单位)。结果呈现为标准化BRET2比率，因为绝对BRET^2比率根据样本和它的稀释液而变化。应注意的是在血清的1/10稀释液中不存在作用可能归因于由血清制备中使用的肝素产生的残余活化的抗凝血酶III使添加的凝血酶失活。
图59-用于气液分配实验的试样夹具
图60-在时间＝0时启动风扇之后，氧气进入除氧SASS2400样本流体中的时间过程。
图61-在时间＝0时启动风扇之后，苯酚进入SASS2400样本流体中的时间过程。使用任意单位指示相对苯酚浓度。
图62-3通L口气动操作的球阀。这允许在活跃取样期间将挥发性顶部空间快速(≤1s)转换至SASS2400空气入流。
图63-显示用于以用于快速转换进气的三通阀进行SASS2400测试的设置的示意图。
图64-Str 112(A)、Str114/113(B)和Str113(C)的选择性。Str112(平均值±SD，n＝3)、Str114/113(平均值±SD，n＝14)和Str113(平均值±SD，n＝6)对1μM气味剂或水(灰色棒条)的BRET2反应。****P<0.0001，**P<0.001且*P<0.05。
图65-BRET标记的SGSR-112(A)和SGSR-114/113(B)线虫气味受体对2-戊酮的BRET反应。
图66-BRET标记的(A)Str114/113线虫气味受体对丁二酮和2–戊酮以及(B)Str-113线虫气味受体对1-己醇的BRET反应。
图67-使用GMR基于BRET2的传感器实时、连续、芯片上检测1μM麦芽糖。A)在100μL/小时输入速率下随时间变化的通道发光度，B)在100μL/小时输入下随时间变化的BRET2比率。C)在200μL/小时输入速率下随时间变化的通道发光度，D)在200μL/小时输入速率下随时间变化的BRET2比率。E)在水对照与1μM麦芽糖之间进行的在100μL/小时下从200至250秒平均化的BRET2比率的比较。F)在水对照与1μM麦芽糖之间进行的在200μL/小时下从200至250秒平均化的BRET2比率的比较。
序列检索表
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SEQ ID NO:43-秀丽隐杆线虫str-114/113嵌合蛋白。
SEQ ID NO:44-编码秀丽隐杆线虫str-112的开放阅读框。
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SEQ ID NO:46-编码秀丽隐杆线虫str-114/113嵌合蛋白的开放阅读框。
发明详述
一般性技术和定义
除非另外明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都应视为具有与由本领域(例如在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
除非另外指示，否则本发明中利用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是为本领域技术人员所熟知的标准程序。所述技术是在以下出处中的文献中进行描述和说明：如J.Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)；T.A.Brown(编),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,第1和2卷,IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编),DNA Cloning:A Practical Approach,第1-4卷,IRLPress(1995和1996)；以及F.M.Ausubel等(编),Current Protocols inMolecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直至目前的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)；以及J.E.Coligan等(编)Current Protocols in Immunology,JohnWiley & Sons(包括直至目前的所有更新)。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解成指“X和Y”或“X或Y”且应视为提供对两种含义或对任一含义的明确支持。
除非上下文另外表明，否则以单数提及术语(如传感器分子和受质)也明确指复数。举例来说，根据逻辑，许多个别传感器分子而非单一分子将流过装置。
除非相反陈述，否则如本文所用，术语约是指指定值的+/-20％、更优选+/-10％、甚至更优选+/-5％。
在整篇本说明书中，用词“包含(comprise)”或变化形式(如“comprises”或“comprising”)应理解为暗示包括所述要素、整数或步骤、或成组要素、整数或步骤，而非排除任何其它要素、整数或步骤、或成组要素、整数或步骤。
检测/分类/筛选系统
本发明涉及一种检测样本中的分析物的方法，所述方法包括
i)使以下各物流过包括一个或多个微通道的微流体装置，
a)所述样本，
b)包含结合所述分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
c)所述化学发光供体的底物，
ii)在所述装置中混合所述传感器分子、样本和底物，以及
iii)使用电光学感测装置检测由所述化学发光供体对所述底物的修饰，
其中当所述分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
本发明也涉及一种用于执行本发明的方法的微流体系统，所述系统包括
i)至少一个适于容纳(或包含)包含结合所述分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子的储集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
ii)包括一个或多个微通道的微流体装置，
iii)用于在所述装置中混合所述传感器分子、所述样本和所述化学发光供体结构域的底物的部件，
iv)用于检测所述分析物与所述传感器分子的结合的反应室，和
v)电光学感测装置，
其中当所述分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
如熟练人员将了解，本发明的方法和系统可用于检测样本中存在或不存在分析物，且如果存在，那么也可用于测定所述分析物的浓度。
本发明具有超过先前技术的众多优势，特别是当与传感器分子固定于装置的方法和系统进行比较时。首先，无需再生(再设置)装置。其次，在本发明的方法和系统中存在较小信号漂移。第三，因为装置可再使用的次数比当固定传感器分子时多许多，所以成本得以降低。第四，本发明避免在固定构造下归因于传感器分子的表面积和密度的信号较低问题。第五，当前技术是基于体积的检测技术，而非其中传感器分子需要连接于表面的基于表面的技术，如表面等离子体共振。传感器-分析物反应发生更加快速，由此甚至在不主动控制下减少分析时间。
此外，BRET具有超过基于荧光的技术的若干优势，因为它不需要用外部光源激发供体。BRET不遭受供体的自身荧光、光散射、光致漂白和/或光致异构化或对细胞的光致损伤。在BRET测定中不存在外部光源导致背景极低以及因此检测灵敏度增加。举例来说，就监测凝血酶催化的蛋白水解裂解而言，BRET比FRET灵敏50倍(Dacres等,2009b)。
关于使用本发明的方法分类样本，传感器分子(更通常是一组传感器分子)可用于检测代表特定子群体的物质(分析物)样式。
举例来说，方法可用于分类啤酒、葡萄酒、乳酪或其它消费品的不同类型、年代、品质等。方法也可广泛地与食品、饮料、香料、芳香剂等的样本一起用于分类或定量它们的感官性质，如甜味、苦味、鲜味特征、例如关于辣椒素(capsaicin)或羟基-α-山椒醇(sanshool)的“热度”、例如关于薄荷醇(menthol)的“凉爽度”和/或适合传感器分子可针对其加以分离或工程改造的任何嗅觉指示。方法也可用于基于化学特征分类广泛范围的其它样本，例如基于顶部空间、呼吸、汗、尿、其它生物流体的样本分类人、动物或植物的健康、营养或疾病状态。方法的另一用途在于基于样本的毒性或有害性，如存在爆炸物或爆炸物相关组分、毒性工业化学品、化学或生物学战争试剂或病原微生物来分类样本。方法也可用于监测工业过程，包括与规格的一致性或存在、不存在各种水平的任何一组或多组化学品。方法也可用于实时或以批式模式分类环境样本，例如以确定空气质量、不合意气味或毒性化学品的存在或水平、或类似地天然或网状水系统、污水系统或地下水的质量，或分类与土壤或岩石接触的流体。
通常通过基于对一组训练样本的电光学反应的样式产生判别函数或分类器来对样本进行分类，所述样本代表或涵盖希望判别的所有类别的样本。这可使用多变量统计方法，如主成分分析、线性判别分析、逐步判别分析等来常规达成。或者，可使用广泛多种机器学习方法，一个实例是支持向量机。一类似方法在于使用贝叶斯网络(Bayesian network)或训练人工神经网络来在测试组的样本之中进行所述判别。一种可行方法是接着捕捉来自测试或未知样本的电光学反应的样式，实时处理它们并将它们与用训练组样本获得的保存的样式进行比较，根据最佳匹配将它们指定至已知类别或如果先前尚未观察到类似样式，那么将它们指定至一个或多个新型类别。对于分类方法，并非必需的是实际分析物是已知的，仅需要传感器分子(或成组传感器分子)可重现地产生与不同类别的样本不同的信号样式，此使得使用者能够分类所分析的样本。
关于灵敏度，可检测低至微摩尔浓度、纳摩尔浓度、飞摩尔浓度、阿托摩尔浓度或甚至更低的分析物浓度。在实施方案中，本发明的方法比如果所述方法在相同试剂浓度下在微孔板上所执行的灵敏至少5倍、或至少10倍、或5倍至1,000倍、或5倍至100倍、或5倍至50倍、或5倍至20倍，或且在一些情况下多达100至1,000倍。
本发明特别适用于实时检测分析物。如本文所用，术语“实时”是指某一状态大致上同时以另一形式显示(例如以显示器上的图像或具有处理的数据的图形式)。在所述情况下，“实时”滞后实际事件为数据处理所需的时间。如果所述时间滞后大致上可忽略，那么它包括在“实时”的范围中。所述时间滞后可通常在10秒内，且优选不加限制地在1秒内。在优选实施方案中，本发明的方法是在约1s至约100s内执行。
如本文所用，“福斯特距离”是能量转移效率是(平均)50％所处的供体与接受体之间的距离。福斯特距离(Ro)取决于许多因素，包括在不存在接受体下的供体量子产率、溶液的折射率、各结构域的偶极角定向、以及供体和接受体的光谱重叠积分。
如本文所用，“量子产率”是指原始能量供给的最终发射的量度。
如本文所用，“斯托克斯位移”是相同电子跃迁的吸收和发射光谱的带最大值的位置之间的波长差异。
在实施方案中，本发明用于在装置上分析递增(例如通过在芯片上合成分析物)或递减(例如在芯片上降解或修饰分析物)浓度的分析物。通常，这将需要在装置上的两个不同点处，例如在分析物所流过的第一和第二反应室中检测底物的修饰。因此，在实施方案中，分析物从传感器分子释放导致BRET比率变化≥15％、≥20％、≥30％、≥35％、约15％至约50％、或约15％至约40％的最大观察BRET比率。
在另一实施方案中，传感器分子可进入结合于配体的输入微通道，且待检测的分析物(例如催化酶)裂解和/或修饰所述配体以使修饰的配体从传感器分子释放(不再结合于传感器分子)。
本发明的方法和系统中的BRET感测是在微流体装置中实现。在一个构造中，系统包括若干模块，其包括(1)样本递送，(2)试剂储存和处理，(3)微流体芯片和装载系统，(4)任选温度控制，(5)用于光收集的电光学系统，(6)电光学检测系统，(7)数据撷取和处理，和(8)软件和嵌入控制系统(图13)。
样本递送
“样本”可为已知或怀疑包含待检测的分析物或要检测预期或需要不存在特定物质、一组物质或组合物的任何物质或组合物。样本的实例包括空气、液体和生物材料。样本可直接从环境或来源获得，或可在执行本发明的方法之前通过适合程序至少部分纯化。
样本可呈能够流过微流体装置的任何形式。实例包括但不必限于液体、气体、乳液或混悬液。在实施方案中，样本是已用气体预平衡的液体。混悬液的实例包括但不必限于油包水、水包油和含气体的液体。
在更特定实施方案中，使环境空气或来自目标位置或任何目标对象或样本的顶部空间的其它气体与水或水溶液紧密接触以使分析物的快速质量传递基于分析物的气体浓度、溶解度和分配系数以及液相的组成从气相向液相发生。产生相对于液体体积具有大面积的气液界面的任何方法都是潜在适合的。示例性方法包括湿壁旋流器、喷雾或鼓泡系统。SASS2400湿壁旋流器是适于加速挥发物从空气分配至水相中的装置的一特定实例。优选地，方法允许大体积的空气与较小体积的液体接触，由此允许对大体积的气相取样以及提供浓缩步骤。基于SASS2400的公布的规格，有可能在标准温度和压力下每分钟使1体积的水或水溶液与40,000体积的气体接触。视所用设备的尺寸和操作特征而定，可对低得多或高得多的气液比进行取样。
在一个实施方案中，混悬液是或包含无细胞提取物。在替代性实施方案中，混悬液包含细胞。
可通过任何适合手段使样本(以及传感器分子和底物)流过微流体装置，所述手段如但不必限于以下一项或多项：泵送、真空、水力、抽吸、电动、化学渗透、毛细管力、声学、电磁、压电学等。泵送机制可用用于各种应用的紧凑、小型化以及微米尺寸泵实现。可存在用以从样本滤出碎片，如粒子、有机小滴等的预调装置、和/或测量样本的一些基本参数(如样本的温度、湿度、流动速率和体积)的条件监测装置。
试剂储存和处理
可使用用于多种试剂(BRET试剂、清洁DI水、底物等)储存的一次性和可收回液体储存系统。装置可在实验室中预装载且在操作期间插入感测装置中。
微流体装置和装载系统
微流体装置(在本领域中也称为芯片或“芯片上的实验室(lab-on-a-chip)”)通过在腔室和通道中操作流体试剂来进行化学或生物化学反应或分析，所述腔室和通道的横截面的尺寸通常是约10至50μm(微米)直至约100至1000μm，且其形成在通常平坦的具有线性尺寸约1mm至约20cm的基板上或中。当流体反应物以从输入储集器通过装置流向出口的连续流形式，或以在操作期间大致上充满装置的通道和腔室的流体等分试样的半连续流形式来流过装置的通道和腔室时，微流体装置可操作流体反应物。或者，微流体装置可操作呈单独和离散微滴形式的流体试剂，所述微滴的特征在于具有的长度的数量级接近装置尺寸或小于装置尺寸。
一旦微流体装置插入芯片装载系统中，则微流体装置可维持与所有样本和试剂递送出口连通。这个装载系统可形成为温度控制和光学组件的一部分。单一至多个反应器可集成至芯片中(图14)。三种试剂(样本、传感器分子和底物)流可被泵送至芯片中且在混合区中混合。在替代性构造中，存在两个输入微通道，一个用于底物且另一个用于传感器分子和样本的预混合物。在另一构造中，存在两个输入微通道，一个用于传感器分子且另一个用于底物和样本的预混合物。
混合的试剂将经受BRET反应且产物可在从废物出口收集之前通过检测腔室连续泵送(图15)。
如本文所用，术语“混合”或其变化形式是指分析物、传感器分子和底物通过任何种类的手段接触，无论是扩散(例如由线性(分层)流动所致)和/或通过某种主动混合手段。因此，在一个实施方案中，“用于混合的手段”可为线性(分层)流动中的被动扩散。在这个实施方案中，尽管未达成完全混合，但本发明者已发现发生足量混合供本发明的方法适当地起作用。在实施方案中，扩散混合导致至少20％包含样本、传感器分子和底物的微通道具有这些组分的均质混合物。
至少两个微通道汇合以形成共用微通道的角度可从0°变化至接近约170°或实际上与微流体芯片(装置)的平面成某一角度。
如本文所用，术语“共用微通道”或其变化形式是指包含样本、传感器分子和底物的微通道或其区段。
如本文所用，术语“输入微通道”或其变化形式是指如样本、传感器分子或底物等特定试剂或试剂的组合进入微流体装置所通过的微通道。
在至少一些实施方案中，由于存在层流区，所以混合手段优选在混合区中实施以增强反应物的接触。混合手段可包括被动混合(图8和图44)和/或主动混合，如用声学混合器混合(例如如WO2006/105616中所述)。其它混合技术也可出于所述目的加以实施，如WO 2003/015923中所述的技术。
如本文所用，术语“在装置中混合传感器分子、样本和底物”及其变化形式涵盖在装置的储集器中混合传感器分子，样本和底物、在流入装置的微通道中的管中混合传感器分子、样本和底物，在装置的微通道中混合传感器分子、样本和底物，或在反应室中混合传感器分子、样本和底物，或其两个或更多个组合。在优选实施方案中，传感器分子、样本和底物是在微通道中混合。优选地，如果传感器分子和样本不在微通道中混合，那么它们临在进入微通道之前(例如10秒、更优选1秒或小于1秒)加以混合。
在实施方案中，混合步骤导致传感器分子、底物和分析物形成至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％均质的混合物。如上所指示，对于任何给定流动速率和通道构造，主动混合将产生更大程度的均质性，但这未必为执行本发明所需。
本发明的方法可用于使用同一微流体装置，例如使用如图14b和14c中所示的装置同时或依序检测两种或更多种不同分析物。在实施方案中，不同传感器分子是使用不同微通道流入装置中。为方便起见，如果待分析的样本的各分析物相同，那么可存在进入装置中的单一样本流，其接着分支且与包含不同传感器分子的其它通道接合(参见图14b和14c)。如果各传感器分子的底物相同，那么同样适用。熟练人员可视待分析的样本的数目、为检测各靶标分析物所需的传感器分子的数目、以及鉴于所用不同传感器分子所需的相应底物的数目而定来容易地设计微通道的适合构造。
微流体装置可由具有化学相容性和机械强度的必需特征的任何材料制造。所述物质的实例包括但不必限于硅、玻璃(例如熔融二氧化硅、熔融石英、硼硅酸盐或任何类型的具有不同添加剂的玻璃)、聚二甲基硅氧烷、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯聚砜、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、多晶硅、聚四氟乙烯、聚砜、丙烯腈丁二烯、苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(对苯二甲酸丁二酯)、聚(醚砜)、聚(醚醚酮)、聚(乙二醇)、苯乙烯-丙烯腈树脂、聚(对苯二甲酸1,3-丙二酯)、聚乙烯丁醛、聚偏二氟乙烯、聚(乙烯吡咯烷酮)、环状烯烃共聚物及其任何组合。
可使用本领域中的标准技术，如单一和多层软平版印刷(MSL)技术和/或牺牲层囊封方法构建装置(芯片)(参见例如Unger等(2000)；WO 01/01025)。制造微流体装置的其它方法包括微型机制、微型磨削、基于激光的机制、化学蚀刻、(深度)反应性离子蚀刻、压印技术。这些技术可连同热压纹和/或注射模制技术一起用于批量生产微型装置。在制造技术方面存在许多先前技术。这些技术中的一些也描述于US 5,858,195、US 5,126,022、US 4,891,120、US 4,908,112、US5,750,015、US 5,580,523、US 5,571,410、US 5,885,470和US 6,793,753中。可制造独立结构以具有相对于通道宽度和高度极薄或极厚的壁。通道的壁以及顶部和底部可都具有不同厚度且可由相同材料或不同材料或材料的组合制得，所述组合如玻璃、硅和可生物相容材料(如PDMS)的组合。密封通道或腔室可完全由如PDMS等可生物相容材料制得。
适用于本发明的装置可具有一个或多个通道和/或反应室。举例来说，装置可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或大于10个通道。此外，装置可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或大于10个反应室。
反应室和微通道可为本领域中已知的任何适合形状，如但不限于圆柱形、矩形、半球形或梯形。
在实施方案中，当装置能够进行一个以上反应时，通道设计使得各组分流过具有相同长度、尺寸和构造的通道，如图47中提供的两侧对称平行通道布局。
在另一实施方案中，微通道的功能和反应室的功能可通过其中发生混合且从其收集光的单一组合的微流体元件来满足。
微流体装置将通常具有一个或多个约1pl(即皮升或一万亿分之一升)至约200μl的反应室体积。然而，在某些应用中，约0.01nl(即纳升或十亿分之一升)至约100nl之间、或约0.01nl与10nl之间的反应室体积可为有利的。当各反应室的体积在约0.20nl至约5nl之间时，一些实施方案可最优地实施。另一实施方案是其中各反应室的体积在约0.25nl至约2nl之间。在另一实施方案中，反应室具有约1μl至约12μl的体积。适当时可使用其它可能的反应室体积。
在优选实施方案中，反应室的宽度大于其长度。在一个实例中，反应室具有的横截面积为约1mm2至1cm2且高度为至多约5mm。
在一些情况下，可能合乎需要的是使用具有一种以上尺寸和形状的反应室。举例来说，本发明者已观察到较大反应室会产生更多光且允许检测更弱发射性传感器分子，常以在递呈含有靶标分析物的样本后的反应时间(达到BRET比率峰值变化的时间)较慢以及当移除分析物时停机时间较长为代价。因此，不同通道可配备尺寸不同的反应室以匹配传感器分子和分析物或成组分析物的特定组合的灵敏度、精确度和时间动态。也可能以及在一些情况下可能合乎需要的是每个传感器通道建构一个以上反应室。这将允许在较高发光度和定量精确度(大腔室)和较高时间分辨率(较小腔室)下接近同时检测样本。这可通过光学开关或等效物使大腔室和较小腔室与它们自身的进入检测器的光路配合，或使各腔室与单独固态光检测器配合来容易地达成。
可基于装置的特定应用选择微通道的尺寸。因此，微通道的宽度可在例如约0.1mm至约10mm的范围内。在一些实施方案中，微通道的宽度是约0.5mm至约5mm。在一些实施方案中，微通道的宽度是约1mm至约4mm。在一些实施方案中，微通道的宽度是约2.5mm。也可基于装置的特定应用选择微通道的深度或高度。因此，微通道的深度可在例如约5μm至约2000μm的范围内。在一些实施方案中，微通道的深度是约100μm至约1000μm。在一些实施方案中，微通道的深度是约250μm至约750μm。在一些实施方案中，微通道的深度是约560μm。在另一实施方案中，各微通道具有约1μm2至约1mm2的横截面积。
如熟练人员将了解，装置将具有适合进口和出口以使得相关组分能够流过装置。
熟练技术人员应充分了解的是流过微流体装置取决于各种因素，包括但不限于微通道的尺寸、流体的粘度、以及所用的检测和方法。因此，样本(传感器分子和底物)可在约1μl/h至约10ml/h的速率下流过芯片微通道。在一些实施方案中，样本(传感器分子和底物)可在约1μl/h至约100μl/h、约5μl/h至约200μl/h、约7.5μl/h至约500μl/h、或约10μl/h至约1ml/h的速率下流过装置微通道。
在一个实施方案中，装置包括用于感测例如相同来源(样本)中的不同分析物的多个反应室。由于可能需要使用不同传感器分子来检测不同分析物，所以在一些情况下，可能合乎需要的是改变不同、优选平行通道中的流动速率。就此而言，可设置各个别流动速率以使各个别传感器分子的灵敏度最优化。
在一个实施方案中，在包括多个反应室的装置中，去向和来自各反应室的流动速率是通过单独手段控制，例如单独抽吸泵控制去向和来自各反应室的流动速率。这个构造允许在潜在不同流动速率和因此速度与灵敏度之间的不同平衡下，彼此独立地同时操作多个传感器通道。
微流体通道的表面可通过暴露于适合试剂的溶液(如牛血清白蛋白、稀释哺乳动物血清、鱼皮明胶、脱脂乳蛋白的0.1-5％(w/v)水溶液)，和/或使用非离子洗涤剂(如吐温-20(Tween-20))的溶液，或通过使用酵母微粒体的混悬液加以钝化。
在试剂(样本、传感器分子、底物)已穿过装置之后，可通过使适当流体(例如洗涤流体，如缓冲液)流过微通道来洗涤装置。这使得装置能够被再使用。因此，在一些实施方案中，方法进一步包括在已检测分析物之后使如缓冲液等流体流过微型装置的步骤。待流过微型装置的流体的量可为任何量且可基于芯片的体积。在一些实施方案中，洗涤流体的量是装置中的微通道的总体积的约0.5倍至约10倍。在一个实施方案中，洗涤流体的量是装置中的微通道的总体积的约1.5倍至约2.5倍。
温度控制
如果存在，那么这个模块用于维持试剂储存的所需温度为1-8℃、优选2-4℃；以及BRET反应的所需温度为20-37℃、优选25-28℃。BRET温度控制可与装载机构和电光学收集装置集成在一起。具体来说，它们是根据使用局部电阻加热或珀耳帖(Peltier)装置冷却达成控制功能的技术来构建。举例来说，热控制处理器可通过温度控制的散热器或冷却元件(如珀耳帖装置)维持在基线温度下，其中致动器由局部化加热控制在基线以上。或者，可使用小型热泵提供冷却。局部化加热可优选由有利地由例如小于50、25、15或10V的低电压控制的小于约1至2W的低功率电阻加热器提供。
用于光收集的电光学系统
如本文所用的术语“信号”是指测量为吸光度变化的发光。在一些实施方案中，信号将为“发射光”，其中检测信号的步骤将为通过一个或多个光检测器检测具有特定光波长的光子。示例性光检测器包括可被冷却的光电倍增管(PMT)、光电二极管、雪崩光电二极管、硅或其它固态光电倍增管(http://en.wikipedia.org/wiki/Silicon_photomultiplier)或CCD照相机。优选地，光检测器具有的光子检测效率≥10％、更优选≥30％且最优选≥50％。优选地，这些效率在光谱的蓝色和绿色带中起作用。检测器进一步包括使检测的光限于特定波长或特定波长范围的部件。这可例如为任选固定于滤光轮的适合滤光器、或滤光滑片、或单色器、或分色镜、或这些装置中的两个或更多个的组合。
电光学系统可主要由光纤和光学开关组成(图16)。光纤可替换成纤维束或液体光导管。核心直径约10μm至约3000μm的纤维可固定至装载系统中。对于纤维束或液体光导管，核心直径可在0.5mm至10mm的范围内。纤维的平末端可恰好位于反应室以下，其中各纤维收集来自特定腔室的光。可设计两种可与反应室集成的BRET电光学检测元件(参见图17)。球形微透镜可被并入反应室中以帮助将BRET光聚焦至光纤的核心中。
在另一实施方案中，光纤/液体光导管系统可替换成一组透镜和镜子以使来自各腔室的光被接转至检测器中。多通道系统的转换可通过机械断续器或其它转换机构来实现。
为进一步增加收集的BRET信号，可将平坦或非球面镜放置在反应室的顶部上(图17b)。在这个情况下，发射至顶部的大多数BRET光将被反射回光纤中。对于多通道检测，光学开关可用于收集来自所有通道的光。这个元件的材料可为具有出色光学、化学性质的玻璃或聚合材料，如聚二甲基硅氧烷、环状烯烃共聚物(COC)等。BRET反应室将连接于以上针对样本递送和混合加以设计的微流体网络。
数字光子积分
超低水平光检测需要高灵敏性光电倍增管(PMT)和数字信号处理单元来消除暗电流。图42说明用于本发明中的一示例性系统主要由三个单元组成：PMT、光子计数单元、USB计数单元。H10721P-210是一种在可见光波长内提供高灵敏度的具有超级双碱光阴极的电流输出PMT。感光区域是直径8mm的圆形。当光子到达超级双碱光阴极时，产生光电子。光电子被加速朝向在各阶段电子的数目以指数方式增加所处的一系列级联电极结构。在最后阶段，PMT以光电子脉冲或电流形式输出产生的电子的总和。
暗电流定义为在不存在入射光下从PMT出现的电流输出。通过鉴定和消除所谓“暗脉冲”，有可能使暗电流最小。在这个实例中，信号处理单元(C9744光子计数单元)用于消除暗脉冲。所述单元允许实施使用者设置的阈值以使仅将幅值高于阈值的脉冲传送至输出端。剩余脉冲被滤出输出信号。在这个单元中，通过判别准则的脉冲被转换成5V数字信号脉冲且传送至输出端。
C8855-01是一种被设计来在无死时间下计数数字信号脉冲的USB接口计数单元。在C9744光子计数单元中产生的信号被输入计数单元且结果被传送至具有USB连接的PC中。
光学检测系统
检测可使用并入装置中或与装置分开但与装置的待检测区域对准的检测器达成。
光学检测系统对来自包括各BRET反应室的各微流体通道的光输出进行取样。各微流体通道可配备有专用光检测器。举例来说，可将单一BRET反应室的一部分光输出引导通过蓝色带通滤光器，而可将其余部分引导通过绿色带通滤光器(或其它适合带通特征件，视在用BRET的类型而定)。可使用光纤、光纤束或液体光导管将来自这些滤光器的光引导至单独光电倍增管。或者，可紧密邻近于带通滤光器放置硅或其它高灵敏性固态光电倍增管以便对直接来自各微流体通道和BRET反应室的光发射进行取样。在其它实施方案中，可将一非球面透镜或一组非球面透镜放置在光纤、光纤束或液体光导管的末端处以在进入PMT之前使输出光束准直，由此降低归因于在PMT的敏感区外部的射线发散的光学损耗。在优选实施方案中，带通滤光器被放置在微流体芯片的相对侧上且与它紧密接触，且与各微流体通道上的两个带通滤光器紧密接触来放置固态光电倍增管或其它光检测器。为各微流体通道提供专用检测系统的优势是这使光学系统的复杂度最小且使潜在光子损失(包括归因于其中对于大部分轮询周期而言，各微流体通道都是光学沉默的转换死时间的光子损失)最小。
或者，各微流体通道可由一个或多个共享的光检测器依序轮询。
在一个实施方案中，检测系统可由光学或光学机械转换装置组成，所述装置通过光纤或光导管从各微流体通道接受光且通过单一光纤或光导管连续输出这些输入的每一个的光学信号。从腔室至腔室的转换时间可在纳秒至数秒(例如2或3秒)的范围内，优选在10-500毫秒或小于10毫秒的范围内。光学转换装置的输出进行碰撞且如分色镜等光检测器将光拆分成分别对应于BRET供体和接受体的发射的两个波长范围且两个光电倍增管用于同时检测在这些波长范围的每一个内的光(图16)。任选地，分色镜可由调谐至BRET供体和接受体发射光谱的带通滤光器加强。
在替代性实施方案中，可使用快门框替代光学开关。在所述布置中，快门框的输出端可为多对一多分叉光导管，其将所有光学通道的输出都约束至将光引导至光检测器中的单一光导管中。在这个布置中，操作快门以使来自各单一微流体通道的光连续穿过光检测器。转换系统的潜在优势是它允许较小数目的光检测器对较大数目的微流体通道的光学输出取样，从而节约成本、重量和功率。
在另一实施方案中，可选择成对固态光检测器的操作特征以使它们的峰值光子检测效率(PDE)对于BRET供体和接受体的峰值发射具有选择性或半选择性。在这个情况下，有可能免除光谱滤光器和分色镜且依赖不同类型的固态光检测器的固有差异性光谱灵敏度来产生BRET比率。
数据撷取和处理
就计数/门相对于时间而言的供体和接受体的BRET信号将由适合软件收集。BRET比率是基于从接受体通道收集的光与从供体通道收集的光的比率加以计算的。如果传感器分子和底物的流量比率保持恒定且在BRET腔室中无分析物被检测到，那么这个BRET比率应为恒定的。然而，在分析物存在下，BRET比率将对应于反应室中的试剂的量而变化。
软件和嵌入控制系统
优选地，系统包括可学习且判别不同化学样本所特有的反应样式的可训练数据处理和输出软件算法。软件将捕捉来自各微流体通道的信号的突出特征，如基线BRET比率、当暴露于样本时的稳态BRET比率以及BRET比率变化的时间过程的各种特征。来自各通道的这些特征将被输入多种判别算法，如主成分分析、线性判别分析、逐步判别分析、机器学习算法(如支持向量机)、贝叶斯网络分析或神经网络算法中，且与先前学习的样本分类的结果进行比较。优选通过GUI和/或声学输出端向控制器提供假定样本分析或分类。或者，各通道中的信号强度可以视觉和/或听觉方式输出以使控制器可使反应样式与先前已被训练来认定的反应样式匹配。
在一个实施方案中，GUI软件用于控制所有装置中组成部分，如取样子系统的速度和浓度比率、微流体通道的流动速率、冲洗和净化循环的定时、泵、任何主动混合的速率和强度、光检测器系统的灵敏度和积分时间、试剂储集器和反应室的温度、以及数据撷取和处理的所有方面。任选地，这些功能中的许多可通过嵌入微控制器来执行。一些或所有功能可在膝上计算机或平板计算机或等效装置上执行。
化学发光共振能量转移
化学发光是由于化学反应导致的伴有有限热发射的能量发射(发光)。术语“化学发光”在本文中用于涵盖依赖于酶的活性的生物发光。
如本文所用，生物发光共振能量转移(BRET)是一种基于生物发光蛋白质供体与接受体分子之间的非放射性能量转移的邻近测定。
如本文所用，术语“空间位置”是指供体相对于接受体分子的三维定位，其由于分析物结合传感器分子或从传感器分子释放而变化。
如本文所用，术语“偶极定向”是指与供体和/或接受体分子关于它们在三维空间中的定向相关的偶极矩在三维空间中的方向。偶极矩是在分子上的电荷变化的结果。
使用BRET作为一实例，在实施方案中，在生物发光蛋白质与接受体分子之间发生的能量转移呈现为由使用选择特定波长的光学滤光器(一个用于接受体分子发射且另一个用于生物发光蛋白质发射)测量的发射计算的比率(参见等式1)。
Ea/Ed＝BRET比率     (1)
其中Ea定义为接受体分子发射强度(发射光是使用适合于接受体的发射的特定滤光器选择)且Ed定义为生物发光蛋白质发射强度(发射光是使用适合于生物发光蛋白质的发射的特定滤光器选择)。
本领域技术人员应易于了解的是光学滤光器可为允许适于BRET的波长判别的任何类型的滤光器。举例来说，根据本发明使用的光学滤光器可为干涉滤光器、长通滤光器、短通滤光器等。穿过滤光器的波长的强度(通常以每秒计数(CPS)或相对发光单位(RLU)计)可使用光电倍增管(PMT)、光电二极管(包括级联光电二极管)、光电二极管阵列或灵敏性照相机(如电荷耦合装置(CCD)照相机)定量。定量的信号随后用于计算BRET比率且表示能量转移效率。BRET比率随接受体发射的强度增加而增加。
通常，测定接受体发射强度与供体发射强度的比率(参见等式1)，其是用任意单位表示的反映能量转移效率的数值。比率随能量转移效率增加而增加(参见Xu等,1999)。
能量转移效率也可使用供体发射强度与接受体发射强度的反比来表示(参见等式2)。在这个情况下，比率随能量转移效率增加而降低。在进行这个计算之前，相对于背景光的存在和底物的自身发光来校正发射强度。这个校正通常是通过从含有底物，但无本发明的生物发光蛋白质、接受体分子或多肽的对照样本减去在适当波长下测量的发射强度来进行。
Ed/Ea＝BRET比率     (2)
其中Ea和Ed是如上所定义。
生物发光蛋白质和接受体分子发射的光强度也可使用基于单色器的仪器，如分光荧光计、电荷耦合装置(CCD)照相机或二极管阵列检测器定量。使用分光荧光计，进行发射扫描以使在添加底物后，生物发光蛋白质发射峰与接受体分子发射峰两者均被检测。峰下面积表示相对光强度且用于计算如上所概述的比率。能够测量来自相同样本的生物发光蛋白质和接受体分子的光的任何仪器都可用于监测本发明的BRET系统。
在替代性实施方案中，单独接受体分子发射适于有效检测和/或定量BRET。在这个情况下，仅使用接受体发射强度表示能量转移效率。将易于为本领域技术人员显而易知的是为测量能量转移，可使用接受体发射强度而不进行任何比率计算。这是由于以下事实：在理想情况下，只有当接受体分子吸收从生物发光蛋白质传递的光，它才将发射光。在这个情况下，仅一个滤光器是必需的。
在相关实施方案中，单独生物发光蛋白质发射适于有效检测和/或定量BRET。在这个情况下，能量转移效率是仅使用生物发光蛋白质发射强度加以计算。将易于为本领域技术人员显而易知的是为测量能量转移，可使用供体发射强度而不进行任何比率计算。这是由于以下事实：当接受体分子吸收从生物发光蛋白质转移的光时，来自生物发光蛋白质的可检测发射存在相应降低。在这个情况下，仅一个滤光器是必需的。
在替代性实施方案中，使用仅需要一个光学滤光器来进行测量的比率测量结果表示能量转移效率。在这个情况下，供体或接受体的光强度是使用适当光学滤光器测定且对样本的另一测量是在不使用任何滤光器下进行(开放光谱的强度)。在这个后述测量中，定量总光输出(对于所有波长)。接着使用等式3或4进行比率计算。对于等式3，仅需要用于接受体的光学滤光器。对于等式4，仅需要用于供体的光学滤光器。
Ea/Eo-Ea＝BRET比率或＝Eo-Ea/Ea     (3)
Eo-Ed/Ed＝BRET比率或＝Ed/Eo-Ed     (4)
其中Ea和Ed是如上所定义且Eo定义为组合的所有波长的发射强度(开放光谱)。
应易于为本领域技术人员显而易知的是其它等式可从等式1至4导出。举例来说，一个所述导出式涉及相对于在生物发光蛋白质和/或接受体分子的发射波长下存在的背景光进行校正。
在进行BRET测定时，可使用BRETCount测定来自各孔的光发射。BRETCount仪器是一种改进的TopCount，其中TopCount是由Packard Instrument(Meriden,CT)销售的微量滴定板闪烁和发光计数器。不同于利用两个重合光电倍增管(PMT)来消除背景噪声的经典计数器，TopCount采用单一PMT技术和时间分辨的脉冲计数来降低噪声以允许在标准不透明微量滴定板中计数。使用不透明微量滴定板可使光学串扰降低至可忽略水平。TopCount呈各种形式，包括分别允许同时读取1、2、6或12个样本的1、2、6和12个检测器(PMT)。除BRETCount之外，其它可商购获得的仪器也能够进行BRET：Victor2(Wallac,Finland(Perkin Elmer Life Sciences))和Fusion(PackardInstrument,Meriden)。BRET可使用可检测至少接受体分子发射和优选两个波长(针对接受体分子和生物发光蛋白质)或大于两个波长的读取器来进行。
化学发光
非酶促化学发光是在催化剂存在下，有机染料与氧化剂之间的化学反应的结果。当来自被化学诱导的有机染料的激发态的能量衰减至基态时，发生化学发光发射。化学发光发射的持续时间和强度主要取决于反应溶液中存在的化学试剂的程度。
如本文所用，术语“生物发光蛋白质”是指能够作用于适合底物以产生发光的任何蛋白质。
本领域中应了解的是生物发光蛋白质是一种使底物转化成活性产物的酶，所述活性产物接着当它弛豫时释放能量。活性产物(由生物发光蛋白质对底物的活性产生)是生物发光蛋白质产生的转移至接受体分子的发光的来源。
存在可用于本发明中的许多不同生物发光蛋白质(参见例如表1)。已知且从许多发光生物体分离发光系统，所述生物体包括细菌、原虫、腔肠动物、软体动物、鱼、千足虫、蝇、真菌、蠕虫、甲壳动物和甲壳虫，特别是光叩甲属(Pyrophorus)的叩头虫和Photinus、Photuris和Luciola属的萤火虫。显示生物发光的其它生物体列于WO00/024878、WO 99/049019和Viviani(2002)中。
一个极其熟知的实例是一类被称为荧光素酶的催化产生能量的化学反应的蛋白质，其中特定生物化学物质、荧光素(天然存在的荧光团)是由具有荧光素酶活性的酶氧化(Hastings,1996)。多种多样原核生物体和真核生物体(包括细菌、藻类、真菌、昆虫、鱼和其它海洋形式的物种)可以这个方式发射光能量且各自具有在化学方面不同于其它生物体的荧光素酶活性和荧光素的特定荧光素酶活性和荧光素。荧光素/荧光素酶系统在形式、化学和功能方面极其不同。因此，具有荧光素酶活性的生物发光蛋白质可从多种来源或通过多种手段获得。具有荧光素酶活性的生物发光蛋白质的实例可见于US 5,229,285、5,219,737、5,843,746、5,196,524和5,670,356中。两种最广泛使用的荧光素酶是：(i)海肾荧光素酶(来自海洋海肾(R.reniformis))，其是一种35kDa蛋白质，使用腔肠素作为底物且在480nm下发射光(Lorenz等,1991)；和(ii)萤火虫荧光素酶(来自北美萤火虫(Photinus pyralis))，其是一种61kDa蛋白质，使用荧光素作为底物且在560nm下发射光(de Wet等,1987)。
长腹水蚤荧光素酶(来自挠足虫(Gaussia princeps))已用于生物化学测定中(Verhaegen等,2002)。长腹水蚤荧光素酶是一种在快速反应中氧化腔肠素，从而导致在470nm下发射强光的20kDa蛋白质。
也已表征来自蕈蚊属的适用于本发明的荧光素酶(WO2007/019634)。这些酶的大小为约59kDa且是催化发射光谱在光谱的蓝色部分内的发光反应的ATP依赖性荧光素酶。
天然存在的生物发光蛋白质的生物活性变体或片段可易于由本领域技术人员产生。适用于本发明的所述变体的三个实例是各自是海肾荧光素酶的变体的Rluc2(Loening等,2006)、Rluc8(Loening等,2006)和Rluc8.6-535(Loening等,2007)。在另一优选实施方案中，选择BRET化学发光供体的序列以获得比并有天然海肾荧光素酶传感器的传感器分子更大的热稳定性。RLuc2或RLuc8是适合选择的适宜实例，其因此展现发光度高于并有天然海肾荧光素酶序列的传感器≥5倍或≥10倍。所述增强的发光度具有显著益处，因为它允许使用较低检测室体积和/或较快芯片上流动速率，同时伴有在检测室体积和流动速率的任何给定组合下的时间分辨率改进。或者，对于任何给定时间分辨率，它允许更经济地使用试剂。
表1.示例性生物发光蛋白质。
如本文所用，“生物活性片段”是如本文所述的多肽的维持全长多肽的确定活性的部分。如本文所用，“生物活性变体”是与天然存在的分子和/或确定分子有一个或多个氨基酸不同，但维持确定活性(如以上对于生物活性片段定义的确定活性)的分子。生物活性变体与天然存在的分子和/或确定分子通常至少50％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、且甚至更优选至少99％一致。
可用于本发明中的替代性非荧光素酶生物发光蛋白质是可作用于适合底物以产生发光信号的任何酶。所述酶的特定实例是β-半乳糖苷酶、内酰胺酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶。这些酶的合成发光底物在本领域中是熟知的且可从如Tropix Inc.(Bedford,MA,USA)等公司商购获得。
适用于本发明的过氧化物酶的实例由Hushpulian等(2007)描述。
在优选实施方案中，具有小分子量的生物发光蛋白质用于防止归因于空间位阻的对相互作用的抑制。生物发光蛋白质优选由单一多肽链组成。此外，生物发光蛋白质优选不形成寡聚物或聚集体。生物发光蛋白质海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶和萤火虫荧光素酶满足这些准则中的所有或大多数。
底物
如本文所用，术语“底物”是指可连同化学发光供体一起用于产生或吸收发光的任何分子。对底物的选择可影响由化学发光供体产生的光的波长和强度。
一种广泛已知的底物是腔肠素，其存在于腔肠动物、桡足动物、毛颚动物、栉水母、十足虾、糠虾、放射虫和一些鱼类中(Greer和Szalay,2002)。对于例如海肾荧光素酶，可使用在418与512nm之间产生光发射的腔肠素类似物/衍生物(Inouye等,1997)。已描述在使用海肾荧光素酶下，在400nm下发射光的腔肠素类似物/衍生物(400A、深蓝C)(WO 01/46691)。腔肠素类似物/衍生物的其它实例是EnduRen和ViviRen。
如本文所用，术语“荧光素”是指见于能够生物发光的生物体中的一类发光生物色素，其在酶荧光素酶存在下被氧化以产生氧基荧光素和呈光形式的能量。荧光素或2-(6-羟基苯并噻唑-2-基)-2-噻唑啉-4-甲酸是首先从萤火虫北美萤火虫分离。从那时起，已发现并研究来自主要来自海洋的各种不同生物体，例如鱼和鱿鱼的各种形式的荧光素，然而，已在陆地栖息生物体，例如蠕虫、甲壳虫和各种其它昆虫中鉴定出许多荧光素(Day等,2004；Viviani,2002)。
存在至少五种一般类型的荧光素，其各自在化学方面不同且由在化学方面和在结构方面不同的采用广泛范围的不同辅因子的荧光素酶催化。首先，是作为需要ATP来达成催化的萤火虫荧光素酶(EC1.13.12.7)的底物的萤火虫荧光素。其次，是也见于一些鱿鱼和鱼中的由长链醛和还原型磷酸核黄素组成的细菌荧光素。细菌荧光素酶是FMNH依赖性的。第三是作为见于沟鞭藻纲(海洋浮游生物)中的四吡咯叶绿素衍生物的沟鞭藻纲荧光素，所述沟鞭藻纲是造成夜间海洋磷光的生物体。沟鞭藻纲荧光素酶催化沟鞭藻纲荧光素氧化且由三个相同且具有催化活性的结构域组成。第四，是见于某些种虾和深海鱼(例如光蟾鱼(Porichthys))中的咪唑并吡嗪种虾素(imidazolopyrazinevargulin)。最后，是作为蛋白质水母发光蛋白的光发射体的见于放射虫、栉水母、腔肠动物、鱿鱼、桡足动物、毛颚动物、鱼和虾中的腔肠素(咪唑吡嗪)。
接受体分子
如本文所用，术语“荧光接受体结构域”(在本文中也称为“接受体分子”)是指可接受由于化学发光供体的活性而发射的能量，且将它以光能量形式再发射的任何化合物。存在可用于本发明中的许多不同接受体分子。接受体分子可为蛋白质或非蛋白质。作为蛋白质的接受体分子的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Venus、mOrange、Topaz、GFPuv、去稳定化EGFP(dEGFP)、去稳定化ECFP(dECFP)、去稳定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、海肾GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白或藻胆蛋白或其任一个的生物活性变体或片段。不是蛋白质的接受体分子的实例包括但不限于Alexa Fluor染料、Bodipy染料、Cy染料、荧光素、丹磺酰、伞形酮、荧光微球体、发光微球体、荧光纳米晶体、海蓝、级联蓝、级联黄、太平洋蓝、俄勒冈绿、四甲基若丹明、若丹明、得克萨斯红、稀土元素螯合物或其任何组合或衍生物。
一个极其熟知的实例是包括来自水母维多利亚水母的绿色荧光蛋白和由应用分子生物学，例如诱变和嵌合蛋白技术产生的众多其它变体(GFP)的一组荧光团(Tsien,1998)。GFP是基于它们的发色团的独特组分加以分类，各类别具有不同激发和发射波长：类别1，中性酚和阴离子酚盐的野生型混合物，类别2，酚盐阴离子，类别3，中性酚，类别4，具有堆叠s-电子系统的酚盐阴离子，类别5，吲哚，类别6，咪唑，以及类别7，苯基。
已被突变的天然存在的接受体分子(变体)也可适用于本发明。适于BRET的工程改造系统的一个实例是海肾荧光素酶和GFP的增强型黄色突变体(EYFP)配对，在不存在介导蛋白质(在这个情况下是G蛋白偶联受体)下，所述配对不在显著程度上直接彼此相互作用(Xu等,1999)。
在另一实施方案中，接受体分子是荧光纳米晶体。纳米晶体或“量子点”作为荧光标记具有超过有机分子的若干优势，包括对光降解具有抗性、亮度提高、无毒性且具有使得能够同时监测若干过程的尺寸依赖性狭窄发射光谱。另外，纳米晶体的吸收光谱连续处于高于第一峰，从而使得所有尺寸以及因此所有颜色能够用单一激发波长激发。
荧光纳米晶体可以多种方式连接或“生物缀合”于蛋白质。举例来说，可用来自二氢硫辛酸(DHLA)或两亲性聚合物的羧酸根基团使“量子点”的表面帽(surface cap)带负电荷。可直接或通过由带正电荷的亮氨酸拉链肽融合于重组蛋白所组成的桥使蛋白质静电缀合于DHLA-纳米晶体。后者以针对预定靶标的特异性结合一级抗体。或者，用常规碳二亚胺化学使抗体、抗生蛋白链菌素(streptavidin)或其它蛋白质共价偶联于纳米晶体的聚丙烯酸酯帽。
存在用以产生包括硒化镉、硫化镉、砷化铟和磷化铟的纳米晶体的胶体方法。这些量子点可以直径10至50个原子在量子点体积内含有少至100至100,000个原子。一些量子点是一种材料以较大带隙包埋在另一材料中的小区域。这些可为所谓核心-外壳结构，例如其中CdSe在核心中且ZnS在外壳中或来自称为有机改性硅酸盐(ormosil)的特殊二氧化硅形式。点越大，它的荧光光谱越红(能量越低)。相反，较小点发射较蓝(较高能量)光。显色与量子点的能级直接相关。定量地来说，决定荧光化光的能量(以及因此颜色)的带隙能量与量子点的尺寸的平方成反比。较大量子点具有更紧密间隔的更多能级。这允许量子点吸收含有较小能量的光子，即较接近光谱的红端的光子。
在替代性实施方案中，接受体分子是荧光微球体。这些荧光微球体通常由聚合物制得，且含有并入聚合物基质中的荧光分子(例如荧光素GFP或YFP)，所述聚合物基质可缀合于多种试剂。荧光微球体可在内部或在表面上加以标记。内部标记会产生荧光发射光谱通常狭窄的极其光亮和稳定的粒子。在内部标记下，表面基团仍然可用于使配体(例如蛋白质)缀合于珠粒的表面。内部标记的珠粒广泛用于成像应用中，因为它们显示对光致漂白的较大抗性。
羧酸盐改性的荧光微球体适于使用如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)等水溶性碳二亚胺试剂来共价偶联蛋白质。硫酸荧光微球体是相对疏水性的且将被动地并且接近不可逆地吸附几乎任何蛋白质。醛-硫酸荧光微球体是已被改性来添加表面醛基团，且与蛋白质反应的硫酸微球体。
在另一实施方案中，接受体分子是发光微球体。这些发光微球体通常由含有并入聚合物基质中的发光分子(例如铕或铂的络合物)的聚合物制得，所述聚合物基质可缀合于多种试剂。
适用于本发明的非荧光接受体结构域的实例包括淬灭剂，如DABCYL[4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸]、DABSYL(二甲基氨基偶氮基磺酸)、金属纳米粒子(如金和银)、黑洞淬灭剂(BHQ)和QXL淬灭剂。
化学发光供体结构域和接受体结构域对
如本文所用，术语“在存在和/或不存在分析物下，化学发光供体结构域和接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内”是指可在±50％R0的范围内进行的稳态RET测量。这个短语涵盖从化学发光供体结构域向接受体结构域的发光能量转移的效率在10-90％的范围内。超出这些距离限度，仍然有可能估计距离，但不确定性会增加。
在确定适合配对时应考虑的准则是接受体分子相较于供体的发射/荧光光谱的相对发射/荧光光谱。供体的发射光谱应与接受体分子的吸收光谱重叠以使来自供体发光发射的光能量处于能够激发接受体分子的波长下且由此当两个分子关于彼此处于适当邻近度和定向时促进接受体分子荧光。举例来说，已证明的是基于可观察发射光谱峰，海肾荧光素酶/EGFP配对不如海肾荧光素酶/EYEF配对(Xu,1999；Wang,等(1997),Bioluminescence and Chemiluminescence:Molecular Reporting with Photons,Hastings等编(Wiley,New York),第419-422页)。为研究潜在配对，制备含有所选生物发光蛋白质和接受体分子的蛋白质融合物(举例来说)且在适当底物存在下加以测试。
也应确认的是供体和接受体分子不乱真地彼此缔合。这可通过例如区分生物发光蛋白质和接受体分子在相同细胞中的共表达且接着监测荧光光谱以确定是否发生BRET来达成。这可例如使用Xu等(1999)的方法来达成。是否观察到少许BRET或未观察到BRET，那么所选生物发光蛋白质和接受体分子形成适合BRET对。
供体发射可通过对底物的修饰来操作。在荧光素酶的情况下，底物是腔肠素。在改变供体发射背后的基本原理在于提高供体发射与接受体发射之间的分辨率。原始BRET系统使用海肾荧光素酶作为供体，EYFP(或Topaz)作为接受体以及腔肠素h衍生物作为底物。这些组分当在BRET测定中组合时产生在475-480nm范围内(对于生物发光蛋白质)以及在525-530nm范围内(对于接受体分子)的光，从而产生光谱分辨率45-55nm。
不幸的是，海肾荧光素酶产生大致上与GFP发射重叠的宽发射峰，此转而促进降低系统的信噪比。本发明的一种使用coel400a作为海肾荧光素酶底物的BRET系统提供供体发射波长与接受体发射波长之间的广泛光谱分辨率(-105nm)。在coel400a下，海肾荧光素酶产生在390-400nm之间的光，且制备吸收在这个范围内的光并在505-508nm下再发射光的GFP。由于在海肾荧光素酶发射与GFP发射之间的光谱分辨率的这个增加，这个BRET系统提供用以监测本发明的多肽的构象的小变化的出色生物学工具。这是超过使用腔肠素h衍生物和EYFP的先前所述系统的显著改进，先前所述系统具有的供体与接受体之间的波长差异是约51nm。
本领域中已知由于海肾荧光素酶活性而在各种波长下产生光(不同于由野生型腔肠素产生的光)的各种腔肠素衍生物，包括coel400a。本领域工作人员将了解的是因为供体的光发射峰已变化，所以必须选择将在这个波长下吸收光且由此允许高效能量转移的接受体分子。这可例如通过改变第4类GFP以使它变为第3或1类GFP来进行。在供体的光发射与接受体的光吸收峰之间的光谱重叠尤其是一种用于达成高效能量转移的条件。已知第3和1类GFP会在400nm下吸收光且在505-511nm之间再发射。这导致供体发射与接受体发射之间的波长差异是约111nm。
其它生物发光蛋白质和接受体分子对的实例提供于表2中。
传感器分子
如本文所用，术语“传感器分子”是指任何分子、两个或更多个共价或非共价缔合的分子的络合物、或可至少在一定阶段紧密缔合以使得能够在供体与接受体之间进行RET的两个或更多个分子。此外，如果存在，那么形成结构域的两个或更多个单独分子可通过中间分子进行缔合。在一个实例中，传感器分子可为蛋白质络合物，其中络合物的各亚单位是非共价缔合的且接受体和结构域可在所述蛋白质络合物的相同或不同亚单位上。在另一实例中，传感器分子是两个单独核酸链，一个用接受体标记且另一个用供体标记，以使与靶标(分析物)杂交导致供体和接受体充分接近以产生RET。在这个实例中，可认为传感器分子是在它结合分析物时形成。
表2.示例性BRET生物发光蛋白质和接受体分子对。
结合分析物(或候选化合物)的结构域可为任何分子，只要它可与供体和接受体适当缔合即可。
在实施方案中，结合分析物的结构域是蛋白质或核酸。在优选实施方案中，结构域是蛋白质。在实施方案中，蛋白质是结合一种或多种分析物(配体)的天然存在的蛋白质或蛋白质的保留分析物(配体)结合活性的变体。实例包括但不必限于受体、气味结合蛋白、信息素结合蛋白、酶(例如蛋白酶、氧化酶、植酸酶(phytase)、壳多糖酶、转化酶、脂酶、纤维素酶、木聚糖酶、激酶、磷酸酶、延长酶、转移酶、脱饱和酶)、配体载体或细菌周质结合蛋白。在实施方案中，受体是G蛋白偶联受体，如气味受体或味觉受体(例如甜味、苦味或鲜味味觉受体，如Doty,2012中所述的受体)。在另一实施方案中，气味受体或味觉受体来自线虫或脊椎动物或是其突变体。
在一个实施方案中，传感器分子是以无细胞组合物形式提供。如本文所用，术语“无细胞组合物”是指含有少许(如果有的话)完整细胞且包含传感器分子的分离的组合物。无细胞组合物的实例包括细胞(如酵母细胞)提取物和含有分离和/或重组传感器分子(如蛋白质)的组合物。用于从细胞制备无细胞组合物的方法在本领域中是熟知的且描述于WO 2010/085844中。在某些实施方案中，传感器分子被包埋在脂质双层(如脂质体制剂的脂质双层)、细胞或无细胞提取物中。
G蛋白偶联受体
如本文所用，除非另外指定，否则术语“G蛋白偶联受体”是指通过G蛋白进行信号传导的七跨膜受体。所述受体可为单一亚单位、或两个或更多个受体亚单位。当存在两个或更多个受体亚单位时，它们可为相同、不同或其组合(例如存在两个某一亚单位和单一另一亚单位)。此外，除非另外指定或暗示，否则术语“G蛋白偶联受体”和“G蛋白偶联受体的亚单位”或其变化形式可互换使用。
如本文所用，术语“气味受体”、“嗅觉受体”、“OR”或其变化形式是指当存在于生物体的细胞中时涉及于化学感受感知中的多肽。在实施方案中，细胞是神经元。此外，术语“气味受体”或“嗅觉受体”是指结合气味配体或形成为结合气味配体的蛋白质络合物的一部分，从而产生生理反应的多肽。
如本文所用，术语“形成为…的一部分”是指生物发光蛋白质或接受体分子位于G蛋白偶联受体或其亚单位的指定区域内。这个术语也包括生物发光蛋白质和/或接受体分子有可能连接于或结合G蛋白偶联受体，但不形成连续氨基酸链。在一个实施方案中，生物发光蛋白质或接受体分子完全替代G蛋白偶联受体的指定区域。在另一实施方案中，G蛋白偶联受体的一些而非所有指定区域被替代。在另一实施方案中，G蛋白偶联受体中无指定区域被替代。如熟练收件人将了解，生物发光蛋白质或接受体分子将不被插入来使得多肽的G蛋白偶联受体部分不能结合分析物以导致生物发光蛋白质相对于接受体分子的位置和/或偶极定向的空间变化。
G蛋白偶联受体(GPCR)也称为七跨膜受体、7TM受体、蛇形受体、七螺旋受体和G蛋白连接受体(GPLR)。GPCR是一个大型蛋白质家族的跨膜受体，所述受体感受细胞外部的分子且活化内部信号转导路径并最终产生细胞反应。结合并活化这些受体的配体包括光敏化合物、气味、信息素、激素和神经递质，且在尺寸方面从小分子变化至肽直至大型蛋白质。GPCR涉及于许多疾病中，但也是约半数所有现代医学药物的靶标。GPCR可基于序列同源性和功能类似性被分组成至少5类：
A类，视紫红质(rhodopsin)样，
B类，分泌素(secretin)样，
C类促代谢/信息素，
D类真菌信息素，和
E类cAMP受体。
A类视紫红质样受体包括：胺受体：乙酰胆碱、α肾上腺素受体、β肾上腺素受体、多巴胺、组胺、血清素、章鱼胺(Octopamine)和示踪胺；肽受体：血管紧张素、铃蟾素(Bombesin)、舒缓激肽、C5a过敏毒素、Fmet-leu-phe、类APJ、白介素-8、趋化因子受体(C-C趋化因子、C-X-C趋化因子、BONZO受体(CXC6R)、C-X3-C趋化因子和XC趋化因子)、CCK受体、内皮素受体、黑素皮质素受体、神经肽Y受体、神经降压素(Neurotensin)受体、类鸦片受体、生长激素抑制素(Somatostatin)受体、速激肽受体(物质P(NK1)、物质K(NK2)、神经介素K(NK3)、速激肽样1和速激肽样2)、血管加压素样受体(血管加压素、催产素和芋螺升压肽(Conopressin))、甘丙肽样受体(甘丙肽、抑咽侧体神经肽(Allatostatin)和GPCR 54)、蛋白酶活化样受体(例如凝血酶)、阿立新(Orexin)和神经肽FF、乌洛滕生(Urotensin)II受体、肾上腺髓质素(G10D)受体、GPR37/内皮素B样受体、趋化因子受体样受体和神经介素U受体；激素蛋白质受体：促卵泡激素、促黄体素-绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素和促性腺激素；(视紫红质)视蛋白受体；嗅觉受体；类前列腺素受体：前列腺素、前列环素和凝血脂素；核苷酸样受体：腺苷和嘌呤受体；大麻受体；血小板活化因子受体；促性腺激素释放激素受体；促甲状腺激素释放激素和促泌素受体：促甲状腺激素释放激素、生长激素促泌素和类生长激素促泌素；褪黑素受体；病毒受体；溶血鞘脂(Lysosphingolipid)和LPA(EDG)受体；白三烯B4受体：白三烯B4受体BLT1和白三烯B4受体BLT2；以及A类孤儿/其它受体：血小板ADP和KI01受体、SREB、Mas原致癌基因、RDC1、ORPH、LGR样(激素受体)、GPR、GPR45样、半胱氨酰基白三烯、Mas相关受体(MRG)和GP40样受体。
B类(分泌素-受体家族)GPCR包括多肽激素的受体(降血钙素、促皮质素释放因子、胃抑制肽、升糖素、升糖素样肽-1、升糖素样肽-2、促生长激素释放激素、甲状旁腺激索、PACAP、分泌素、血管活性肠多肽、利尿激素、EMR1、蛛毒素受体(Latrophilin))、被认为在质膜处介导细胞间相互作用的分子(脑特异性血管生成抑制剂(BAI))和一组调控应激反应和长寿的果蝇蛋白(玛士撒拉(Methuselah)样蛋白)。
C类促代谢谷氨酸/信息素受体包括促代谢谷氨酸、I组促代谢谷氨酸、II组促代谢谷氨酸、III组促代谢谷氨酸、其它促代谢谷氨酸、细胞外钙感受性受体、推定信息素受体、GABA-B、GABA-B亚型1、GABA-B亚型2和孤儿GPRC5受体。
适用于本发明的传感器分子可包含G蛋白偶联受体，当在细胞中表达时，所述受体的N末端在细胞外部且C末端在细胞内部。本领域技术人员了解适用于检测跨膜蛋白质的定向的技术。所述技术包括但不限于晶体照相术、NMR研究、建模研究以及显微技术，如免疫标记与清洁剂可渗透组合控制光或电子显微制备、片段互补标记两种多肽等。
在优选实施方案中，G蛋白偶联受体是A类GPCR。在另一优选实施方案中，A类(视紫红质样)GPCR是气味受体、多巴胺受体、蕈毒碱受体或肾上腺素能受体，更优选是气味受体。气味受体可来自任何来源，只要当在细胞中表达时，所述受体的N末端在细胞外部且C末端在细胞内部即可。实例包括但不限于脊索动物受体、线虫受体或其任一个的生物活性变体或片段。脊索动物受体的实例包括但不限于哺乳动物受体、禽类受体和鱼受体。在优选实施方案中，气味受体是线虫受体或其生物活性变体或片段。在实施方案中，线虫受体是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)受体或其生物活性变体或片段。可用于产生本发明的多肽和/或用于本发明的方法中的气味受体的实例描述于以下中：Buck和Axel(1991)；Robertson(1998和2001)；Aloni等(2006)；Feldmesser(2006)；Olender等(2004a和b)；Glusman等(2000a、2000b和2001)；Fuchs等(2001)；Pilpel和Lancet(1999)；Sharon等(1998)；Zozulya等(2001)；Niimura和Nei(2003)；Lander等(2001)；Zhang和Firestein(2002)；Young等(2002)；以及Fredriksson和Schioth(2005)。此外，气味受体的全面清单可从SenseLab网站(http://senselab.med.yale.edu)获得。
在其它实施方案中，GPCR是B类或C类受体，其中C类是这两个实施方案中的更优选实施方案。
在特别优选实施方案中，G蛋白偶联受体包含七跨膜结构域。
生物发光蛋白质可形成为G蛋白偶联受体(或本发明的多肽)的第一、第三、第五非跨膜环(结构域)或C末端的一部分。接受体分子也形成为G蛋白偶联受体(或本发明的多肽)的第一、第三、第五非跨膜环(结构域)或C末端的一部分。当G蛋白偶联受体在细胞中表达并存在时，这些区域各自是细胞内的。
当作为相同分子(也就是相同单一多肽链)的一部分时，接受体分子与生物发光蛋白质不能在相同区域中，然而，当G蛋白偶联受体以二聚体或更高级多聚体形式存在时，接受体分子与生物发光蛋白质可在等效区域中。举例来说，生物发光蛋白质可形成为受体的一个亚单位的C末端的一部分，且接受体分子可形成为受体的另一亚单位的C末端的一部分。在这个实例中，标记与之缔合的亚单位可为相同或不同的，例如两个亚单位可为等同的，例外之处是一个用生物发光蛋白质标记而另一个用接受体分子标记。
在一个实施方案中，生物发光蛋白质形成为GPCR亚单位的第三非跨膜环的一部分，而接受体分子形成为第五非跨膜环的一部分。在替代性实施方案中，接受体分子形成为GPCR亚单位的第三非跨膜环的一部分，而生物发光蛋白质形成为第五非跨膜环的一部分。
在另一实施方案中，生物发光蛋白质形成为GPCR亚单位的第一非跨膜环的一部分，而接受体分子形成为第三非跨膜环的一部分。在另一实施方案中，接受体分子形成为GPCR亚单位的第一非跨膜环的一部分，而生物发光蛋白质形成为第三非跨膜环的一部分。
在优选实施方案中，生物发光蛋白质形成为GPCR亚单位的第五非跨膜环的一部分，而接受体分子形成为C末端的一部分。在替代性实施方案中，接受体分子形成为GPCR亚单位的第五非跨膜环的一部分，而生物发光蛋白质形成为C末端的一部分。
在另一实施方案中，G蛋白偶联受体包含至少两个亚单位，其中生物发光蛋白质形成为第一亚单位的第三非跨膜环的一部分，而接受体分子形成为第二亚单位的第五非跨膜环的一部分。在替代性实施方案中，接受体分子形成为第一亚单位的第三非跨膜环的一部分，而生物发光蛋白质形成为第二亚单位的第五非跨膜环的一部分。
在另一实施方案中，G蛋白偶联受体包含至少两个亚单位，其中生物发光蛋白质形成为第一亚单位的第一非跨膜环的一部分，而接受体分子形成为第二亚单位的第三非跨膜环的一部分。在另一实施方案中，接受体分子形成为第一亚单位的第一非跨膜环的一部分，而生物发光蛋白质形成为第二亚单位的第三非跨膜环的一部分。
在另一实施方案中，G蛋白偶联受体包含至少两个亚单位，其中生物发光蛋白质形成为第一亚单位的第五非跨膜环的一部分，而接受体分子形成为第二亚单位的C末端的一部分。在替代性实施方案中，接受体分子形成为第一亚单位的第五非跨膜环的一部分，而生物发光蛋白质形成为第二亚单位的C末端的一部分。
在另一实施方案中，G蛋白偶联受体包含至少两个亚单位且供体和接受体分子分别在第一和第二亚单位的相同位点中。
在实施方案中，生物发光蛋白质或接受体分子位于第五跨膜结构域的第二氨基酸之后以及在第六跨膜结构域开始之前的第二氨基酸之前。在另一实施方案中，生物发光蛋白质或接受体分子位于第五跨膜结构域之后的约氨基酸8之后或第五跨膜结构域之后的约氨基酸22之后。在另一实施方案中，生物发光蛋白质或接受体分子被插入在第六跨膜结构域之前的约10或12个氨基酸处。最优选地，生物发光蛋白质或接受体分子位于第三非跨膜环(结构域)的中间。
关于C末端，优选的是天然C末端的约5至25个氨基酸保持在第七跨膜结构域的末端处。优选地，生物发光蛋白质或接受体分子被插入在第七跨膜之后的约16或20个氨基酸之后。
转向生物发光蛋白质或接受体分子在第一非跨膜环(结构域)中的位置，优选的是所述标记被插入在第一跨膜结构域的末端之后约两个氨基酸处以及在第二跨膜结构域开始之前的约两个氨基酸处。最优选地，生物发光蛋白质或接受体分子位于第一非跨膜环(结构域)的中间。
在另一实施方案中，生物发光蛋白质可形成为G蛋白偶联受体(或本发明的多肽)的N末端、第二、第四或第六非跨膜环(结构域)的一部分。接受体分子也可形成为G蛋白偶联受体(或本发明的多肽)的N末端、第二、第四或第六非跨膜环(结构域)的一部分，然而，当作为相同分子的一部分时，它与生物发光蛋白质不能在相同区域中。当G蛋白偶联受体在细胞中表达并存在时，这些区域各自在细胞外。
GPCR可为两个或更多个不同GPCR的非天然存在的嵌合体。具体来说，这使得能够产生转导盒，其中视待检测的化合物而定，一个受体的多个部分始终存在于广泛多种GPCR的其它部分插入其中的嵌合体中。
在一个实施方案中，亚单位包含第一G蛋白偶联受体亚单位的N末端和至少大部分第一跨膜结构域、第二G蛋白偶联受体亚单位的至少大部分第一非跨膜环直至至少大部分第五跨膜结构域、以及第一G蛋白偶联受体亚单位的至少大部分第五非跨膜环直至C末端。
在另一实施方案中，亚单位包含第一G蛋白偶联受体亚单位的N末端直至至少大部分第五跨膜结构域、以及第二G蛋白偶联受体亚单位的至少大部分第五非跨膜环直至C末端。
如本文所用，术语G蛋白偶联受体的“至少大部分”指定部分(结构域)是指至少51％、更优选至少75％以及甚至更优选至少90％的指定区域。
熟练人员可易于确定G蛋白偶联的N末端、跨膜结构域、非跨膜环(结构域)和C末端。举例来说，多种生物信息学方法可用于基于蛋白质的氨基酸序列和与G蛋白偶联受体的已知跨膜结构域的类似性来确定蛋白质中的跨膜结构域的位置和拓扑结构。比对和氨基酸序列比较在本领域中是例如通过使用BLAST程序或CLUSTAL W程序来常规进行。基于与含有已知跨膜结构域的蛋白质的比对，本领域技术人员有可能预测跨膜结构域的位置。此外，一些跨膜蛋白质的3维结构是已知的，例如七跨膜G蛋白偶联视紫红质光受体结构已通过x射线结晶学加以解析。基于分析和与所述3D结构的比较，有可能预测其它膜蛋白质中的跨膜结构域的位置和拓扑结构。也存在可用于预测蛋白质中的跨膜结构域的位置和拓扑结构的许多程序。举例来说，可使用以下的一个或组合：TMpred(Hofmann和Stoffel,1993)，其预测跨膜蛋白质区段；TopPred(von Heijne等,1992)，其预测膜蛋白质的拓扑结构；PREDATOR(Frishman和Argos,1997)，其由单一和多个序列预测二级结构；TMAP(Persson和Argos,1994)，其由多重比对的序列预测蛋白质的跨膜区域；和ALOM2(Klien等,1984)，其由单一序列预测跨膜区域。
根据标准命名法，跨膜结构域和非跨膜环(结构域)的编号是相对于多肽的N末端。
秀丽隐杆线虫str-112(SEQ ID NO:41)和/或str-113(SEQ ID NO:42)的结合2-戊酮的变体包括但不限于与str-112(SEQ ID NO:41)和/或str-113(SEQ ID NO:42)至少90％一致的分子、与str-112(SEQ ID NO:41)和/或str-113(SEQ ID NO:42)至少90％一致的生物活性片段、及其融合蛋白，如str-114/113(SEQ ID NO:43)。如熟练人员将了解，当确定一致性％时，优选忽略蛋白质的包含标记的区段，如SEQ ID NO 13、14、18、27、28和30中的接受体和供体。
核酸
在一个实施方案中，结构域(或目标分子)是核酸。如熟练收件人将了解，存在依赖核酸结合的将适合用于本发明的方法中的许多检测系统。
分子信标(MB)已在构建适用于检测均质溶液中的特定核酸的探针方面被广泛研究。MB由具有茎和环结构的单链核酸序列组成且用BRET组分在5′和3′末端处标记。5′和3′末端的紧密邻近导致发生能量转移。靶标DNA序列与探针核酸序列杂交，从而迫使BRET组分移开且导致BRET比率降低。尽管已研究荧光团-接受体对的组合，但方法因需要可引起核酸的自身荧光的激发源而具有缺陷。用生物发光蛋白质替代荧光团会克服这个问题。
在另一实例中，可使接受体和供体缀合于各自互补于相同靶标核酸序列的不同部分的两个不同反义寡核苷酸。靶标序列的不同部分紧密位于靶标核酸序列内。在与靶标核酸杂交后，使BRET组分紧密邻近，从而导致BRET比率增加。
在另一实例中，在不存在靶标核酸下，接受体和供体标记的互补寡核苷酸探针杂交，从而导致能量转移。在靶标核酸存在下，靶标和标记的供体竞争与接受体蛋白质杂交，由此降低BRET比率。BRET比率的降低可与样本中存在的总核酸的量相关。
用途
本发明可用于检测广泛多种分析物的存在或不存在或浓度，所述分析物包括小挥发物和非挥发性有机分子、大分子以及生物粒子和细胞。本发明可与几乎任何可与化学发光转导系统功能性联用的生物识别元件，包括G蛋白偶联受体和其它受体、结合蛋白、酶、肽和核酸分子相容。本发明的微流体方法和系统的用途的实例描述于Li和Lin(2009)；Mark等(2010)；Theberge等(2010)；Mohammed和Desmulliez(2011)；Esch等(2011)；Yeo等(2011)；Noh等(2011)以及Godin等(2008)中。
在特别优选实施方案中，分析物是气味剂。通常，气味剂将为可通过至少一种生物体的化学感受气味受体来检测的挥发性有机或无机化合物或无机气体。这些可包括含有胺和/或巯基的化合物、羧酸、醇、醛、烷、烯、芳族化合物、酯、萜烯或萜烯衍生物、醚、CO2等以及携带这些特征的组合的化合物。
气味剂可向人指示值的或感兴趣的某一生物或化学状态。所述指示可包括：
●食品和饮料、医药或相关材料的感觉吸引力、品质或安全性。
●人或动物的健康、营养或运动状态。
●存在或不存在危险物质，包括病原体。
●工业过程的进展或状态。
●环境污染或状态。
●香料、芳香剂或其它化妆品的感觉吸引力、品质或安全性。
在特别优选实施方案中，分析物不结合供体或接受体结构域。
在另一实施方案中，方法可用于筛选结合传感器分子的化合物。如熟练人员将了解，这允许方法用于例如药物发现和/或开发中。更具体来说，分析物结合的结构域是潜在治疗剂的靶标。因此，在这个实施方案中，优选的是由分析物结合的结构域是临床重要的分子，如但不限于肾上腺素能受体、血清素受体、多巴胺受体、促代谢/谷氨酸受体、GABA受体、犁鼻骨受体、味觉受体、或分泌素样受体。
作为另一实例，本发明的方法可用于检测如超高温(UHT)加工奶的奶的腐败。在这个实例中，传感器分子可为由至少部分地导致奶腐败的细菌蛋白酶裂解的分子。举例来说，传感器分子可包含如κ-酪蛋白的乳蛋白的由用化学发光供体结构域和接受体结构域标记的蛋白酶裂解的区域。
如熟练人士将了解，本发明也可为多路的。在这个系统中，提供结合不同化合物的两种或更多种不同传感器分子。各不同传感器分子包括不同供体和/或接受体分子以致它们在不同波长下发射来使得能够检测和定量不同靶标化合物。
实施例
实施例1–杂交BRET系统在用于凝血酶裂解测定的微流体系统 中的性能
材料和方法
BRET系统
使用BRET1和BRET2技术的组合且在本文中称为杂交BRET。具体来说，以天然腔肠素为底物的RLuc用作生物发光供体且GFP2用作接受体分子。通过含有凝血酶裂解位点的肽序列(LQGSLVPR↓GSLQ(RG))连接供体和接受体(GFP2-RG-RLuc)且在大肠杆菌中表达。凝血酶裂解裂解位点导致杂交BRET信号变化。BRET系统的机制显示于图1A中。
材料
如先前所报道表达和纯化GFP2-RG-RLuc生物传感器(Dacres等2009a)。纯化的融合蛋白在凝血酶裂解缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、100mM NaCl、1mM EDTA)中。用于基于微流体的测定和基于板读取器的测定的天然腔肠素底物(Biosynth)的最终浓度分别是58.6μM和5μM。在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备1单位(U)/μl凝血酶蛋白酶(Amersham Biosciences)溶液。
微流体芯片制造和实验设置
使用SpectraMax M2分光荧光计(Molecular Devices)在微板中以及在下述微流体装置中进行同时双重发射杂交BRET测量。添加5μM天然腔肠素底物至1μM生物传感器中，在400与650nm之间使用发光扫描模式记录对BRET构建体的光谱扫描。
对于微芯片BRET测量，使用标准光刻术由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造宽70μm且高50μm的简单Y形微通道微芯片(图1B)。在商业绘图软件包(Adobe Illustrator CS4)中完成芯片设计且将设计图案印刷在透明掩模(5,080dpi，Allardice)上。使用分层干膜抗蚀剂(Shipley 5038)制造微流体装置的主模。在113℃下将多层抗蚀剂分层于抛光不锈钢的基板上。使用在20mJ/cm2下操作的准直的UV源(λ＝350-450nm)和透明薄膜掩模以平版印刷方式使通道图案化。在暴露之后，在20％Na2CO3溶液中显现测试图案。
随后使用100nm Ni的初始溅射沉积，继之以电镀以达到厚度150μm来以镍垫片形式复制抗蚀剂中的图案。接着将10/1(w/w)比率的PDMS与固化剂倾注在垫片上，脱气且在75℃下烘焙过夜。切割装置且从垫片剥离并接着暴露于空气等离子体10分钟。接着立刻用玻璃载片密封PDMS；在75℃下烘焙三小时之后，PDMS强烈粘着于玻璃的表面且PDMS玻璃微芯片处于即用状态。
微流体测量的设置的示意图显示于图1C中。neMESYS高压泵系统(Cetoni,Germany)用于将流体从具有50μl容量的两个SGE注射器(Supelco)泵送于微芯片上。两个物流的流动速率均是20μl/h。被微芯片放置在显微镜(Nikon Eclipse TE2000-U)平台上以进行目视观察和测量。蓝宝石激光器(488nm，Coherent)用于定位检测点。用20×物镜(Plan Fluor,Nikon)收集发射的生物发光。515nm–555nm(对于GFP2)和430nm–455nm(对于RLuc)的带通滤光器(Nikon)用于两个通道。缩小透镜(Nikon C-0.45×)用于将从各通道发射的光聚焦于光电倍增管(Hamamatsu H7421)上。各通道的光的数据撷取的积分时间是200ms。测量位置沿在输入通道的首次汇合处(x＝0)开始直至微芯片的末端的主通道变化。
凝血酶测定
添加各种浓度的凝血酶至纯化的GFP2-RG-RLuc生物传感器中且在30℃下孵育90分钟。为测量凝血酶裂解的程度，将在孵育之后的样本混合物和天然CLZ溶液从单独注射器泵送至两个进口通道中且使其流过主通道。两个物流之间的扩散在界面处诱导BRET反应。在蛋白酶测定之前，使来自酵母的重组水蛭素(hirudin)(Sigma)与凝血酶一起在室温下孵育十分钟。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
为确认凝血酶完全裂解GFP2-RG-RLuc生物传感器，进行SDS-PAGE分析。在1×样本装载缓冲液(Invitrogen)中稀释蛋白质(2.5μg)以在12％Bis-Tris胶凝中用MOPS操作缓冲液(NuPAGE,Invitrogen)进行SDS-凝胶电泳。条带用Fast StainTM(Fisher)染色且接着观察。
数据分析
使用微板光谱仪，将杂交BRET比率计算为在500nm和470nm下测量的生物发光发射的比率。使用微芯片系统，将杂交BRET比率计算为长波长发射(515nm-555nm)与短波长发射(430nm-455nm)的比率(Pfleger和Eidne,2006)。为允许在两个不同检测系统之间比较，通过将杂交BRET比率表示为在相同测量系统中不添加凝血酶的BRET比率的倍数来使杂交BRET比率标准化。所有数据都报道为平均值±标准偏差(SD)。使用Graphpad prism(针对Windows的5.00版，Graphpad Software,San Diego,California,USA)进行双尾未配对t检验。统计显著性定义为p<0.05。
结果
凝血酶对BRET光谱和比率的影响
在凝血酶处理之前，凝血酶生物传感器的生物发光光谱是双峰的，其中在470nm下的峰表示RLuc发射且在500nm下的第二峰表示GFP2发射(图2A)。这指示能量从天然腔肠素的激发态转移至GFP2。在凝血酶裂解后，光谱的绿色组分降低，从而说明凝血酶裂解凝血酶生物传感器已使供体与接受体之间的能量转移效率降低。
SDS-PAGE(图2B)确认在凝血酶处理之后，融合蛋白被裂解成分子量是32.4KDa和36.4KDa的两个组分(泳道5，图2B)，对应于His标记的GFP2和未标记的RLuc。与水蛭素一起预孵育BRET生物传感器抑制形成两个组分，从而显示凝血酶特异性(泳道6)。
使用BRETH比率变化定量凝血酶对生物传感器裂解的影响。在凝血酶裂解之后，BRETH比率从1.11±0.06至0.75±0.04显著降低(P＝0.0009)约32％。在凝血酶裂解之后，杂交BRET比率0.79±0.05不显著不同(P＝0.3309)于通过混合各1μM RLuc和GFP2获得的杂交BRET比率(图3，对照)。预添加水蛭素防止BRETH比率1.08±0.14的凝血酶诱导降低。这不显著不同于在无凝血酶下测量的比率(P＝0.7663)。
芯片上BRET测量
为优化用于检测BRET生物传感器的流动条件，进行一系列实验来成像和定量在不同位置、流动速率和生物传感器浓度下的BRET发光度(图5)。在两个流体流融合蛋白和底物的初始接触阶段，扩散层是狭窄的且仅小体积的液体发射生物发光(数据未显示)。生物发光的强度也较低(约457)，但显著高于背景(约2.3)。从x＝1至5mm，生物发光强度保持几乎恒定，但在x＝7mm处存在显著增加。这个增加可反映区域中的混合增加。无论生物发光的强度如何，BRETH比率在整个测量区域中保持几乎恒定(约5.2)。为确定芯片上测量的基准，将BRET比率与使用商业BRET检测仪器测量的微板数据进行比较。在微芯片测量结果与微板测量结果之间，BRET比率的相对变化(即用凝血酶测量的BRET比率对在无凝血酶下测量的BRET比率)极其一致(在±4％内)。
也研究改变流动速率和生物传感器浓度对BRETH比率的影响(图6)。在两个位置x＝0和4.9mm处测量流动速率依赖性(图6a)。在x＝0处，对于研究的流动速率的范围(即20–60μl/h)，BRETH比率也是恒定的(在±1.1％内)。在x＝4.9mm处，由于流动条件变化，BRET比率存在略微较大的变化(在±2％内)。然而，两个测量位置之间的总体不确定性在±5％内。图6b显示杂交BRET比率随生物传感器浓度而变。尽管低蛋白质浓度的不确定性相对较高(例如标准偏差＝7.7％，在1.49μM生物传感器浓度下)，但平均BRETH比率的总体变化随生物传感器浓度变化较小，即标准偏差2.7％。在不同测量条件下，BRETH比率变化较小是一项重要发现，因为这意味着BRETH反应的完成对于定量而言并不关键，只要可测量生物发光即可。尽管更完全混合将被预测会增加系统的光度，但我们的数据暗示在BRETH比率方面的影响将较小。这潜在简化用于进行基于BRET的检测的微流体装置的设计要求，至少对于研究中考虑的凝血酶浓度的水平而言。
凝血酶浓度的影响
使用流动速率20μl/h和生物传感器浓度2.972μM(图6)，将测量固定在x＝2.1mm处(图5)，我们使用一定范围的凝血酶浓度，就测量凝血酶而言比较微芯片系统和微板系统(图7)。BRETH比率随凝血酶的浓度增加直至0.24nM(对于微流体测量)和2.7nM(对于微板测量)而线性变化。在较高浓度下，由于凝血酶饱和，BRET比率变化的显著性要小得多。在低凝血酶浓度区域中，校准是线性的，其中R2值超过0.995。比较校准的梯度揭示微流体方法对凝血酶浓度变化的灵敏性比微板方法大4.7倍。相较于使用基于微板的技术的310pM，基于微芯片的技术对凝血酶的检测限是27pM。基于微芯片的BRETH系统具有在BRET2基于微板的测定的计算值与BRET1基于微板的测定的计算值(分别是15pM和53pM)之间的中间检测限(Dacres等2009a)。
结论
生物发光共振能量转移方法已首次使用流体相凝血酶敏感性生物传感器，以流动形式加以说明。所用BRETH技术是BRET1和BRET2的组合，其允许以可测量光度测试BRET2组分。在微芯片中的Y形微通道网络中进行BRET反应和检测。实验定量测量位置、流动速率和生物传感器浓度的影响。这些因素影响两个光学通道中的生物发光强度，但不影响BRETH比率。相较于用商业仪器测量的等效基于微板的技术，基于微芯片的技术显示检测凝血酶的灵敏度提高。相较于使用基于微板的技术的310pM，基于微芯片的技术对凝血酶的检测限是27pM。
实施例2–BRET 2 在微流体系统中的性能
在BRET2系统中，以腔肠素400a(CLZ400A)为底物的海肾荧光素酶(RLuc)用作光子供体且GFP2用作接受体分子。因为BRET2的发光比BRET1 . 5的发光小100倍，所以BRET2反应需要在最优温度、检测室尺寸、流动速率和浓度下高效混合以产生最高生物发光信号。因此，这个系统用于评估不同混合机制(图8)、反应室设计和反应条件。
具有Y形微通道(具有三个混合元件)的PDMS芯片(图8)(其中微通道中具有矩形横截面(宽度200μm以及高度30μm))用于监测BRET2测定。具有不同直径和高度的检测室位于微通道的末端处。通过位于检测室下部的多模光纤收集发射生物发光。发射将由分色镜拆分且通过对应于供体的发射带(430nm-455nm)和接受体的发射带(515nm-555nm)的两个带通滤光器，随后进入两个相应光电倍增管(Hamamatsu H7421)中。
方法涉及使蛋白质溶液在Y形通道的一个进口中流动以及使腔肠素400a底物在通道的另一进口中流动。
方法需要通过被动混合元件在适合流动速率下高效混合蛋白质流和底物流。
方法旨在通过改变混合元件、腔室尺寸、蛋白质和底物浓度、流动速率、温度等来收集尽可能高的生物发光信号。因此，将获得最优微流体混合芯片设计和反应条件且转移至其它BRET测定中。
为增强效率，使用与大型光学检测室集成的流体芯片。通过在腔室下定位光纤，从BRET2反应发射的光被收集且传输至检测子系统中(图9)。这个方法确保最小损失以及因此高灵敏度且允许在两个波长下同时捕捉发射水平的细微变化。
发明者使用能够检测模式蛋白酶(凝血酶)的传感器蛋白质测试检测灵敏度。结果指示相较于可商购获得的微板读取器，BRET2检测灵敏度提高五倍。在这些测试中，我们也确认检测限小于20pM。
图10显示来自灵敏度测试的样本数据。GFP和Rluc的发射计数分别用绿色线(第一版面中的顶部线，第二版面中的底部线)和蓝色线(第一版面中的底部线，第二版面中的顶部线)指示。显示无凝血酶空白和具有270pM凝血酶的条件的原始数据。发射水平之间的比率(BRET2比率：GFP/RLuc)指示对用270pM凝血酶消化传感器的反应的变化约十倍。
图11显示当凝血酶浓度从0变化至270pM时的传感器的反应。所述图也指示当用可商购获得的仪器重复相同实验时的结果。在微流体系统中，灵敏度(斜率)高五倍。计算检测限小于20pM。
在混合传感器蛋白质(1μM)与包含凝血酶(540nM)和底物(12.5μM)的制剂后，用双进口微流体装置测量BRET2比率。通过混合传感器蛋白质(1μM)与底物(12.5μM)来进行对照实验。测量出在输入流动速率50μL/h下，芯片上反应的BRET2信号降低约75％(图12)。
实施例3-基于BRET 2 的气味传感器在微流体系统中的性能
相较于FRET(WO 2010/085844)或标准BRET，BRET2系统更适于测量GPCR中配体诱导的分子重排。这是因为在优选GPCR构建体中，BRET对间隔6.8nm(Dacres等,2010和2011)充分匹配于BRET2供体和接受体组合的福斯特距离。然而，一个折衷是当使用BRET2化学时，RLuc供体的量子产率较低。这导致较少光子可用于检测。使用RLuc2和8个突变已显示会提高BRET2系统的量子产率(De等,2007)，同时对BRET2系统的福斯特距离仅具有最小影响(图1)。本发明者在OGOR传感器中用RLuc2或RLuc8替代RLuc以试图增加光子产率而不损害气味剂测定的灵敏度。图18显示用于使用并有RLuc2的OGOR2进行丁二酮检测的转导流程。
材料和方法
构建并有标记的秀丽隐杆线虫气味受体的BRET2-GPCR传感器
嵌合BRET2标记的气味受体具有插入秀丽隐杆线虫气味受体的第三细胞内环(IC3)中和C末端处的BRET2组分，其中绿色荧光蛋白GFP2在IC3处，且海肾荧光素酶RLuc在蛋白质(OGOR)的C末端处。使用定点诱变，将RLuc2突变引入pYES-DEST-52OGOR序列中。引物1和2(表3)用于引入突变C124A且引物对3和4用于引入M185V突变以制备名为OGOR2的构建体(图18，SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2)。
表3.用于将RLuc2突变C124A和M185V引入pYES-DEST52-OGOR序列中的引物。
OGOR2样本制备
将酵母菌落接种在10mL补充有2％葡萄糖的SCMM-U(酿酒酵母基本培养基，每200mL组成：1.34g无氨基酸的酵母提取物和0.38g无尿嘧啶的酵母补充培养基)中且在28℃下孵育过夜。过夜培养物的等分试样用于接种补充有2％棉子糖和2％半乳糖的SCMM-U直至最终O.D.6000.4且在15℃下在200rpm下的振荡下再孵育72小时。
在4℃下在1500x g下离心细胞培养物5分钟。将细胞再混悬于1mL无菌水中且在10,000x g下离心1分钟。将细胞再混悬于4mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。细胞通过弗伦奇压碎器(French press)(约18000psi)进行溶解且通过在15000x g下离心(4℃)15分钟来移除细胞碎片。在此之后，在4℃下在40,000rpm(Beckman Coulter L-80超速离心机)下离心上清液部分1小时。倾析上清液且将膜离心块再混悬于1mL PBS中并在4℃下储存48小时。
丁二酮测定
所有配体溶液都直接在水中制备。使用510nm下的GFP2强度使OGOR浓度标准化。在96孔板(Perkin-Elmer)中，以总体积100μL在磷酸盐缓冲盐水中进行测定。在28℃下在用Topseal-ATM(Packard)密封的孔中使OGOR与各配体一起孵育45分钟。
板读取器测量
在孵育之后，添加腔肠素400a底物(Biosynth)以达到最终浓度5μM。用使用BRET2发射滤光器机组的POLARstar OPTIMA微板读取器(BMG LabTech)记录同时双重发射BRET2测量结果，所述机组包括RLuc/Clz400a发射滤光器(410nm带通80nm)和GFP2发射滤光器(515nm带通30nm)，其中两个通道的增益分别设置成3300和4095，积分时间是0.5s。
终点芯片上微流体测量
在与光学检测室集成的两进口微流体混合器装置中进行芯片上终点微流体测定。制备腔肠素400a底物(Biosynth)以达到最终浓度12.5μM且在第一进口中引入。将OGOR和OGOR2膜离心块再混悬于1mL PBS中，必要时稀释且在28℃下与浓度在1aM–1μM的范围内的丁二酮溶液一起孵育45分钟。在第二进口中引入制剂。对于各进口，以输入流动速率400μl/h启始芯片上混合。使用两个光电倍增管记录BRET2测量结果，一个光电倍增管配备有RLuc/Clz400a发射滤光器(410nm带通80nm)且另一个光电倍增管配备有GFP2发射滤光器(515nm带通30nm)。使用与芯片上光学检测室对准的具有核心直径1mm的光纤来收集光学输出。
实时芯片上微流体测量
在与光学检测室集成的三进口微流体混合器装置中进行芯片上实时测量。第一进口用于引入腔肠素400a底物(Biosynth)，其在PBS中被制备来得到最终浓度12.5μM。第二进口含有在PBS中被稀释来得到最终浓度1fM的丁二酮(2,3-丁二酮)，或仅含有PBS作为对照。第三进口用于引入传感器蛋白质混悬液，其是通过将上述膜离心块再混悬于1mL PBS中且必要时进一步稀释来制备。通过使用在50-400μl/h的范围内的输入流动速率来启始芯片上混合。使用两个光电倍增管记录BRET2测量结果，一个光电倍增管配备有RLuc/Clz400a发射滤光器(410nm带通80nm)且另一个光电倍增管配备有GFP2发射滤光器(515nm带通30nm)。使用与芯片上光学检测室对准的具有核心直径1mm的光纤来收集光学输出。
分析
BRET2信号被计算为在515nm下的发射强度与在410nm下的发射强度的比率。所有数据都报道为平均值±标准偏差(SD)或平均值±平均值标准误差(SEM)，如正文中所述。使用针对Windows的5.03版Graphpad Prism，在使数据标准化之后，用斜率可变的log[激动剂]对反应曲线来拟合曲线。在Graphpad prism中进行双尾未配对t检验。统计显著性定义为p<0.05。
结果
强度
将RLuc2突变引入OGOR中使生物发光强度增加的因数是从1766±125RLU(对于OGOR)至272886±26754RLU(对于OGOR2)的约150(图19)。因此，OGOR的这个突变形式显示有助于在微流体芯片上BRET2检测由OGOR2结合气味剂的潜力。通过芯片上测量结果确认这个预测。RLuc2突变使生物发光强度增加的因数是从6.45±2.9RLU至809.74±116RLU的约126(图20)。
在多孔板中说明由OGOR2结合气味剂
在向微板的各孔中的含有OGOR2的膜制剂中添加1μM丁二酮后，BRET2信号存在21.4％降低(图21)。丁二酮诱导的BRET2信号变化显著不同(P＝0.0136)于对水的对照反应。反应于丁二酮的信号的变化百分比小于在并有天然RLuc的原始OGOR传感器(32％)下所见。然而，相较于就OGOR而言的1.0±13.5％(n＝4)，就OGOR2而言的空白测量结果1.0±7.0％(n＝3)存在较小变化。因此，OGOR2传感器潜在能够检测的丁二酮浓度低于OGOR传感器，因为检测限计算为空白信号±3×S.D.。
OGOR2对丁二酮的反应(图22)是剂量依赖性的，具有一定线性范围(跨越6个对数单位，从10-18至10-12M)(图22)。计算EC50值是11.4aM丁二酮。这比微孔中的OGOR反应低两个数量级，从而表明对丁二酮的灵敏度提高。
使用微流体终点测定检测由OGOR2结合丁二酮
在孵育10fM丁二酮与含有OGOR2的膜混悬液之后，微流体芯片上测量结果显示BRET2信号降低36.9％(图23)。BRET2信号降低比使用板读取器得到的等效测量结果大1.5倍(图21)。这指示使用OGOR家族生物传感器的微流体测量在狭义上比板读取器测量更灵敏。
OGOR2的浓度依赖性反应从10-18至10-16M跨越2个对数单位(图24)。计算EC50值是约10aM丁二酮。这个水平与板读取器测量结果良好一致(图22)。
用微流体装置实时芯片上检测由OGOR2结合气味剂
实时芯片上测量结果显示在输入流动速率50、100、200和300μl/h下在芯片上混合1fM丁二酮与290nM蛋白质和12.5μM底物之后，BRET2比率降低27.4％(图25和26)。
实施例4-基于BRET 2 的周质结合蛋白传感器在微流体系统中的 性能
周质结合蛋白(PBP)形成见于细菌中的一个大型且不同的家族的可溶性蛋白质。PBP结合一定范围的不同化学迥异物质，包括碳水化合物、氨基酸和神经递质、金属和离子，仅举几例(Medintz等,2006)。尽管PBP在一级序列方面无关，但它们都经受通常被称为‘捕蝇草(venus-fly-trap)’机制的大型配体诱导的构象重排(Sharff等,1992和1993；Spurlino等,1991)。
在MBP的FRET标记的N末端和C末端之间的测量距离6.93nm(Park等,2009)与GPCR内的测量距离具有类似尺度，从而表明相较于FRET，BRET可为用于测量这个范围内的距离的更好选项。在微流体芯片上测量由PBP结合配体可产生关于广泛范围的应用领域的通用转导平台，所述应用领域包括安全、食品和饮料品质控制、环境和健康照护。发明者选择MBP作为这个概念的初始测试，因为它是PBP超家族的一个充分表征的成员且潜在代表所有PBP。由周质蛋白MBP结合麦芽糖的BRET2转导机制显示于图27中。这个传感器是结构和/或配体结合机制与MBP类似的所有PBP的概念验证。熟知的是基于MBP的生物传感器对麦芽糖的亲和力可通过MBP结构域的靶向突变来改变。类似方法可适用于其它PBP。
材料和方法
构建BRET蛋白
通过聚合酶链反应(PCR)扩增RLuc2且克隆至Easy载体(Promega,Australia)中。此导致在扩增的基因的下游引入BstBI位点，且XhoI限制位点直接处于扩增的基因的上游。DNA测序确认扩增子序列正确。将扩增子插入pRSET GFP2-FL1-RLuc(Dacres等,2010)的BstBI和XhoI位点中，从而替代RLuc以得到pRSET GFP2-FL1-RLuc2。
扩增MBP且连接至Easy载体中。在这个过程期间，BstBI位点被插入在扩增的基因的上游且PstI位点插入在下游。将MBP限制克隆至pRSET GFP2-FL1-RLuc2的PstI和BstBI位点中，从而用MBP替代FL1序列以产生pRSET GFP2-MBP-RLuc2。
使用定点诱变(Stratagene)，利用引物C1(CAGATGTCCGCTTTCGCGTATGCCGTGCGTAC)(SEQ ID NO:11)和C2(GTACGCACGGCATACGCGAAAGCGGACATCTG)(SEQ ID NO:12)将W140突变引入pRSET GFP2-MBP-RLuc2中。BRET2标记的MBP受体的核苷酸和氨基酸序列提供为SEQ ID NO:3至6)。
表达和纯化BRET2蛋白
在大肠杆菌菌株BL21DE3(Novagen)中表达蛋白质。在37℃、200rpm下，在含有100μg/mL氨苄西林和2％葡萄糖的LB(10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl(pH 7.4))中由单一菌落使过夜培养物生长。通过接种500mL含有100μg/mL氨苄西林的LB直至A6000.1且在37℃(200rpm)下孵育3.5小时，随后在22℃(200rpm)下过夜孵育来诱导表达。在接种之后24小时收集细胞。
对于蛋白质纯化，通过在4335×g(4℃)下离心15分钟来收集细胞，且再混悬于平衡缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液、300mM NaCl，pH 7.0)中。使细胞混悬液穿过在压力约22000psi下的匀浆器(Avestinemulsiflex C3(ATA Scientific,Australia))且通过在15000×g(4℃)下离心15分钟来分离可溶性蛋白质部分。根据供应的说明书(BD Talon(BDBiosciences,Clontech,Australia))，使用钴亲和色谱纯化蛋白质。在用150mM咪唑洗脱纯化的蛋白质之后，使用纤维素膜(12,000分子量截断值(Sigma))相对于50mM Tris(pH 8)、100mM NaCl和1mM EDTA透析样本。在干冰上快速冷冻500μL蛋白质的等分试样且储存在-80℃下。通过在280nm下的吸光度来确定蛋白质浓度且根据Gill和vonHippel(1989)的方法加以计算。
光谱扫描
所有光谱扫描都用SpectraMax M2板读取分光荧光计(MolecularDevices,Australia)记录。在96孔板(Perkin-Elmer,Australia)中进行反应。使用以20nm间隔在360与650nm之间扫描的发光扫描模式记录对BRET2构建体的生物发光扫描。
终点芯片上微流体测量
用具有两个进口的微流体混合器、被动微混合器和集成光学检测室进行芯片上测量。通过使用两个光电倍增管记录BRET2测量结果，一个光电倍增管配备有RLuc/Clz400a发射滤光器(410nm带通80nm)且另一个光电倍增管配备有GFP2发射滤光器(515nm带通30nm)。通过使用通过分色镜与芯片上光学检测室对准的具有核心直径1mm的光纤来收集光学输出。
实时芯片上微流体测量
用具有三个进口的微流体混合器、被动微混合器和集成光学检测室进行实时芯片上测量。通过使用两个光电倍增管记录BRET2测量结果，一个光电倍增管配备有RLuc/Clz400a发射滤光器(410nm带通80nm)且另一个光电倍增管配备有GFP2发射滤光器(515nm带通30nm)。使用通过分色镜与芯片上光学检测室对准的具有核心直径1mm的光纤来收集光学输出。
BRET蛋白测定
1μM纯化的蛋白质用于所有能量转移测定(最终体积100μL)。通过在磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.058M Na2H2PO4、0.017NaH2PO4、0.068M NaCl(pH 7.4))中稀释蛋白质来制备1μM纯化的蛋白质。使纯化的蛋白质与溶解于双重去离子水中的糖或水一起在28℃下孵育30分钟。在孵育之后，添加16.67μM腔肠素400a且立刻记录信号。
芯片上BRET蛋白测定
对于芯片上测定，使1μM纯化的蛋白质与1mM麦芽糖溶液一起在28℃下孵育40分钟。制剂接着与5μM腔肠素400a一起在芯片上混合且记录来自检测室的光学信号。通过在相同条件下孵育蛋白质制剂与水且在芯片上混合来进行对照实验。比较结果以确定在添加麦芽糖后的BRET2信号变化百分比且扩展来确定麦芽糖灵敏度。
实时芯片上BRET蛋白测定
对于实时测定，同时在芯片上混合蛋白质制剂、麦芽糖和底物。使1μM纯化的蛋白质与1mM麦芽糖溶液和5μM腔肠素400a底物溶液混合。记录来自检测室的光学信号。通过改变流动速率来控制芯片上反应时间。测量不同反应时间的BRET2信号变化且将结果与用水进行的对照实验进行比较。
BRET比率确定
将BRET比率计算为最大接受体发射强度与最大供体发射强度的比率。
实时芯片上检测麦芽糖
使用具有两个输入通道和长度18mm的蛇形共用通道的y形芯片。共用通道的横截面尺寸是0.2mm x 0.035mm。BRET反应室是 且H＝1mm。在腔室的上表面上不存在镜子。捕捉光且使用具有输入端的分叉光导管(主干直径6mm且NA＝0.59)转移至标准分色检测器中。PMT门控时间是500毫秒。在共用通道中测试两个不同流动速率：每小时200μL和400μL。
制备含有1μM麦芽糖和31.25μM Clz400a底物或在阴性对照的情况下仅含有31.25μM Clz400a底物的输入物A。输入物B含有1μMGMR传感器。在输入流动速率100μL/小时或200μL/小时下将A和B泵送至Y形微流体芯片的单独臂中以分别得到共用通道流动速率200μL/小时或400μL/小时。估计总滞留时间在约230秒(在第一情况下)和115秒(在后述情况下)下。根据在开始流动之后200-250秒收集的平均数据来确定BRET2比率。
数据分析
使用GraphPad Prism(针对Windows的5版，Graphpad Software,San Diego,California,USA)进行所有数据分析。除非正文中另外陈述，否则所有数据都将报道为平均值±标准偏差(SD)。将使用Graphpadprism进行双尾未配对t检验。统计显著性定义为p<0.05。
结果
通过MBP BRET比率检测麦芽糖-板读取器测定
通过测试对一定范围的糖，包括单糖、二糖和三糖的反应来确定BRET标记的MBP蛋白的选择性(图28)。仅麦芽糖(P＝.001)和麦芽三糖(P＝0.02)产生来自BRET标记的MBP的BRET信号的显著(P<0.05)变化。BRET生物传感器不对葡萄糖、果糖、蔗糖或棉子糖起反应。Fehr等(2002)说明FRET生物传感器能够检测麦芽糖和一定范围的麦芽糖寡糖，但不特异性识别不含有α-1,4-糖苷键连的任何戊糖、己糖、糖醇、二糖或三糖。随着麦芽糖链的长度从两个单元(麦芽糖)增加至三个单元(麦芽三糖)，BRET比率变化的幅值从29.65％降低至17.03％(图28)。这与如由电顺磁共振(EPR)研究(Hall等,1997)和FRET测量(Fehr等,2002)所说明，在较大α1,4-寡麦芽糖苷链存在下，闭合移动降低一致。比较BRET2反应的相对大小与文献(Fehr等,2002)中报道的FRET反应的相对大小说明BRET组分替代FRET组分可增加生物传感器的动态范围，从而导致相较于FRET的约12％(Fehr等,2002)，BRET的信号变化29.65±1.11％。基于在福斯特距离方面的类似性，发明者预期经典BRET1的信号变化将与FRET的信号变化具有相同数量级。
将W140A突变体引入GFP2-MBP-RLuc2中使对麦芽糖的BRET2反应消除(图28)。未观察到对水或麦芽糖的BRET2反应之间的显著差异(P＝0.63)。W140A突变体具有的针对麦芽糖的解离常数高于100mM且先前当应用于监测麦芽糖向酵母中的摄取时被用作FRET标记的MBP的对照(Fehr等,2002)。W140A突变体对麦芽糖缺乏反应指示麦芽糖对GFP2-MBP-RLuc2的BRET2比率的影响不归因于麦芽糖与BRET组分自身之间的直接相互作用。这些结果确认GFP2-MBP-RLUC2(GMR)和类似传感器在基于BRET2的微流体芯片测定中的潜在适合性。
反应时间
BRET2反应随孵育时间增加而增加直至30分钟，在30分钟时，反应达到最大(图29)。30分钟用于进一步测定。在本微板测定形式中，不可能实时记录BRET2反应，但可使用微流体芯片形式进行实时麦芽糖测定。
灵敏度
BRET2标记的MBP生物传感器能够定量跨越三个对数单位的在1×10-8M至3.16×10-6M的范围内的不同浓度的麦芽糖，其中EC50是3.71×10-7M(图30a)。FRET标记的MBP受体的反应仅历经两个对数单位，在0.26-21.12μM的范围内是线性的，其中EC50是3.24μM。
芯片上测定测量
在具有L≈18mm的蛇形共用通道的双输入微流体混合装置(图8b)上进行灵敏度测定。BRET反应室是且H＝1mm，不具有镜子。使用具有6mm主干且NA＝0.59的分叉光导管。使1μMGMR传感器与浓度在10-9至10-3M的范围内的麦芽糖一起在28℃下孵育40分钟。在输入流动速率400μl/h下将孵育的样本和31.25μMClz400a底物各自泵送于芯片上。光导管的主干末端用于收集来自BRET反应室的信号。光导管的两个分支被导向在两个PMT前方的两组滤光器块(针对蓝色的410/80、针对绿色的515/30)。在各浓度下测量BRET2信号。使用同一批GMR传感器在三天中的每一天重复实验。使用九个芯片，每个芯片用于各测试浓度，跨越全部三天。芯片上检测的对数浓度反应曲线与先前基于板的测量的反应曲线实际上一致，如EC50＝2.2x 10-7M(图30b)。
在芯片上研究传感器对麦芽糖的特异性超过传感器对糖葡萄糖和蔗糖的特异性。发射的幅值较高，其中Rluc/Clz400a信号在10000至25000计数/门(500ms)的范围内且GFP2信号在2000至10000计数/门(500ms)的范围内。在不存在分析物下，BRET2比率是0.225。结合麦芽糖(图52)导致BRET2比率较大变化，其中对于0.1mM麦芽糖的平均BRET2比率是0.35，超过无糖对照增加52％。与葡萄糖和蔗糖的反应导致BRET2比率分别增加7％和15％，从而确认基于BRET2的传感器对麦芽糖的选择性在微流体形式中得以维持。
实时芯片上检测麦芽糖
因为发明者已先前显示对于蛋白酶和挥发性检测，本发明能够在芯片上混合样本与传感器和底物，以使整个检测反应可以连续流形式在芯片上进行。发明者说明这在三种输入物：样本、传感器和腔肠素400A底物下，使用OGOR2传感器和丁二酮(图26)以及使用凝血酶的两种输入物(参见例如图51)可行。发明者扩展这个研究工作以显示相同方法在基于BRET的麦芽糖传感器下可行。在这个情况下，为方便起见，发明者也使用双输入微流体芯片。预混合腔肠素底物和含有麦芽糖的样本溶液(或无麦芽糖的阴性对照)且泵送至一个输入端中并将GMR传感器溶液泵送至另一输入端中。
在两个流动速率下启始流动之后约40秒检测信号，但在较快流动速率(每小时200μL输入物)的情况下，信号更快速(60秒对约130秒)稳定(图67)。总发光度是强烈的且易于检测，在100μl/h下，1000-1500计数/门(对于Rluc/Clz400a)和6000-7000计数/门(对于GFP2)，或在200μl/h下，2000-3000计数/门(对于Rluc/Clz400a)和7000-9000计数/门(对于GFP2)。
一旦稳定，在两个流动速率下，1μM麦芽糖即均易于与对照区分(图64)，其中较慢流动速率产生BRET2比率变化约20％且较快流动速率显示变化约27％。
实施例5–比较有和无纤维光学开关下的生物发光信号收集
用于本发明中的仪器的一个高度优选要求是多路，指的是仪器必须能够几乎同时(即一个分析物至下一个分析物之间的时间延迟极小)检测若干分析物。为降低仪器的成本和空间以及重量，光纤开关可用于使得能够多路。在实施方案中，若干输入光纤将并行收集来自至少六个检测室的生物发光信号。光学开关将接着使一个针对短时期(数百毫秒)的特定输入纤维连接于单一输出纤维，所述输出纤维连接于用于将信号拆分和带传送至两个光电倍增管(PMT)中的光学块。以相同方式，开关将开启下一输入纤维。在当前实例中，开关花费50ms来在输入纤维之间变化。光学转换不可避免地在收集的信号中引入光学损耗。因此，进行这个实验以确认是否有可能通过光学开关收集信号且计算归因于光学转换的信号损失的量。
实验设置
实验设置显示于图31中。图31A显示无光学开关的设置。操作单一纤维以对准在微流体芯片的光学检测室下方。接着将纤维直接连接于光学块。图31B显示具有光学开关的设置。使用Leoni 1x9mol纤维光学开关。9个输入端由超小型A(SMA)连接器端接，而单一输出纤维由套圈连接器(FC)端接。不锈板被机械加工来含有一排允许连接来自底部的光纤的SMA插坐。在板的顶部上安置有微流体芯片，其中光学腔室对准在纤维的尖端处。对于这个实验，使用一个输入纤维。接着将输出纤维连接于光学块。
材料和方法
在与光学检测室集成的两进口微流体混合器装置中进行芯片上终点微流体测定。在TE缓冲液(10mM Tris(pH 8.0)、100mM NaCl、1mM EDTA)中制备腔肠素400a底物(Biosynth)以达到最终浓度12.5μM且引入第一进口中。在1μM的浓度下在TE缓冲液(10mM Tris(pH8.0)、100mM NaCl、1mM EDTA)中稀释GTR膜蛋白。在第二进口中引入制备的GTR溶液。对于各进口，以输入流动速率400μl/h启始芯片上混合。使用两个光电倍增管记录BRET2测量结果，一个光电倍增管配备有RLuc/Clz400a发射滤光器(410nm带通80nm)且另一个光电倍增管配备有GFP2发射滤光器(515nm带通30nm)。对于图31中的两种情况，使用一个单一输入纤维收集光学输出。门控时间是500ms。
结果
图32显示在无和有光学转换下，Rluc/Clz400通道中对于三次操作收集的实时生物发光信号。GFP也显示类似特性(数据未显示)。根据这些结果，确认生物发光信号已成功穿过光学开关。就损失而言，图33比较在无和有光学转换下，RLuc/Clz400a通道与GFP通道两者中收集的发光信号。对于RLuc/Clz400a通道，归因于光学开关的损失是40％，而对于GFP通道，损失是28％。
实施例6–优化总体系统发光度和光子检测效率
本发明的一个重要特征是它能够在经济使用试剂下实时检测极低水平的分析物。达成此举的一个关键在于每单位体积传感器溶液产生最大数目的光子。并入如RLuc2突变的改进有助于此。也至关重要的是使光学检测系统中的光子损失最小。高光子检测效率允许达成反应时间、试剂经济性和信噪比的合乎需要组合。增加BRET反应室和共用通道的体积倾向于增加可用光信号，此会改进信噪比但降低系统的时间分辨率。在其它条件相等的情况下，增加装置中的流动速率会提高装置的时间分辨率，但降低它的试剂经济性和信噪比。也至关重要的是使光学检测系统中的损失最小。产生许多替代性实验设置来提高光子检测效率。
实验设置
用与图31A中所示的微流体芯片类似的具有两个进口、被动混合元件和检测室的微流体芯片进行芯片上测量。被铝镜放置在反应室的顶部上以增强BRET信号。使用两个光电倍增管记录BRET发射，一个光电倍增管配备有RLuc/Clz400a发射滤光器(410nm带通80nm)且另一个光电倍增管配备有GFP2发射滤光器(515nm带通30nm)。
将许多变化形式与原始设置(图31A)进行比较。使反应室的直径从原始直径2mm增加至4mm(图34A)。反应室的高度在1与2mm之间变化。直径0.4-1.0mm的单一光纤(图31A)用5mm核心直径、NA＝0.59的馈入分色镜中液体光导管或光纤束(图34A)、或主干核心直径6mm、分支核心直径4mm的分叉光导管(图37)、或主干核心直径8mm且分支核心直径4mm的多分叉光导管(图38和40)替换。
材料和方法
在第4天在高(100和50倍)稀释比率下从储备溶液于PBS中制备OGOR2传感器溶液。在PBS中在31.25μM下制备Clz400a。当包括丁二酮时，在最终浓度1μM下将它添加至OGOR2传感器溶液中。对于对照实验，仅添加DI水。无和有丁二酮的传感器管均在28℃下孵育30分钟。
结果
比较纤维直径1.0mm的原始系统与使用单一5mm核心液体光导管的改进系统之间的光收集(图35)。在传感器稀释100倍下，原始系统具有高噪声水平且RLuc2信号和GFP2信号两者都不可与噪声区分。相反，使用液体光导管，背景噪声水平实质上较低且截至接通系统之后约50秒，两个发射通道均可明确与噪声区分。截至在开始试剂泵送之后约200秒达成最大信号水平。应注意的是因为较新构造具有的BRET反应室体积比原始体积大4倍，所以在这个条件下多花费多达100秒来达成信号饱和。然而，可截至50秒检测与基线的差别。对于50倍稀释比率，观察到类似结果(结果未显示)。在改进的系统下，有可能在50倍和100倍稀释度下使用OGOR2检测分析物(图36)。
如果各微流体通道具有专用光检测器，那么如(图37)中所示的流程的流程是适合布置，其中各微流体通道与将光引导至一对光电倍增管或等效检测器中的分叉光导管对接。比较这个布置与分色镜显示它在另外类似条件下可具有更好光子检测效率和信噪比特征(图39)。
如果光导管(核心直径≥1.0mm)替代光纤(核心直径≤1.0)使用，那么难以获得适于光学检测系统在不同微流体通道之间的时间域转换的光学开关。在这个情况下，可使用快门框。适合光学构造的一实例显示于图38中。从多通道芯片收集的光被导向快门框且输出通过多分叉纤维束被引导至光学检测器中。快门位于多分叉纤维束的输入侧，从而允许软件选择通道的顺序和监测的持续时间。
一适合多分叉光导管布置显示于图40中。比较这个布置与通道特异性分叉光导管(图37)获得的结果指示相较于分叉光导管，分色滤光器产生在GFP通道中的信号高8倍以及在Rluc通道中的信号高6.6倍(图41)。在分色滤光器下，BRET2比率是4.67±0.07，而对于分叉布置，BRET2比率是3.85±0.25。
实施例7–适合阀和固态基光检测器的实例
极其广泛多种基于真空的且是固态的传感器可商购获得，所述传感器可与微流体芯片对接以测量通过BRET反应产生的光。图42说明使用传统真空管的高计数效率、高增益、低黑暗噪声组件。图43说明使用固态技术建构的高光子检测效率、高增益、低黑暗噪声组件。关于这两种方法的许多变化形式是可用的。
实施例8–实验和理论优化在微流体芯片中的扩散混合
层流条件可适于本发明中使用的具有典型尺寸的微流体芯片。在这个情况下，混合主要通过扩散来发生且可需要缓慢流动速率和长久滞留时间来接近完成。缓慢流动速率不合需要，因为它们导致开始检测一种或多种分析物的时间比其它情况减缓。这个限制可通过迫使湍流混合，使用例如更复杂微流体几何形状和/或脉动流动和/或微机械混合和/或声学和/或电动手段来克服。尽管可行，但所有这些方法都潜在涉及额外工程复杂性和花费。因此，发明者研究可增强层流环境中的扩散混合的简单被动设计特征。
实验设置
对于用染料进行的研究，发明者使用三进口微流体网络(图44)。凝血酶检测实验使用具有Y形几何形状的两进口微流体网络(图31a)。BRET反应室(未显示)的直径是2mm或4mm。所有微通道的尺寸都是200μm宽乘35μm深。在原始(并列)设置中，通道沿它们的垂直(35μm)侧彼此接触且被制造来具有长约28mm的蛇形混合区(图44)。在改进(扁平堆叠)设置(图45)中，两个输入通道是30μm深和600μm宽且堆叠在彼此的顶部上，通过它们的水平(600μm)侧接触以形成600μm宽和60μm深的线性共用通道。共用通道的长度是20mm。
对于染料实验，以抽取模式使用单一泵在每小时30-300μL的流动速率下从三个输入微通道抽取食品染料的溶液。对于凝血酶感测实验，我们使用与测试浓度的凝血酶预混合的12.5μM腔肠素A底物且泵送至Y形微通道的一个臂中。将如先前(Dacres等,2009b)所述制备的1μM基于BRET2的凝血酶生物传感器泵送至微通道的另一臂中。输入通道流动速率以每小时50-400μL变化。检测限被非正式地估计为在每小时50μL的输入试剂流动速率下，控制器可辨别BRET2比率变化所对应的最低凝血酶浓度。
结果
如图44中所示，使用并列构造，在对应于滞留时间2.35秒的高流动速率(共用通道流动速率＝每小时300μL)下，流动是分层的，且存在少许或不存在可观察混合。在对应于滞留时间23.5秒的较低流动速率(共用通道流动速率＝每小时30μL)下，流动仍然是分层的，但历经这个时期可检测到显著扩散混合。
计算滞留时间
i)对于每小时300μL的抽取流动速率和三输入端网络：
蛇形区域的体积是0.2mm x 0.035mm x 28mm＝>0.196μL。
共用通道中的流动速率是每小时300μL。
0.196/300＝6.53x 10–4小时＝2.352秒。
ii)对于每小时30μL的输入流动速率：
滞留时间长10倍，即23.52秒。
iii)对于并列堆叠：
蛇形区域的体积是0.2mm x 0.035mm x 28mm＝>0.196μL。共用通道中的流动速率是每小时100μL。
0.196/100＝1.96x 10-3小时＝7.056秒。
BRET反应室的体积(π12x 1mm3)＝3.14μL
流动速率是每小时100μL。3.14/100＝0.0314小时＝113秒
总滞留时间是120秒。
iv)对于扁平形堆叠：
通道的体积是0.6mm x 0.06x 20mm＝>0.72μL。通道中的流动速率是每小时100μL
0.72/100＝7.2x 10-3小时＝25.92秒
BRET反应室的体积(π22x1mm3)＝12.6μL
流动速率是每小时100μL。12.6/100＝0.126小时＝452秒。
总滞留时间是478秒或7分58秒。
凝血酶测定对次最优混合极其灵敏，因为分析物与传感器两者均是扩散系数缓慢的大分子且也因为在可检测信号之前凝血酶(kcat≈85s-1)必须通过蛋白水解裂解处理许多传感器且这会花费时间。
使用传统并列网络，在各输入臂中每小时50μl的流动速率下，可实时(120秒)观察的最低凝血酶浓度是540nM。使用扁平形堆叠网络，在相同流动速率(478秒滞留时间)下，可易于检测27nM凝血酶(图46)。检测到降至最低测试浓度14nM的凝血酶。在针对四倍滞留时间差异进行调整之后，对于扁平形堆叠，在检测较低浓度的凝血酶方面存在至少十倍益处。
发明者将这个改进归于在扁平形堆叠构造中扩散混合得以改进。因此，他们比较微流体通道的长度(在并列实例中28mm以及在扁平形堆叠实例中20mm)与为在这些不同构造中完全混合所需的理论距离。
计算为完全扩散混合所需的距离
L：通道长度(mm)
Q：体积流动速率(μl/h)或(mm3/s)
Q＝200μl/h＝200mm3/h＝0.055mm3/s
D：扩散系数(对于凝血酶)D＝4.1610-5mm2/s
U：通道中的平均速度(mm/s)＝Q/宽度x高度(通道横截面积)
X：在时期t内行进的扩散距离通过X2＝t D加以估计。
完全混合的X值取决于通道构造。在采用两输入通道构造下，对于并列设计，X是共用通道宽度的一半，且对于扁平形堆叠设计，X是通道高度的一半。
完全混合的滞留时间＝L/U＝X2/D＝>QX2/宽度x高度x D
因此：
1.当前(并列)设计，其中：
H(通道高度)＝34μm＝0.034mm以及
W(通道宽度)＝200μm＝0.2mm
L≈QW2/4WHD＝0.055mm3/s x 0.04mm2/4x 0.2mm x 0.034mmx 4.1610-5mm2/s＝＝1944mm
2.当前(扁平形堆叠)设计，其中：
H(通道高度)＝60μm＝0.060mm以及
W(通道宽度)＝600μm＝0.6mm
L≈QH2/4WHD＝0.055mm3/s x 3.610-3mm2/4x 0.6mm x 0.06mm x 4.1610-5mm2/s＝33mm
3.优化(扁平形堆叠)设计，其中：
H(通道高度)＝14μm＝14x 10-3mm以及
W(通道宽度)＝1200μm＝1.2mm
L≈QH2/4WHD＝0.055mm3/s x 19610-6mm2/4x 1.2mm x 1410-3mm x 4.1610-5mm2/s＝3.9mm
因此，并列堆叠在1944mm中仅提供28mm(即1.4％)为完全混合所需，而测试的扁平形堆叠布置在33mm中提供20(即61％)为完全混合所需。计算显示在微小额外变化下，将为可行的是进行布置以在7.7mm内(即小于当前设计中可用的长度的40％)达成完全扩散混合。
实施例9–对微流体网络设计和泵送布置的改进
其中连接于共用口的多个试剂输入通道的长度如例如图14中进行变化的微流体网络具有不良可靠性(结果未显示)，因为背压差异倾向于阻止在较长通道中的流动，从而使所有流动都定向通过较短通道。由于类似原因，这些设计也极其易受气泡阻塞。因此，发明者测试许多不同设计特征和泵送布置以提高多通道装置的可靠性。
成对对称微流体传感器的实验设置
在一个实例(图47)中，发明者设计具有两侧对称平行通道布局的网络以获得使用两种不同传感器的两个同时反应。这个布置可被复制来获得任何偶数个传感器通道。
结果
发明者说明使用食品着色染料在两个流动速率下在芯片上的流体流动(图48)。在流动速率150μl/h下，扩散混合是基本上完全的，而在1500μl/h下，输入物流基本上保持分开。
流动是连续的且甚至沿网络的两臂，且阻塞发生的频率小于在不对称设计下的频率。然而，如果气泡或其它阻塞驻留在两个平行臂的一个中，那么这个设计仍然易受堵塞或流动不均匀。因此，发明者研究用于驱动样本和试剂通过微流体网络的其它方法。
合乎需要的是各共用通道具有它的不与任何其它共用通道共用的自身专用压力源。这意味着如果网络中的背压由于任何原因而存在变化，那么流动不能被转向不同共用通道。不幸的是，当以正压模式操作时，观察这个原理将意味着各共用通道需要三个专用泵：一个各自用于传感器、底物和样本，从而导致系统具有复杂以及潜在昂贵的工程要求。一精致且优越的替代方案在于使用以抽吸(负性)模式操作的单一专用泵驱动试剂通过个别共用通道。这仅需要每个共用通道单一泵，如图49中所示。网络中由抽吸压力驱动的层流的品质是均匀且可靠的，如图44中所示。在最坏情况下，一个共用通道或通向它的微流体通道中的阻塞或部分堵塞仅影响那个传感器通道。
为各共用微流体通道(以及因此为各不同传感器)提供专用压力源的辅助益处是这允许独立于彼此以潜在不同流动速率以及因此速度与灵敏度之间的不同平衡同时操作多个传感器通道(图50)。这可能例如允许两个或更多个通道在不同流动速率下使用相同传感器以产生一定范围的不同检测限和时间常数。另一选项在于在针对各传感器优化的不同流动速率下以不同传感器操作若干通道。这个方案的一极端实例将在于以相同或不同样本在同一芯片上并行操作完全不同的传感器类型，如基于GPCR的挥发性传感器和蛋白酶传感器，且针对两个反应类别的极其不同反应动力学定制流动速率。也将可能的是使用如此处所述的抽吸泵送来支持同时在同一芯片上使用不同类型或稀释度的样本或底物化学。
使用抽吸模式可与在网络的进口侧上在简单一次性柱筒中提供试剂的概念完全相容。改变柱筒将允许使用相同基本硬件来简单且快速转换应用或靶标。另一优势是在抽吸模式下，对在各样本之间或在分析物检测之后将泵送装置去污的需要得以最小。
发明者进行并有来自实施例6的优选光收集和检测设置以及这个实施例的优选抽吸模式泵送和来自实施例2的基于BRET2的凝血酶传感器的另一实验。在这个实验中，我们使用具有尺寸是0.2mm x0.035mm x 28mm的蛇形共用通道的简单Y形微流体网络。BRET反应室是且高度1mm，从而产生3.14μL的体积。将来自反应室的光馈入四分支光纤束的一个分支中且从那里进入25.4mm(1英寸)直径光学块中以用专用分色滤光器和两个PMT进行同时双波长测量。芯片用缓冲液灌注且50μL输入储集器用50μL 1μM GTR凝血酶传感器和50μL 12.5μM腔肠素400a底物装载。在共用通道流动速率200μL/h＝0.055μL/s下，在出口处使用负压(抽吸模式)使流动开始。在这些条件下，BRET反应室滞留时间是57秒。
如图51中所示，在启动完成之后，系统在两个光学通道中以出色信噪比产生极其强烈信号(相较于图10a)。基于产生信号所处的速率和BRET反应室滞留时间，对于直径2mm的腔室，我们估计最小腔室高度300μm将仍然产生高于背景的可测量信号(图51c)。在指定流动速率下，这将对应于反应混合物积分时间约20秒。腔室直径4mm将潜在允许腔室高度降低至75μm，同时保留相同信号强度和反应混合物积分时间。
实施例10–本发明应用于饮料和其它流体的实例，包括预测 UHT奶的纤维蛋白溶酶腐败的预示实例
背景
本发明可易于应用于将溶解于水或水溶液中的任何分析物，包括将分配至水溶液中的挥发性化学品。已存在于水性液体，包括奶、果汁、其它饮料和体液(包括血清)中的分析物尤其可经受检测，因为在分析物测量之前无需初步气液分配。
这个领域中的应用的简单实例包括预测UHT奶的腐败。来自已通过UHT处理杀死的细菌的蛋白酶可在储存期间导致完全UHT奶以及脱脂UHT奶中的粘度增加、胶凝和苦味，由此导致保存期限受损。具体来说，纤维蛋白溶酶蛋白水解酪蛋白会导致UHT奶中的这些问题。通常使用的用于检测蛋白酶的测定是缓慢的且不足够灵敏来易于检测在环境温度下储存6–9个月或大于9个月之后，导致UHT奶腐败的极低水平的蛋白酶。本发明可以极大灵敏度且以实时方式测量UHT奶中的所述极低水平的纤维蛋白溶酶。它将可应用于在商业环境中进行线上监测。这将允许估计产品储存期限以及鉴定在包装之前对额外处理的任何需要。基于我们的先前用于凝血酶和卡斯帕酶(caspase)蛋白酶的BRET2传感器，我们将通过将靶标肽序列，优选赖氨酸-X(其中X＝赖氨酸、酪氨酸、缬氨酸或谷氨酸)并入BRET供体与接受体之间的接头中来构建用于检测奶中的纤维蛋白溶酶活性的生物传感器(图53)。这个传感器将被并入本发明的适于农场和工厂使用的形式中。然而，因为我们不易于在手边具有所述传感器，所以我们使用一些现存传感器(包括检测凝血酶的传感器)来说明使用我们的方法检测奶或实际上其它商业上或医学上重要的流体(如橙汁和哺乳动物血清)中的蛋白酶的可行性。
方法
在一个实验中，我们使用由Dacres等(2012)所述的与5μM腔肠素A一起1/125(即≈0.5μM)稀释于PBS中或全脂“Canberra Milk”牌奶、“Just Juice”复原橙汁和哺乳动物血液或血清的各种稀释液中的GFP2-FL1-RLuc2构建体。
在另一实验中，发明者使用与5μM腔肠素A一起1/100(≈0.5μM)稀释于凝血酶裂解缓冲液或奶、橙汁或血清的各种稀释液中的实施例1和2中所述的GTR基于BRET2的凝血酶传感器(其中RLuc被RLuc2替换(GFP2-RG-RLuc2(GTR2)))，即由Dacres等(2012)所述的构建体。通过以2个单位的外源性凝血酶外加样本以模拟内源性蛋白酶来评估凝血酶裂解奶、橙汁或血清的各种稀释液中的GTR2。从哺乳动物肝素化(250IU/ml)血液样本制备血清。为制备血清，使血液样本在室温下静置30分钟且接着在1,000-2,000x g下离心15分钟。上清液被指定为血清。当处理时，将血清样本维持在2-8℃下。所有实验都以100μL最终体积在微孔板中进行且如先前所述在Polarstar Optima微板读取器(BMG Labtech)中读取BRET2信号。
结果
使用GFP2-FL1-RLuc2的初步结果说明BRET2化学在用PBS 1/10稀释的全乳和橙汁的水性环境中良好起作用(图54)。图55显示全乳中的GFP2-FL1-RLuc2的BRET2信号的时间依赖性衰减。
使用GTR2的结果说明BRET2化学也在当于凝血酶裂解缓冲液中1/10稀释时的血清中起作用(图56和57)。相较于再混悬于单独凝血酶测定缓冲液中，当在凝血酶测定缓冲液中1/500(对于血清)、1/50(对于橙汁)和1/10(对于奶)稀释时，生物发光活性得以完全恢复(图56)。除于缓冲液中1/1000稀释之外，相较于缓冲液，所有血清稀释液的BRET2比率都较高(图57a)。当再混悬于橙汁中时，相较于单独缓冲液，当于缓冲液中1/10稀释时，BRET2比率较高，但对于所有其它稀释液而言都是一致值(图57b)。相较于所有其它奶稀释液，仅有再混悬于未稀释奶中的GTR2产生的BRET2比率高于再混悬于单独缓冲液中时(图57c)。
在奶和橙汁的1/10稀释液中检测到凝血酶活性(图58)。在血清中，血清样本于缓冲液中的1/100稀释液产生凝血酶活性。相较于未添加凝血酶的样本，产生凝血酶活性的所有稀释液都产生BRET2比率显著变化(P<0.0001)。在缓冲液中1/1000稀释的血清、1/100稀释的橙汁和1/100稀释的奶中的凝血酶活性导致的BRET2信号变化不显著不同(P>0.25)于在凝血酶裂解缓冲液中产生的BRET2信号变化。
实施例11-使用湿壁旋流器说明挥发物的气液转移
本发明的一个优势是它可应用于检测挥发性分析物。然而，因为传感器必须溶解或混悬于水溶液中，所以挥发性分析物必须在它们可用于接触传感器之前从气相分配至水溶液中。发明者着手说明用可与本发明相容的形式将挥发性化学品从空气转移至液体的可行性。存在可快速用于用水性基样本液体平衡环境空气或靶标顶部空间的许多方法，包括气体在液体中鼓泡或喷雾。然而，发明者选择湿壁旋流器来说明概念，因为适合设备可商购获得。
用于初始测试的实验设置
使用SASS2400湿壁旋流器(Research International)完成初始测试。内部风扇在40L/min下抽取空气且用1mL水使它平衡。为补偿蒸发，监测样本水位且从1300mL储集器补充去离子水。
将样本化学品放置在1.7-2mL eppendorf管中。在铝管道的80mm区段中钻孔以将管安装在SASS2400的进口中(类似于图59)。这些测试的取样时间包括风扇启动和样本液体填充时间。
方法
对于各测试都进行两次连续操作以得到总体积是2mL的样本。遵循氧气再吸收至去离子水中的时间动力学进行测试，所述去离子水已通过用氮气以及用乙醛和苯酚喷射来脱氧。用氧电极测量氧浓度。通过液体或气体色谱，相对于标准物来估计SASS2400样本流体中的挥发物浓度。
结果
取样器的湿壁作用使大面积的样本流体暴露于取样的空气流且在使氮气喷射的样本再充氧的方面极其高效(图60)。在可用这个设备测量的最早时间点，在约7秒内达成氧气饱和度80％且过程在不足60秒内完成。
在测量的最早时间点在SASS2400样本中检测到苯酚(图61)且随时间直至在60秒时的末个样本点以近似线性方式继续累积。
使用这个方案，在浓度递减下，在使用较长取样时间下，用乙醛获得的结果不可靠。发明者将此归于乙醛挥发性极大的性质以及它倾向于从样本储集器快速脱气。
改进的设备设置
为提高在早期时间点的实验时间分辨率，发明者改进设备以允许在SASS2400风扇达到速度且样本腔室已被填充之后输入空气流快速重定向，此花费多达约12秒，通常约9秒。
SASS2400中的风扇被设计来自装置周围的环境吸入空气。限制空气流通过狭窄或过度长度的管道可影响设计空气流40L/min且需要快速转换空气路径，以使取样时间一致(图63)。螺线管阀或蝶阀由于它们对空气流的影响而被视为较不理想。选择3通L口气动操作的球阀(BLS3L6B)以允许使进气从室内空气向室内空气加挥发性试样快速转换(图60)。所述阀与1”BSP配件连接以使空气流的缩窄最小且因为它是3通阀，所以所需的额外管道最少且所述阀可极其接近于SASS2400空气进口加以安装。所述阀通过双作用螺线管和连接于6巴空气供应源的12螺线管(ENS1275)来驱动。
微控制器电路控制螺线管阀的操作。操作时间可编程且被设置成15秒。无数字输出可从SAS2400获得来使微控制器同步，因此它是通过在SASS2400测试循环开始时启动的手动按钮来触发。3通阀的反应低于1秒。
由于挥发性样本的性质，所有测试都在通风橱中进行。试样不可简单地放置在接近3通阀的进口处，因为抽取至SASS2400中的试样浓度可已随通风橱中的任何空气流变化而变化。使11/4英寸pvc倒刺配件连接于螺线管的试样进口侧(图62)。在PVC配件的下侧上离距离螺线管最远的一端20mm钻凿用以安装2ml安全锁定锥形管的孔。归因于SASS2400中的风扇，在这个点处的空气流应恒定在40L/s下。将待测试的试样放置在移除盖子的1.7-2ml安全锁定锥形管中。在各测试开始时，填充锥形管直至上边缘。暴露于空气流的恒定表面积应确保在各测试循环内蒸发速率恒定。
改进的测试程序
所有实验都在通风橱中进行。使用个人防护设备，包括长衫、手套、鞋套和全脸面罩。
在加电和建立计算机连接之后，SASS2400被设置成运行20秒，在无样本暴露下仅从室内空气进行抽取以冲洗系统。螺线管和阀在这个阶段不工作。对螺线管和它的控制电路加电且运行螺线管阀的若干操作以确保空气压力足够用于阀的快速操作。
持续测试运行的持续时间将SASS编程。这是为初始风扇启动的取样加添加所需的暴露时间15秒，在所述时间期间，3通进气阀被从试样转换走。
将清洁8mL样本瓶放置在取样器前方的收集位置中。将0.6mL去离子水放置在准备在测试之后容纳样本的新的2ml样本小瓶中。记录温度、湿度和大气压。
从清洁2mL安全锁定管移除盖子。将苯酚试样放置在安全锁定管中，填充所述管尽可能靠近边缘，随后将所述管放置在安装孔中。对于液体试样，将管放置在它的安装孔中且接着用试样填充。注意确保将液体填充至试样管的边缘以使一致液体表面积暴露于空气流。
同时启动SASS2400和用于螺线管的延迟触发器。在15秒之后，使试样转换至SASS2400空气进口中。在取样时间结束时，关掉风扇且持续20秒将样本泵送至在SASS2400前方的8ml收集瓶中以确保所有样本都转移至样本瓶中。
在各测试循环结束时，SASS2400被编程来使内部蠕动泵运行20秒以将1mL测试样本转移至装配在SASS2400的前方的8ml瓶中。从收集瓶转移0.8mLl样本至分析小瓶中且另外0.6mL去离子水用于填充小瓶，随后将它密封并送去分析。持续取样时间5秒至600秒来操作针对乙醛和苯酚的测试且送去进行色谱分析。
使用新程序的结果
在仅15秒暴露于具有表面积的≈1克苯酚样本之后，SASS2400样本中的平均苯酚浓度是7.7μg/mL(即≈8ppm w/v)。苯酚是高度挥发性化合物的一实例，在20℃下的蒸汽压力＝0.474x 10–4大气压。即使在仅数秒暴露之后，样本小瓶中的乙醛浓度也超出尺度(即>>mg/L)，从而说明乙醛极其快速分配至水中。这些挥发性有机化合物的快速摄取和平衡说明在芯片上微流体检测之前，湿壁旋流器作为气液转移模块的可行性。
实施例12-开发的其它GPCR挥发性传感器
发明者先前描述通过将RLuc或RLuc2和GFP2结构域插入来自秀丽隐杆线虫的odr-10丁二酮受体的序列中来构建基于BRET2的丁二酮传感器。在酿酒酵母中表达这个传感器且制备粗膜混悬液并显示在基于板的测定中以及在以上实施例3中所述的微流体形式中以对丁二酮的精巧灵敏度和选择性起反应。然而，如所指示，本发明的一个优势是可同时操作多个微流体传感器通道以检测多个个别分析物，或在适当选择传感器下，提供复杂样本的化学指纹图谱。为使得能够达成此举，必须获得许多具有不同特异性的可相容挥发性传感器。因此，发明者选择来自秀丽隐杆线虫的五个其它推定化学受体cDNA作为新型基于BRET2的传感器的工程改造的起始点。发明者也构建str-113与str-114之间的嵌合体以说明获得作为天然存在的受体的合成分子杂交物，具有不可易于自天然存在的序列获得的潜在新型配体特异性的传感器的可行性。
SGSR是秀丽隐杆线虫str-112、str-113、str-114、str-115、str-116和str-114/113与分别插入第三细胞内环中和C末端处的BRET2标签GFP2和RLuc或RLuc2的嵌合体。使用来自“The BiologyWorkbench”(一种用于预测跨膜区段的基于网络的工具，http://seqtool.sdsc.edu)的算法“TMAP”预测STR蛋白的第三细胞内环的位置。这些嵌合体被命名为SGSR-112、SGSR-113、SGSR-114/113、SGSR-114、SGSR-115和SGSR-116。
用于设计和构建BRET 2 标记的秀丽隐杆线虫str气味受体的方法
除商业合成的SGSR-112之外，SGSR表达盒都是通过将多个限制位点引入相关基因特异性PCR引物中来设计和制备。将含有那些位点的PCR产物克隆至TOPO PCR载体(Invitrogen)中且接着用相应限制酶(RE)消化并连接至表达盒中。如果特定基因具有一个或多个由盒使用的RE位点，那么进行一些改变来适应它们。
str片段1的RE位点是NcoI(5’)和BspEI(3’)，对于GFP2是BspEI和SalI，对于str片段2是SalI和KpnI/EcoRI(因为EcoRI切割Str116片段2)，且对于海肾荧光素酶是KpnI/EcoRI和NotI。
通过修饰秀丽隐杆线虫SGSR-113(通过用str-114相应片段str-114-1替代str-113的使用盒中的限制位点NcoI和BspEI的第一片段113-1)来构建SGSR 114/113嵌合体。Str114-1含有对应于它的前240个氨基酸的前720个str-114核苷酸且通过使用在5’末端处并有限制位点NcoI且在3’末端处并有限制位点BspEI的引物进行高保真PCR来扩增。
通过限制消化和DNA测序来确认所有构建体都无错误。
GFP2Rluc标记的SGSR-112、SGSR-113、SGSR-114、SGSR-115、SGSR-116和SGSR-114/113受体的氨基酸序列分别提供为SEQ IDNO 13至18，而相应开放阅读框分别提供为SEQ ID NO 19至24。
用额外六个传感器的结果
在15℃下由半乳糖诱导72小时之后，所有SGSR酵母膜制备物都具有强烈GFP2和BRET2信号，且相较于单独LB培养基，当暴露于用OP50大肠杆菌细菌(秀丽隐杆线虫的食物来源)调节的培养基时，它们都显示BRET2比率变化。发明者选择许多特定挥发物(包括1-己醇、1丁醇、丁烷-2,3-二酮、3-羟基丁酮、2-戊酮和2壬酮)供基于对在LB上生长的OP50细菌的顶部空间的GC-MS分析来进一步测试。挥发性配体2-戊酮被测出针对这些传感器中的SGSR-112、SGSR-113和SGSR-114/113三者而言是阳性(图64)。这是首次在不存在基于用未修饰亲本GPCR进行的研究的先前配体认识下，已鉴定基于BRET的GPCR传感器的挥发性配体(或实际上任何配体)。说明BRET系统适用于使一般而言受体且具体来说秀丽隐杆线虫化学受体脱孤。
浓度-反应特征(图65)指示EC50可能在皮摩尔范围内。此举不仅简化以实施将新型挥发性传感器工程改造、脱孤和表征的方法，而且也说明至少在SGSR-112的情况下用于使亲本天然受体脱孤的可行方法，这是几乎20年来首次已达成脱孤。
BRET2标记的SGSR-114/113和SGSR-113传感器对一定范围的挥发性配体，包括醇和酮起反应(图64)。发明者鉴定SGSR-114/113的六个挥发性配体和SGSR-113的四个挥发性配体。SGSR-112对2-戊酮的反应历经从1×10-14M至1x 10-5M的9个对数单位是线性的，其中EC50是1.5×10-10M(1.3ppt)(图65)。这个广泛浓度依赖性与BRET2标记的ODR-10的也历经9个对数单位是线性的反应以及整个生物体的反应一致。
发明者定量SGSR-114/113体外对它的两个配体2-戊酮和丁二酮以及SGSR-113对1-己醇的敏感性(图66)。BRET2标记的Str114/113受体可检测千万亿分率(亚pM)水平的丁二酮和十亿分率(nM)水平的2-戊酮且Str-113受体可检测十亿分率(nM)水平的1-己醇。这些将是用于本发明中的特别适用的半广泛传感器。
用RLuc2构建BRET 2 标记的秀丽隐杆线虫气味受体
在使五个其它天然和一个嵌合BRET2标记的传感器脱孤(在基于板的测定中达成)之后，发明者将RLuc2突变并入它们的各者中。这是需要的，因为如上所述，RLuc2变体已显示光亮得多且因此为在微流体规模下实际使用所必需。
将BRET2组分插入秀丽隐杆线虫气味受体的第三细胞内环(IC3)中和C末端处，其中绿色荧光蛋白GFP2在IC3处，且海肾荧光素酶RLuc在蛋白质的C末端处。使用定点诱变，将RLuc2突变引入pYES-DEST-52 BRET2标记的气味受体序列中。引物1和2(表3)用于引入突变C124A且引物对3和4用于引入M185V突变。将RLuc2突变引入所有基于OGOR、Str-112、Str-113、Str-114、Str-114/113、Str-115和Str-116的传感器以及称为OGOR突变体的另一模式受体中，所述受体含有由Sengupta等(1996)鉴定的先前已显示对丁二酮无反应的原始odr-10突变(H110Y)。
GFP2Rluc2标记的OGOR、OGOR突变体、SGSR-112、SGSR-113、SGSR-114、SGSR-114/113、SGSR-115和SGSR-116受体的氨基酸序列分别提供为SEQ ID NO 25至32，而相应开放阅读框分别提供为SEQ ID NO 33至40。
本领域技术人员应了解的是可在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围下对如特定实施方案中所示的本发明做出众多变化和/或修改。因此，本发明实施方案在所有方面都应视为说明性而非限制性的。
本申请要求2012年4月16日提交的US 61/624,899和2013年4月12日提交的AU 2013204332的优先权，其两者的整个内容均以引用的方式并入本文。
本文论述和/或参照的所有出版物都整体并入本文。
对文件、法案、材料、装置、物品等的已包括在本说明书中的任何论述都仅出于提供本发明的情形的目的。不应视为认可的是任何或所有这些事项因为在本申请的各权利要求的优先日期之前存在而形成为先前技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的普通常识。
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Claims (85)

1.一种检测样本中的分析物的方法，所述方法包括
i)使以下各物流过包括一个或多个微通道的微流体装置，
a)所述样本，
b)包含结合所述分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
c)所述化学发光供体的底物，
ii)在所述装置中混合所述传感器分子、样本和底物，以及
iii)使用电光学感测装置检测所述化学发光供体对所述底物的修饰，
其中当所述分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述传感器分子未固定于所述装置。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述方法可用于实时检测所述分析物。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述传感器分子和所述底物通过不同微通道进入所述装置。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的所述福斯特距离是至少5.6nm。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的所述福斯特距离在约5.6nm与约10nm之间。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述分析物结合所述传感器分子或从所述传感器分子释放导致BRET比率变化≥15％的最大观察BRET比率。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中由所述电光学感测装置检测到的量子产率小于约8％、或小于约5％、或小于约2％。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述接受体结构域具有的斯托克斯位移在约50nm与约150nm之间。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述接受体结构域具有约100nm的斯托克斯位移。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其是在约1s至约100s内执行的。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述样本是液体、气体、乳液或混悬液。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述样本是已用气体预平衡的液体。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述混悬液是或包含无细胞提取物。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述混悬液包含细胞。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中穿过所述微流体装置的流动速率在约1μl/小时至约1.5ml/小时之间。
17.如权利要求16所述的方法，其中穿过所述微流体装置的所述流动速率在约200μl/小时至约1ml/小时之间。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述传感器分子包含如G偶联蛋白质受体的蛋白质受体，且在步骤ii)之后，所述传感器分子的浓度在约1nM至约10μM之间。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中穿过所述微流体装置的流动是连续流动、批式流动或停止流动。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述流动是通过以下一项或多项来进行：泵送、真空、水力、抽吸、电动、化学渗透、毛细管力、声学、电磁、压电学。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述混合是通过在垂直于穿过包含所述样本、传感器分子和底物的微通道的流动方向的维度上进行扩散来达成。
22.如权利要求21所述的方法，其中包含所述样本、传感器分子和底物的所述微通道的区段在5mm与100mm之间。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中各微通道具有约1μm2至约1mm2的横截面积。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中步骤iii)是在体积为约1pl至约200μl的反应室中进行。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括处理至少一个来自所述电光学感测装置的信号以确定所述分析物在所述样本中是不存在抑或是存在，并且如果存在，那么任选测定所述样本中的所述分析物的浓度。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中结合所述分析物的所述结构域是蛋白质或核酸。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述蛋白质是受体、气味结合蛋白、信息素结合蛋白、酶、配体载体或细菌周质结合蛋白。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述受体是G蛋白偶联受体。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述化学发光供体结构域是生物发光蛋白质。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述生物发光蛋白质是荧光素酶、β-半乳糖苷酶、内酰胺酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶或β-葡萄糖苷酶。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述荧光素酶是海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、腔肠动物荧光素酶、北美萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、苹绕实蝇(railroad worm)荧光素酶、细菌荧光素酶、长腹水蚤(Gaussia)荧光素酶、水母发光蛋白(Aequorin)、蕈蚊(Arachnocampa)荧光素酶或其任一个的生物活性变体或片段、或其两个或更多个的嵌合体。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述底物是荧光素、钙、腔肠素或腔肠素的衍生物或类似物。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述接受体结构域是荧光接受体结构域。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述荧光接受体结构域是蛋白质。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述荧光接受体结构域是绿色荧光蛋白(GFP)、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Venus、mOrange、Topaz、GFPuv、去稳定化EGFP(dEGFP)、去稳定化ECFP(dECFP)、去稳定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、海肾GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白或藻胆蛋白或其任一个的生物活性变体或片段。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述荧光接受体结构域是非蛋白质。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述荧光接受体结构域是Alexa Fluor染料、Bodipy染料、Cy染料、荧光素、丹磺酰、伞形酮、荧光微球体、发光微球体、荧光纳米晶体、海蓝(Marina Blue)、级联蓝(Cascade Blue)、级联黄(Cascade Yellow)、太平洋蓝(Pacific Blue)、俄勒冈绿(Oregon Green)、四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)、若丹明、得克萨斯红(Texas Red)、稀土元素螯合物或其任何组合或衍生物。
38.如权利要求29至37中任一项所述的方法，其进一步包括提供所述生物发光蛋白质的辅因子。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述辅因子是ATP、镁、氧、FMNH2、钙或其任何两个或更多个的组合。
40.如权利要求29至39中任一项所述的方法，其中
i)所述生物发光蛋白质是荧光素酶或生物活性变体或片段，和/或
ii)所述底物是荧光素、腔肠素或腔肠素的衍生物或类似物，和/或
iii)所述接受体结构域是绿色荧光蛋白(GFP)、Venus、mOrange或其任一个的生物活性变体或片段。
41.如权利要求40所述的方法，其中
i)所述荧光素酶是海肾荧光素酶，所述接受体结构域是GFP2，且所述底物是腔肠素400a，
ii)所述荧光素酶是海肾荧光素酶2，所述接受体结构域是GFP2，且所述底物是腔肠素400a，
iii)所述荧光素酶是海肾荧光素酶8，所述接受体结构域是GFP2，且所述底物是腔肠素400a，
iv)所述荧光素酶是海肾荧光素酶2，所述接受体结构域是Venus，且所述底物是腔肠素，
v)所述荧光素酶是海肾荧光素酶8，所述接受体结构域是Venus，且所述底物是腔肠素，
vi)所述荧光素酶是海肾荧光素酶8.6-535，所述接受体结构域是mOrange，且所述底物是腔肠素，或
vii)所述荧光素酶是海肾荧光素酶8，所述接受体结构域是mOrange，且所述底物是腔肠素。
42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其包括使用相同微流体装置同时或依序检测两种或更多种不同分析物。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括以下一个或多个集合：
a)三个输入微通道，每一个各自用于所述传感器分子、底物和样本，或
b)两个输入微通道，一个用于所述底物且另一个用于所述传感器分子和样本的预混合物，或
c)两个输入微通道，一个用于所述传感器分子且另一个用于所述底物和样本的预混合物。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中至少一个微通道包括体积与至少一个其它微通道不同的反应室。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中至少一个微通道包括两个或更多个具有相同或不同体积的反应室。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述电光学感测装置具有至少两个不同波长通道。
47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中所述传感器分子存在于无细胞提取物中。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中使所述分析物暴露在细胞的表面上且所述方法进一步包括使包含所述分析物的细胞转向穿过不同于所述样本中缺乏所述分析物的细胞的微通道。
49.一种用于检测样本中的分析物的微流体系统，所述系统包括
i)至少一个适于容纳包含结合所述分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子的储集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
ii)包括一个或多个微通道的微流体装置，
iii)用于在所述装置中混合所述传感器分子、所述样本和所述化学发光供体结构域的底物的部件，
iv)用于检测所述分析物与所述传感器分子的结合的反应室，和
v)电光学感测装置，
其中当所述分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
50.如权利要求49所述的系统，其中所述传感器分子未固定于所述装置。
51.如权利要求49或权利要求50所述的系统，其可用于实时检测所述分析物。
52.如权利要求49至51中任一项所述的系统，其中所述传感器分子和底物通过不同微通道进入所述装置。
53.如权利要求49至52中任一项所述的系统，其中所述微流体装置包括至少两个输入微通道，其中一个所述输入微通道用于使所述传感器分子流入所述装置中。
54.如权利要求49至53中任一项所述的系统，其中所述电光学感测装置包括至少两个不同波长通道。
55.如权利要求54所述的系统，其中所述电光学感测装置能够同时或快速连续地检测两个不同波长通道。
56.如权利要求55所述的系统，其中所述电光学感测装置能够在小于1秒内检测两个不同波长通道。
57.如权利要求49至56中任一项所述的系统，其中所述微流体装置被设计成使得能够检测两种或更多种分析物。
58.一种分类样本的方法，所述方法包括
i)使以下各物流过包括一个或多个微通道的微流体装置，
a)所述样本，
b)包含结合一种或多种分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
c)所述化学发光供体的底物，
ii)在所述装置中混合所述传感器分子、样本和底物，
iii)使用电光学感测装置检测所述化学发光供体对所述底物的修饰，
iv)处理至少一个来自所述电光学感测装置的信号并使电光学反应的样式与一种或多种目标样本的一种或多种预定特征相关联，以及
v)基于所述反应样式的相关性分类所述样本，
其中当所述一种或多种分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
59.如权利要求58所述的方法，其包括两种或更多种不同传感器分子，所述传感器分子各自结合不同分析物或分析物范围，且步骤v)包括基于各所述分析物或分析物范围的存在、不存在或浓度来分类所述样本。
60.如权利要求58或权利要求59所述的方法，其中一种或多种所述分析物是未知的。
61.如权利要求58至60中任一项所述的方法，其可用于实时分类所述样本。
62.如权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述传感器分子未固定于所述装置。
63.如权利要求58至62中任一项所述的方法，其中所述传感器分子和底物通过不同微通道进入所述装置。
64.一种用于分类样本的微流体系统，所述系统包括
i)至少一个适于容纳包含结合一种或多种分析物的结构域、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子的储集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
ii)包括一个或多个微通道的微流体装置，
iii)用于在所述装置中混合所述传感器分子、所述样本和所述化学发光供体结构域的底物的部件，
iv)用于检测所述分析物与所述传感器分子的结合的反应室，和
v)电光学感测装置，
其中当所述一种或多种分析物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
65.如权利要求64所述的系统，其包括两种或更多种不同传感器分子，所述传感器分子各自结合不同分析物或分析物范围。
66.如权利要求64或权利要求65所述的系统，其中一种或多种所述分析物或分析物范围是未知的。
67.如权利要求64至66中任一项所述的系统，其可用于实时分类样本。
68.如权利要求64至67中任一项所述的系统，其中所述传感器分子未固定于所述装置。
69.如权利要求64至68中任一项所述的系统，其中所述传感器分子和底物通过不同微通道进入所述装置。
70.如权利要求64至69中任一项所述的系统，其中所述微流体装置包括至少两个输入微通道，其中一个所述输入微通道用于使所述传感器分子流入所述装置中。
71.一种筛选结合目标分子的化合物的方法，所述方法包括
i)使以下各物流过包括一个或多个微通道的微流体装置，
a)候选化合物，
b)包含所述目标分子、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子，其中在存在和/或不存在所述候选化合物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
c)所述化学发光供体的底物，
ii)在所述装置中混合所述传感器分子、所述候选化合物和底物，
iii)使用电光学感测装置检测所述化学发光供体对所述底物的修饰，
v)处理至少一个来自所述电光学感测装置的信号以确定所述候选化合物是否结合所述传感器分子，以及
vi)如果化合物结合所述传感器分子，那么选择所述化合物，
其中当所述候选化合物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
72.如权利要求71所述的方法，其可用于实时检测所述候选化合物与所述传感器分子的结合。
73.如权利要求71或权利要求72所述的方法，其中所述传感器分子未固定于所述装置。
74.如权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述传感器分子和底物通过不同微通道进入所述装置。
75.一种用于筛选结合目标分子的化合物的微流体系统，所述系统包括
i)至少一个适于容纳所述目标分子、化学发光供体结构域和接受体结构域的传感器分子的储集器，其中在存在和/或不存在候选化合物下，所述化学发光供体结构域和所述接受体结构域的间隔和相对定向在±50％福斯特距离内，
ii)包括一个或多个微通道的微流体装置，
iii)用于在所述装置中混合所述传感器分子、所述候选化合物和所述化学发光供体结构域的底物的部件，
iv)用于检测所述候选化合物与所述传感器分子的结合的反应室，
v)电光学感测装置，
其中当所述候选化合物结合所述传感器分子时，所述化学发光供体结构域相对于所述接受体结构域的空间位置和/或偶极定向被改变。
76.如权利要求75所述的系统，其可用于实时检测所述候选化合物与所述传感器分子的结合。
77.如权利要求75或权利要求76所述的系统，其中所述传感器分子未固定于所述装置。
78.如权利要求75至77中任一项所述的系统，其中所述传感器分子和底物通过不同微通道进入所述装置。
79.如权利要求75至78中任一项所述的系统，其中所述微流体装置包括至少两个输入微通道，其中一个所述输入微通道用于使所述传感器分子流入所述装置中。
80.一种检测样本中的分析物的方法，所述方法包括
i)在腔肠素存在下使所述样本与传感器分子接触，所述传感器分子包含
a)结合所述分析物的结构域，
b)海肾荧光素酶，和
c)绿色荧光蛋白2，以及
ii)确定所述生物发光蛋白质与所述接受体分子之间的生物发光共振能量转移(BRET)是否改变，
其中当所述分析物结合所述结构域时，所述生物发光蛋白质相对于所述接受体分子的空间位置和/或偶极定向被改变。
81.一种分离的传感器分子，其包含结合一种或多种分析物的结构域、海肾荧光素酶和绿色荧光蛋白2。
82.一种检测样本中的2-戊酮的方法，所述方法包括
i)使所述样本与作为秀丽隐杆线虫str-112(SEQ ID NO:41)或str-113(SEQ ID NO:42)的多肽或其结合2-戊酮的变体接触，以及
ii)检测任何所述多肽是否结合于2-戊酮。
83.如权利要求82所述的方法，其中str-113的所述变体是str-114/str-113融合物(SEQ ID NO:43)。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述多肽经过可检测标记。
85.一种检测样本中的细菌的方法，其包括使用如权利要求82至84中任一项所述的方法检测2-戊酮。
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