CN104380084A

CN104380084A - 超灵敏传感器

Info

Publication number: CN104380084A
Application number: CN201380029548.2A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·Y·周; 周梁成
Original assignee: Princeton University
Current assignee: Princeton University
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2015-02-25
Also published as: EP2836821B1; EP2836821A4; JP6301311B2; JP2015514225A; RU2014144947A; WO2013154770A1; EP2836821A1; CA2868928A1; AU2013246359B2; AU2013246359A1

Abstract

本公开尤其提供一种纳米传感器，其包括基底和一个或多个从所述基底表面延伸的立柱，其中所述立柱包括金属点结构、金属盘和金属底板。所述纳米传感器包含覆盖所述金属点结构、金属盘和/或金属底板的至少一部分的分子粘附层以及结合所述分子粘附层的捕获剂。当分析物特异性结合捕获剂时，所述纳米传感器放大来自所述分析物的光信号。

Description

超灵敏传感器

交叉引用

本申请要求2012年4月10日提交的美国临时申请序列号61/622,226的权益，该临时申请出于所有目的以引用的方式并入本文。

关于联邦政府赞助研究的声明

本发明在美国政府支持下进行，由国防高等研究计划局(DARPA)授予的批准号为FA9550-08-1-0222，美国政府享有本发明的某些权力。

背景

存在对增强生物和化学测定的冷光信号(例如，荧光信号)和检测灵敏度的巨大需要。本申请涉及微观/纳米结构和分子层以及用于实现增强(即冷光的放大和检测灵敏度的提高)、其制造和应用的方法。

概述

本公开尤其提供一种纳米传感器，其包括基底和一个或多个从所述基底表面延伸的立柱，所述立柱具有在立柱侧壁上的金属点结构、在所述立柱顶部的金属盘以及覆盖所述立柱底部附近较大区域的金属底板。所述纳米传感器进一步包括覆盖所述金属点结构和/或金属盘和/或金属底板的至少一部分并且结合捕获剂的分子粘附层。所述纳米传感器用特异性捕获目标分析物(例如，可为蛋白质或核酸的分子)的捕获剂涂覆。所述分析物可为直接或间接光学标记的。在间接标记中，具有光标签的第二捕获剂(即，标记的检测剂)用于结合捕获的分析物并因此确定捕获的分析物的存在。当分析物结合捕获剂时，纳米传感器放大来自分析物的光信号。

附图简述

熟练技术人员将理解，以下所述附图仅出于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。一些附图并未按比例绘制。

图1图A和图B示意性示出主题纳米装置的实施方案的一些特征。图C示意性示出其中可制造主题纳米装置的一种方式。

图2示意性示出一种示例性系统。

图3示意性示出一种示例性自组装单层。

图4示意性示出一种示例性抗体检测测定。

图5示意性示出一种示例性核酸检测测定。

图6示意性示出另一种核酸检测测定实施方案。

图7盘连接立柱点天线阵列(D2PA)板和免疫测定。(a)没有免疫测定D2PA板的示意图(整体图和横截面图)。D2PA具有其中带有密集等离子体振子纳米点的密集三维(3D)共振腔纳米天线(由周期性非金属立柱顶部的金盘和立柱足上的金底板形成)，并且将金属部件连接至纳米间隙。(b)D2PA上的免疫测定的示意图，其由粘附层的自组装单层(SAM)、蛋白质-A(作为捕获层)和用IRDye-800cw预标记的人-IgG(作为预标记的生物标志物)组成。(c)具有200nm周期的D2PA的扫描电子显微照片(SEM)(整体图和横截面图)。清楚地观察到静置于硅石纳米立柱侧壁上的金纳米点。

图8在免疫测定沉积(蓝线)和不沉积(红线)的情况下的D2PA的测量的吸收光谱。在进行和不进行免疫测定的情况下，峰吸光度分别为98％和97％并且共振峰宽为165nm和145nm。免疫测定的沉积从795nm至788nm稍微蓝色偏移吸收峰并且增宽吸收波长范围

图9分别用通过D2PA(红线)和玻璃板(蓝线，放大1000倍以在给定标度下为可见的)上的测定捕获的IRDyeg00CW标记的人-IgG的测量的面积平均荧光强度光谱。与玻璃板上的测定相比，平均荧光增强(虚线)在荧光峰波长(800nm)下为7,440倍并且当平均值超过FWHM荧光时为7,220倍。等离子体振子荧光增强因子(EF)光谱具有比荧光光谱宽得多的FWHM，这与观察到的D2PA等离子体振子共振光谱相一致(图5)。

图10在大面积上的荧光增强的测量的均匀度。(a)在D2PA的总计5mm×5mm区域上的测量的免疫测定荧光增强(因子)图。所述图具有总计2,500个方块(50×50)，通过使用100μm×100μm的每个方块面积(即激光探测面积)和100μm的分步重复距离来测量。(b)测量的增强因子的对应直方图给出±9％的高斯分布变化。

图11蛋白质A和IgG的模型直接测定。荧光强度对比D2PA(方块)和玻璃板参考(圆圈)上的IgG浓度。方块和圆圈为测量的数据，并且曲线为使用五参数逻辑回归模型以允许推断测量的数据点之间的数据点的拟合曲线。发现D2PA和玻璃板的检测限(LoD)分别为0.3fM和0.9nM，得到3,000,000倍的LoD增强。D2PA上的免疫测定的示意图，其由粘附层的自组装单层(SAM)、蛋白质-A(作为捕获层)和用IRDye-800cw预标记的人-IgG(作为预标记的生物标志物)组成。

图12在D2PA板上的IRDye800CW标记的IgG的单个分子荧光。(a)在具有10^-10M IgG浓度的D2PA板上的50μm×50μm面积的蛋白质A/IgG免疫测定的2D荧光图。不同“亮斑”为可见的。以及(b)荧光对比单个亮斑的时间。二元逐步行为指示，荧光来自位于D2PA热点(大电场位置)的单个染色分子。与玻璃参考上的免疫测定相比，在热点处的单个分子荧光增强4×10⁶倍。

图13.在D2PA板上的PSA免疫测定。实验数据使用5-参数逻辑模型(实曲线)拟合，以便计算LoD。在D2PA上获得LoD约10aM。与LoD为0.9pM的玻璃板相比，D2PA的灵敏度要好90,000倍。(Chou组，待公布)

图14在D2PA板上的CEA免疫测定。类似构造用作PSA免疫测定。对于迄今为止的初步试验，我们设法获得LoD约28aM。一旦我们设法提高信噪比，就预期更好的灵敏度(较低LoD)。(Chou组，待公布)

图15在D2PA板上的CA15.3免疫测定。类似构造用作PSA免疫测定。对于迄今为止的初步试验，我们设法获得LoD约0.01U/mL。一旦我们设法提高信噪比，就预期更好的灵敏度(较低LoD)。(Chou组，待公布)

图16为示出尖峰浓度与观察到的浓度之间的相关性的两张图表。

图17为示出两种抗体之间的交叉反应性的两张图表。

图18为示出结果的再现性的两张图表。

图19示出DNA杂交测定结果和它的示意图。

图20示出一系列扫描电子显微照片。

图21示意性示出一个替代实施方案。

相应的附图标号指示贯穿附图的若干图中的相应部分。应理解，附图用于示出本公开所阐述的概念并且未按比例绘制。

在详细解释本发明的任何实施方案之前，应理解的是，本发明的应用不限于在以下描述中阐述或附图中说明的部件的构造细节和布置细节。

定义

在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下定义以说明和限定描述中所用术语的含义和范围。

术语“分子粘附层”是指限定厚度的分子的一个或多个层，其包括连接至纳米装置的内表面和可结合捕获剂的外(外部)表面。

术语“捕获剂反应基团”是指在分子中与捕获剂反应的化学官能团的一部分，即可与捕获剂的一部分(例如，羟基、巯基、羧基或氨基)反应以产生稳定牢固的(例如)共价键。

如本文所用术语“捕获剂”是指通过足以允许试剂结合来自不同分子的非均匀混合物的靶分子并且使所述靶分子浓缩的相互作用来结合目标分析物的试剂。结合相互作用通常通过捕获剂的亲和力区域介导。典型的捕获剂包括可特异性结合目标分析物的任何部分。某些捕获剂特异性结合具有小于约10^-6M(例如，小于约10^-7M、小于约10^-8M、小于约10^-9M、小于约10^-10M、小于约10^-11M、小于约10^-12M、低至10^-16M)的解离常数(K_D)的靶分子而没有显著结合其它分子。示例性捕获剂包括蛋白质(例如，抗体)和核酸(例如，寡核苷酸、DNA、RNA，包括适体)。

术语“特异性结合”和“选择性结合”是指捕获剂偏好结合存在于不同靶分子的非均匀混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用将区别样品中希望的(例如，活性)和不希望的(例如，非活性)靶分子，通常大于约10倍至100倍或更大(例如，大于约1000倍或10,000倍)。

术语“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，即大于2个氨基酸、大于约5个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基酸，通常不大于约10,000个氨基酸，这可包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸以及具有修饰的肽主链的多肽。所述术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白，具有或没有N-末端甲硫氨酸残基；免疫标记蛋白；具有可检测融合配体的融合蛋白，例如包括作为融合配体的荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等的融合蛋白；等等。这些术语还包括在细胞中翻译后修饰(例如，糖基化、裂解、分泌、异戊二烯化、羧酸化、磷酸化等)的多肽、以及具有二级结构或三级结构的多肽和牢固结合(例如，共价或非共价)其它部分(例如，其它多肽、原子、辅因子等)的多肽。

术语“抗体”意图是指免疫球蛋白或其任何片段，包括能够抗原结合和噬菌体展示抗体的单链抗体)。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中互换用于描述由核苷酸例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的任何长度的聚合物，或者合成产生(例如，如美国专利号5,948,902和在此引用的文献所述的PNA)的化合物，所述化合物可以类同于两个天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在核酸杂交，例如，可参与沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对相互作用。

如本文所用术语“互补”是指碱基对通过氢键结合目标目标核酸的核苷酸序列。在典型沃森-克里克碱基配对中，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶由尿嘧啶(U)置换。因此，A与T互补并且G与C互补。通常，“互补”是指与目标目标完全互补以使得序列中的每个核苷酸与目标核酸的对应位置中的每个核苷酸互补的核苷酸序列。当核苷酸序列与非目标序列不完全互补(100％互补)但由于核苷酸序列与非目标序列的某些伸展的互补性而仍可与非目标序列碱基配对时，可计算互补百分比以评定非特异性(偏离目标)结合的可能性。通常，50％或更少的互补不会导致非特异性结合。此外，70％或更少的互补可在严格杂交条件下不导致非特异性结合。

如本文所用术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸组成的聚合物。

如本文所用术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。

如本文所用术语“寡核苷酸”指示从约10至200个核苷酸和高至300个核苷酸长度或更长，例如高至500个核苷酸长度或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可为合成的并且在某些实施方案中，为小于300个核苷酸长度。

如本文所用术语“连接”是指一个分子与另一个分子的牢固、例如共价或非共价的结合接合。

如本文所用术语“表面连接”是指牢固连接至表面的分子。

如本文所用术语“样品”涉及包含一种或多种目标分析物的材料或材料的混合物。在具体实施方案中，样品可从生物样品例如细胞、组织、体液和粪便中获得。目标体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血液(例如，全血、分离的血液、血浆、血清等)、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜粘液(chime)、内淋巴液、外淋巴液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、黏液(包括鼻排出物和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓汁、发炎性分泌物、唾液、皮脂(皮肤油脂)、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿以及呼气冷凝物。在具体实施方案中，样品可从受试者例如人体内获得，并且它可在用于受试者测定中之前进行处理。例如，在分析之前，蛋白质/核酸可从使用之前的组织样品中提取，用于此的方法为已知的。在具体实施方案中，样品可为临床样品，例如从患者中收集的样品。

术语“分析物”是指可通过捕获剂结合并且检测的分子(例如，蛋白质、核酸或其它分子)。

术语“测定”是指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。

如本文所用术语“确定”、“测量”和“评定”以及“测定”可互换使用并且包括定量测定和定性测定二者。

如本文所用术语“发光标签”是指当处于外部激发下时可发光的标签。这可为冷光。荧光标签(包括染料分子或量子点)和冷光标签(例如，电子或化学冷光标签)为发光标签类型。外部激发为用于荧光的光(光子)、用于电致冷光的电流和用于化学发光的化学反应。外部激发可为以上的组合。

短语“标记的分析物”是指用发光标签可检测地标记以使得分析物可通过评定标签的存在来检测的分析物。标记的分析物可为直接标记的(即，分析物自身可通过牢固键、例如共价键或非共价键与标签直接缀合)，或者标记的分析物可为间接标记的(即，分析物通过直接标记的第二捕获剂结合)。

术语“杂交”是指核酸通过沃森-克里克碱基配对与互补核酸特异性结合。因此，术语“原位杂交”是指核酸与中期或间期染色体特异性结合。

关于核酸的术语“杂交”和“结合”可互换使用。

术语“捕获剂/分析物复合物”为由捕获剂与分析物特异性结合引起的复合物。捕获剂和用于捕获剂的分析物通常将在“特异性结合条件”或“适用于特异性结合的条件”下彼此特异性结合，其中此类条件为允许结合发生于在溶液中结合的捕获剂与分析物之间的那些条件(就盐浓度、pH、去垢剂、蛋白质浓度、温度等而言)。此类条件，特别是关于抗体及其抗原和核酸杂交的此类条件为本领域已知的(参见，例如，Harlow和Lane(Antibodies：A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)以及Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第5版，Wiley&Sons，2002)。

如本文所用术语“特异性结合条件”是指产生包含彼此特异性结合的分子对的核酸双链体或蛋白质/蛋白质(例如，抗体/抗原)复合物同时不利于在不会彼此特异性结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件为杂交和洗涤条件二者的总和或组合(总体)并且如果需要可包括洗涤和封闭步骤。

对于核酸杂交，特异性结合条件可通过在42℃下在溶液：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖以及20μg/ml变性的剪切的鲑鱼精DNA中孵育，随后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤过滤来实现。

对于抗体与抗原的结合，特异性结合条件可通过在封闭液(例如，具有3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭包含抗体的底物，随后在稀释的封闭液中用包含分析物的样品孵育来实现。在此孵育之后，在洗涤溶液(例如，PBS+TWEEN 20)中洗涤底物并且用第二捕获抗体(检测抗体，它识别抗原中的第二位点)孵育底物。第二捕获抗体可与光可检测标签例如荧光团如IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800缀合。在另一次洗涤之后，可检测结合的第二捕获抗体的存在。本领域技术人员会知道可进行改变以增加检测的信号并减少背景噪声的参数。

术语“第二捕获剂”也被称为“检测剂”，是指对抗原具有高特异性亲和力的一组生物分子或化学化合物。第二捕获剂可牢固连接至光可检测标签，例如，酶、荧光标签，或者其自身可通过经由生物缀合连接至光可检测标签的另一种检测剂检测(Hermanson，“Bioconjugate Techniques”Academic Press，第2版，2008)。

术语“生物素部分”是指亲和剂，其包括生物素或生物素类似物，如脱硫生物素、氧化生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等。生物素部分以至少10-8M的亲和力结合链霉抗生物素蛋白。生物素亲和剂还可包括接头，例如，-LC-生物素、-LC-LC-生物素、-SLC-生物素或-PEGn-生物素(其中n为3-12)。

术语“链霉抗生物素蛋白”是指链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白二者，以及以高亲和力结合生物素的其任何变体。

术语“标志物”是指其在生物样品中的存在或丰度与疾病或病状相关的分析物。

术语“键”包括共价键和非共价键，包括氢键、离子键以及通过范德华(van der Waal)力产生的键。

术语“放大”是指信号数量增加，例如信号至少10倍增加、至少100倍增加、至少1,000倍增加、至少10,000倍增加或者至少100,000倍增加。

其它特异性结合条件为本领域已知的并且也可用于本文。

必须应注意，除非上下文另外明确地规定，否则本文中和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物，例如在使用单词“单个”时。例如，提及“分析物”包括单个分析物和多种分析物，提及“捕获剂”包括单个捕获剂和多种捕获剂，并且提及“检测剂”包括单个检测剂和多种检测剂。

示例性实施方案详述

以下详述通过举例的方式而不是通过限制的方式阐述本发明的一些实施方案。

参照图1A和图1B，本文公开纳米装置100，其包括：(a)基底110；以及(b)一个或多个从所述基底表面延伸的立柱115，其中所述立柱中的至少一个包括立柱体120、所述立柱顶部的金属盘130、所述立柱底部的金属底板150，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的所述基底表面的大部分；设置在所述立柱侧壁上的金属点结构130以及覆盖所述金属点结构和/或所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分的分子粘附层160。此装置中的底层结构被称为“盘连接立柱点天线阵列(D2PA)”并且实例为已描述的那些(参见，例如，Li等OpticsExpress 2011 19，3925-3936以及WO2012/024006，它们以引用的方式并入)。

分子粘附层160的外表面包含捕获剂反应基团，即可与捕获剂化学反应的反应基团，例如胺反应基团、硫醇反应基团、羟基反应基团、咪唑基反应基团以及胍基反应基团。出于说明目的，分子粘附层160覆盖金属点结构160、金属盘130和金属底板150的所有暴露表面。然而，出于实用目的，粘附层160仅需要覆盖金属点结构160、金属盘130和金属底板150的暴露表面的一部分。如图所示，在某些情况下，基底110可由电介质(例如，SiO₂)制成，尽管也可使用其它材料，例如，硅、GaAs、聚二甲硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。同样地，金属可为金、银、铂、钯、铅、铁、铅、镍、铜、铝、其合金或其组合，尽管也可使用其它材料，只要材料的等离子体频率高于光信号和用于产生光信号的光的等离子体频率。

纳米装置100的特征在于，它放大粘附层外表面近端的光信号。

在一些实施方案中，立柱的一个或多个零件的尺寸或者两个部件之间的距离可为小于放大的光的波长。例如，立柱体120的横向尺寸、立柱体120的高度、金属盘130的尺寸、金属点结构140之间的任何间隙之间的距离、金属点结构140与金属盘130之间的距离可小于放大的光的波长。如图1A所示，立柱可以阵列形式布置于基底上。在特定情况下，最近的立柱阵列可由小于光的波长的距离间隔。立柱阵列可为周期性的和非周期性的。

纳米装置可设置在容器内，例如多孔板的孔内。纳米装置还可为多孔板的孔的底部或壁。纳米装置可设置在微流体通道(1至1000微米的通道宽度)或者纳米流体通道(通道宽度小于1微米)内或为此类通道的内壁的零件。

如以下将更详细描述的(并且如图1C所示)，主题纳米装置100可通过涂覆所谓“盘连接立柱点天线阵列”200(即，“D2PA”来制造，所述纳米装置100基本上由基底110和多个立柱组成，所述立柱包括立柱体120、具有分子粘附层160的金属盘130、金属底板150以及金属点结构140。可用于主题纳米装置中的示例性D2PA的详述提供于WO2012/024006中，所述专利出于公开的所有目的以引用的方式并入本文。

以下所附描述的第一部分描述底层D2PA结构的某些特征件(即，基底、立柱体、金属盘、金属底板和金属点结构)。以下所附描述的第二部分描述分子粘附层、捕获剂以及其中可采用主题纳米传感器的测定。

盘连接立柱点天线阵列(D2PA)

盘连接立柱点天线阵列具有带有连接至立柱体上的纳米级金属点的浮动金属盘或纳米盘的3D等离子体振子腔天线。确切地说，在一些实施方案中，所述D2PA具有基底、所述基底上的立柱阵列、每个立柱顶部的金属盘或纳米盘、立柱侧壁上的纳米级金属点(在所述盘与一些点之间具有间隙、在相邻点之间具有间隙)以及覆盖没有被立柱占据的大部分基底区域的金属底板。

在一个实施方案，立柱阵列在由硅形成的基底上由SiO₂制造为具有200nm间距、130nm高度和70nm直径。金属底板可由40nm厚的金层形成，沿着正常方向使用e-束蒸发使其沉积于立柱阵列结构和基底上。沉积过程在每个SiO₂立柱顶部形成金的金属盘同时在硅基底表面上形成金纳米孔金属底板。每个盘具有40nm厚度和约110nm的直径。在蒸发过程期间，以约0.4A/s的沉积速度，金原子扩散到SiO₂立柱的侧壁中并且聚集到粒度为10nm与30nm之间的随机颗粒中，从而形成纳米级金属点。

具有金纳米盘、随机金纳米颗粒金属点以及底部金纳米孔板(底板)的基底通过蒸发过程形成。金纳米颗粒分散在SiO₂立柱的侧壁上以形成纳米级金属点，在它们之间具有约0.5nm至20nm的窄间隙，这可感应高度增强的电场。如本文所用术语“间隙”被定义为两个结构之间的最小间隔，例如两个盘之间的最小间隔或盘与相邻点结构之间的间隔。还应指出，即便点的一部分与另一个点接触，仍存在通过本结构实现的增强作用，因为在其它位置中的相邻结构之间存在其它间隙。

D2PA结构可通过等离子体共振和纳米天线来增强光吸收。结构可通过盘与纳米点之间的纳米间隙以及纳米点本身之间的纳米间隙(140)增强局部电场，并且通过在所述盘与底板之间形成的垂直腔(用于光)以及通过盘阵列形成的横向腔进行帮助。

更确切地说，结构可通过纳米立柱阵列增强光吸收，并且可通过这些结构增强光信号从表面反射。它可具有增强的垂直腔光吸收作用，这经由所述盘通过所述点和所述底板增强光吸收来形成。它还可具有通过金属底板增强光吸收的横向腔光吸收作用。本领域技术人员将认识到，任何特定D2PA结构可具有这些功能中的一个、若干个或所有，这取决于结构的特定构造，包括立柱阵列中的间隔、立柱的大小、盘的大小、点的大小以及所采用的材料。

通过结构增强光信号将通过结构特征件之间的纳米间隙、等离子体共振、天线吸收、天线辐射、垂直腔以及横向腔的增强来实现。D2PA结构的元件和功能可从不同角度查看。盘和盘与相邻金属点之间以及点自身之间的间隔间隙可影响通过结构提供的局部电场增强。每个立柱体上的点位置和点数目也可增强局部电场。每个立柱的直径和每个压盖盘的直径可影响等离子体共振频率。二氧化硅立柱高度可影响腔长度和纳米间隙数目并且还可影响盘和金底板的连接。每单位区间的立柱数目可影响活性区域，并且立柱阵列中的间距(间隔)可影响光的相干吸收和辐射。金底板可影响天线和腔，并且立柱形状可决定光依赖性吸收。

在结构内，可“调整”多个变量以增强信号。例如，盘的直径和立柱的形状可发生改变以改变等离子体共振频率，金属点将影响局部信号增强，也影响盘至点间隙、点位置以及每个立柱体上的点计数；立柱高度将影响共振腔长度和存在的纳米间隙数目，以及盘与金属底板之间的连接作用。在结构表面上每单位区间的立柱总数限定活性区域，并且立柱间隔(间距)影响光能的相干吸收和辐射。最后，金属底板材料和厚度涉及天线和腔的作用。本领域普通技术人员将认识到，可在需要时改变来自本文所示的示例性实施方案的这些变量中的每一个，以获得具有所需特征或“调整”来实现特定增强的结构100，而不背离本发明的范围。

设想所述结构的多种构造。例如，D2PA的结构可在金属底板下具有SiO₂层并且所述层连续地形成立柱。可选地，D2PA具有没有孔的金属底板，以使得立柱直接形成于底板材料上，这进而沉积于底层基底的SiO₂层上。

当构建本公开的D2PA结构时，用于底层基底的材料可为绝缘体、半导体或电介质绝缘体。基底不需要为单件式的，而可为层压结构，其包括绝缘体或半导体材料顶层(邻近立柱的层)，同时基底的其余部分由任何固体材料制成。

基底顶层上的立柱体可由绝缘材料形成，但可为半导体。用于形成立柱的示例性材料为电介质：二氧化硅、氮化硅、氧化铪(HfO)、氧化铝(AIO)或半导体：硅、GaAs以及GaN。一旦形成，立柱就可具有侧壁，所述侧壁为柱状(直的)、倾斜的、弯曲的或其任何组合。每个立柱的高度可选自5nm至7,000nm，并且每个立柱的横向尺寸可选自5nm至8,000nm。立柱的顶部表面形状可为圆形、点形(角锥体的)、多边形(polygon)、椭圆形、长条形、多边形(polygon)、其它类似形状或其组合。阵列中的立柱之间的间隔可为周期性的或非周期性的。对于一些应用，优选周期性时段并且选择时段来使光吸收和辐射最大化，这是光波长依赖性的。阵列中的相邻立柱之间的间隔(间距)可为4nm至4000nm。

每个立柱顶部设有可由以下之一形成的金属盘：(a)单个元件金属，如金、银、铜、铝、镍；(b)多个层和/或单个金属的多个层的组合；(c)金属合金；(d)半导体；(e)产生等离子体振子的任何其它材料；或者(f)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何组合。每个盘的形状可为圆形、点形(如以角锥体或圆锥体形式)、多边形、椭圆形、细条形、多边形、其它类似形状或其组合。每个盘的形状可与它所设置的相关立柱的顶部表面的形状相同或不同。优选地，每个盘的横向尺寸为4nm至1500nm，并且盘的厚度为1nm至500nm。金属盘的直径可大于或小于支撑立柱的直径。直径差异可从0nm至200nm变化，这取决于工作的波长。

设置在金属盘与金属底板之间的每个立柱的侧壁上，金属点具有近似球形、盘样、多边形、细长形、其它形状或其组合的形状。立柱的金属点可全部都具有近似相同的形状或者可单独地变化。金属点的尺寸优选为3nm至600nm之间，并且三个尺寸可为不同的。可为特定光信号选择点的准确尺寸，所述尺寸也通过制造便利性和于其间制造相关间隙来调节。

在一些实施方案中，相邻金属点之间的间隙和盘与相邻金属点之间的间隙为0.5nm至200nm之间。对于很多应用，优选小间隙以增强光信号。立柱上的每个金属点之间的间隙可发生改变。

在实施方案中，金属底板在具有用于每个立柱的孔的基底上限定金属层。选择金属底板厚度为1nm至2000nm，其中优选厚度范围为50nm-200nm。金属底板材料可选自与用于形成以上所述金属盘的相同的组，但是对于给定的D2PA结构，金属底板可由与用于形成盘的材料相同或不同的材料形成。

D2PA结构的以上描述为可采用的材料、形状以及尺寸范围的说明，而不认为是排除的。其它材料、形状和尺寸在需要时可用于实现所需增强作用。每个D2PA结构的准确材料、形状和尺寸将通过经由待增强的光吸收(波长、极化)、待增强的光再辐射和/或待增强的局部电场强加的特定需要来决定。

可使用以下方法制造D2PA阵列。初始步骤为提供具有立柱材料层如SiO₂的基底。下一步为采用光刻压印过程将具有立柱图案的模子压印到沉积在立柱材料层上的抗蚀层中。在将图案压印到抗蚀层中以形成蚀刻掩模之后，通过蚀刻过程去除残余材料以留下抗蚀层的立柱样结构的图案。然后蚀刻掩膜材料层如铬(Cr)或其它材料沉积于立柱样结构的图案上，并且去除剩余抗蚀材料，从而导致Cr的图案直接沉积于立柱材料层上。最后的蚀刻步骤可为干法蚀刻如逆蚀刻或湿法蚀刻过程，所述蚀刻步骤去除无保护的立柱材料步骤并且留下设置在基底表面上的立柱阵列。任何剩余蚀刻掩膜材料(Cr)任选通过干法蚀刻或湿法蚀刻过程去除，并且采用蒸发过程使金属底板材料、盘材料和金属点以基本准直的沉积方式沉积于结构上。

普通技术人员将认识到，不同光刻步骤可使用任何多种已知光刻方法(包括电子束光刻、离子束光刻、光刻法或纳米压印光刻)来在抗蚀材料中形成图案。类似地，将认识到，蚀刻掩膜材料可为金属电介质或绝缘体。

在进行光刻步骤之前或之后，蚀刻掩膜材料可沉积于抗蚀层上。如果蚀刻掩膜材料在光刻步骤之后沉积，则通常将使用掀去过程。可选地，如果纳米压印光刻步骤首先用于形成抗蚀图案，则其次蚀刻掩膜材料可随后沉积于所得沟槽中，并且然后进行掀去过程。用于制备D2PA阵列的其它方法为可能的。

通过操纵D2PA结构的不同参数，可操纵从约100nm至约8000nm的不同波长的光。

可用对待检测的光波长特异的一种或多种特征件构建增强结构。这些特征包括材料选择、纳米级立柱高度、纳米级立柱侧壁形状、纳米级金属盘形状、纳米级金属点形状间隔、金属材料以及金属底板构造。纳米级金属点结构间隔的选择进一步包括选择相邻纳米级金属点结构之间的间隙距离和/或选择纳米级金属盘与相邻纳米级金属点结构之间的间隙间隔。

纳米级结构的基底可为电绝缘体、电介质绝缘体或半导体。任选地，基底可为层压结构，并且其中在基底表面的层为电绝缘体或半导体；并且其中表面层下方的基底体由任何固体材料组成。

立柱体可由绝缘体或半导体形成，并且具有选自以下形状的顶部：圆形、点形、多边形、锥形、椭圆形、细条形或其任何组合。立柱的侧壁表面可为柱状的、倾斜的或弯曲的。优选地，立柱具有范围为5nm至7000nm的高度和范围为5nm至8000nm的直径。任选地，立柱可为从衬板表面延伸的立柱阵列的一部分，其中相邻立柱之间的间隔的范围为2nm至4,000nm。立柱阵列可限定具有相对于选择波长的光选择的间隔的周期性阵列，以便使用纳米级结构使光的吸收或辐射最大化。用于在纳米级结构上形成立柱的适合材料包括二氧化硅、氮化硅、氧化铪、氧化铝、硅、砷化镓以及氮化镓。

纳米级结构的金属盘形成于立柱顶部，它由金属如金、银、铜、铝、其合金或其组合形成。金属盘表面不需要均匀，并且可具有任何构造，如圆形、点形、多边形、椭圆形、条形或其组合。优选地，金属盘的横向尺寸范围为5nm至1500nm，并且金属盘的垂直厚度范围为1nm至500nm。

设置在纳米级结构立柱侧壁上的金属点结构各自具有选自由近似球形、圆形、多边形、细长形或其组合组成的形状组的形状，并且具有范围为3nm至600nm的尺度。一般立柱上的金属点结构与金属盘之间的间隙范围为0.5nm至600nm，相邻金属点结构之间的间隙也一样。

纳米级结构的金属底板可被配置为具有立柱体从基底表面延伸通过的孔，或者可基本上为连续的，具有设置在其上的立柱体。优选地，金属底板具有范围为1nm至2000nm、例如50nm至200nm的厚度，并且由选自由以下组成的金属组的金属组成：金、银、铜、铝、其合金或其组合。金属底板可由与金属盘相同的材料或不同的材料形成。

本公开的纳米级结构可通过多种方法制成。用于制造用于增强局部电场、吸收光或辐射光的纳米级结构的示例性方法包括以下步骤：提供包括绝缘或半导体材料外表面的基底；在所述外表面上形成具有范围为5nm至7000nm的高度和范围为5nm至8000nm的横向尺寸的立柱阵列；将导电材料应用于立柱顶部和底层基底；以及同时(或随后)使导电点结构沉积在立柱侧壁上。立柱阵列通过包括以下的过程形成：电子束光刻、离子束光刻、光刻法或纳米压印光刻。

在被配置用于增强约800nm波长的光的一个实施方案中，D2PA纳米结构可由周期性非金属(例如，电介质或半导体)立柱阵列(200nm间距和约100nm直径)、每个立柱顶部的金属盘(约135nm直径)、立柱底部的金属底板、任意位于立柱壁上的金属纳米点以及这些金属部件之间的纳米间隙组成。盘阵列和底板(二者均为55nm厚)形成可有效地垂直和横向捕集激发光的3D腔天线。每个立柱根据立柱几何形状具有约10至50个纳米点；并且立柱密度为2.5×10⁹个立柱/cm²。

装置可被配置来检测具有范围为400nm至1,000nm的波长的光。在某些实施方案中，纳米点的平均直径范围为1nm至25nm，并且纳米点之间的间隙和纳米点与纳米盘之间的间隙范围可为1nm至10nm。金属选自金、银、铜、铝、其合金及其组合。立柱顶部具有选自以下形状：圆形、多边形、锥形、椭圆形、细条形或其任何组合。金属盘的横向尺寸范围为5nm至150nm。金属盘与金属底板以范围为0.1nm至60nm的距离间隔。至少一个金属点结构具有范围为1nm至25nm的尺寸。金属点结构与金属盘结构之间的距离和金属点结构与金属底板之间的距离以范围为0.5nm至50nm的距离间隔。

在具体实施方案中，多个立柱中的两个最近的立柱之间的间隔的范围为2nm至200nm。立柱具有柱状、倾斜或弯曲的侧壁表面。金属盘与金属底板的厚度为5nm至60nm之间。立柱具有小于光波长的横向尺寸或高度。金属盘具有与立柱基本上相同的横向几何形状。立柱包括选自的电介质或半导体材料：聚合物、二氧化硅、氮化硅、氧化铪、氧化铝、硅、砷化镓以及氮化镓。金属盘的横向尺寸小于光的波长。

图21示出两个替代实施方案，在实施方案(A)400中，没有立柱侧壁上的金属点结构，而仅有立柱415和立柱顶部的金属盘430以及立柱底部的金属底板450、以及涂覆在所述盘和所述底板上的分子粘附层460。它具有基底410，在实施方案(B)500中，没有立柱和金属点结构，而仅有金属底板570、然后为在金属底板顶部具有电介质(例如，SiO2)或半导体580薄膜的电介质或半导体基底510上的薄金属膜580、以及最后金属盘和仅涂覆在所述盘上的分子粘附层560。它具有基底510，

金属盘的形状和大小(横向尺寸及其厚度)与D2PA相似。对于实施方案(A)，立柱和底板与D2PA相似。对于实施方案(B)，薄电介质和半导体的材料与立柱的材料相似，但是膜厚度为0.5nm至150nm；并且底板的厚度没有限制(除了不薄于2nm)。在两个实施方案中，金属材料与D2PA相似，除了在实施方案(B)中，两种不同材料可用于盘和底板。

分子粘附层和捕获剂连接

如图1所示，纳米装置100包括覆盖底层D2PA金属表面的至少一部分的分子粘附层160。分子粘附层具有两个目的。首先，分子粘附层起到垫片的作用。对于最佳荧光，发光标签(例如，荧光团)不能太接近金属表面，因为非辐射过程会熄灭荧光。发光标签也不能离金属表面太远，因为它会减小放大。理想地，发光标签应处于离金属表面的最佳距离。第二，分子粘附层提供将捕获剂连接至纳米装置的良好粘附。良好粘附通过具有分子粘附层的分子中的反应基团来实现，所述分子粘附层在一侧对捕获剂具有高亲和力并且在另一侧对纳米装置具有高亲和力。

分子粘附层(MAL)160可具有很多不同的构造，包括(a)交联分子的自组装单层(SAM)、(b)多分子层薄膜、(c)(a)和(b)的组合以及(d)捕获剂自身。

在MAL(a)的实施方案中，其中分子粘附层160为交联分子或配体的自组装单层(SAM)，SAM的每个分子由以下三个部分组成：(i)头部基团，其对纳米装置表面具有特异性化学亲和力；(ii)末端基团，其对捕获剂具有特异性亲和力；以及(iii)分子链，其为连接头部基团和末端基团的长系列分子并且其长度(这决定金属至捕获剂之间的平均间隔)可影响纳米装置的光放大。此SAM示出于图3中。

在许多实施方案中，连接至金属表面的头部基团属于硫醇基团和-SH。连接至金属表面的头部基团的其它替代方案为羧酸(-COOH)、胺(C＝N)、硒醇(-SeH)或磷烷(-P)。如果单层涂覆在电介质材料或半导体(例如，硅)上，则可使用其它头部基团，例如硅烷(-SiO)。

在许多实施方案中，末端基团包括多种捕获剂-反应基团，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤素取代的苯酚酯、五氟苯酚酯、硝基取代的苯酚酯、酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、马来酰亚胺、碘代乙酰基、酰肼、醛或环氧化物。其它适合的基团为本领域已知的并且可描述于例如Hermanson，“Bioconjugate Techniques”Academic Press，第2版，2008中。末端基团可在它们组装到纳米装置表面之后化学连接到分子链上，或者在它们组装在表面上之前与分子链一起合成。

其它末端基团为羧基-COOH基团(用EDC/NHS活化已与配体上的-NH2形成共价结合)；氨基，-NH2基团(通过由EDC/NHS活化的酰胺键与配体上的-COOH形成共价结合)；环氧基，与-NH2反应(配体，不需要交联剂)；醛(与配体上的-NH2反应而不需要交联剂)；硫醇，-SH(通过SMCC样生物缀合方式连接至配体上的-NH2)；以及谷胱甘肽(GHS)(对于捕获GST标记的蛋白质为理想的。

分子链可为碳链，其长度可进行调整以改变发光标签至金属之间的距离以优化光信号。在一个实施方案中，如实施例部分将更详细描述的，SAM层为二硫双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)，其头部基团为通过硫-金键结合金表面的-SH，并且末端基团为结合捕获剂伯胺位点的NHS-酯，并且分子烷烃链具有1.7nm的长度。

在许多实施方案中，连接头部基团和末端基团的分子链为烷烃链，所述烷烃链仅由氢和碳原子组成，其中所有键均为单键，并且碳原子没有形成环结构而是形成简单的直链。分子链的其它替代方案可为来自聚合物如聚(乙二醇)(PEG)、聚(乳酸)(PLA)等的配体。分子链对于头部基团所连接的金属表面而不是末端基团所连接的捕获剂为化学非反应性的。决定分析物与纳米装置表面的距离的链长度可进行优化，以便实现最大信号放大。如以下将更详细描述的，分子链可具有例如0.5nm至50nm的厚度。

用于主题纳米传感器的分子粘附层可由在一侧牢固连接至金属(通过例如硫原子)并且在另一侧(外侧)封端捕获剂反应基团的自组装单层(SAM)组成，所述捕获剂反应基团例如胺反应基团、硫醇反应基团、羟基反应基团、咪唑基反应基团以及胍基反应基团。单层可具有疏水或亲水表面。最常用的捕获剂反应基团为NHS(它为胺反应性的)和马来酰亚胺(它为巯基反应性的)，尽管可使用很多其它反应基团。

在一些实施方案中，分子粘附层可为以下的自组装单层：烷硫醇(参见，例如Kato Journal ofPhysical Chemistry 2002 106：9655-9658)、聚(乙烯)乙二醇硫醇(参见，例如，Shenoy等Int.J.Nanomedicine.20061：51-57)、芳香硫醇或封端于硫醇的一些其它链。

可使用硫醇基团，因为(a)硫醇的硫与金和其它金属相互作用以形成牢固而稳定键的键(参见，例如，Nuzzo等J.Am.Chem.Soc.1987109：2358-2368)并且(b)范德华力引起烷烃和其它链堆积，这引起SAM自发地组建(参见，例如，Love等Chem.Rev.2006 105：1103-1169)。此外，末端基团可用于直接连接至捕获分子或者用于化学修饰。

烷硫醇可用于一些实施方案中。据估计，在烷硫醇堆积单层中存在4×10¹⁴个烷硫醇分子/cm²(Nuzzo等，J.Am.Chem.Soc.1987 109：733-740)，这近似对应于与底层表面上的每个金原子的烷硫醇键。由烷硫醇组成的自组装单层可通过在烷硫醇溶液中浸湿金基底来产生(参见，例如，Lee等Anal.Chem.2006 78：6504-6510)。金能够与还原的烷硫醇(-SH基团)和烷基二硫化物(-S-S-)反应(参见，例如，LoVe等Chem.Rev.2005 105：1103-1169)。

一旦产生聚(乙二醇)硫醇或烷硫醇的自组装单层，就可采用多种策略来将捕获剂连接至自组装单层。在一个实施方案中，捕获剂如链霉抗生物素蛋白(SA)可连接至SAM，以固定生物素化捕获剂。

在一个实施方案中，链霉抗生物素蛋白(SA)自身可用作SAM的官能团(例如，末端基团)，以交联对SA具有高结合亲和力的捕获剂分子，如生物素化分子，包括肽、寡核苷酸、蛋白质和糖。

抗生物素蛋白、链酶抗生物素蛋白的官能团对生物素基团具有高亲和力，以形成抗生物素蛋白-生物素。此高亲和力使抗生物素蛋白/链酶抗生物素蛋白很好地用作官能团并且使生物素基团用作互补的官能团结合。此类官能团可使分子粘附层与纳米装置结合、分子粘附层与捕获剂之间结合以及发光标签与第二捕获剂结合。在一个实施方案中，包含硫醇反应基团的分子粘附层可通过将金表面连接至氨基末端的SAM并且使用磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)进一步修饰以产生马来酰亚胺活化的表面来制备。马来酰亚胺活化的表面为反应性硫醇基团并且可用于连接包含硫醇-(例如，半胱氨酸)基团的捕获剂。

在另一个实施方案中，包含胺-反应基团(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))的分子粘附层可通过例如在琥珀酰亚胺烷烃二硫化物如二硫双-磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)或二硫双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)的1-10mM溶液中浸湿金基底来产生(参见，例如，Peelen等J.ProteomeRes.2006 5：1580-1585和Storri等Biosens.Bioelectron.1998 13：347-357)。

在另一个实施方案，包含胺反应基团(NHS)的分子粘附层可使用羧基末端的SAM如12-羧基-1-十一烷硫醇来产生。在此情况下，SAM表面可在1-乙基-3(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDC)存在下链接至NHS，以产生与伯胺形成稳定的酰胺键的中间体(参见，例如，Johnsson等Anal.Biochem.1001 198：268-277)。

在另一个实施方案中，分子粘附层可包括以高亲和力结合IgG、其它免疫球蛋白形式例如IgE的Fc区的蛋白质A。

在另一个实施方案中，咪唑基团(也与胺反应)可通过将羧基末端的SAM与1，1′-羰二咪唑(CDI)反应来添加。

在其它实施方案中，醛末端的烷硫醇单层可用于固定蛋白质和氨基末端DNA寡核苷酸，并且his-标记的融合蛋白可固定于氮基三乙酸(NTA)-修饰的金表面。

硫醇反应基团可连接至合成的DNA和RNA寡核苷酸，包括适体，所述适体可容易用硫醇末端商业合成。硫醇反应基团还可连接至包含半胱氨酸基团的蛋白质，例如抗体。硫醇化分子可连接至马来酰亚胺修饰的表面(参见，例如，Smith等Langmuir 2002 19：1486-1492)。在某些情况下，可使用在末端Cys之后插入的氨基酸间隔物(例如，Ser-Gly-Ser-Gly)，这提高缺乏间隔物的结合相对肽的数量。对于寡核苷酸，可使用烷烃间隔物。合成以包含末端硫醇的碳水化合物可以相同方式连接至金上。

胺反应基团可与伯胺(如赖氨酸残基上的游离胺)形成键。除蛋白质之外，胺反应表面可用于固定其它生物分子，包括含有赖氨酸残基的肽和用氨基末端合成的寡核苷酸。

在MAL(b)的实施方案中，其中分子粘附层160为多分子层薄膜，分子可通过物理吸附和牢固结合涂覆在D2PA纳米装置上。在一个实例中，蛋白质A可涂覆在D2PA纳米装置表面的整个表面区域或部分表面区域上，在此情况下，蛋白质A可通过物理吸附过程沉积并且具有4nm至5nm的厚度。在另一个实例中，所述层可为聚合物如聚乙二醇(PEG)的薄膜，所述聚合物在一端具有官能头部基团，例如，硫醇(-SH)。官能PEG分子层与D2PA纳米装置表面形成牢固结合。PEG分子层厚度可通过改变PEG聚合物链长度来调整。另一个实例为无定形SiO2薄膜，其使用物理或化学沉积方法，例如蒸发、喷溅、溶胶凝胶方法连接至D2PA纳米装置的表面。在沉积期间可精确控制SiO2薄膜厚度。

在MAL(c)的实施方案中，其中分子粘附层160为多分子层薄膜和SAM的组合，SAM层可首先沉积，随后为多分子层。

在一个实例中，分子粘附层可首先包含链酶抗生物素蛋白单层，然后包含对链酶抗生物素蛋白具有高结合亲和力的其它分子层，如生物素、生物素化分子，包括肽、寡核苷酸、蛋白质和糖。

在一个实例中，分子粘附层可包含SAM层二硫双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)(DSU)和蛋白质A层。DSU SAM层通过硫-金键结合纳米装置金属表面并且具有结合蛋白质A上的伯胺位点的NHS-酯的末端基团。在特定情况下，捕获抗体通过其Fc区域结合DSU顶部的此双层蛋白质A。蛋白质A可确保更好捕获效率的抗体定位。

在MAI(d)的实施方案中，其中分子粘附层160本身为捕获剂，捕获剂具有头部基团，所述头部基团对主题纳米装置的金属或立柱侧壁(即D2PA)具有高亲和力。常见头部基团之一为硫醇反应基团。硫醇反应基团可连接至合成的DNA和RNA寡核苷酸，包括适体，所述适体可容易用硫醇末端商业合成。硫醇反应基团还可连接至包含半胱氨酸基团的蛋白质，例如抗体。其中MAL本身用作捕获剂的另一个实例为抗体片段层，例如，半-IgG、Fab、F(ab’)2、Fc。抗体片段通过位于铰链区的硫醇-肽链内切酶直接结合金属表面。图6中示出此实施方案。在此实施方案中，核酸包括直接结合纳米装置的头部基团。如图5所述地进行其余的步骤。

分子粘附层的厚度范围应为0.5nm至50nm，例如，1nm至20nm。可根据具体应用将，通过例如增加或减少所用SAM的接头(烷烃或聚(乙二醇)链)长度来优化分子粘附层厚度。假设接头中的每个键为0.1nM至0.15nM，则最佳SAM在某些情况下可包含5至50个碳原子、例如10至20个碳原子的聚合物接头。

纳米传感器可通过经由捕获剂与分子粘附层表面上的捕获剂反应基团之间的反应将捕获剂连接至分子粘附层来制成。

捕获剂可通过任何常规方法如以上所述的那些方法连接至分子粘附层。在很多情况下，捕获剂可通过高亲和力牢固相互作用，例如生物素与链酶抗生物素蛋白之间的那些相互作用连接至分子粘附层。因为链酶抗生物素蛋白为蛋白质，链酶抗生物素蛋白可使用以上所述的任何胺反应方法连接至分子粘附层表面。生物素化捕获剂可通过将其点样到链酶抗生物素蛋白上来固定。在其它实施方案中，捕获剂可通过形成牢固结合的反应，例如蛋白质赖氨酸残基或胺化寡核苷酸中的氨基与NHS酯之间的反应在捕获剂与分子粘附层之间产生酰胺键来连接至分子粘附层。在其它实施方案中，捕获剂可通过蛋白质半胱氨酸残基或巯基寡核苷酸中的巯基与分子粘附层表面上的巯基反应马来酰亚胺之间的反应来牢固连接至分子粘附层。用于将捕获剂连接至多种反应基团的方法为本领域已熟知的。

在一个实施方案中，捕获剂可为捕获蛋白质的核酸，或者捕获剂可为捕获核酸例如DNA、RNA的蛋白质。核酸可通过序列特异性(紧密的)或非序列特异性(松的)结合来结合蛋白质。

在某些情况下，主题纳米装置可使用以下方法制造：(a)在基底顶部表面形成至少一个立柱图案；(b)沉积顶部表面的金属材料层；(c)允许沉积于立柱顶部的金属材料形成盘、沉积于立柱底部的金属材料形成金属底板并且沉积于侧壁的金属材料形成至少一个金属点结构；以及，如以上所述的，(d)在沉积的金属材料顶部沉积分子粘附层，其中所述分子粘附层覆盖金属点结构、金属盘和/或金属底板的至少一部分，并且其中所述分子粘附层外表面包含捕获剂反应基团。

此外，(a)中的形成图案包括一种材料的直接压印(压花)，所述材料可为电特性的电介质或半导体，并且可为聚合物或者通过固化单体或低聚物形成的聚合物或者无定形的无机材料。材料可为具有10纳米至10毫米厚度的薄膜或者具有基底的多层材料。压印(即，压花)意指具有在其表面具有结构的模子并且将所述模子压到待压印的材料中，以反转材料中的所述结构。基底或顶部压印层可为塑料的(即，聚合物)，例如，聚苯乙烯(PS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、其它丙烯酸等。压印可通过使用滚筒压印机的辊对辊技术(roll to roll technology)进行。此过程具有巨大的经济优点并因此降低成本。

纳米传感器

提供通过以上所述方法制成的纳米传感器。在某些实施方案中，纳米传感器包含(a)基底；以及(b)一个或多个从所述基底表面延伸的立柱，其中所述立柱中的至少一个包括：i.立柱顶部的金属盘；ii立柱底部的金属底板，所述金属底板覆盖立柱底部附近的基底表面的大部分；iii.设置在立柱侧壁上的金属点结构；iv.覆盖所述金属点结构、金属盘和/或金属底板中的至少一部分的分子粘附层；以及v.特异性结合分析物的捕获剂，其中所述捕获剂连接至所述分子粘附层。纳米传感器的特征在于，当分析物结合捕获剂时，它放大来自分析物的光信号。

光放大来自以下一个或若干个因素：纳米传感器可(a)有效吸收光激发(例如，在激发荧光部分的波长下的光)、(b)将吸收的光聚集到某些位置上、(c)将分析物置于其中聚集大部分光的区域、并且(d)有效地辐射通过分析物产生的来自分析物所固定的位置的光。

根据分析物标记的方式，放大的光信号可为冷光(例如，化学冷光或电致冷光或荧光)。图3示出其中捕获剂为蛋白质例如抗体的生物传感器；图4示出其中捕获剂为核酸例如寡核苷酸的生物传感器。在一些实施方案中，选择分子粘附层厚度以优化光信号的放大。

在一些实施方案中，不同捕获剂连接至纳米传感器表面，其中每种捕获剂例如以阵列形式涂覆在表面的不同位置上，以此提供不同分析物的多重检测，因为每个位置对于捕获特定类型的分析物为特异性的。

在一些实施方案中，可以多孔格式、例如24-孔、96-孔或384孔格式实施纳米传感器，其中多孔板的每个孔包含纳米传感器(例如，纳米传感器处于每个孔中或者为每个孔的底部或部分侧壁)。每个孔中的捕获剂可为相同或不同的。在一些实施方案中，各自涂覆在不同位置上的多种不同捕获剂可置于孔中，这提供不同分析物的多重检测。在这些实施方案中，可平行地分析样品中的若干分析物。在一些实施方案中，纳米传感器可为微流体或纳米流体通道的一部分。

在具体的实施方案中，主题纳米传感器可进一步包括特异性结合捕获剂的标记分析物。如以上所述的，标记分析物可用发光标签直接或间接标记。在其中分析物用发光标签间接标记的实施方案中，分析物可结合第二捕获剂，所述第二捕获剂也被称为：自身光学标记的检测剂(例如，二次抗体或另一种核酸)。第二捕获剂在一些情况下可被称为“检测剂”。

在其它实施方案中，主题纳米传感器可设置在微流体通道(1至1000微米的通道宽度)或者纳米流体通道(通道宽度小于1微米)内或为此类通道的内壁的零件。纳米传感器可设置在每个通道内的多个位置处并且可用于多个通道中。不同位置或不同流体通道中的纳米传感器可随后用不同捕获剂涂覆，以进行多重检测。

系统

还提供一种包括以下各项的系统：主题纳米传感器、用于所述纳米传感器的固定器、从标签(即，发光标签)诱导光信号的激发源；以及适用于读取光信号的读取器(例如，能够产生纳米传感器表面的二维光谱图的光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或成像装置)。将清楚的是，所述系统还可具有电子设备、计算机系统、软件以及放大、滤波、调节、控制和保存来自所述读取器的电信号并控制读取器和样品固定器位置的其它硬件。样品固定器位置可在一个或所有三个正交方向上移动，以允许读取器扫描来自样品不同位置上的光信号。

激发源可为(a)光源，例如适用于激发特定荧光团的波长的激光和具有用于波长选择的滤光器的灯或发光二极管；或者(b)用于提供电流以从纳米传感器发出光的电源(当使用电化学冷光标签时可采用它)。图2中示出示例性系统。参考图2，激发系统可包括激光、激光光学装置(包括射束扩展器、透镜、镜子和激光线通带滤波器)、读取器(例如，具有CCD传感器的分光计)、另外的光学装置(例如，长波长通带滤波器、分束器和透镜)以及用于纳米传感器的固定器。在某些情况下，固定器可处于具有X-Y和Z移动的机动载台上。

在特定情况下，激光线通带滤波器滤出波长不同于激光的光，并且长波长通带滤波器将仅允许从光学检测标签发出的光经过。由于不同应该标签吸收不同光谱范围的光，应选择荧光标签以使其峰值吸收波长匹配激光激发波长，以便实现最佳量子效率。在许多实施方案中，从纳米传感器上的荧光标签发出的光信号处于高于激光波长的至少20nm的波长下。因此，纳米传感器等离子体振子共振应调整以包括荧光标签的吸收峰、发射峰和激光激发波长。在一些实施方案中，激发波长和荧光波长范围可为100nm至20,000nm。优选的范围为300nm至1200nm。600-850nm范围由于低背景噪声而为优选的。

如从以上可清楚的是，可以多孔格式实施某些纳米传感器。在这些实施方案中，可移动载台以使得读取器可单独读取来自多孔板的每个孔的光信号。

测定方法

主题纳米传感器可用于检测样品中的分析物。此方法可包括：(a)在适于样品中分析物与捕获剂的特异性结合的条件下，将包含分析物的样品与纳米传感器接触；以及(b)读取来自纳米传感器的光学检测信号，其中所述光学检测信号指示分析结合捕获剂。在以上步骤(a)中，在结合捕获剂之后，分析物可用发光标签标记或不标记(也被称为直接或间接标记)。在其中分析物在结合之前不用发光标签标记的实施方案中，分析物在结合捕获剂之后可结合自身光学标记的第二捕获剂(即检测剂)(例如，二次抗体或另一种核酸)、标记的第二捕获剂或标记的检测剂(此过程也被称为分析物的间接标记)。在使用间接标记的感测中，在以上读取步骤(b)之前，去除未结合分析物的标记的第二捕获剂。在使用直接标记的感测中，在以上读取步骤(b)之前，去除未结合分析物的光学标签。

在测定中读取发光标签时，向发光标签施加激发(光、电、化学或其组合)，并且检测光的特性，包括强度、波长和位置。

在某些实施方案中，所述方法包括将捕获剂连接至主题纳米装置的分子粘附层以产生纳米传感器，其中所述连接通过捕获剂与分子粘附层上的分子的捕获剂反应基团的化学反应进行，如以上所述的。另外，所述方法包括将包含目标分析物的样品与纳米传感器接触，并且所述接触在适于特异性结合的条件下进行，并且所述目标分析物特异性结合捕获剂。在此步骤之后，所述方法包括去除未结合捕获剂的任何目标分析物(例如，通过在结合缓冲液中洗涤纳米传感器的表面)；然后添加与光学检测标签缀合的检测剂，以检测目标分析物。在去除未结合目标分析物的检测剂之后，然后可使用具有读取系统的纳米装置，以读取来自与纳米传感器保持结合的检测剂的光信号(例如，范围为300nm至1200nm的波长的光)。可清楚的是，所述方法进一步包括用发光标签标记目标分析物。这可在接触步骤之前或之后进行，即，在分析物结合捕获剂之后。在某些实施方案中，分析物在与纳米传感器接触之前进行标记。在其它实施方案，分析物在结合纳米传感器的捕获剂之后进行标记。另外，如以上所提到的，分析物可直接标记(在此情况下，分析物可在所述方法开始时牢固连接至发光标签)或间接标记(即，通过将目标分析物结合第二捕获剂，例如标记的二次抗体或标记的核酸，其特异性结合目标分析物并且连接至发光标签)。在一些实施方案中，所述方法可包括在接触步骤(b)之前封闭纳米传感器，从而防止捕获剂与非目标分析物非特异性结合。

用于特异性结合并且为目标分析物特异性结合捕获剂的适合条件，包括适合温度、时间、溶液pH水平、环境光线水平、湿度、化学试剂浓度、抗原-抗体比率等。

在某些实施方案中，核酸捕获剂可用于捕获蛋白质分析物(例如，DNA或RNA结合蛋白)。在替代实施方案中，蛋白质捕获剂(例如，DNA或RNA结合蛋白)可用于捕获核酸分析物。

样品可为液体样品，并且在某些实施方案中，样品可为源于细胞、组织或体液的临床样品。目标体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血液(例如，全血、分离的血液、血浆、血清等)、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜粘液、内淋巴液、外淋巴液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、黏液(包括鼻排出物和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓汁、发炎性分泌物、唾液、皮脂(皮肤油脂)、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿以及呼气冷凝物。

图4和图5示出测定的一些步骤。对于捕获剂与其结合配偶体(包括分析物)之间的分子相互作用的方法的一般方法为本领域已知的(参见，例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，第一版(1988)Cold spring Harbor，N.Y.；Ausubel等，Short Protocols in MolecularBiology，第3版，Wiley&Sons，1995)。图4和图5所示方法为示例性的；那些附图中所述的方法不是进行测定的仅有的方式。

图4中示出示例性抗体结合测定的一些步骤。在此测定中，纳米装置100根据以上所述的方法连接至抗体，以产生包括连接至纳米装置的分子粘附层的抗体202的纳米传感器200。在产生纳米传感器200之后，在适于特异性结合的条件下将纳米传感器与包含目标分析物(例如，目标蛋白质)的样品接触。抗体202特异性结合样品中的目标分析物204。在从纳米传感器中洗涤未结合分析物之后，在适于特异性结合的条件下将纳米传感器与用发光标签208标记的二次抗体206接触。在从纳米传感器中去除未结合的二次抗体之后，可读取纳米传感器以确定和/或定量分析物204在初始样品中的量。

图5中示出示例性核酸结合测定的一些步骤。在此测定中，纳米装置100根据以上所述的方法连接至核酸，例如寡核苷酸，以产生包括连接至分子粘附层的核酸分子302的纳米传感器300。在产生纳米传感器200之后，在适于目标核酸304与核酸捕获剂302特异性杂交的条件下，将纳米传感器与包含目标核酸304的样品接触。核酸捕获剂304特异性结合样品中的目标核酸304。在从纳米传感器中洗涤未结合的核酸之后，在适于特异性杂交的条件下将纳米传感器与用发光标签308标记的第二核酸306接触。在从纳米传感器中去除未结合的第二核酸之后，可读取纳米传感器以确定和/或定量核酸304在初始样品中的量。

可使用主题装置进行的增强的DNA杂交测定的一个实例为夹心杂交测定。捕获DNA为在其3’-端具有硫醇官能团的单链DNA。检测DNA为在其3’-端具有荧光标签官能团例如IRDye800CW的单链DNA。捕获DNA和检测DNA二者均具有20bp的长度。它们用不同的序列合成，以在不同区域形成与目标DNA的互补结合。首先，捕获DNA通过硫-金反应固定于D2PA纳米装置的金属表面上。然后，将目标DNA添加到纳米装置中，以由捕获DNA进行捕获。最后，将荧光标记的检测DNA添加到纳米装置中，以检测固定的目标DNA。在洗去未结合的检测DNA之后，测量从纳米装置表面发出的荧光信号，以进行目标DNA分子的检测和定量。

在图4和图5所示的实施方案中，结合的分析物可使用第二捕获剂(即，“检测剂”)进行检测，所述第二捕获剂可与催化发色化合物合成的荧光团或酶缀合，所述发色化合物可目视检测或者使用成像系统检测。在一个实施方案中，可使用辣根过氧化物酶(HRP)，其可将发色底物(例如，TMB、DAB或ABTS)转化为有色的产物或者可选地在使用化学冷光底物时产生冷光产物。在具体的实施方案中，由标签产生的光信号具有300nm至900nm范围的波长)。在某些实施方案中，标签可为电化学冷光的，因此，光信号可通过向传感器供应电流来产生。

在一些实施方案中，第二捕获剂(即，检测剂)，例如二次抗体或第二核酸，可连接至荧光团，例如呫吨染料，例如荧光素和罗丹明染料，如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常已知的缩写为FAM和F)、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G⁵或G⁵)、6-羧基罗丹明-6G(R6G⁶或G⁶)以及罗丹明110；花青染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst33258；菲啶染料，例如德克萨斯红(Texas Red)；乙啡啶染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如花青染料，如Cy3、Cy5等；BODIPY染料和喹啉染料。常用于本中请的目标特定荧光团包括：嵌二萘、香豆素、二乙氨基香豆素、FAM、氯三嗪荧光素、荧光素、R110、曙红、JOE、R6G、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺(Lissamine)、ROX、萘并荧光素、德克萨斯红、萘并荧光素、Cy3和Cy5、IRDye800、IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800等。

第一和第二捕获剂应以高特异性亲和力结合目标分析物。然而，第一和第二捕获剂不能为分子，因为它们需要结合抗原中的不同位点。一个实例为抗人β淀粉样蛋白捕获抗体6E10和检测G210，在此情况下，6E10仅结合人β淀粉样蛋白肽上的第10个氨基位点，而G210仅结合第40个氨基位点。捕获剂和第二捕获剂不能相互反应。另一个实例使用兔抗人IgG作为捕获抗体并且使用驴抗人IgG作为检测抗体。由于捕获剂和检测剂来源于不同宿主种类，它们不能相互反应。

用于使用荧光团标记蛋白质(例如二次抗体)和核酸的方法为本领域已知的。化学冷光标签包括吖啶酯和磺酰胺、鲁米诺(luminol)和异鲁米诺；电化学冷光标签包括钌(II)螯合物，并且其它标签为已知的。

应用

主题方法和组合物在多种应用中找到用途，其中此类应用通常为分析物检测应用，其中如果不定量的话，则至少定性地检测给定样品中的特定分析物的存在。用于进行分析物检测测定的方法为本领域技术人员已熟知的并且不需要在此详细描述。通常，在足以使分析物结合连接至传感器的其对应捕获剂的条件下，将怀疑包含目标分析物的样品与主题纳米传感器表面接触。捕获剂对目标靶向分子具有高特异性亲和力。此亲和力可为其中抗体结合抗原上的特异性表位的抗原-抗体反应，或者在两条或更多条核酸互补链之间为序列特异性的DNA/RNA或DNA/RNA杂交反应。因此，如果目标分析物存在于样品中，它可能在捕获剂位点处结合传感器，并且在传感器表面形成复合物。即，捕获的分析物固定于传感器表面。在去除未结合的分析物之后，然后例如使用标记的第二捕获剂检测此结合复合物(即，固定的目标分析物)在传感器表面上的存在。

目标特异性分析物检测应用包括其中采用核酸捕获剂的杂交测定和其中采用多肽(例如抗体)的蛋白质结合测定。在这些测定中，首先制备样品和随后的样品制剂，在特异性结合条件下将样品与主题纳米传感器接触，从而在与连接至传感器表面的捕获剂互补的目标核酸或多肽(或其它分子)之间形成复合物。

在一个实施方案中，捕获寡核苷酸为合成的20-100碱基长度的单链DNA，它在一端硫醇化。这些分子固定于纳米装置的表面上，以捕获具有与固定的捕获DNA互补的序列的目标单链DNA(它可为至少50bp长度)。在杂交反应之后，添加其序列与目标DNA未占用核酸互补的检测单链DNA(它可具有20-100bp长度)，以与目标杂交。检测DNA具有与荧光标签缀合的一端，其发射波长处于纳米装置的等离子体振子共振内。因此，通过检测从纳米装置表面发出的荧光发射，可准确检测和定量目标单链DNA。捕获和检测DNA的长度决定熔化温度(核苷酸链将分开以上熔化温度)、错配程度(链越长，错配越低)。选择用于互补结合的长度的关注点之一取决于使错配最小化同时将熔化温度保持尽可能高的需要。此外，确定杂交长度的总长度，以便实现最佳信号放大。

主题传感器可用于诊断疾病或病状的方法中，所述方法包括：(a)从怀疑患有疾病或病状的患者中获得液体样品；(b)将所述样品与主题纳米传感器接触，其中纳米传感器的捕获剂特异性结合疾病的生物标志物并且其中所述接触在适于生物标志物与捕获剂的特异性结合的条件下进行；(c)去除未结合所述捕获剂的任何生物标志物；以及(d)读取来自保持与纳米传感器结合的生物标志物的光信号，其中光信号指示患者患有所述疾病或病状，其中所述方法进一步包括在生物标志物结合所述捕获剂之前或之后用发光标签标记所述生物标志物。如以下将更详细描述的，患者可能怀疑患有癌症并且抗体结合癌症生物标志物。在其它实施方案中，患者怀疑患有神经障碍并且所述抗体结合神经障碍的生物标志物。

主题传感器的应用包括但不限于(a)与某些疾病状态相关的化学化合物或生物分子的检测、定量和纯化，所述疾病例如传染病和寄生虫病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神障碍以及器质性疾病(例如肺病、肾病)；(b)来自环境例如水、土壤的微生物(例如，病毒、真菌和细菌)或生物样品(例如，组织、体液)的检测、纯化和定量；(c)会对食品安全或国家安全造成危害的化学化合物或生物样品(例如，有毒废物、炭疽)的检测、定量；(d)医学或生理监测的生命参数例如葡萄糖、血氧水平、总血细胞计数的定量；(e)来自生物样品例如细胞、病毒、体液的特异性DNA或RNA的检测和定量；(f)用于染色体分析的染色体和线粒体中的DNA的基因序列的测序和比较；或者(g)例如在药物合成或纯化期间检测反应产物。

检测可在各种样品基质如细胞、组织、体液以及粪便中进行。目标体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血液(例如，全血、分离的血液、血浆、血清等)、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜粘液、内淋巴液、外淋巴液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、黏液(包括鼻排出物和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓汁、发炎性分泌物、唾液、皮脂(皮肤油脂)、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿以及呼气冷凝物。

在一些实施方案中，主题生物传感器可用于通过检测来自样品中的病原体的目标核酸来诊断病原体感染。目标核酸可例如来自包含选择包含以下的组的病毒：人类免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)、人T-细胞白血病病毒和2(HTLV-1和HTLV-2)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、腺病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、人疱疹病毒8(HHV-8，也被称为卡波氏肉瘤疱疹病毒)以及黄病毒(包括黄热病病毒、登革病毒、日本脑炎病毒以及西尼罗河病毒)。然而，本发明不限于来自上述病毒的DNA序列的检测，而可在没有任何问题的情况下用于兽医和/或人类医学中重要的其它病原体。

人乳头瘤病毒(HPV)基于其DNA序列同源性而进一步细分为70多种不同类型。这些类型引起不同疾病。1、2、3、4、7、10和26-29型HPV引起良性疣。5、8、9、12、14、15、17和19-25以及46-50型HPV在具有薄弱免疫系统的患者中引起病变。6、11、34、39、41-44和51-55型在生殖器区域和呼吸道的粘膜上引起良性尖锐疣。16和18型HPV具有特殊医疗兴趣，因为它们引起生殖器粘膜的上皮发育不良并且与子宫颈、阴道、外阴和肛管的高比例浸润癌有关。人乳头瘤病毒的DNA整合被视为宫颈癌的致癌作用的决定性因素。可以例如从衣壳蛋白质L1和L2的DNA序列检测人乳头瘤病毒。因此，本发明的方法特别适于检测组织样品中的16和/或18型HPV的DNA序列，从而评定癌发展的危险。

在一些情况下，纳米传感器可用于检测以低浓度存在的生物标志物。例如，纳米传感器可用于检测易于接近的体液(例如，血液、唾液、尿液、泪液等)中的癌症抗原、检测在易于接近的体液中的组织特异性疾病的生物标志物(例如，神经障碍的生物标志物(例如，阿尔兹海默症抗原))、检测传染病(具体地为检测低滴度潜伏性病毒，例如HIV)、检测母体血液中的胎儿抗原、以及用于检测例如受试者血流中的外源性化合物(例如，药物或污染物)。

下表提供可使用主题纳米传感器(当与适当单克隆抗体一起使用时)检测的蛋白质生物标志物以及其相关疾病的列表。在表中也指示生物标志物的一种可能的来源(例如，“CSF”；脑脊液)。在很多情况下，主题生物传感器可检测所指示的不同体液中的那些生物标志物。例如，在CSF中发现的生物标志物可例如在尿液、血液或唾液中鉴别。

如以上所述的，主题纳米传感器可用于检测样品中的核酸。除以上所述的诊断应用之外，主题纳米传感器可用于多种药物发现和研究应用。例如，主题纳米传感器可用于多种应用，包括但不限于疾病或病状的诊断或监测(其中核酸的存在提供疾病或病状的生物标志物)、药物目标的发现(其中例如核酸在疾病或病状中差异性表达并且可靶向用于药物治疗)、药物筛选(其中药物的作用通过评定核酸水平来监测)、确定药物敏感性(其中药物敏感性与核酸的特定特征有关)以及基本研究(其中希望确定核酸在样品中的存在，或者在一些实施方案中，确定特定核酸在两种或更多种样品中的相对水平)。

在某些实施方案中，核酸在两种或更多种不同核酸样品中的相对水平可使用以上方法获得，并且进行比较。在这些实施方案中，从以上所述方法中获得的结果通常被标准化为核酸在样品中的总量(例如，保守的RNA)，并且进行比较。这可通过比较比率或者通过其它方式进行。在具体实施方案中，可比较两种或更多种不同样品的核酸特征以确定与特点疾病或病状相关的核酸。

在一些实例中，不同样品可由“实验性”样品(即，目标样品1)和与实验性样品相比较的“对照”样品组成。在许多实施方案中，不同样品为成对的细胞类型或其部分，一种细胞类型为目标细胞类型，例如异常细胞，并且另一种为对照，例如正常细胞。如果比较两部分细胞，所述部分通常为来自两种细胞中每一种的相同部分。然而，在某些实施方案中，可比较相同细胞的两部分。示例性细胞类型对包括例如，从组织活检中分离的细胞(例如，从患有疾病的组织如结肠、乳房、前列腺、肺、皮肤癌中分离的或者感染病原体等的组织中分离的)和来自相同组织的正常细胞(通常来自相同患者)；在组织培养物中生长的无限增殖的(例如，具有增殖性突变或者无限增殖的转基因的细胞)、感染病原体或者进行处理(例如，使用环境或化学药剂，如肽、激素、改变的温度、生长条件、物理应力、细胞转化等)的细胞和正常细胞(例如，与除不是无限增殖、感染或处理等的细胞之外的实验细胞另外相同的细胞)；从患有癌症、疾病的哺乳动物、年老的哺乳动物或暴露于病状下的哺乳动物中分离的细胞和从相同种类的健康或年轻哺乳动物中分离的、优选相同家族中分离的细胞；以及来自相同哺乳动物的分化细胞和未分化细胞(例如，一个细胞为例如哺乳动物中另一个细胞的祖先)。在一个实施方案中，可采用不同类型的细胞例如神经元细胞和非神经元细胞或者不同状态的细胞(例如，在刺激细胞之前和之后)。在本发明的另一个实施方案中，实验材料为易于由病原体如病毒、例如人免疫缺陷病毒(HIV)等感染的细胞，并且对照材料为抵抗病原体感染的细胞。在本发明的另一个实施方案中，样品对表示为未分化细胞例如干细胞和分化细胞。

虽然出于清晰理解的目的已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述实施方案，但显而易见，本领域的普通技术人员根据以上教导在不脱离所述权利要求书的精神或范围的情况下可以对其做出某些变化和修改。

实施例

根据下列实施例可进一步理解本教导的方面，所述实施例不应当被解释为以任何方式限制本教导的范围。

以下实施例提供如何使用具有分子间隔物的自组装单层(SAM)的新等离子体振子结构D2PA测量使用用近似IR染料(IRDye800CW)标记的蛋白质A和人免疫球蛋白G(IgG)进行免疫测定的荧光度和检测灵敏度的描述。与在玻璃板上进行的相同测定相比，对D2PA的免疫测定的平均荧光度增强7,400倍，并且检测灵敏度增强3,000,000倍(检测限从0.9nM减小至0.3fM)。此外，平均荧光度增强具有8个数量级的动态范围(从100nM至1fM)，并且在具有±9％空间变化的整个大样品区域上为均匀的。当单分子荧光团置于D2PA的“热点”上时，其荧光度增强4×10⁶倍，这指示进一步显著增加平均增强和检测灵敏度的可能性。观察到的增强为高于先前所报道的数量级。大的增强归因于可克服当前等离子体振子结构设计中的一些关键性缺点的独特D2PA 3D体系结构以及薄SAM分子间隔物的使用。怀疑D2PA可将溶液中的生物标志物集中到等离子体振子结构的热点中，这可进一步提高增强。D2PA板的制造方法为简单、便宜和可缩放的。与良好空间均匀度、宽动态范围和易于制造一起，免疫测定的荧光度和检测灵敏度的巨大增强应广泛应用于生物研究、医学诊断和很多其它方面。

材料和方法I

等离子体振子结构。本文所述的等离子体振子体系结构将被称为“盘连接立柱点天线阵列(D2PA)”，它具有其中带有紧密等离子体振子纳米点和连接金属部件的纳米间隙的紧密三维(3D)共振腔纳米天线阵列(图7中示出；还参见Li等Optics Express 2011 19，3925-3936)。3D天线极大地增加接收光和辐射光的效率，金属纳米点和纳米间隙进一步将光“聚集”到小区域中，以增加局部电场，并且高密度增加平均增强和均匀度。具体地，D2PA由周期性非金属(例如，电介质或半导体)立柱阵列(200nm间距、约100nm直径和约65nm高度)、每个立柱顶部的金属盘(约135nm直径)、立柱底部的金属底板、任意位于立柱壁上的金属纳米点以及这些金属部件之间的纳米间隙组成(图7)。盘阵列和底板(二者均为55nm厚)形成可有效地垂直和横向捕集激发光的3D腔天线。纳米点具有约5-20nm的直径，并且它们与纳米盘之间的纳米间隙为1nm-10nm。每个立柱根据立柱几何形状具有约10至50个纳米点；并且立柱密度为2.5×10⁹个立柱/cm²。其它部分已讨论优化以匹配激发激光和荧光的波长的立柱和盘的准确直径和高度以及在等离子体振子增强中的D2PA的每个元件的作用(Li等Optics Express 2011 19，3925-3936)。

在4”融合硅石圆片上通过将纳米压印(自上而下)与自对准自组装(自下而上)组合的纳米制造方法制造D2PA结构。首先通过纳米压印和反应离子蚀刻在硅石圆片上形成立柱图案。然后，在垂直于圆片表面的方向上将薄金层蒸发到圆片上，这同时沉积立柱顶部的金纳米盘、金底板以及立柱侧壁上的金纳米点。沉积于立柱侧壁上的金比纳米盘顶部和底板上的金薄很多。此薄金为不稳定的并且在高蒸发温度下扩散；并且连同SiO2表面上的金的非润湿性特性一起，金自组装到在其之间具有小间隙并且邻近金纳米盘精确自对准的纳米点中。在其它部分描述D2PA结构和制造的其它详情(Li等，同上；Chou等Science 1996 272：85-87以及Chou等Applied Physics Letters 1995 67：3114-3116，这些文献全部都以引用的方式并入以用于那些教导)。

图20示出纳米装置盘连接立柱点天线阵列(D2PA)的扫描电子显微照片。具有70nm直径金属盘和侧壁上的大小范围为5nm至30nm的金属点结构的相同D2PA的(A)顶视图和(B)侧视图。以及具有100nm直径的金属盘和侧壁上的大小范围为1nm至15nm的金属点结构的另一个D2PA的(C)顶视图和(D)侧视图。在(C)中，四个盘中的两个丢失。两个D2PA均具有200nm的周期。

免疫测定、荧光团、粘附层和参考。免疫测定用于测试荧光的增强并且检测灵敏度为蛋白质A和人免疫球蛋白G(IgG)的直接测定，它们广泛用作此类测试的最简单模型测定。固体板表面上的蛋白质-A用作捕获剂，以捕获溶液中已经用红外荧光染料(IRDye800CW(Li-COR))标记的IgG(目标分析物)，从而不需要使用另外的检测剂。蛋白质A通过牢固Fc(片段，可结晶的)结合捕捉人IgG。然后，通过测量其荧光标签定量溶液中的IgG浓度。

因为蛋白质A不会结合D2PA板的金属表面孔，在金属与蛋白质A之间使用另外的粘附层。此粘附层会将另外的材料添加到间隔物中，并且可能减弱等离子体振子增强。为了限制总间隔物厚度同时提供蛋白质A与金属(在我们的情况下为金)的良好结合，使用二硫双十一烷酸琥珀酰亚胺酯(DSU)的自组装单层(SAM)作为粘附层。DSU分子具有牢固结合金表面的硫化物一端和良好结合蛋白质A的氨基²⁶的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基的另一端。SAM为约1.7nm厚，并且折射率为n＝1.50。与估计为4.8nm的蛋白质A层一起，总间隔物厚度为6.5nm。

对于与D2PA板免疫测定荧光增强测量相比，使用平玻璃板作为参考。以相同方式和相同批次准备D2PA板和参考上的免疫测定。

荧光团标签和免疫测定的准备。用本身的红外线荧光染料IRDye800CW标记人IgG(Rockland Immunochemicals)。通过将反应染料与IgG溶液混合并且使它们在20℃下在黑暗环境中反应2小时，将染料分子上的NHS酯基连接至IgG上的氨基。通过缓冲液更换经由使用脱盐旋转柱(Pierce Zeba)来分离游离的染料。每个IgG具有1.3IRdye800CW分子的平均值。

对于将DSU SAM涂覆在D2PA上，将板浸入到0.5mM DSU(Dojindo，Japan)在1，4-二噁烷(Sigma-Aldrich)中的溶液中，并且在室温下在密封容器中孵育过夜，以形成SAM间隔物。在孵育之后，在1，4-二噁烷中广泛地冲洗它们并且用氩气干燥，并且准备好用于蛋白质A固定。

将磷酸缓冲盐(PBS)缓冲液(pH＝7.4，Sigma-aldrich)中的蛋白质A(Rockland Immunochemicals)滴在D2PA和参考板上，并且在密封容器中在室温下将每个板孵育120min。然后在洗涤溶液(R&D系统)中将板洗涤3次，每次15分钟，以去除未结合的分子。在涂覆蛋白质A之后，将板切成5mm×5mm方形片，以用于测试。然后，将PBS溶液中的荧光标记的IgG随后滴到蛋白质A层上，并且在密封容器中在室温下孵育60min。在以相同方式进行另一次洗涤之后，在去离子水流中轻轻地冲洗板，以去除任何盐含量。在用氩气干燥之后，立即光学测量所述板。

为了精确控制所述板上的IgG浓度，首先通过系列稀释储备溶液(使用具有±0.6％不准确度的分配移液管)制备从1μM至10aM的不同浓度的PBS溶液中的IgG。然后将每个浓度的3μL溶液精确滴在单独的方形片上(每个片为5mm×5mm)。选择3μL体积以确保溶液层在完全润湿板顶部表面之后将不会泄漏到板的背面。

光学测量。使用具有785nm激光激发的商用激光扫描共焦分光计(ARAMIS，Horiba Jobin Yvon)测量在D2PA板和参考板上的免疫测定的平均荧光度。系统使用显微镜透镜将激发激光束正常聚集在样品表面并且使用相同透镜收集产生的荧光。激光束为处于快速光栅扫描(通过扫描检流计反射镜系统)中，以使区域(称为“激光扫描区域”)上的激发均匀，所述区域从激光光斑大小(衍射限制的焦点)变为100μm×100μm。通过使用x-y载台分步重复激光扫描区域，可自动测量高至20mm×20mm的样品区域。将来自样品的光学信号发送至由光栅和CCD组成的分光计中，以进行光谱测量。通常，使用10×物镜(数值孔径(N.A.)＝0.25)和100μm×100μm激光扫描区域。对于测量单个分子荧光，使用给出激发区域的光学信号的2D图的另一种光学装置。

结果和讨论I

D2PA板的等离子体振子共振。优化D2PA纳米结构以使其等离子体振子共振接近于激发激光的波长(785nm)以及免疫测定中使用的荧光染料(IRDye-800CW)的吸收和发射峰值(分别为780nm和800nm)。通过使用白色光源测量透射光谱(T)和反射光谱(R)获得D2PA的吸光度，并且校准为分别在玻璃板(T＝94％)和银镜标准(R＝98％)上进行的相同测量。对于没有任何分子涂覆的优化的D2PA板，发现吸光度(1-T-R)在795nmm下具有97％的共振峰并且在145nm半峰(FWHM)下具有共振全宽。在应用免疫测定之后，峰吸光度为98％，并且共振峰稍微蓝色偏移至788nm，并且FWHM为165nm-稍微较宽(图8)。蓝色偏移而不是常见的红色偏移(这也在另一种等离子体振子系统中观察到)归因于破坏性干扰来自表面等离子体的振荡极化的负分子极化度。

超过7,400倍的大面积平均荧光增强和良好均匀度(±9％变化)。图9中给出蛋白质A/IgG免疫测定在D2PA板和参考(平玻璃板)上的典型荧光光谱。在使用具有100μm×100μm)的激光扫描区域的10nM荧光标记的IgG的测定上测量两个光谱。激光功率和检测器积分时间对于D2PA为3μW和1秒，并且对于参考玻璃板为212μW和8秒；但是在绘制的图9中标准化。与玻璃参考样品相比，D2PA上的免疫测定荧光强度显著增强。在另一方面，与参考相比，荧光峰值波长为相同的(800nm)并且在半峰(FWHM)下的全宽几乎相同(约30nm)，这由于以下事实：D2PA等离子体振子共振具有其在788nm下优化的峰和约165nm的FWHM-比染料荧光峰宽5倍，从而使等离子体振子增强因子在IRDye800CW荧光的整个波长范围内几乎不变。

在D2PA板上超过参考(玻璃板)的免疫测定的平均荧光增强通过以下获得：

其中对于参考和D2PA板，I_{激发.参考}和I_激发.D2PA分别为激光激发的强度，并且I_{荧光.参考}和I_荧光.D2PA分别为测量的平均荧光强度。注意，对参考和D2PA二者使用相同IgG浓度测量平均荧光增强。这避免由不同IgG浓度的作用所引起的误差。此外，确保平均准确度，测量样品上的至少总计5个不同激光扫描区域(每个区域为100μm×100μm)。

使用以上方法，在10nM荧光标记的IgG下D2PA板的测量的平均荧光增强在比较荧光峰时为超过参考7,440倍，并且在荧光强度整合到荧光光谱的FWHM上时为7,220倍。图9示出平均荧光增强光谱具有比荧光光谱宽得多的FWHM，这与观察到的D2PA等离子体振子共振光谱相一致(图8)。对于100nM荧光标记的IgG浓度，平均峰值增强为8,460倍。在此观察的免疫测定荧光增强高于先前的免疫测定中的等离子体振子增强荧光两个数量级(Zhang等Optics Express2007 15 2598-2606；.Tabakman等Nature Communications 2011 2：466)。

D2PA的另一个重要特征为在大区域上的巨大平均荧光增强的均匀度。通过绘制整个D2PA板的5mm×5mm区域上的10nM荧光标记的IgG浓度的荧光强度图测量D2PA板的均匀度。使用激光扫描区域(100μm×100μm)，在图中称为“方块”；因此存在总计2,500个方块(50×50)(图10a)。激光功率为3μW并且每个方块的积分时间为一秒钟。在绘图测量中进行的统计显示，此大样品表面上的平均荧光增强为7,000倍，其中变化为(定义为高斯分布的变化)平均值的18％或±9％-在任何位置均非常均匀(图10b)。

对于以上测量中所使用的激光激发功率密度和激发时间，没有观察到饱和或显著的漂白，它们对于确保准确增强测量为必需的。实际上，发现来自D2PA和参考样品的荧光信号在广泛范围的激光功率密度和染料浓度下为线性的，这指示不饱和。此外，荧光对比时间测量显示，在所用激光强度下，即使持续比所用典型测量时间长很多的时间段，仍没有显著的漂白。

次毫微微摩尔检测灵敏度和宽动态范围。在临床诊断应用中，检测灵敏度(即，检测限(LoD))和动态范围具有比荧光增强因子更实际的意义。为了测试这些，测量来自用不同IgG浓度准备的D2PA和参考的免疫测定荧光信号：从1μM至10aM(其中系列稀释因子为10)。使用广泛接受的标准确定的LoD为与荧光信号相对应的IgG浓度，所述荧光信号等于背景光学噪声加上其三倍标准偏差(即，均方根差)。在我们的实验中，通过对空白样品进行与具有IgG的样品完全相同的光学测量(即，相同光学装置、样品区域、激光功率和积分时间)来获得背景光学噪声。在相同基底上使用相同制备方法制备空白样品，所述方法除用滴下纯缓冲溶液(即，无IgG)替代滴下荧光标记的IgG的正常步骤之外。

图11示出荧光信号对比沉积于D2PA和参比上的荧光标记IgG浓度的对数图(反应曲线)。误差条为从每个浓度的五个不同样品区域的测量值计算的标准偏差。为了确定LoD，首先使用五参数逻辑回归模型创建允许推测测量的数据点之间的数据点的拟合曲线。发现D2PA板上的免疫测定的LoD为0.3fM(3×10^-16M)，并且动态范围(其中荧光与IgG浓度成线性)超过八个(8)数量级(从1μM至1fM)(图11)。在另一方面，发现在参考板(平面玻璃板)上进行的相同免疫测定的LoD为0.9nM(0.9×10^-9M)。因此，与玻璃板相比，在D2PA板上检测灵敏度增强3,000,000倍(超过6个数量级)。此检测灵敏度增强为高于先前使用等离子体振子结构的作用两个数量级以上(Zhang等Optics Express 2007 15 2598-2606；Tabakman等Nature Communications 2011 2：466)。

信号分子荧光团在热点下的荧光增强高至4×10⁶倍。为了探索进一步增强荧光和检测灵敏度的可能性，从位于D2PA“热点”(即其中局部电场为最强的区域)的单个标记IgG分子计算免疫测定的荧光增强。当IgG分子彼此相距很远(即，极低IgG浓度)并且使用灵敏的CCD照相机时，此单个分子荧光可为可见的。

100pM的IgG浓度用于研究单个分子荧光，这给予两个固定的IgG之间约420nm的平均距离。使用具有40×物镜(N.A.＝0.6)的倒置显微镜(Nikon，USA)绘制免疫测定的二维荧光图。785nm激光束均匀地扩展，以照射D2PA板上的50μm×50μm区域。通过512×512像素分辨率(因此对于给定的激光扫描区域为每像素约390nm)的电子倍增电荷耦合装置(EM-CCD，Andor)连续收集图像。CCD像素大小过采样在光学衍射极限(通过瑞利判据确定为0.8μm)内成像的荧光强度分布。

从D2PA板上的100pM荧光标记的IgG的荧光成像(图12a)中，观察到在相同背景中任意分布的不同荧光“亮斑”。作为时间函数的单个亮斑的荧光强度显示具有二元逐步行为(图12b)，这指示在D2PA热点处或附近的单个分子首先发射荧光并且然后得到漂白。

为了评估在热点处的单个分子的荧光增强因子g_热点，我们使用两种方法。对于第一种方法，g_热点为在D2PA的“热点”处的单个分子荧光信号S_热点与参考样品上的每个分子的平均荧光信号(这等于参考样品上的面积平均荧光强度I_{参考.平均}除以参考样品上的每单位面积的平均IgG分子n_{参考.平均.})的比率：

其中I_激发.D2PA和I_{激发.参考}分别为D2PA和参考板的激发强度。根据图12(a)，S_热点＝1,200计数，I_{参考.平均}＝3,088个计数/μm²，并且n_参考.平 _均＝7.22×10⁵个分子/μm²，I_{参考.激发}＝1.74mW并且I_激发.D2PA＝110μW。发现荧光增强为g_热点＝4.4×10⁶，这大于“热点”³¹中单个分子的大部分报道的荧光增强3个数量级。

对于第二种方法，从D2PA板的每个分子的平均荧光强度(I_D2PA.平 _均/n_D2PA.平均)除以荧光增强因子(EF)推算出参考的每个分子的平均荧光增强。EF的整除测量来自D2PA板至常规玻璃板的信号：

对于I_D2PA.平均＝19计数、EF＝7,220和n_平均～7.22个分子/μm²，发现g_热点＝3.28×10⁶。两种方法给出一致的结果，以用于计算单个分子荧光增强。两种方法的平均值给出g_热点～4×10⁶。

巨大测定荧光和检测灵敏度增强和均匀度的来源。不希望受到任何具体理论的约束，认为观察到的荧光和检测灵敏度增强存在三个主要原因。第一个并且最重要的原因为独特的D2PA等离子体振子结构。第二个原因为适当极薄间隔物层。并且第三个原因为D2PA结构可将生物标志物集中到D2PA热点中的可能性。

同样不希望受到任何具体理论约束，认为等离子体振子结构D2PA通过四个关键性因素显著增强荧光。(1)3D天线阵列极其有效地接收激发光并且辐射荧光。如图8已示出的，优化的D2PA的测量的吸光度在785nm激发激光波长下为约97％。良好光吸收器也为良好辐射器。(2)D2PA中的小金属点和小间隙可将光强烈聚集至小区域，以显著增强局部电场，如SERS研究中已证明的(Li等，同上)。点和间隙越小，聚集(和局部电场增强)将会越强(Schuller等NatureMaterials 2010 9：193-204和Nie等Science 1997 275：1102-1106)。然而，也已熟知子波长大小的小金属结构为极差的光吸收器和辐射器(Fromm等Nano Letters 2004 4 957-961和Farahani等Physical ReviewLetters 2005 95，文章编号017402)。因此，仅小点和单独的间隙而没有天线将不能制成良好荧光增强器，因为它可集中小部分入射光子同时丢弃大部分光子，并且它不能将近场中产生的荧光有效地辐射到远场中。(3)D2PA天线与纳米结构之间通过其间的纳米间隔有效耦合，以制成有效接收和辐射光并且将光局部聚集到小斑点中的D2PA。并且(4)高密度天线、点和间隙允许较大百分比靶向分子处于热点附近，从而增加荧光平均增强和均匀度并且减小装置几何形状变化的性能灵敏度。由于最终等离子体振子增强为所有四个因素的产物，缺乏四个因素之一的任何等离子体振子结构可结束不好的等离子体振子增强器，这恰好是大部分先前的等离子体振子结构所遭受的问题并且是一起改进所有四个因素的D2PA优秀的确切原因。

为了使总体MEF荧光最大化，适当的极薄间隔物层在平衡荧光激发和通过相同金属淬火中起关键性作用。在其中仅D2PA金属与荧光团之间的间隔物为SiO2层(即，没有任何测定)的单独的实验中，发现5nm SiO2厚度提供MEF与淬火³⁰之间的最佳平衡。考虑到D2PA测定的总间隔物层厚度为6.5nm(不包括IgG)并且有效介电常数为3，此间隔物具有非常接近于5nm SiO2间隔物的总有效电介质距离。因此，自组装粘附层DSU的选择为MEF提供适当的间隔。

D2PA结构可将溶液中的生物标志物(目标分析物)集中到热点(即，大局部电场区域)中的该理论仅为推测的。三个可能的原因可解释此集中。(1)D2PA表面上的液体干燥将首先发生于立柱侧壁外，但是最后发生于间隙内。因此，在干燥期间的液体移动可将生物标志物从其它位置携带到间隙内。(2)在D2PA中局部构建的电场可将生物标志物(如果它们是极性分子)移动到热点中。并且(3)SAM粘附层DSU仅粘附金而不是SiO2，这可引起金纳米点上比未被金覆盖的SiO2侧壁更多的蛋白质A和因此更多的荧光标记的IgG。

需要讨论两种更重要的实验事实。(1)测量的免疫测定荧光信号强度不会像生物标志物浓度一样快地下降(即，不是1∶1比率)。荧光免疫测定已知的这种情况被认为是由以下事实所引起的：在孵育期间IgG与蛋白质A的结合和洗涤期间蛋白质A上结合的IgG的损失对于不同IgG浓度可为不同的。并且(2)通过D2PA(3,000,000)的检测灵敏度(LoD)增强高于10nM荧光标记的IgG的荧光增强(7,400)400多倍。我们怀疑这可能是因为溶液中的生物标志物集中到D2PA的热点中。

还应指出，已知通过等离子体振子结构的荧光增强取决于染料的固有量子效应(QE)：对于较低QE，具有较强增强。在低QE下，荧光增强与QE成反比。IRDye800cw染料具有7％的量子效应，与其它测定实验中使用的染料的QE相似。甚至当测量不同染料的QE的差异时，观察到的平均荧光增强仍高于先前的实验两个数量级。

最终，在热点处的单个荧光团的大荧光增强因子可指示如果将生物标志物置于热点中，则能进一步显著增加测定检测灵敏度。

材料和方法II

前列腺特异性抗原的超灵敏检测

纳米传感器(也称为：D2PA板)上的PSA免疫测定的准备。D2PA免疫测定板由两个部件组成：(1)上述D2PA等离子体振子纳米结构和(2)二硫双十一烷酸琥珀酰亚胺酯(DSU)顶部的蛋白质A层的混合自组装层。DSU分子通过牢固结合金的硫化物一端和良好结合蛋白质A氨基的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基的另一端来提供蛋白质A与金表面的牢固交联。这些分子层(蛋白质A和DSU)具有两个功能：(1)具有6.5nm的组合厚度，它们将用作可抑制金属荧光淬火作用的间隔物层；并且(2)由于抗体将通过其Fc区域结合蛋白质A，D2PA上的分子层可增加抗体定位和固定的量，这将进一步提高抗体的捕获效率。

对于在D2PA上涂覆DSU SAM和蛋白质A，将新制造的D2PA基底切成5mm×5mm片并且浸入到0.5mM DSU(Dojindo，Japan)于1，4-二噁烷(Sigma-Aldrich)中的溶液中，并且在室温下在密封容器中孵育过夜。在孵育之后，在1，4-二噁烷中广泛地冲洗D2PA基底并且用氩气干燥。立即将这些DSU涂覆的D2PA基底置于标准96-孔板(Pierce，USA)的分开的孔中。然后将它们浸入到100uL磷酸缓冲盐(PBS)溶液(pH＝7.2，Sigma-Aldrich)中的10ug/mL蛋白质A(RocklandImmunochemicals)中并且在4℃冰箱中在密封条件下孵育过夜。然后吸出溶液并且在洗涤溶液(R&D系统)中将各个单独的D2PA板洗涤3次，每次15分钟，以去除未结合的蛋白质A。然后在去离子水流中轻轻冲洗所述板，以去除任何盐含量。在用氩气干燥之后，D2PA免疫测定板准备好用于立即进行免疫测定测试或者储存在-20C下以用于随后的使用。

基于荧光的PSA夹心测定广泛用于研究和临床诊断二者，所述测定在D2PA免疫测定板上进行。首先通过将D2PA免疫测定板浸入到具有180ug/mL的浓度的100uL捕获抗体溶液中来固定捕获抗体(小鼠抗人激肽释放酶3)，并且在室温下孵育2小时。然后吸出溶液并且用洗涤缓冲液洗涤，然后通过浸入到100uL封闭溶液(R&D系统)中来封闭每个单独的板，并且在室温下孵育1小时。在相同吸出/洗涤过程之后，然后将每个孔中的D2PA板浸入到100uL PBS溶液中的浓度为10aM至10pM(稀释因子为10)的PSA(R&D系统)中。然后在室温下将它们孵育2小时。在另一次洗涤之后，将浓度为200ng/mL的100uL检测抗体(羊抗人激肽释放酶3)添加到每个单独的板中并且在室温下孵育1小时。然后再次重复吸出/洗涤过程并且将50ng/mL浓度的50uL稀释的IRDyeg00CW标记的链酶抗生物素蛋白(Rockland Immunochemicals)添加到每个D2PA板中，并且在室温下孵育1小时。在完成洗涤之后，在去离子水中轻轻冲洗D2PA板并且用氩气干燥。在进行免疫测定之后立即光学测量所述板。

对于与D2PA免疫测定板荧光增强和灵敏度提高的比较，使用蛋白质A涂覆的平面玻璃板作为参考。在参考上使用来自相同批次的试剂准备相同夹心PSA免疫测定并且以相同方式进行处理。

光学测量。使用具有785nm激光激发的商用激光扫描共焦分光计(ARAMIS，Horiba Jobin Yvon)测量在D2PA板和参考板二者上的基于荧光的PSA免疫测定。以正常角度测量样品表面上的激发光和荧光信号。系统使用相同显微镜透镜聚集激发激光束并且收集产生的荧光。激光束为处于快速光栅扫描(通过扫描检流计反射镜系统)中，以使区域(称为“激光扫描区域”)上的激发均匀，所述区域从激光光斑大小(衍射限制的焦点)变为100μm×100μm。通过使用x-y载台分步重复激光扫描区域，可自动测量高至20mm×20mm的样品区域。将来自样品的荧光信号耦合至由光栅和CCD组成的分光计中，以进行光谱测量。在此报道中，使用10×物镜(数值孔径(NA.)＝0.25)和100μm×100μm激光扫描区域并且测量整个5mm×5mm D2PA免疫测定板表面。

结果II

在大区域上超过1,700倍的巨大荧光增强和良好均匀度(±10％变化)。

图13示出在D2PA板和玻璃板参考上测量的PSA免疫测定的典型荧光光谱。两个光谱均在使用10pM PSA浓度的测定上获得。激光功率和检测器积分时间对于D2PA为3uW和10秒钟，并且对于参考玻璃板为212uW和8秒钟。对于参考玻璃板上的测量必须使用较大激光激发功率，以便获得具有良好信噪比(SNR)的光谱。对于以上测量中所使用的激光激发功率密度和激发时间，既没有观察到饱和也没有观察到显著的漂白，它们对于确保准确的增强因子测量为必需的。事实上，由于激光焦点的光栅扫描，荧光信号在长时间段内为恒定的-因此漂白作用在我们的实验中为最小化的。

在此评估的增强因子仍保持较高浓度。使用以上方法，当比较荧光峰值强度时，在10pM PSA下的测量的D2PA板平均荧光增强超过玻璃参考板1,700倍。

十阿摩尔(Atto-Molar)检测灵敏度和宽动态范围。为了证明巨大荧光增强将如何提高免疫测定灵敏度即LoD和动态范围，测量在D2PA和参考玻璃板上10aM至10pM(其中系列稀释因子为10)PSA浓度的PSA免疫测定荧光信号响应。使用广泛接受的标准确定的LoD为与荧光信号相对应的PSA浓度，所述荧光信号等于背景光学噪声加上其三倍标准偏差(即，均方根差)。在PSA免疫测定中，通过对测定进行完全相同的光学测量来获得背景光学噪声，在所述测定期间用纯PBS缓冲溶液(即，无PSA)置换PSA溶液同时准备方法的其它步骤保持相同。

图13示出作为对数标度的PSA浓度的函数的D2PA和参考板荧光免疫测定信号(即，反应曲线)。误差条为从五次重复(不同样品板具有相同免疫测定和相同PSA浓度)的测量值中计算的标准偏差。使用五参数逻辑回归函数创建拟合曲线，这允许推测测量的PSA浓度之间的数据点。然后确定在D2PA板的免疫测定的LoD为10aM(0.3fg/mL)，并且动态范围超过60(从1fM至1uM)。还发现在参考玻璃板上进行的相同免疫测定的LoD为0.9pM(27pg/mL)。因此，D2PA免疫测定板检测灵敏度与玻璃板相比增强90,000倍。此外，在此报道的检测灵敏度比先前使用竞争技术的报道好至少30倍。

乳腺癌生物标志物CEA和CA15.3的超灵敏检测

以上所述的纳米传感器已证明(a)分别为28aM(～0.8fg/mL)和0.001U/mL的癌胚抗原(CEA)(参见图14)和CA15.3(乳腺癌生物标志物)(参见图15)的LoD，这比商用ELISA试剂盒(CEA：R&D系统和CA15.3：Abcam)好3-5个数量级并且比临床截止电平(在血浆中，对于CEA为4ng/mL并且对于CA15.3为25U/mL)更灵敏5-6个数量级。(b)两个新测定具有8个动态级别的线性。

对于D2PA板上的改进的三层夹心CEA测定，当使用常规板读取器(面积平均荧光强度)时，在具有8级动态范围的缓冲液中分别获得28aM(～0.8fg/mL)的LoD(图14)。新测定的LoD比标准玻璃板上进行的相同测定好170,000倍；比目前最好的CEA免疫测定(例如，任意黄金岛)灵敏20倍；并且比血浆中的典型CEA水平(4ng/mL)灵敏5-6个数量级。

对于CA15.3免疫测定，已获得0.001U/mL的LoD(单位/毫升，1个单位为与维持的参考抗原制备物有关的任意值。U/mL与摩尔浓度之间的转化为不可用的)并且比血浆中的典型CA15.3水平(25U/mL)灵敏4-5个数量级。

阿尔兹海默病生物标志物β淀粉样蛋白1-40和1-42的超灵敏检测

新测定表明(a)缓冲液中β-淀粉样蛋白(Aβ)的LoD，对于Aβ42为2.3fM(103fg/mL)并且对于Aβ40为0.2fM(0.9fg/mL)；(b)超过8个动态级别的线性；(c)血清和唾液的尖峰和回收评定的回收率分别为88％和106.8％；(d)Aβ40与Aβ42(对于1pg/ML Aβ42浓度)的0.06％交叉反应；以及(e)Aβ42在血液和唾液二者中的一致和重复检测。参见图16和图17。

在检测Aβ-42中，普通96板底部用新测定板置换；并且改进商用“Aβ-42和40ELISA试剂盒”(Covance USA)，其中通过生物素-抗生物素蛋白反应(在我们的测定中没有使用酶)仅将商用链酶抗生物素蛋白缀合的荧光(IRDye800CW)标签(Rockland USA)连接至Covance生物素化检测抗体(试剂)。然后同样使用试剂盒的其余部分，并且然后进行常规方法。在Covance试剂盒中的捕获剂和检测剂对于Aβ-42分别为6E10和抗-Aβ42，并且对于Aβ-40分别为6E10和抗-Aβ40。

用于Aβ测定中的捕获剂和检测剂为二硫双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)(DSU)和蛋白质A。DSU具有牢固结合D2PA上的金表面的硫化物的一端和良好结合蛋白质A上的氨基的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的另一端，所述蛋白质A进而通过Fc区域结合捕获抗体。

(a)具有8级动态范围的次-100fM检测限(LoD)。在D2PA板上的第一测试中，使用蛋白质A和荧光标记的IgG的两层模型免疫测定，并且获得超过玻璃板一百万多倍(x10⁶)的LoD增强。参见图11。对于D2PA板上的改进的三层夹心Aβ测定，当使用常规板读取器(面积平均荧光强度)时，在具有8级动态范围的缓冲液中分别获得用于检测Aβ42和Aβ40的2.3fM(10.3fg/mL)和0.2fM(0.9fg/mL)的LoD。新测定的LoD比标准玻璃板上进行的相同测定好5,000倍；比目前最好商用Aβ测定(例如，Meso Scale Discovery)灵敏500倍；并且比血浆中典型水平Aβ-42和Aβ-40(C_Aβ42～50pg/mL，C_Aβ40～200pg/mL)灵敏约4和5个数量级；并且分别比唾液中(C_Aβ42～5pg/mL和C_Aβ40～25pg/mL)灵敏约3和4个数量级。

(b)已在所有测试中获得8个动态级别的良好线性(参见，例如图11)。

(c)在D2PA板上对Aβ-42免疫测定进行的尖峰和回收测试中获得血浆的88％回收率和人唾液的102％回收率。(参见，例如，图16)

(d)已获得在1pg/mLAβ浓度下超过Aβ40的Aβ42免疫测定的0.06％交叉反应性和在较高Aβ浓度下好很多的交叉反应性(图17)

(e)已证明在D2PA板上的Aβ免疫测定(图18)和D2PA上的其它测定的优异平行性。实际上，已进行2个独立的生产运行并且获得一致的结果。

超灵敏DNA杂交测定

使用D2PA纳米装置的增强的DNA杂交测定的实施例之一为夹心杂交测定。捕获DNA为在其5’-端具有硫醇官能团的单链DNA。(3’-GAAGAAGATAGACTTACATG-5’-SH)检测DNA为在其3’-端具有荧光标签官能团例如IRDye800CW的单链DNA(IR800-3’-TTTGGCTTGTGGTAGTTAGA-5’)。捕获DNA和检测DNA二者均具有20bp的长度。它们用不同的序列合成，以在不同区域形成与目标DNA的互补结合。目标DNA为5’-ACCGAACACCATCAATCTCTTCTATCTGAATGTACTTTTT-3’)

首先，通过使用用具有1M NaCl浓度的1X TE缓冲液稀释的5μM DNA溶液孵育D2PA纳米装置，将捕获DNA固定于D2PA纳米装置金属表面。然后，在DNA杂交缓冲液(H7140，Sigma-Aldrich)中稀释目标DNA并且将其添加到纳米装置中，以与捕获DNA杂交。控制杂交温度为低于35℃的温度。最后，将具有100μM浓度的荧光标记的检测DNA添加到纳米装置中，以与固定的目标DNA杂交。杂交缓冲液和温度与最后步骤保持相同。在洗去未结合的检测DNA之后，测量从纳米装置表面发出的荧光信号，以进行目标DNA分子的检测和定量。

我们测量了来自使用不同浓度的目标DNA的DNA杂交测定的荧光信号强度。图19示出在D2PA纳米装置上进行的杂交测定的荧光反应曲线(标准曲线)。计算为背景信号加上背景信号的三倍标准偏差的检测限为71fM。

Claims

1.一种纳米装置，其包括：

(a)基底；以及

(b)一个或多个从所述基底表面延伸的立柱，其中所述立柱中的至少一个包括：

i.所述立柱顶部的金属盘；

ii.所述立柱底部的金属底板，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的所述基底表面的大部分；

iii.所述立柱侧壁上的金属点结构；以及

iv.覆盖所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分的分子粘附层；

其中所述纳米传感器放大所述粘附层外表面近端的光信号。

2.如权利要求1所述的纳米装置，其中所述分子粘附层的所述外表面包含选自以下的捕获剂反应基团：胺反应基团、硫醇反应基团、羟基反应基团、咪唑基反应基团以及胍基反应基团。

3.如权利要求2所述的纳米装置，其中所述捕获剂反应基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤素取代的苯酚酯、五氟苯酚酯、硝基取代的苯酚酯、酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯、马来酰亚胺、碘代乙酰基、酰肼、醛或环氧化物。

4.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述分子粘附层通过金属-硫键连接至所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板。

5.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述分子粘附层具有0.5nm至50nm的厚度。

6.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述分子粘附层为烷硫醇或硫-聚(乙二醇)的单层。

7.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述分子粘附层通过链酶抗生物素蛋白/生物素相互作用连接至所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板。

8.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述分子粘附层的所述外表面包含生物素部分或链酶抗生物素蛋白。

9.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板的外表面包含可结合生物素化捕获剂的链酶抗生物素蛋白基团。

10.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板的外表面包含可结合链酶抗生物素蛋白连接的捕获剂的生物素部分。

11.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述纳米传感器设置在容器内。

12.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中，其中所述分子粘附层为自组装单层(SAM)，其中所述SAM的每个分子包括三个部分：(i)对所述纳米装置的金属表面具有特异性亲和力的头部基团、(ii)对所述捕获剂具有特异性亲和力的末端基团、以及(iii)连接所述头部基团与所述末端基团的接头，其中所述接头的长度决定所述金属表面之间的平均间隔并且连接的捕获剂可影响所述纳米装置的光放大。

13.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属选自金、银、铜、铝、其合金及其组合。

14.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述立柱的所述顶部具有选自以下形状：圆形、多边形、锥形、椭圆形、细条形或其任何组合。

15.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属盘的横向尺寸范围为5nm至150nm。

16.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属盘与所述金属底板以范围为0.1nm至60nm的距离间隔。

17.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述至少一个金属点结构具有范围为1nm至25nm的尺寸。

18.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属点结构与所述金属盘之间的距离和所述金属点结构与所述金属底板之间的距离的范围为0.5nm至50nm。

19.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述多个立柱的两个最近的立柱之间的所述间隔的范围为2nm至200nm。

20.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述立柱具有柱状、倾斜或弯曲的侧壁表面。

21.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属盘和金属底板的厚度为5nm至60nm之间。

22.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述立柱具有小于所述光的波长的横向尺寸或高度。

23.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属盘具有与所述立柱基本上相同的横向几何形状。

24.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述立柱包括选自的电介质或半导体材料：聚合物、二氧化硅、氮化硅、氧化铪、氧化铝、硅、砷化镓以及氮化镓。

25.如任一项前述权利要求所述的纳米装置，其中所述金属盘的所述横向尺寸小于所述光的所述波长。

26.一种制造纳米传感器的方法，其包括：

将捕获剂连接至如权利要求1所述的纳米装置的所述分子粘附层。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述捕获剂为蛋白质或核酸。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述捕获剂为抗体。

29.如权利要求26或27所述的方法，其中所述捕获剂为寡核苷酸。

30.一种纳米传感器，其包括：

(a)如权利要求1所述的纳米装置；以及

(b)特异性结合分析物的捕获剂，其中所述捕获剂连接至所述纳米装置的所述分子粘附层；

其中当分析物结合所述捕获剂时，所述纳米传感器放大来自所述分析物的光信号。

31.如权利要求30所述的纳米传感器，其中所述光信号为冷光或荧光。

32.如权利要求30或31所述的纳米传感器，其中所述捕获剂为蛋白质。

33.如权利要求32所述的纳米传感器，其中所述捕获剂为抗体。

34.如权利要求30或31所述的纳米传感器，其中所述捕获剂为核酸。

35.如权利要求34所述的纳米传感器，其中所述捕获剂为寡核苷酸。

36.如权利要求30至35中任一项所述的纳米传感器，其进一步包括特异性结合所述捕获剂的标记的分析物。

37.如权利要求36所述的纳米传感器，其中所述标记的分析物用发光标签直接或间接标记。

38.如权利要求37所述的纳米传感器，其中所述标记的分析物通过链酶抗生物素蛋白/生物素相互作用连接至所述发光标签。

39.如权利要求30至38中任一项所述的纳米传感器，其中选择所述分子粘附层的厚度以优化所述光信号的放大。

40.如权利要求30至39中任一项所述的纳米传感器，其中纳米传感器处于多孔格式中，其中多孔板的每个孔包含如权利要求30所述的纳米传感器，其中每一个所述孔中的所述纳米传感器包含不同捕获剂。

41.一种系统，其包括：

(a)如权利要求30所述的纳米传感器；

(b)用于所述纳米传感器的固定器；

(c)从标签诱导光信号的激发源；以及

(d)适用于读取所述光信号的读取器。

42.如权利要求41所述的系统，其中所述激发源为光源。

43.如权利要求41所述的系统，其中所述激发源为电流。

44.如权利要求41至43中任一项所述的系统，其中所述读取器为能够产生所述纳米传感器的表面的二维光谱图的光检测器、CCD照相机、CMOS照相机、分光计或光学传感器。

45.如权利要求41至44中任一项所述的系统，其中所述纳米传感器处于多孔格式中，并且可移动所述固定器和/或所述读取器，以使得读取器可独立地读取来自每个所述孔的光信号。

46.一种检测和/或定量分析物的方法，其包括：

(a)将捕获剂连接至如权利要求1所述的纳米装置的所述分子粘附层，以产生纳米传感器；

(b)将包含目标分析物的样品与所述纳米传感器接触，其中所述目标分析物特异性结合所述捕获剂，并且所述接触是在适于所述结合的条件下进行的；以及

(c)读取来自结合所述纳米传感器的任何目标分析物的光信号；

其中所述方法进一步包括在所述目标分析物结合所述捕获剂之前或之后用发光标签标记所述目标分析物。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述读取使用光、电、化学或其组合将激发应用于所述发光标签，并且测量选自强度、波长和位置的所述光信号的至少一种特性。

48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述分析物在结合所述纳米传感器的所述捕获剂之后标记。

49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述标记通过将所述目标分析物结合检测剂来进行，所述检测剂特异性结合所述目标分析物并且连接至发光标签。

50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述发光标签结合所述捕获剂之后标记所述发光标签，其中所述方法进一步包括在所述读取之前从所述纳米传感器中去除任何未结合的发光标签。

51.如权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述检测剂为包含发光标签的二次抗体。

52.如权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述检测剂为包含发光标签的核酸。

53.如权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述发光标签为荧光、化学冷光或电致冷光标签。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述发光标签用IRDye800CW、Alexa 790或Dylight 800标记。

55.如权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述标签发出波长范围为300nm至1200nm的光。

56.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述接触步骤(b)之前封闭所述纳米传感器，从而防止所述捕获剂非特异性结合非目标分析物。

57.如权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述样品为液体样品。

58.如权利要求46至57中任一项所述的方法，其中所述样品为临床样品。

59.如权利要求46至58中任一项所述的方法，其中所述样品源于体液。

60.如权利要求46至59中任一项所述的方法，其中所述分析物为蛋白质。

61.如权利要求46至59中任一项所述的方法，其中所述捕获剂和所述分析物为核酸。

62.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述分析物为癌症生物标志物。

63.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述分析物为神经病的生物标志物。

64.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述分析物为心血管疾病的生物标志物。

65.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述分析物为器质性疾病的生物标志物。

66.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述分析物为传染病或寄生虫病的生物标志物。

67.一种用于制造如权利要求1所述的纳米装置的方法，其包括：

(a)在基底顶部表面形成至少一个立柱图案；

(b)沉积所述顶部表面的金属材料层；

(c)允许沉积于立柱顶部的所述金属材料形成盘、沉积于立柱底部的所述金属材料形成金属底板以及沉积于侧壁的所述金属材料形成至少一个金属点结构；

(d)在所沉积的金属材料顶部沉积分子粘附层，其中所述分子粘附层覆盖所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分，并且其中所述分子粘附层的外表面包含捕获剂反应基团。

68.如权利要求67所述的方法，其进一步包括：

将捕获剂连接至所述分子粘附层。

69.如权利要求67或68所述的方法，其中所述形成图案为材料的压花。

70.一种诊断疾病或病状的方法，其包括：

(a)从怀疑患有所述疾病或病状的患者中获得液体样品；

(b)将所述样品与如权利要求1所述的纳米传感器接触，其中所述纳米传感器的所述捕获剂特异性结合所述疾病的生物标志物并且其中所述接触在适于所述生物标志物与所述捕获剂的特异性结合的条件下进行；

(c)去除未结合所述捕获剂的任何生物标志物；以及

(d)读取来自与所述纳米传感器保持结合的生物标志物的光信号，其中光信号指示所述患者患有所述疾病或病状；

其中所述方法进一步包括在所述生物标志物结合所述捕获剂之前或之后用发光标签标记所述生物标志物。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述患者被怀疑患有癌症并且所述抗体结合癌症生物标志物。

72.如权利要求70所述的方法，其中所述患者被怀疑患有神经障碍并且所述抗体结合所述神经障碍的生物标志物。

73.如权利要求70至72中任一项所述的方法，其中所述液体样品包括羊水、房水、玻璃状液、全血、分离的血液、血浆、血清、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜粘液、内淋巴液、外淋巴液、排泄物、胃酸、胃液、淋巴液、黏液(包括鼻排出物和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓汁、发炎性分泌物、唾液、皮脂(皮肤油脂)、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿或呼气冷凝物。

74.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述传感器用于检测或定量与疾病状态相关的化学化合物或生物分子。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述疾病为癌症、心脏疾病、肺病、肾病或精神病。

76.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述传感器用于检测或定量微生物。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述微生物为来自环境或临床样品的病毒、真菌或细菌。

78.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述传感器用于检测或定量对食品安全或国家安全造成危害的化学化合物或生物实体。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述化学化合物或生物实体为有毒废物或炭疽。

80.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述传感器用于定量医学或生理监测中的生命参数。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述生命参数为葡萄糖、血氧水平或总血细胞计数。

82.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述传感器用于检测或定量来自生物样品的特异性DNA或RNA。

83.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述传感器用于测序和比较染色体或线粒体中的DNA的基因序列。