CN110088281A - 用于多核苷酸合成的纹理化表面 - Google Patents

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Abstract

本文针对用于从头多核苷酸合成的表面提供了方法、装置和系统，该从头多核苷酸合成提供增加的多核苷酸产量。本文所述的表面包含增加表面积的纹理，与非纹理化表面相比，其提供增加的多核苷酸产量。另外，核苷偶联试剂跨越这类表面的图案化放置提供了提高的合成产量、呈现，以及表面上不同多核苷酸种类之间的污染的减少。

Description

用于多核苷酸合成的纹理化表面
交叉引用
本申请要求于2016年8月3日提交的美国临时申请号62/370,548的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如具体地和个别地指出每一单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
背景技术
具有高保真度和低成本的高效化学基因合成在生物技术和医学以及基础生物医学研究中发挥核心作用。从头基因合成是基础生物学研究和生物技术应用的强大工具。尽管已知用于以小规模合成相对较短片段的各种方法，但这些技术在可扩展性、自动化、速度、精确度和成本方面却不尽人意。需要用于保证所需基因的成功合成并适于自动化的简单、可重现、可扩展、不易出错并具成本效益的方法的装置。
发明内容
本文提供了用于多核苷酸合成的装置，所述装置包含：包含表面的固体支持物；在所述表面上的多个座位，其中每个所述座位包含：内部区域，其中所述内部区域包含多个凹陷或突起，以及包含多个第一分子的外部区域，其中所述外部区域跨越并延伸超出所述内部区域，并且其中每个所述第一分子均结合至所述表面并包含能够与核苷结合的反应性基团。本文进一步提供了一种装置，其中所述多个座位排列成簇。本文进一步提供了一种装置，其中每个簇包含50至500个座位。本文进一步提供了一种装置，其中每个簇包含约121个座位。本文进一步提供了一种装置，其中所述外部区域的直径为至多100um。本文进一步提供了一种装置，其中所述外部区域的直径为约60um。本文进一步提供了一种装置，其中所述内部区域的直径为约55um。本文进一步提供了一种装置，其中所述内部区域的直径是所述外部区域的直径的80％至95％。本文进一步提供了一种装置，其中所述内部区域的直径比所述外部区域的直径短2um至20um。本文进一步提供了一种装置，其中所述内部区域的直径比所述外部区域的直径短约5um。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述凹陷或突起的蚀刻深度为100um至1000nm。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述凹陷或突起的蚀刻深度为200um至500nm。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述凹陷或突起的宽度为100至500um。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述凹陷或突起的宽度为300至330um。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述凹陷或突起的间距长度是所述凹陷或突起的宽度的约2至3倍。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述凹陷或突起的深度是间距长度的约60％至125％。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述凹陷或突起的间距为至多1um。本文进一步提供了一种装置，其中所述固体支持物的拉伸强度为1MPa至300MPa。本文进一步提供了一种装置，其中所述固体支持物的拉伸强度为1MPa至10MPa。本文进一步提供了一种装置，其中所述固体支持物的刚度为1GPa至500GPa。本文进一步提供了一种装置，其中所述固体支持物的刚度为1GPa至10GPa。本文进一步提供了一种装置，其中所述固体支持物包括尼龙、硝酸纤维素或聚丙烯。本文进一步提供了一种装置，其中所述固体支持物包括硅、二氧化硅、氮化硅、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、金或铂。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述第一分子均为硅烷。本文进一步提供了一种装置，其中所述硅烷为氨基硅烷。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述第一分子均为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。本文进一步提供了包含多个第二分子的装置，其中多个第二分子位于围绕每个所述座位的外部区域的区域中的表面上，并且其中每个第二分子结合至所述表面但缺少能够与核苷结合的反应性基团。本文进一步提供了一种装置，其中每个所述第二分子为氟硅烷。本文进一步提供了一种装置，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷、全氟辛基三氯硅烷、全氟辛基三乙氧基硅烷或全氟辛基三甲氧基氯硅烷。
本文提供了多核苷酸合成方法，其包括：
提供多核苷酸的预定序列；提供如权利要求1至27中任一项所述的装置；以及合成所述多核苷酸。本文进一步提供了一种方法，其中所述多核苷酸包括至少30,000种不相同的多核苷酸。本文进一步提供了一种方法，其中所述至少30,000种不相同的多核苷酸编码至少750个基因。本文进一步提供了一种方法，其中与所述多核苷酸的所述预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸的总错误率小于1/1000个碱基。本文进一步提供了一种方法，其中与所述多核苷酸的所述预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸的总错误率小于1/1500个碱基。本文进一步提供了一种方法，其中与所述多核苷酸的所述预定序列相比，至少30,000种不相同的多核苷酸中的至少80％没有错误。本文进一步提供了一种方法，其中与所述多核苷酸的预定序列相比，至少30,000种不相同的多核苷酸中的至少89％没有错误。
本文提供了基因合成方法，其包括：提供多核苷酸的预定序列；提供如权利要求1至27中任一项所述的装置；合成所述多核苷酸；以及组装所述多核苷酸以形成多个基因。本文进一步提供了一种方法，其进一步包括在步骤(d)之前释放所述多核苷酸。
本文提供了用于多核苷酸合成的系统，所述系统包含：材料沉积装置，其包含用于多核苷酸合成的多种试剂和用于沉积所述用于多核苷酸合成的多种试剂的多个喷嘴；用于控制所述用于多核苷酸合成的多种试剂从所述多个喷嘴中的释放的计算机；以及用于合成多核苷酸的如权利要求1至27中任一项所述的装置。
附图说明
图1A描绘了座位簇的16x 16阵列。
图1B描绘了座位簇的排列。
图1C描绘了座位簇内的座位的示例性排列。
图2A描绘了包含凸起纹理特征阵列的示例性纹理化座位的横截面图。
图2B描绘了包含凹陷纹理特征阵列的示例性纹理化座位的横截面图。
图3A描绘了纹理化座位的示例性排列的顶视图。
图3B描绘了示例性纹理化座位的顶视图。
图4A描绘了一侧抛光的示例性装置。
图4B描绘了在示例性装置上平版印刷的过程。
图4C是通过平版印刷形成的示例性装置的凹陷特征。
图4D图示了对示例性装置进行氧化的过程。
图4E图示了使用非光敏物(photosensitive lack)对示例性装置进行平版印刷的过程。
图4F图示了对示例性装置进行氧化物蚀刻以形成具有基准结构的纹理化硅表面的过程。
图5图示了具有图案化表面的示例性装置，该图案化表面包含涂覆有用于与核苷偶联的分子的座位，其中该座位被涂覆有不与核苷偶联的试剂的区域围绕。
图6A-6F图示了用于产生核苷偶联剂密度降低的表面的示例性方法。
图6A图示了用氧等离子体清洁示例性装置的过程。
图6B图示了用非光敏物涂覆示例性装置的过程。
图6C图示了光学地平版印刷示例性装置的过程。
图6D图示了在示例性装置的暴露表面上沉积第一分子的过程。
图6E图示了剥离非光敏物的过程。
图6F图示了将第三分子结合到示例性装置的表面的过程。
图7A图示了用于多核苷酸合成的示例性装置的表面区域，其涂覆有结合至表面并与核苷偶联的硅烷。
图7B图示了用于多核苷酸合成的示例性装置的表面区域，其涂覆有硅烷的混合物，一种硅烷结合至表面并与多核苷酸偶联，另一种硅烷结合至表面而不与核苷偶联。
图8A-8G图示了用于产生核苷偶联剂密度降低的表面的示例性方法。
图8A图示了用氧等离子体清洁示例性装置的过程。
图8B图示了用第一化学层涂覆示例性装置的过程，该第一化学层结合至装置的表面并结合核苷。
图8C图示了用非光敏物涂覆示例性装置的过程。
图8D图示了光学地平版印刷示例性装置的过程。
图8E图示了对第一化学层进行图案化的过程。
图8F图示了根据本公开内容的实施方案沉积第二化学层的过程，该第二化学层包含结合至表面但不结合示例性装置表面上的核苷的分子。
图8G图示了剥离非光敏物的过程。
图9是说明从寡核苷酸合成到基因装运的示例性过程工作流的示图。
图10图示了用于核酸合成的示例性系统的略图，该系统包含多核苷酸合成仪、装置(晶片)、概述了系统元件在多个方向上的对齐的示意图，以及用于试剂流动的示例性设置。
图11图示了用于寡核苷酸合成的示例性亚磷酰胺化学过程。
图12图示了具有基准标记的示例性装置。
图13图示了具有基准标记的另一种示例性装置。
图14图示了示例性计算机系统。
图15是图示示例性计算机系统的第一架构的框图。
图16是说明示例性网络的示图，该网络被配置用于并入多个计算机系统、多个蜂窝电话和个人数据助理，以及网络附加存储(NAS)。
图17是使用共享虚拟地址存储空间的示例性多处理器计算机系统的框图。
图18是示例性纹理化微流体装置的图像。
图19是示例性纹理化微流体装置的另一图像。
图20是示例性纹理化微流体装置的近景图像。
图21是示例性纹理化微流体装置的切片的侧视图。
图22A是示例性纹理化微流体装置的扫描电子显微照片。
图22B是示例性纹理化微流体装置的扫描电子显微照片。
图23A是示例性非纹理化座位簇的低放大倍数图像。
图23B是示例性纹理化座位簇的低放大倍数图像。
图24A是示例性非纹理化座位簇的高放大倍数图像。
图24B是示例性纹理化座位簇的高放大倍数图像。
图25A图示了外纹理化座位的示例性排列。
图25B图示了示例性外纹理化座位。
图26A图示了包含凸起纹理特征阵列的排列的示例性外纹理化座位的横截面图。
图26B图示了包含凹陷纹理特征阵列的排列的示例性外纹理化座位的横截面图。
图27A是示例性外纹理化座位簇的低放大倍数图像。
图27B是示例性外纹理化座位簇的高放大倍数图像。
图28图示了具有纹理化座位簇的图案的示例性纹理化微流体装置。
图29A-29D是分配到纹理化座位簇的示例性纹理化微流体装置图案上的小液滴的图像，该图案与图28的排列一致。
图29A描绘了分配到示例性纹理化微流体装置上的200nL小液滴的图像。
图29B描绘了分配到示例性纹理化微流体装置上的275nL小液滴的图像。
图29C描绘了分配到示例性纹理化微流体装置上的350nL小液滴的图像。
图29D描绘了分配到示例性纹理化微流体装置上的425nL小液滴的图像。
图30A是描绘包含纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的第一示例性装置的遗漏率(dropout rate)的图表。
图30B是描绘包含纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的第二示例性装置的遗漏率的图表。
图30C是描绘包含纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的第三示例性装置的遗漏率的图表。
图30D是描绘包含纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的第四示例性装置的遗漏率的图表。
图31A图示了示例性功能化表面。
图31B显示了在示例性功能化表面上的五个位置处的BioAnalyzer数据。
图32显示了在示例性硅寡核苷酸合成装置上合成的表面提取的100-聚体寡核苷酸的BioAnalyzer数据。
图33表示示例性序列比对，其中“x”表示单碱基缺失，“星号”表示单碱基突变，而“+”表示Sanger测序中的低质量点。
图34表示示例性序列比对，其中“x”表示单碱基缺失，“星号”表示单碱基突变，而“+”表示Sanger测序中的低质量点。
图35是编码240个基因的寡核苷酸的示例性直方图，其中寡核苷酸的长度为x轴，寡核苷酸的数目为y轴。
图36是共同编码基因的多核苷酸的示例性直方图，其中寡核苷酸的长度为x轴，寡核苷酸的数目为y轴。
图37A图示了当合成表面时，对于30、50和80-聚体的多核苷酸，每个装置的DNA厚度的示例性图。
图37B图示了当合成表面时，对于30、50和80-聚体的多核苷酸，每个装置的DNA质量的示例性图。
图38图示了对于多种硅烷溶液，在给定的合成寡核苷酸指数下的缺失率。
图39图示了深度为500um的多种纹理化微流体装置的平均缺失和插入率。
图40图示了多种示例性纹理化微流体装置的测量的和预期的产量增加。
图41图示了在具有不同蚀刻深度的示例性纹理化微流体装置上的四种核酸碱基的缺失率。
图42图示了具有不同蚀刻深度的示例性纹理化微流体装置根据纹理类型的相对缺失率。
图43图示了具有不同蚀刻深度的示例性纹理化微流体装置根据纹理深度的相对缺失率。
图44图示了在具有不同蚀刻深度的示例性纹理化微流体装置上，四种核酸碱基根据碱基的插入率。
图45示出了与非纹理化设计相比，示例性纹理化微流体装置根据基质纹理类型的相对插入率。
具体实施方式
本公开内容提供了用于以低错误率快速平行合成多核苷酸文库的系统、方法、装置。本文所述的寡核苷酸合成步骤是“从头的”，意指以一次一个单体的方式构建寡核苷酸以形成聚合物。在从头合成多核苷酸期间，从表面延伸的单链多核苷酸的拥挤导致错误率增加。为了减少与拥挤相关的错误的频率，本文提供了降低结合到表面的特定区域的核苷偶联剂密度的方法。同时，为了补偿从表面延伸的多核苷酸的密度降低，本文公开了增加表面积以便增加合成多核苷酸产量的方法。
定义
贯穿本公开内容，数值特征以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简明，而不应被解释为对任何实施方案范围的硬性限制。相应地，对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的单个数值，除非上下文另有明确规定。例如，诸如从1至6的范围描述应被认为已经明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的单个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本发明之中，但受制于所声称范围中的任何被明确排除的限值。当所声称范围包括限值中之一或全部两者时，排除了这些包括的限值中之一或全部二者的范围也被包括在本发明中，除非上下文另有明确规定。
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制任何实施方案。除非上下文另有明确规定，否则如本文所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也预期包括复数形式。将进一步理解的是，术语“包括”和/或“包含”在本说明书中使用时指定所述特征、整体、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个特征、整体、步骤、操作、元件、组件和/或其群体。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何或所有组合。
除非特别说明或从上下文中明显看出，否则如本文所使用的，关于数字或数字范围的术语“约”应理解为所述数字及其数字+/-10％，或对于范围列出的值低于所列下限的10％且高于所列上限的10％。
本文所使用的，术语“预选序列”、“预限定序列”或“预定序列”可互换使用。该术语意指在聚合物的合成或组装之前，聚合物的序列是已知和选定的。具体地，本发明的多个方面主要就核酸分子的制备在本文中进行了描述，寡核苷酸或多核苷酸的序列在核酸分子合成或组装之前已知和选定的。
本文提供了用于产生合成(即从头合成或化学合成)多核苷酸的方法和组合物。贯穿全文，术语寡核苷酸(oligonucleotide)、寡核苷酸(oligo)和多核苷酸被定义为同义词。本文所述的合成多核苷酸的文库可包含共同编码一种或多种基因或基因片段的多种多核苷酸。在一些情况下，多核苷酸文库包含编码序列或非编码序列。在一些情况下，多核苷酸文库编码多种cDNA序列。cDNA序列所基于的参考基因序列可含有内含子，而cDNA序列不含外显子。本文所述的多核苷酸可编码来自生物体的基因或基因片段。示例性生物体包括但不限于原核生物(例如，细菌)和真核生物(例如，小鼠、兔、人和非人灵长类动物)。在一些情况下，多核苷酸文库包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸中的每一种编码多种外显子的序列。本文所述的文库内的每种多核苷酸可以编码不同的序列，即，不相同的序列。在一些情况下，本文所述的文库内的每种多核苷酸包含至少一个与该文库内另一种多核苷酸的序列互补的部分。除非另有说明，否则本文所述的多核苷酸序列可包括DNA或RNA。
本文提供了用于产生合成(即从头合成)基因的方法和组合物。包含合成基因的文库可以通过本文其他部分进一步详述的各种方法构建，例如PCA、非PCA基因组装方法或分层基因组装，将两条或更多条双链多核苷酸组合(“缝接”)以产生更大的DNA单元(即，底盘)。大构建体的文库可包含长度为至少1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500kb或更长的多核苷酸。大构建体可被独立选择的约5000、10000、20000或50000个碱基对的上限约束。任意数目的编码多肽区段的核苷酸序列的合成，该序列包括编码非核糖体肽(NRP)的序列，编码以下物质的序列：非核糖肽合成酶(NRPS)模块和合成变体、其他模块化蛋白质如抗体的多肽区段、来自其他蛋白质家族的多肽区段，包括非编码DNA或RNA，如调控序列，例如启动子、转录因子、增强子、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、衍生自微RNA的核仁小RNA，或感兴趣的任何功能性或结构性DNA或RNA单元。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、基因间DNA、由连锁分析限定的基因座(多个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核仁小RNA、核酶、互补DNA(cDNA)(其为mRNA的DNA表现形式，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增获得)；经合成或通过扩增产生的DNA分子、基因组DNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。编码本文提及的基因或基因片段的cDNA可包含至少一个编码外显子序列的区域，而没有在相应基因组序列中发现的介于之间的内含子序列。或者，cDNA的相应基因组序列可能最初缺少内含子序列。
除非另有说明，否则本文提及的水接触角对应于将会在所讨论的表面的非弯曲、光滑或平面的等价物上进行的测量。
簇和座位
本文提供了包含表面的装置，其中该表面被修饰用于在预定的位置并且以低错误率、低遗漏率、高产量和高寡核苷酸呈现来支持多核苷酸合成。在一些实施方案中，表面包含多个座位，其中每个座位包含沉积在该座位上的多个第一分子，其中第一分子结合至表面并包含能够与核苷结合的反应性基团。
如本文所使用的，术语“座位”(“locus”)和“座位”(“loci”)分别指装置表面上的单个离散活性区域和多个离散活性区域，其中多个第一分子沉积在所述座位上，其中第一分子结合至表面并包含能够与核苷结合的反应性基团。在一些实施方案中，多个第一分子包括一个分子或分子混合物，该分子结合至表面并包含能够结合核苷的反应性基团。
参照图1A至1C，本文提供的示例性装置100包含表面101，其中表面101包含多个座位110，其中每个座位110包含多个第一分子120，其中多个第一分子120包含高能分子，并且其中第一分子结合至表面101并包含能够与核苷的反应性基团，以便合成单个序列多核苷酸。在该排列中，沉积在每个座位110上的多个第一分子120表现出比装置的表面101更高的表面能，并且其中表面能的变化促进流体的小液滴定位到座位110上。在一些实施方案中，通过调节座位110的图案和几何形状来改变小液滴在座位110上的定位。在一些情况下，一个座位110上的高能分子120能够结合至表面并包含能够与某种核苷结合的反应性基团，以支持具有特定序列的某多核苷酸群体的合成，其中另一个座位110上的第一分子能够结合至表面并包含能够与不同核苷结合的反应性基团，以支持具有不同序列的不同多核苷酸群体的合成。
在一些情况下，装置100的表面101包含多个座位110，其中多个座位110被排列成多个簇140，其中每个簇140包含多个座位110。参照图1A至1C，装置100的表面101包含簇140的16列16行的直线阵列，其中每个簇140包含156个座位110的六边形阵列，其中每列和每行的簇140被簇间隙141分开。在一些实施方案中，多个座位110中的每一个的中心均位于簇140内的蜂窝晶格中，其中每一个座位110都被座位间隙142分开。
本文所述的座位的形状可包括圆形、三角形、正方形、矩形、六边形、多边形、无定形形状、像素化无定形形状，或本领域已知的任何形状、或任何可以通过本领域已知的方法制备的形状。可以将座位成形以允许液体容易流过而不产生气泡。
分解开的座位可以具有单分散大小分布，其中两个或更多个座位具有近似相同的宽度、高度和/或长度。在一些实施方案中，座位具有有限数量的形状和/或大小，例如，分解开的座位可呈现为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20种或更多种不同的形状，各自具有单分散大小。在一些实施方案中，座位的形状以多个单分散大小分布(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或更多个单分散大小分布)重复。
座位的单分散分布可反映为具有该模式的小于25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更小的标准偏差的幺模分布。座位的单分散分布可反映为具有约0.001％至约25％的标准偏差的幺模分布。座位的单分散分布可反映为具有至少约0.001％的标准偏差的幺模分布。座位的单分散分布可反映为具有至多约25％的标准偏差的幺模分布。座位的单分散分布可反映为具有约0.001％至约5％的标准偏差的幺模分布。座位的单分散分布可反映为具有约0.001％、约0.01％、约0.05％、约0.1％、约1％、约2％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％或约25％的标准偏差的幺模分布。
在一些情况下，从簇140内的多个座位110延伸的多核苷酸共同编码较长的核酸序列，例如基因。在一些情况下，在多个座位110上合成多核苷酸文库，然后将多核苷酸组装成大核酸如基因。
在进一步的情况下，每个座位110被包含第二分子的钝化区域围绕，其中第二分子包括低能分子，其中第二分子结合至表面并且缺少能够与核苷偶联的反应性基团。活性区域中的高能分子表现出高表面能。钝化区域中的低能分子表现出比活性区域的表面能更低的表面能。每个座位110被一个或多个钝化区域围绕，其中一个或多个钝化区域包含多个低能分子111，并且其中低能分子111能够结合至表面101但不能与核苷结合。
簇和座位的排列
本文提供了包含表面的装置，其中所述表面被修饰用于在预定位置并且以低错误率、低遗漏率、高产量和高寡核苷酸呈现的方式支持多核苷酸合成。表面可包含多个座位，其中每个座位构成表面的活性区域，其中每个活性区域包含包括高能分子的第一分子，并且其中第一分子结合至表面并包含能够与核苷结合的反应性基团。活性区域中的高能分子表现出高表面能。
每个座位可被钝化区域围绕，其中每个钝化区域包含多个低能分子，并且其中低能分子能够结合至表面但不能与核苷偶联。在一些实施方案中，钝化区域中的低能分子表现出比活性区域中的高能分子更低的表面能。
参照图2A至2C，座位210以三角形图案、直线图案、五边形图案、蜂窝图案、八边形图案、多边形图案、不规则阵列或其任何组合排列在簇240内。在一些实施方案中，簇240的形状包括圆形、三角形、正方形、矩形、六边形、多边形、无定形形状、像素化无定形形状，或闭合Z字形。簇240以三角形图案、直线图案、五边形图案、蜂窝图案、八边形图案、多边形图案、不规则阵列或其任何组合进行排列。座位密度的示例性范围为约1个座位/mm2至约1000个座位/mm2。在一些情况下，装置表面上的座位的数目为约5,000；10,000；约1,000,000或更多。
本文提供了这样的装置，其中本文公开的表面包含多个簇，其中簇中的座位的数目为约2至约500。簇中的座位的数目可为约10至约50、50至500、50至1000或超过1000。在示例性排列中，每个簇包括109、121、130或137个座位。在一些排列中，座位的直径与两个座位之间的间隙距离(间距)之比为约1:50至约50:1。在一些排列中，座位的直径与两个座位之间的间隙距离之比为至少约1:10。在一些排列中，座位的直径与两个座位之间的间隙距离之比为至多约10:1。在一些实施方案中，座位的直径与两个座位之间的间隙距离之比为约1:50、约1:20、约1:10、约1:5、约1:2、约1:1、约2:1、约5:1、约10:1、约20:1或约50:1。
本文所述的座位的宽度或直径可为约5μm至约1,000μm。在一些排列中，座位的宽度或直径为至多约1,000μm。在一些排列中，座位的宽度或直径为约5μm至约10μm、约5μm至约50μm、约5μm至约100μm、约5μm至约200μm、约5μm至约300μm、约5μm至约400μm、约5μm至约500μm、约5μm至约600μm、约5μm至约700μm、约5μm至约800μm、约5μm至约1,000μm、约10μm至约50μm、约10μm至约100μm、约10μm至约200μm、约10μm至约300μm、约10μm至约400μm、约10μm至约500μm、约10μm至约600μm、约10μm至约700μm、约10μm至约800μm、约10μm至约1,000μm、约50μm至约100μm、约50μm至约200μm、约50μm至约300μm、约50μm至约400μm、约50μm至约500μm、约50μm至约600μm、约50μm至约700μm、约50μm至约800μm、约50μm至约1,000μm、约100μm至约200μm、约100μm至约300μm、约100μm至约400μm、约100μm至约500μm、约100μm至约600μm、约100μm至约700μm、约100μm至约800μm、约100μm至约1,000μm、约200μm至约300μm、约200μm至约400μm、约200μm至约500μm、约200μm至约600μm、约200μm至约700μm、约200μm至约800μm、约200μm至约1,000μm、约300μm至约400μm、约300μm至约500μm、约300μm至约600μm、约300μm至约700μm、约300μm至约800μm、约300μm至约1,000μm、约400μm至约500μm、约400μm至约600μm、约400μm至约700μm、约400μm至约800μm、约400μm至约1,000μm、约500μm至约600μm、约500μm至约700μm、约500μm至约800μm、约500μm至约1,000μm、约600μm至约700μm、约600μm至约800μm、约600μm至约1,000μm、约700μm至约800μm、约700μm至约1,000μm或约800μm至约1,000μm。在一些实施方案中，座位的宽度或直径为约5μm、约10μm、约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm或约1,000μm。在一些情况下，本文所述的簇内的座位被约1μm至约500μm的间隙距离分开。
在一些情况下，本文所述的表面的区域内簇的密度为至少或约1个簇/100mm2、1个簇/10mm2、1个簇/5mm2、1个簇/4mm2、1个簇/3mm2、1个簇/2mm2、1个簇/1mm2、2个簇/1mm2、3个簇/1mm2、4个簇/1mm2、5个簇/1mm2、10个簇/1mm2、50个簇/1mm2或更大。
在一些实施方案中，簇的宽度或直径为约0.05mm至约50mm。在一些实施方案中，簇的宽度或直径为至少约0.05mm。在一些实施方案中，簇的宽度或直径为至多约50mm。在一些实施方案中，簇的宽度或直径为约0.05mm至约0.1mm、约0.05mm至约0.25mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.05mm至约1mm、约0.05mm至约2mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约20mm、约0.05mm至约50mm、约0.1mm至约0.25mm、约0.1mm至约0.5mm、约0.1mm至约1mm、约0.1mm至约2mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约20mm、约0.1mm至约50mm、约0.25mm至约0.5mm、约0.25mm至约1mm、约0.25mm至约2mm、约0.25mm至约5mm、约0.25mm至约10mm、约0.25mm至约20mm、约0.25mm至约50mm、约0.5mm至约1mm、约0.5mm至约2mm、约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约10mm、约0.5mm至约20mm、约0.5mm至约50mm、约1mm至约2mm、约1mm至约5mm、约1mm至约10mm、约1mm至约20mm、约1mm至约50mm、约2mm至约5mm、约2mm至约10mm、约2mm至约20mm、约2mm至约50mm、约5mm至约10mm、约5mm至约20mm、约5mm至约50mm、约10mm至约20mm、约10mm至约50mm或约20mm至约50mm。在一些实施方案中，簇的宽度或直径为约0.05mm、约0.1mm、约0.25mm、约0.5mm、约1mm、约2mm、约5mm、约10mm、约20mm或约50mm。本文提供了这样的表面，其包含至少10、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、30000、40000、50000个或更多个簇。
在一些情况下，簇以三角形图案、圆形图案、直线图案、五边形图案、蜂窝图案、八边形图案、多边形图案、不规则阵列或其任何组合排列在装置的表面上。
在一些情况下，簇的宽度为约1μm至约10,000μm。示例性簇宽度包括约10μm至约25μm、约10μm至约50μm、约10μm至约75μm、约10μm至约100μm、约10μm至约250μm、约10μm至约500μm、约10μm至约750μm、约10μm至约1,000μm、约10μm至约2,500μm、约10μm至约5,000μm和约10μm至约10,000μm。
包含纹理特征的表面
本文提供了包含表面的装置，其中所述表面被修饰用于在预定位置并且以低错误率、低遗漏率、高产量和高寡核苷酸呈现的方式支持多核苷酸合成。在一些实施方案中，该表面包含多个座位，其中每个座位包含表面的活性区域，其中每个活性区域包含包括高能分子的第一分子，其中第一分子结合至表面并包含能够与核苷结合的反应性基团。在一些实施方案中，被偶联剂覆盖的表面部分包含座位，其中多个座位包含簇，并且其中多个簇构成装置。在一些实施方案中，座位形成具有一定水接触角的亲水区域。
在一些情况下，本文所述装置的表面的一部分未被包含能够与核苷结合的反应性基团的高能分子覆盖，这降低了每个表面区域的合成多核苷酸的产量。由于多核苷酸产量不足可能损害随后利用合成多核苷酸(例如，作为基因组装体)的下游分子生物学过程，本文提供的装置的表面包含多个凹陷和多个突起中的至少一种，以增加多核苷酸延伸表面积。
在一些情况下，本文提供的装置的表面包括这样的表面，其包含多个分解开的座位，核酸或其他分子沉积在该分解开的座位上以供多核苷酸合成，其中该表面是光滑且基本上平面的，或者包含凸起和/或下陷特征(例如，三维特征)的纹理。在一些情况下，本文提供的装置的表面包含多个凹陷或突起，其增加装置的表面积和多核苷酸产量。在一些实施方案中，多个凹陷或突起以对应于座位的位置的图案排列。在一些情况下，多个凹陷或突起包括孔、微孔、通道、立柱或其他凸起或下陷特征的阵列。在一些情况下，可通过沉积装置如多核苷酸合成仪对多个凹陷或突起进行试剂沉积。在一些情况下，试剂和/或流体可以收集在与凹陷或突起中的一个或多个流体连通的较大的孔中。在一些情况下，多个凹陷或突起包括与簇内的多个座位对应的多个通道，其中多个通道或孔与簇的一个孔流体连通。
在第一示例性排列中，本文所述的装置包含用于多核苷酸延伸的座位，该座位包含凹陷或突起，其中座位延伸超出凹陷或突起的边界。在一些实施方案中，装置200的表面包含多个座位210，其中每个座位210包含凹陷230a或突起230b(分别根据图2A和2B)，以及活性区域220。在一些实施方案中，每个座位210的活性区域220被钝化区域221围绕。
在一些实施方案中，每个凹陷230a或突起230b具有深度240和宽度241，其中凹陷230a或突起230b被间距242分开。凹陷230a或突起230b可具有与在同一座位210内的另一凹陷230b或突起230b相同或不同的深度240、宽度241、体积或其任何组合。座位210的凹陷230a或突起230b可具有与另一座位210的凹陷230a或突起230b相同或不同的深度240、宽度241、体积或其任何组合。座位210的簇内的座位210的凹陷230a或突起230b可具有与座位210的另一簇内的座位210的凹陷230a或突起230b相同或不同的深度240、宽度241、体积或其任何组合。
凹陷230a和突起230b可以被设计成允许受控的流动，并确保在装置200的表面上用于多核苷酸合成的均匀传质路径。可以为了特定或一定范围的化学暴露时间，为了多核苷酸合成期间的洗涤效果，和/或为了提高波及效率而设计凹陷230a和突起230b以及由此使用装置200的方。在一些情况下，可以通过确保生长的多核苷酸不会占据突起或凹陷230a230b内的初始可用体积的超过50％、45％、40％、25％、20％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％，来提高波及效率。在一些情况下，可采用标准硅片工艺来形成包含突起或凹陷230a 230b的装置200，该突起或凹陷具有高表面积和足够流动通道以允许与装置200的表面进行快速化学交换和暴露。凹陷230b或突起230b之间的间距242可以被设计用于为预期多核苷酸的两倍长度提供足够的空间。
在一些情况下，间距的距离足以容纳长度为约10聚体至约2000聚体的多核苷酸。在一些情况下，间距的距离足以容纳长度为约10聚体至约500聚体的多核苷酸。在一些情况下，间距的距离足以容纳长度为至少约10聚体的多核苷酸。
在一个示例性排列中，间距242是本文公开的表面上合成的多核苷酸长度的至少两倍。凹陷230b和突起230b可被设计成使得深度240足以进行有效洗涤。在一个实例中，凹陷230b或突起230b的深度240是凹陷230b或突起230b之间的间距242的约0.5倍至约1.5倍，并且间距242是宽度241的约两倍。
在此表示为“S”的每个装置的表面积通过以下等式测量，其中d＝深度；w＝宽度；以及间距：
等式1：
当间距与宽度的之比为约2时，可以使用以下等式来计算包含纹理化表面的装置的表面积，其中S0是非纹理化表面的装置的表面积：
等式2：
在一些排列中，凹陷和突起具有包括圆形、三角形、正方形、五边形、六边形、八边形、多边形、不规则形状或其任何组合在内的横截面形状。在一些实施方案中，凹陷和突起相对于装置的表面向内或向外逐渐变细。凹陷和突起可具有锐利的、锥形的、倒角的或圆形的边缘。在一些情况下，凹陷和突起的组的周长可通过不同类型的结构特征或通过差异功能化进行标记。在一些情况下，凹陷或突起沿其高度变化并且取决于装置的组成。例如，包含由除硅之外的材料组成的表面的装置可具有与相同宽度的硅结构不同的高度。凹陷或突起的高度和/或宽度可以由所用材料的机械强度来确定，以确保凹陷或突起可以在处理期间支撑其自身重量而不会破裂。
在一些实施方案中，装置的表面340包含含有凹陷230b或突起230b的纹理化部分330，以及包含第一分子320的活性部分。在一些实施方案中，根据图2A、2B、3A和3B，装置200、300的座位310的纹理化部分330的边界完全位于相应座位210、310的边界内。在一些实施方案中，纹理化部分330的边界与其各自的座位310的边界是同心的或从其各自的座位310的边界均匀地偏移一定的偏距343。
在一些情况下，偏距与座位直径之比为约5:1至约50:1。在一些实施方案中，偏距与座位直径之比为至少约5:1。在一些实施方案中，偏距与座位直径之比为至多约50:1。在一些实施方案中，偏距与座位直径之比为约5:1至约10:1、约5:1至约15:1、约5:1至约20:1、约5:1至约25:1、约5:1至约30:1、约5:1至约35:1、约5:1至约40:1、约5:1至约45:1、约5:1至约50:1、约10:1至约15:1、约10:1至约20:1、约10:1至约25:1、约10:1至约30:1、约10:1至约35:1、约10:1至约40:1、约10:1至约45:1、约10:1至约50:1、约15:1至约20:1、约15:1至约25:1、约15:1至约30:1、约15:1至约35:1、约15:1至约40:1、约15:1至约45:1、约15:1至约50:1、约20:1至约25:1、约20:1至约30:1、约20:1至约35:1、约20:1至约40:1、约20:1至约45:1、约20:1至约50:1、约25:1至约30:1、约25:1至约35:1、约25:1至约40:1、约25:1至约45:1、约25:1至约50:1、约30:1至约35:1、约30:1至约40:1、约30:1至约45:1、约30:1至约50:1、约35:1至约40:1、约35:1至约45:1、约35:1至约50:1、约40:1至约45:1、约40:1至约50:1或约45:1至约50:1。在一些实施方案中，偏距与座位直径之比为约5:1、约10:1、约15:1、约20:1、约25:1、约30:1、约35:1、约40:1、约45:1或约50:1。
装置表面上的纹理特征的表面密度可为约1个特征/mm2至约800个特征/mm2或更多。每个座位的纹理特征的数目可为约10至约50,000个。在一些实施方案中，每个座位的纹理特征的数目为约10、约100、约500、约1,000、约2,000、约4,000、约6,000、约8,000、约10,000、约20,000、约40,000或约50,000个。
在一些情况下，凹陷或突起的高度与宽度之比为约1:50至约50:1。在一些情况下，凹陷或突起的高度与宽度之比为约1:50、约1:20、约1:10、约1:5、约1:2、约1:1、约2:1、约5:1、约10:1、约20:1或约50:1。
在一些情况下，凹陷或突起的高度与相邻的凹陷或突起之间的间距之比为约1:50至约50:1。在一些情况下，凹陷或突起的高度与相邻的凹陷或突起之间的间距之比为约1:50、约1:20、约1:10、约1:5、约1:2、约1:1、约2:1、约5:1、约10:1、约20:1或约50:1。在一些情况下，高度与间距之比为约0.6:1至约5:2。
在一些情况下，凹陷或突起的高度为约10nm至约1,000,000nm。在一些情况下，凹陷或突起的高度为约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约10nm至约50,000nm、约10nm至约100,000nm、约10nm至约500,000nm、约10nm至约1,000,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约50nm至约50,000nm、约50nm至约100,000nm或约50nm至约500,000nm。
在一些情况下，凹陷或突起的宽度为约10nm至约1,000,000nm。在一些实施方案中，凹陷或突起的宽度为至少约10nm。在一些实施方案中，凹陷或突起的宽度为至多约1,000,000nm。在一些实施方案中，凹陷或突起的宽度为约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约10nm至约50,000nm、约10nm至约100,000nm、约10nm至约500,000nm、约10nm至约1,000,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约50nm至约50,000nm、约50nm至约100,000nm、约50nm至约500,000nm或约50nm至约1,000,000nm。在一些情况下，凹陷或突起的宽度为约10nm、约50nm、约100nm、约500nm、约1,000nm、约5,000nm、约10,000nm、约50,000nm、约100,000nm、约500,000nm或约1,000,000nm。
在一些情况下，相邻的凹陷或突起之间的间距为约10nm至约1,000,000nm。在一些情况下，相邻的凹陷或突起之间的间距为约10nm至约50nm、约10nm至约100nm、约10nm至约500nm、约10nm至约1,000nm、约10nm至约5,000nm、约10nm至约10,000nm、约10nm至约50,000nm、约10nm至约100,000nm、约10nm至约500,000nm、约10nm至约1,000,000nm、约50nm至约100nm、约50nm至约500nm、约50nm至约1,000nm、约50nm至约5,000nm、约50nm至约10,000nm、约50nm至约50,000nm、约50nm至约100,000nm、约50nm至约500,000nm或约50nm至约1,000,000nm。在一些情况下，相邻的凹陷或突起之间的间距为约10nm、约50nm、约100nm、约500nm、约1,000nm、约5,000nm、约10,000nm、约50,000nm、约100,000nm、约500,000nm或约1,000,000nm。
在第二种排列中，本文所述的装置包含用于多核苷酸延伸的座位，该座位包含凹陷或突起，其中座位延伸超出凹陷或突起的边界。在一些情况下，装置2600的表面包含多个座位2610，其中每个座位2610包含凹陷纹理2630a特征或凸起纹理特征2630b(分别根据图26A和26B)，以及活性区域2620。在一些情况下，每个座位2610的活性区域2620被钝化区域2621围绕。
在一些情况下，每个凹陷纹理特征2630a或凸起纹理特征2630b具有深度2640和宽度2641，其中凹陷纹理2630a特征或凸起纹理特征2630b被节距2642分开。凹陷纹理特征2630a或凸起纹理特征2630b可与在同一座位2610内的另一凹陷纹理特征2630b或凸起纹理特征2630b具有相同或不同的深度2640、宽度2641、体积或其任何组合。座位2610的凹陷纹理特征2630a或凸起纹理特征2630b可具有与另一座位2610的凹陷纹理特征2630a或凸起纹理特征2630b相同或不同的深度2640、宽度2641、体积或其任何组合。座位2610的簇内的座位2610的凹陷纹理特征2630a或凸起纹理特征2630b可与座位2610的另一簇内的座位2610的凹陷纹理特征2630a或凸起纹理特征2630b具有相同或不同的深度2640、宽度2641、体积或其任何组合。
形成纹理化表面的方法
本文提供了用于形成包含表面的装置的方法，其中所述表面被修饰用于在预定位置并且以低错误率、低遗漏率、高产量和高寡核苷酸呈现的方式支持多核苷酸合成。在一些实施方案中，该表面被修饰用于在预定的位置支持多核苷酸合成。常用的功能化方法包括将有机硅烷分子选择性沉积到本文公开的装置的表面上。选择性沉积是指在装置上产生两个或更多个不同区域的过程，其中至少一个区域具有与相同装置的另一个区域不同的表面或化学性质。这样的性质包括但不限于表面能、化学终止、化学分子的表面浓度等。本文所述或本领域已知的改变表面化学性质的任何合适的方法均可用来对表面进行功能化，例如有机硅烷的化学气相沉积。通常，这导致功能化物质的自组装单层(SAM)的沉积。
本文提供了对本文公开的用于多核苷酸合成的装置的表面进行功能化的方法，包括光刻术。示例性光刻方法包括：1)将光致抗蚀剂施加至表面；2)将抗蚀剂暴露于光(例如，使用在一些区域不透明而在其他区域透明的二元掩模)；以及3)使抗蚀剂显影；其中被暴露的区域被图案化。然后图案化的抗蚀剂可充当掩模以用于后续的处理步骤，例如刻蚀、离子注入和沉积。处理之后，通常去除抗蚀剂，例如通过等离子体剥离或湿法化学去除。任选地，可以使用氧等离子体清洁来促进抗蚀剂清除区域中残余的有机污染物的去除，例如，通过使用通常较短的等离子体清洁步骤(例如，氧等离子体)。可通过使抗蚀剂溶解在合适的有机溶剂中、等离子体刻蚀、曝光和显影等来剥离抗蚀剂，从而暴露已被抗蚀剂覆盖的表面区域。可以以不会去除功能化基团或以其他方式破坏功能化表面的方法来去除抗蚀剂。
本文提供了对本文公开的用于多核苷酸合成的装置的表面进行功能化的方法，包括抗蚀剂或光致抗蚀剂涂层。在许多情况下，光致抗蚀剂是指用于光刻术中以形成图案化的涂层的光敏材料。该光致抗蚀剂作为液体施加以便当混合物中的挥发性溶剂蒸发时在表面上凝固。在一些情况下，抗蚀剂在旋涂法中作为薄膜(1um至100um)施加。可通过将涂覆的抗蚀剂暴露于穿过掩模或中间掩模的光，改变其在显影剂中的溶解速率而将其图案化。在一些情况下，抗蚀剂涂层用作牺牲层，充当用于修饰下方表面的后续步骤(例如刻蚀)的阻挡层，随后通过抗蚀剂剥离去除。可以在保护抗蚀剂覆盖的区域免于活性或钝化功能化的同时对装置的表面进行功能化。
本文提供了这样的方法，其中化学清洁是表面制备中的预备步骤。在一些示例性方法中，活性功能化在平版印刷术之前进行。可首先清洁装置，例如，使用水虎鱼(piranha)溶液。清洁工艺的实例包括将装置在升高的温度(例如，120℃)下在水虎鱼溶液(例如，90％H2SO4，10％H2O2)中浸泡，以及洗涤(例如，水)和干燥该装置(例如，氮气)。该工艺任选地包括水虎鱼溶液后的处理，包括将经水虎鱼溶液处理的装置浸泡在碱性溶液(例如，NH4OH)中，随后水洗(例如，水)。或者，可任选地在水虎鱼溶液浸泡和任选的水虎鱼溶液后的处理之后，对装置进行等离子体清洁。等离子体清洁工艺的实例包括氧等离子体蚀刻。
本文提供了表面制备方法，其中在光刻之后进行活性化学气相沉积(CVD)步骤。任选地，示例性的第一步骤包括使用本文公开的清洁方法来清洁装置表面。清洁可包括氧等离子体处理。在一些情况下，CVD步骤用于沉积混合物，该混合物具有至少两种分子，导致高表面能区域和涂覆有第一化学层的区域，该第一化学层是较低表面能区域。该混合物可包含结合至表面并与核苷亚磷酰胺偶联的分子，该分子与更大量的结合至表面但不与核苷亚磷酰胺偶联的分子混合。对于两步稀释方案，在将混合物沉积在表面上之前，步骤包括沉积100％的混合物成分分子，该分子结合至表面但不与核苷亚磷酰胺偶联。第一化学层可包含本文公开的氟硅烷，例如，十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-三氯硅烷。第二化学层可包含至少两种本文公开的硅烷。在一些情况下，两种硅烷是GOPS和丙基三甲氧基硅烷。在示例性方法中，在用混合物处理之前，用丙基三甲氧基硅烷处理表面。上述工作流程是示例性过程，并且可以根据最终功能化表面的所需特性省略或改变任何步骤或组分。
本文公开的装置的表面可以涂覆有抗蚀剂，经历功能化，并且/或者在平版印刷术之后，然后进行处理以去除抗蚀剂。在一些情况下，用溶剂去除抗蚀剂，例如用包含N-甲基-2-吡咯烷酮的剥离溶液。在一些情况下，抗蚀剂剥离包括超声处理或超声破碎。在剥离抗蚀剂之后，可以进一步使表面经历结合至暴露区域的活性功能化剂的沉积，以产生所需的差异功能化图案。在一些情况下，活性功能化区域包含一种或多种不同种类的硅烷，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种硅烷。一种或多种硅烷中的一种可以以大于另一种硅烷的量存在于功能化组合物中。功能化剂的组成和密度可有助于低错误率的多核苷酸合成，例如，错误率小于1/1000个碱基、小于1/1500个碱基、小于1/2000个碱基、小于1/3000个碱基、小于1/4000个碱基、小于1/5000个碱基。
本文提供了包括将粘合促进剂施加到表面的方法。除了施加非光敏物之外，还施加粘合促进剂。在一些情况下，对表面施加粘合促进剂和非光敏物，包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅和氮化硅。示例性粘合促进剂包括硅烷，例如氨基硅烷。示例性氨基硅烷包括但不限于(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺。另外，可以在表面上沉积钝化层，该钝化层可以具有或不具有反应性氧化物基团。钝化层可包含氮化硅(Si3N4)或聚酰胺。光刻步骤可用于限定在钝化层上形成座位的区域。
本文提供了用于从装置开始产生具有多个座位的基底的方法。由材料(例如，硅)组成的装置可具有安置于其上的任何数目的层，包括但不限于诸如金属(例如，二氧化硅、氧化硅或铝)的导电层。装置的表面可包含保护层(例如，氮化钛)。该层可借助于各种沉积技术来沉积，该沉积技术诸如有：化学气相沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD)、等离子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热丝CVD(HWCVD)、引发CVD(iCVD)、改进型CVD(MCVD)、气相轴向沉积(VAD)、外气相沉积(OVD)以及物理气相沉积(例如，溅射沉积、蒸发沉积)。在一些情况下，层可以经由等离子体增强CVD(PECVD)来沉积。热氧化物层可充当硅的蚀刻掩模。在一些情况下，该热氧化物层的厚度可为至少约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或更厚。
氧化物层可以沉积在本文提供的装置的表面上。该氧化物层可包含二氧化硅。二氧化硅可使用正硅酸四乙酯(TEOS)、高密度等离子体(HDP)或者其任何组合来沉积。二氧化硅可沉积成适合于制造本文其他部分进一步详细描述的合适微结构的厚度。在一些情况下，二氧化硅以共形的方式在硅基底上生长。可以在湿或干的气氛中进行硅基底上的生长。提供了示例性湿法生长方法，其中湿法生长在高温(例如，约1000摄氏度)下于水蒸气中进行。干法生长方法可以在氧气存在下进行。
可使用光刻技术(诸如在半导体行业中使用的技术)创建座位。例如，可向二氧化硅上涂覆(例如通过晶片的旋涂)光致抗蚀剂(例如，当暴露于电磁辐射时会改变性质的材料)以达到任何合适的厚度。示例性涂层厚度包括约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400或500μm。示例性光致抗蚀剂材料是MEGAPOSIT SPR 3612光致抗蚀剂(Dow Electronic Material)或类似产品。可将包括光致抗蚀剂的基底暴露于电磁辐射源。可以使用掩模来从光致抗蚀剂的一些部分屏蔽辐射，以便限定座位的区域。光致抗蚀剂可为负性抗蚀剂或正性抗蚀剂(例如，可将座位的区域暴露于电磁辐射，或者可将除座位之外的区域暴露于如由掩模所限定的电磁辐射)。将覆盖要在其中创建解析座位的位置的区域暴露于电磁辐射，以限定对应于二氧化硅层中的解析座位的位置和分布的图案。光致抗蚀剂可通过限定与解析座位相对应的图案的掩模而暴露于电磁辐射。接下来，可例如借助于湿法化学刻蚀和洗涤操作来移除光致抗蚀剂的暴露部分。继而可将掩模的被移除部分暴露于化学刻蚀剂，以刻蚀基底并将解析座位的图案转移到二氧化硅层中。刻蚀剂可包括酸，例如，在二氧化硅的情况下为缓冲HF。
可以使用各种刻蚀程序来在待形成解析座位的区域中刻蚀硅。刻蚀程序可以是各向同性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率等于或基本上等于沿着正交方向的刻蚀速率)，或各向异性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率低于沿着正交方向的刻蚀速率)，或者它们的变化形式。刻蚀技术可以是湿法硅刻蚀(诸如KOH、TMAH、EDP等)，和干法等离子体刻蚀(例如DRIE)。这两者都可用于通过互连来刻蚀微结构晶片。
干法刻蚀可为基本上垂直地(例如，朝向基底)而非横向地或基本上横向地(例如，平行于基底)进行刻蚀的各向异性刻蚀。在一些情况下，干法刻蚀包括用诸如CF4、CHF3、C2F6、C3F6或其任意组合等基于氟的刻蚀剂来进行刻蚀。在一些情况下，刻蚀使用具有100mT、1000W、20G和50CF4的设置的Applied Materials eMax-CT机器进行400秒。本文所述的基底可通过深反应离子刻蚀(DRIE)来刻蚀。DRIE是一种高度各向异性的刻蚀工艺，用于在晶片/基底中创造出通常具有高宽深比的深穿透、陡边孔穴和沟槽。可以使用两种主要的高速率DRIE技术刻蚀基底：低温技术和Bosch技术。美国专利号5501893中描述了应用DRIE的方法，该专利通过引用而全文并入本文。
湿法刻蚀可为在所有方向上移除材料的各向同性刻蚀。在一些情况下，使用可被(例如，用氟化铵)缓冲以减慢刻蚀速率的氢氟酸基质在室温下进行湿法氧化物刻蚀。在一些情况下，化学处理可用于蚀刻薄表面材料，例如二氧化硅或氮化硅。示例性化学处理包括缓冲氧化物刻蚀(BOE)、缓冲HF和/或NH4F。完全移除氧化物层所需的刻蚀时间通常凭经验确定。在一个实例中，在22℃下，以15:1的BOE(缓冲氧化物刻蚀)进行刻蚀。
二氧化硅层可被刻蚀至深达下面的材料层。例如，可刻蚀二氧化硅层直至氮化钛层。在一些情况下，二氧化硅在1000摄氏度的温度下生长，并且下面的层通常是硅。
在刻蚀之后，可以在刻蚀的硅层的顶部添加另外的表面层。在示例性排列中，另外的表面层是与粘合促进剂有效结合的表面层。示例性的另外的表面层包括但不限于二氧化硅和氮化硅。在二氧化硅的情况下，可以通过在硅上共形生长该材料的薄层来添加另外的层。
在一些情况下，对本文的装置表面施加光刻术以产生光致抗蚀剂掩模。在随后的步骤中，使用深反应离子刻蚀(DRIE)步骤在没有光致抗蚀剂的位置处刻蚀垂直侧壁(例如，直至包括绝缘层的结构中的绝缘层)。在随后的步骤中，剥离光致抗蚀剂。可以在装置处理侧上重复光刻术、DRIE和光致抗蚀剂剥离步骤。在装置表面包含绝缘层如二氧化硅的情况下，使用刻蚀工艺来移除隐埋的氧化物(BOX)。然后可以施加热氧化来移除在该方法期间可能已经沉积在侧壁上的污染聚合物。在随后的步骤中，使用湿法刻蚀工艺来剥离热氧化。
为了使抗蚀剂仅涂覆表面的较小区域(例如，下陷特征诸如孔和/或通道)，可以将抗蚀剂小液滴沉积到下陷特征中，在该特征中它任选地扩散。在一些情况下，例如通过刻蚀(例如，氧等离子体刻蚀)去除一部分抗蚀剂，以留下仅覆盖选定区域的光滑表面。
可例如使用水虎鱼溶液湿法清洁表面。或者，可例如通过干氧等离子体暴露等离子体清洁表面。可以通过由向装置层通道中的芯吸所支配的工艺来涂覆光致抗蚀剂。可以使用光刻术来对光致抗蚀剂进行图案化，以暴露期望为钝化的区域(即，不是设计用于进行寡核苷酸合成的区域)。通过光刻术进行图案化可以通过将抗蚀剂暴露于通过具有感兴趣的图案的二元掩模的光而发生。在暴露之后，可在显影液中移除暴露区域中的抗蚀剂。
进行了许多步骤来制备纹理化表面。将本文公开的示例性装置401(例如，基于硅的)抛光(图4A)，通过印刷平版印刷术形成纹理化层图案401(图4B)，进行硅反应离子刻蚀和抗蚀剂剥离以在表面中留下凹痕403(图4C)，使表面经历氧化407(图4D)，任选地使用非光敏物409通过平版印刷术来印刷基准层(图4E)，之后，最终氧化物刻蚀产生具有基准结构413的纹理化硅表面(图4F)。此外，然后可以将该装置暴露于如上文和本文其他部分所述的功能化剂，以产生具有图案化表面的装置，该表面具有涂覆有用于偶联核苷515的分子(单独的或在图7B中描绘的混合物形式)的座位，该座位被涂覆有不与核苷517偶联的试剂的区域围绕，图5。
图6A-6F中图示了用于产生核苷偶联剂密度降低的表面的示例性方法。作为第一步，任选地用氧等离子体清洁装置601，图6A。示例性装置包括由二氧化硅或氧化硅制成的装置。在清洁之后立即用非光敏物603(例如，光致抗蚀剂)涂覆该装置，图6B。然后进行光学平版印刷术，图6C，其中电磁波长605通过荫罩607投射，导致在预定位置处的非光敏物的移除并且保留在其他位置处的非光敏物609。接下来，第一分子(例如，氟硅烷)沉积在表面上并且涂覆由于光刻术611而暴露的区域处的表面，图6D。第一分子是不与核苷偶联的分子。然后剥离非光敏物(图6E)，露出暴露区域613。下一步涉及两部分沉积过程。首先，结合该表面并且缺少能够与核苷结合的反应性基团的第二分子。接下来，在表面上沉积包含第二分子和第三分子的混合物，其中第三分子结合表面并且还能够偶联核苷，图6F。该两步沉积过程在具有低浓度活化剂的表面上产生预定位点615。为了促进多核苷酸合成过程中反应的效率，用于多核苷酸延伸的区域(座位)比围绕该座位的表面区域的表面能更高。
当多核苷酸701从具有饱和量的核苷偶联分子的表面延伸时，它们相对拥挤，图7A。相反，当多核苷酸在具有核苷偶联分子703和非核苷偶联分子704的混合物的表面上延伸时，观察到不那么拥挤的结果(图2B)和较低的错误率。表面功能化的第一示例性方法在上文中参考图6A-1F讨论。在图6中，作为最后一步，沉积活性功能化剂，图6F。
或者，活性功能化剂可以在该过程中较早地沉积，并起到非光敏物的粘合促进剂的作用。图8提供了该替代方法的说明性表示。作为第一步，任选地用氧等离子体清洁装置801，图8A。在清洁之后，用第一化学层涂覆装置的表面，结合该表面并结合核苷的分子沉积在表面803上(例如，氨基硅烷)，图8B。然后用非光敏物803涂覆装置的表面，图8C。然后进行光学平版印刷术，图8D，其中电磁波长804通过荫罩806投射，导致在预定位置处的非光敏物802的移除并且保留其他位置处的非光敏物808(光致抗蚀剂)。光致抗蚀剂掩模的使用导致第一化学层805的图案化，图8E。第二化学层——结合表面但不结合核苷的分子807沉积在表面上，图8F。然后剥离非光敏物(图8G)，露出暴露区域809。产生的表面用包含用于多核苷酸延伸反应的核苷偶联分子的座位图案化。
本文提供了用于多核苷酸合成的装置，其包含具有表面的平板；表面上的多个座位；以及跨越每个座位区域的多个凹陷或突起，其中每个凹陷或突起的宽度为约200至500nm长，并且其中每个凹陷或突起的深度为约250至1000nm长。本文进一步提供了这样的装置，其中每个凹陷或突起的宽度为200nm长。本文进一步提供了这样的装置，其中每个凹陷或突起的深度为250至500nm长。本文进一步提供了这样的装置，其中每个凹陷或突起的深度为500nm长。本文进一步提供了这样的装置，其中每个座位的间距为400至1000nm长。本文进一步提供了这样的装置，其中每个座位的间距为400nm长。本文进一步提供了这样的装置，其中每个座位的直径为约0.5至100μm长。本文进一步提供了这样的装置，其中每个座位包含多个第一分子，并且其中所述多个第一分子包括结合至表面并包含能够与核苷结合的反应性基团的第一分子。本文进一步提供了这样的装置，其中所述第一分子为硅烷。本文进一步提供了这样的装置，其中所述硅烷为氨基硅烷。本文进一步提供了这样的装置，其中所述第一分子为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。本文进一步提供了这样的装置，其中围绕每个座位的区域包含多个第二分子，其中所述多个第二分子包括结合至表面并缺少能够与核苷结合的反应性基团的第二分子。本文进一步提供了这样的装置，其中所述第二分子为氟硅烷。本文进一步提供了这样的装置，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷、全氟辛基三氯硅烷、全氟辛基三乙氧基硅烷或全氟辛基三甲氧基氯硅烷。本文进一步提供了这样的装置，其进一步包含表面上的多个簇，其中每个簇包含多个座位的子集，并且其中所述多个座位的子集包含50至500个座位。本文进一步提供了这样的装置，其中所述多个座位的子集包含121个座位。本文进一步提供了这样的装置，其中每一个簇的直径为0.5至2mm。本文进一步提供了这样的装置，其中每个座位包含多个第三分子，其中所述多个第三分子包括结合至表面并缺少能够与核苷结合的反应性基团的第三分子。本文进一步提供了这样的装置，其中所述第三分子为丙基三甲氧基硅烷。本文提供了用于多核苷酸合成的装置，其包含：具有表面的硅片；表面上的多个座位；以及跨越每个座位区域的多个凹陷或突起，其中每个凹陷或突起的宽度为约200至400nm长，并且其中每个凹陷或突起的深度为约250至500nm长。本文提供了用于多核苷酸合成的系统，其包括：材料沉积装置，该装置包含用于多核苷酸合成的多种试剂和用于沉积所述用于多核苷酸合成的多种试剂的多个喷嘴；用于控制所述用于多核苷酸合成的多种试剂从所述多个喷嘴中的释放的计算机；以及本文公开的用于接收所述用于多核苷酸合成的多种试剂的平板。
本文提供了多核苷酸合成方法，其包括：为至少30,000种不相同的多核苷酸提供预定序列；提供如权利要求1至20中任一项所述的装置；合成至少30,000种不相同的多核苷酸，其中所述至少30,000种不相同的寡核苷酸中的每一个的长度为至少30个碱基并且从表面上的不同座位延伸，并且其中与预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其进一步包括从表面释放至少30,000种不相同的多核苷酸；以及组装至少250个预选核酸，其中与预定序列相比，所组装的至少250个预选核酸编码的序列的总缺失错误率小于1/1000个碱基。
本文提供了多核苷酸合成方法，其包括：提供包含表面的装置，其中所述装置包含表面上的多个座位；以及跨越每个座位区域的多个凹陷或突起，其中每个凹陷或突起的宽度为约200至400nm长，并且其中每个凹陷或突起的深度为约250至500nm长；为至少5,000种不相同的多核苷酸提供预定序列；以及合成所述至少5,000种不相同的多核苷酸，其中所述至少5,000种不相同的寡核苷酸中的每一个的长度为至少30个碱基并且从表面延伸，并且其中在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，所述至少5,000种不相同的多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。
本文提供了多核苷酸合成方法，其包括：提供包含表面的装置，其中所述装置包含表面上的多个座位；以及跨越每个座位区域的多个凹陷或突起，其中每个凹陷或突起的宽度为约200至500nm长，并且其中每个凹陷或突起的深度为约250至1000nm长；在第一区域处的表面上沉积第一多个分子，其中所述第一区域包含多个座位，并且其中第一多个分子包括结合至表面并且缺少能够与核苷结合的反应性基团的第一分子；以及在第一区域处的表面上沉积混合物，其中该混合物包含第一多个分子和第二多个分子，其中所述第二多个分子包括第二分子，其中所述第二分子结合至表面并且包含能够结合核苷的反应性基团，并且其中所述第一分子和所述第二分子以10:1至约2500:1的摩尔比存在于混合物中；为至少5,000种不相同的多核苷酸提供预定序列；以及合成所述至少5,000种不相同的多核苷酸，其中所述至少5,000种不相同的寡核苷酸中的每一个的长度为至少30个碱基并且从表面延伸，并且其中与预定序列相比，所述至少5,000种不相同的多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其中所述至少5,000种不相同的多核苷酸共同编码至少40个基因。本文进一步提供了这样的方法，其中所述至少6,000种不相同的多核苷酸共同编码至少50个基因。本文进一步提供了这样的方法，其中所述至少100,000种不相同的多核苷酸共同编码至少750个基因。本文进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子为氟硅烷。本文进一步提供了这样的方法，其中所述硅烷为氨基硅烷。本文进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。进一步地，本文提供了这样的方法，所述第一分子为丙基三甲氧基硅烷。如权利要求24所述的方法，其进一步包括在第二区域处的表面上沉积第三多个分子，其中所述第三多个分子包括结合至表面并且缺少能够结合核苷的反应性基团的第三分子，其中所述第一分子和所述第二分子的表面能都高于所述第三分子的表面能。本文进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少10度。本文进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子包括氟硅烷。本文进一步提供了这样的方法，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷、全氟辛基三氯硅烷、全氟辛基三乙氧基硅烷或全氟辛基三甲氧基氯硅烷。本文进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以50:1至2500:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。本文进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。本文进一步提供了这样的方法，其中所述表面包含二氧化硅层。本文进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，所述至少5,000种不相同的多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，所述至少5,000种不相同的多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/2000个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，所述至少5,000种不相同的多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/3000个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其中所述至少5,000种不相同的多核苷酸中的每一个的长度为30个碱基至200个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其中所述至少5,000种不相同的多核苷酸中的每一个的长度为约50至约120个碱基。
本文提供了制备用于多核苷酸合成的表面的方法，其包括：提供包含表面的装置，其中所述装置包含二氧化硅；在第一区域处的表面上沉积第一分子，其中所述第一分子结合至表面并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；在第二区域处的表面上沉积第二分子，其中所述第二区域包含被所述第一区域围绕的多个座位，其中所述第二分子结合至表面并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；以及在所述第二区域处的表面上沉积混合物，其中所述混合物包含所述第二分子和第三分子，其中所述第三分子与表面和核苷亚磷酰胺结合，并且其中所述混合物包含的所述第二分子的量大于所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子和所述第三分子的表面能都高于所述第一分子的表面能，并且其中表面能是在光滑平面表面上的水接触角的量度。进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少10、20、50或75度。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述硅烷为氨基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子为丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子为氟硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约100:1至约2500:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物在沉积在表面上时呈气态。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子在沉积在表面上时呈气态。本文进一步提供了这样的方法，其中所述表面包含二氧化硅层。本文提供了通过任一种本文所述方法制备的用于多核苷酸合成的装置。
本文提供了制备用于多核苷酸合成的表面的方法，其包括：提供包含表面的装置，其中所述装置包含二氧化硅，并且其中所述表面包含氧化硅层；用结合氧化硅的光敏材料涂覆表面；将表面的预定区域暴露于光源以移除涂覆在表面上的光敏材料的一部分；在表面上沉积第一分子，其中所述第一分子结合在预定区域处的表面并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；移除涂覆在表面上的光敏材料的剩余部分以暴露座位，其中所述座位中的每一个被包含第一分子的预定区域围绕；在座位处的表面上沉积第二分子，其中所述第二分子结合至座位并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；以及在座位处的表面上沉积混合物，所述混合物包含所述第二分子和第三分子，并且其中所述第三分子与表面和核苷亚磷酰胺结合。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子和所述第三分子的表面能都高于所述第一分子的表面能，并且其中表面能是在光滑平面表面上的水接触角的量度。进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少10、20、50或75度。进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少50度。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述硅烷为氨基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子为丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子为氟硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约100:1至约2500:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物在沉积在表面上时呈气态。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子在沉积在表面上时呈气态。进一步提供了这样的方法，其中所述方法进一步包括在用结合氧化硅的光敏材料涂覆表面之前向表面施加氧等离子体。进一步提供了这样的方法，其中所述方法进一步包括在将表面的预定区域暴露于光之后向表面施加氧等离子体。本文提供了通过任一种本文所述方法制备的用于多核苷酸合成的装置。
本文提供了多核苷酸合成方法，其包括：为至少30,000种不相同的多核苷酸提供预定序列；提供包含图案化表面的装置，其中所述装置包含二氧化硅；其中所述图案化表面如下产生：在第一区域处的表面上沉积第一分子，其中所述第一分子结合至表面并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；以及在第二区域处的表面上沉积第二分子，其中所述第二区域包含被所述第一区域围绕的多个座位，其中所述第二分子结合至表面并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；以及在第二区域处的表面上沉积混合物，其中所述混合物包含所述第二分子和所述第三分子，其中所述第三分子与表面和核苷亚磷酰胺结合，其中所述混合物包含的所述第二分子的量大于所述第三分子；以及合成所述至少30,000种不相同的多核苷酸，所述多核苷酸中的每一个的长度为至少10个碱基，其中与预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸编码的序列的总缺失错误率小于1/1000个碱基，并且其中所述至少30,000种不相同的多核苷酸中的每一个从不同的座位延伸。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子和所述第三分子的表面能都高于所述第一分子的表面能，并且表面能是在光滑平面表面上的水接触角的量度。进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少10、20、50或75度。进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少50度。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述硅烷为氨基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子为丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子为氟硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约100:1至约2500:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物在沉积在表面上时呈气态。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子在沉积在表面上时呈气态。进一步提供了这样的方法，其中所述至少30,000种不相同的多核苷酸中的每一个的长度为至少30个碱基。进一步提供了这样的方法，其中所述至少30,000种不相同的多核苷酸中的每一个的长度为10个碱基至1kb。进一步提供了这样的方法，其中所述至少30,000种不相同的多核苷酸中的每一个的长度为约50至约120个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总缺失错误率小于约1/1700个碱基。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下获得总缺失错误率。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，所述至少30,000种不相同的合成多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总错误率小于1/2000个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总错误率小于1/3000个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其中所述表面包含二氧化硅层。
本文提供了核酸合成方法，其包括：为至少200个预选核酸提供预定序列；提供包含图案化表面的装置，其中所述装置包含二氧化硅；其中所述图案化表面如下产生：在第一区域处的表面上沉积第一分子，其中所述第一分子结合至表面并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；以及在第二区域处的表面上沉积第二分子，其中所述第二区域包含被所述第一区域围绕的多个座位，其中所述第二分子结合至表面并且缺少与核苷亚磷酰胺结合的反应性基团；以及在第二区域处的表面上沉积混合物，其中所述混合物包含所述第二分子和第三分子，其中所述第三分子与表面和核苷亚磷酰胺结合，其中所述混合物包含的所述第二分子的量大于所述第三分子；以及合成至少20,000种不相同的多核苷酸，所述多核苷酸的中每一个的长度为至少50个碱基，其中所述至少20,000种不相同的多核苷酸中的每一个从图案化表面的不同座位延伸；从图案化表面释放所述至少20,000种不相同的多核苷酸；将所述至少20,000种不相同的多核苷酸悬浮在溶液中；以及使包含至少20,000种不相同的多核苷酸的溶液经历聚合酶链组装反应以组装至少200个基因，其中与预定序列相比，所组装的至少200个预选核酸编码的序列的总缺失错误率小于1/1500个碱基。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子和所述第三分子的表面能都高于所述第一分子的表面能，并且其中表面能是在光滑平面表面上的水接触角的量度。进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少10、20、50或75度。进一步提供了这样的方法，其中所述第一区域与所述第二区域之间的水接触角的差异为至少50度。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第三分子为3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述硅烷为氨基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子为丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子为氟硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约100:1至约2500:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以约2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述混合物包含以2000:1的摩尔比存在的所述第二分子和所述第三分子。进一步提供了这样的方法，其中所述第一分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述第二分子缺少游离羟基、氨基或羧基基团。进一步提供了这样的方法，其中所述至少20,000种不相同的多核苷酸中的每一个的长度为约50至约120个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总缺失错误率小于约1/1700个碱基。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下获得总缺失错误率。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，所组装的至少200个预选核酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总错误率小于1/2000个碱基。本文进一步提供了这样的方法，其中所述表面包含二氧化硅层。
本文提供了用于多核苷酸合成的装置，其包含：具有表面的装置，其中所述装置包含二氧化硅；表面上的多个凹陷或立柱，其中每个凹陷或立柱包括：宽度长度为6.8nm至500nm，间距长度为所述宽度长度的约两倍，并且深度长度为所述间距长度的约60％至约125％；表面上的多个座位，其中每个座位的直径为0.5至100μm，其中每个座位包含所述多个凹陷或立柱中的至少两个；以及表面上的多个簇，其中每个簇包含50至500个座位并且具有0.5至2mm的横截面。进一步提供了这样的装置，其中每个簇包含100至150个座位。进一步提供了这样的装置，其中所述装置包含至少30,000个座位。进一步提供了这样的装置，其中所述间距长度为1μm或更小。进一步提供了这样的装置，其中所述深度长度为1μm或更小。进一步提供了这样的装置，其中每个座位的直径为0.5μm。进一步提供了这样的装置，其中每个座位的直径为10μm。进一步提供了这样的装置，其中每个座位的直径为50μm。进一步提供了这样的装置，其中每个簇的横截面为约1.125mm。进一步提供了这样的装置，其中每个簇的间距为约1.125mm。进一步提供了这样的装置，其中每个座位包含与表面和核苷亚磷酰胺结合的分子。进一步提供了这样的装置，其中所述与表面和核苷亚磷酰胺结合的分子为硅烷。进一步提供了这样的装置，其中所述与表面和核苷亚磷酰胺结合的分子为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。进一步提供了这样的装置，其中所述硅烷为3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。进一步提供了这样的装置，其中所述硅烷为氨基硅烷。进一步提供了这样的装置，其中围绕所述多个座位的区域包含结合至表面并且缺少核苷亚磷酰胺的分子。进一步提供了这样的装置，其中所述结合至表面并且缺少核苷亚磷酰胺的分子为氟硅烷。进一步提供了这样的装置，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷或全氟辛基三氯硅烷。进一步提供了这样的方法，其中所述表面包含二氧化硅层。
本文提供了多核苷酸合成方法，其包括：提供预定序列；提供通过任一种本文所述方法制备的用于多核苷酸合成的装置；合成长度为至少10个碱基的多种不相同的多核苷酸，其中所述不相同的多核苷酸中的每一个从不同的座位延伸。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总缺失错误率小于约1/1700个碱基。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下获得总缺失错误率。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，所述多种不相同的合成多核苷酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总错误率小于1/2000个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总错误率小于1/3000个碱基。
本文提供了核酸合成方法，其包括：为至少200个预选核酸提供预定序列；提供本文所述的装置；合成至少20,000种不相同的多核苷酸，所述多核苷酸中的每一个的长度为至少50个碱基，其中所述至少20,000种不相同的多核苷酸中的每一个从不同座位延伸；从表面释放所述至少20,000种不相同的多核苷酸；将所述至少20,000种不相同的多核苷酸悬浮在溶液中；以及使包含至少20,000种不相同的多核苷酸的溶液经历聚合酶链组装反应以组装至少200个基因，其中与预定序列相比，所组装的至少200个预选核酸编码的序列的总缺失错误率小于1/1500个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总缺失错误率小于约1/1700个碱基。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下获得总缺失错误率。进一步提供了这样的方法，其中在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，所组装的至少200个预选核酸编码的序列的总错误率小于1/1000个碱基。进一步提供了这样的方法，其中与预定序列相比，总错误率小于1/2000个碱基。
本文提供了用于多核苷酸合成的装置，其包含：具有表面的装置，其中所述装置包含二氧化硅；表面上的多个凹陷或立柱，其中每个凹陷或立柱包括(i)6.8nm至500nm的宽度长度，(ii)为所述宽度长度的约两倍的间距长度，以及(iii)为所述间距长度的约60％至约125％的深度长度；表面上的多个座位，其中每个座位的直径为0.5至100um，其中每个座位包含所述多个凹陷或立柱中的至少两个；表面上的多个簇，其中每个簇包含50至500个座位并且具有0.5至2mm的横截面，其中所述多个座位包含少于饱和量的分子，所述分子结合至表面并且与核苷亚磷酰胺偶联；以及围绕每个座位的多个区域，其包含结合表面并且不偶联核苷亚磷酰胺的分子，其中所述多个座位比所述围绕每个座位的多个区域的表面能更高。进一步提供了这样的装置，其中所述结合表面并且与核苷亚磷酰胺偶联的分子为本文公开的硅烷。进一步提供了这样的装置，其中所述结合表面并且不偶联核苷亚磷酰胺的分子为本文公开的氟硅烷。进一步提供了这样的装置，其中所述多个座位涂覆有这样的分子，其结合表面，不偶联核苷亚磷酰胺，并且具有比围绕每个座位的多个区域上的分子更高的表面能。进一步提供了这样的方法，其中所述表面包含二氧化硅层。
表面材料
本文提供了包含表面的装置，其中所述表面被修饰用于在预定位置并且以低错误率、低遗漏率、高产量和高寡核苷酸呈现的方式支持多核苷酸合成。在一些实施方案中，本文提供的用于多核苷酸合成的装置的表面由能够被修饰用于支持从头多核苷酸合成反应的多种材料制成。在一些情况下，该装置具有足够的导电性，例如，能够跨整个装置或其一部分形成均匀电场。本文所述的装置可包含柔性材料。示例性柔性材料包括但不限于改性尼龙、未改性尼龙、硝酸纤维素和聚丙烯。本文所述的装置可包含刚性材料。示例性刚性材料包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、二氧化硅、氮化硅、塑料(例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯，以及其共混物)和金属(例如，金、铂)。本文公开的装置可由包括硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃或其任何组合在内的材料制成。在一些情况下，本文公开的装置使用本文所列材料或本领域中已知的任何其他合适材料的组合制成。
本文所述的示例性材料的拉伸强度的列表如下：尼龙(70MPa)、硝酸纤维素(1.5MPa)、聚丙烯(40MPa)、硅(268MPa)、聚苯乙烯(40MPa)、琼脂糖(1-10MPa)、聚丙烯酰胺(1-10MPa)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)(3.9-10.8MPa)。本文所述的固体支持物的拉伸强度可为1至300、1至40、1至10、1至5或3至11MPa。本文所述的固体支持物的拉伸强度可为约1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、20、25、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、270MPa或更大。在一些情况下，本文所述的装置包含用于多核苷酸合成的固体支持物，其呈能够储存在连续环或卷轴中的柔性材料例如带或柔性片的形式。
杨氏模量衡量材料对负载下的弹性(可恢复)变形的抵抗力。本文所述的示例性材料的刚度的杨氏模量的列表如下：尼龙(3GPa)、硝酸纤维素(1.5GPa)、聚丙烯(2GPa)、硅(150GPa)、聚苯乙烯(3GPa)、琼脂糖(1-10GPa)、聚丙烯酰胺(1-10GPa)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)(1-10GPa)。本文所述的固体支持物的杨氏模量可为1至500、1至40、1至10、1至5或3至11GPa。本文所述的固体支持物的杨氏模量可为约1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、20、25、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、400、500GPa或更大。由于柔性与刚度之间的关系为彼此成反比，因此柔性材料具有低杨氏模量并且在负载下其形状显著改变。
在一些情况下，本文公开的装置包含二氧化硅基质和氧化硅表面层。或者，该装置可以具有氧化硅基质。本文提供的装置的表面可以是纹理化的，导致用于多核苷酸合成的总表面积增加。本文公开的装置可包含至少5％、10％、25％、50％、80％、90％、95％或99％的硅。本文公开的装置可以由绝缘体上硅(SOI)晶片制成。
功能化表面
本文提供了包含表面的装置，其中所述表面被修饰用于在预定活性区域以低错误率、低遗漏率、高产量和高寡核苷酸呈现的方式支持多核苷酸合成。在一些实施方案中，可以以适合于寡核苷酸合成的各种方式来调节表面的表面特性。本文公开的装置是包含表面的装置，其中所述表面的部分具有不同的润湿性特征和不同的偶联核苷的能力。在一些实施方案中，本文公开的装置包含表面和沉积在所述表面的至少一部分上的多个第一分子，其中所述多个第一分子包括表现出高表面能的高能分子，其中所述第一分子结合至表面并且包含能够与核苷结合的反应性基团，并且其中所述包含第一分子的表面部分是活性区域。在一些实施方案中，将多个第二分子沉积在表面的一部分上，其中所述多个第二分子包括表现出低表面能的低能分子，其中所述多个第二分子结合至表面并且缺少偶联核苷的反应性基团，从而形成阻止与表面的偶联反应的钝化区域。在一些实施方案中，所述核苷包含核酸单体。
在一些实施方案中，所述多个第一分子包括多种高能分子的混合物，其中每种高能分子结合至表面并且包含能够与核苷结合的反应性基团。在一些实施方案中，所述多个第一分子包括多种高能分子的混合物，其中每种高能分子结合至表面并且包含能够与特定核苷结合的反应性基团，以支持具有某个序列的某多核苷酸群体的合成。在一些情况下，从装置的表面合成的多核苷酸编码较长的核酸序列(例如，基因)。在一些情况下，所述多个第二分子包括多种低能分子的混合物，其中每种低能分子结合至表面并且缺少能够偶联一种或多种特定核苷的反应性基团。在一些实施方案中，所述低能分子包含钝化功能化。在一些实施方案中，低能分子缺少用于在偶联反应中与核苷结合的可用反应性基团，如羟基、氨基或羧基基团。
在一些情况下，所述多个第一分子包含核苷偶联反应性基团，例如核苷亚磷酰胺。在一些实施方案中，反应性基团包括羟基、氨基、羧基基团或其任何组合，其中所述反应性基团通过偶联反应与核苷结合。在一些情况下，所述装置的表面包含硅，并且第一分子包括氨基硅烷分子，该氨基硅烷分子的硅原子与表面上的氧原子结合，并且采用另外的化学相互作用与光致抗蚀剂或生物分子结合。在一个实例中，所述第一分子包括(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)或(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，其中每个第一分子均包含能够与装置表面上的氧原子结合的硅原子，并且其中所述多个第一分子包含胺基团以与有机分子结合。示例性第一分子包括(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺。
表面的表面能或疏水性可与在水滴表面与固体表面之间形成的水接触角相关。具有小于90°的水接触角的固体表面被认为具有高表面积，并且被称作亲水性的或极性的。具有大于90°的水接触角的固体表面被认为具有低表面能，并且被称作疏水性的或非极性的。具有非常低的表面能的高度疏水性表面可具有大于120°的水接触角。
在一些情况下，在一个或多个光滑或平面等效表面上测得的在包含第一分子的表面部分的水接触角与包含第二分子的表面部分的水接触角之间的差别对应于差异的疏水性。在一些实施方案中，水接触角小于40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°，或者大于90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°。在一些实施方案中，水接触角为约5°至约90°。在一些实施方案中，水接触角为至少约5°。在一些实施方案中，水接触角为至多约90°。在一些实施方案中，水接触角为约5°至约10°、约5°至约20°、约5°至约30°、约5°至约40°、约5°至约50°、约5°至约60°、约5°至约70°、约5°至约80°、约5°至约90°、约10°至约20°、约10°至约30°、约10°至约40°、约10°至约50°、约10°至约60°、约10°至约70°、约10°至约80°、约10°至约90°、约20°至约30°、约20°至约40°、约20°至约50°、约20°至约60°、约20°至约70°、约20°至约80°、约20°至约90°、约30°至约40°、约30°至约50°、约30°至约60°、约30°至约70°、约30°至约80°、约30°至约90°、约40°至约50°、约40°至约60°、约40°至约70°、约40°至约80°、约40°至约90°、约50°至约60°、约50°至约70°、约50°至约80°、约50°至约90°、约60°至约70°、约60°至约80°、约60°至约90°、约70°至约80°、约70°至约90°或约80°至约90°。在一些实施方案中，水接触角为约5°、约10°、约20°、约30°、约40°、约50°、约60°、约70°、约80°或约90°。
不受理论束缚，润湿现象被理解为在固-液界面处的分子之间的表面张力或吸引力的量度，并以达因/cm2表示。在一个实例中，由于氟碳化合物的碳-氟键的独特的极性(电负性)，氟碳化合物被认为具有非常低的表面张力。在其他实例中，结构紧密的Langmuir-Blodgett型膜层的表面张力可能主要由烷基链末端中的氟的百分比来决定。对于这样紧密有序的膜，单个末端三氟甲基基团可使得表面几乎与全氟烷基层一样为疏脂性的。进一步地，共价附接至下面的衍生化固体支持物(例如高度交联的聚合物)的氟碳化合物表现出的反应位点的密度低于Langmuir-Blodgett型膜的反应位点密度。例如，甲基三甲氧基硅烷表面的表面张力为约22.5mN/m，而氨基丙基三乙氧基硅烷表面的表面张力为约35mN/m。
一般认为表面在其临界表面张力大于45mN/m时表现出亲水行为。因此，具有高临界表面张力的表面表现出小接触角和较强的吸附行为。一般认为表面在其临界表面张力小于35mN/m时表现出疏水行为。低临界表面张力与亲油行为(即表面被烃油的润湿)有关。具有20mN/m以下的临界表面张力的表面可抵抗通过烃油的润湿，并被认为既疏油又疏水。
可使用硅烷表面修饰来生成宽范围的临界表面张力。本文公开的装置和方法包括表面涂层，例如，包含硅烷的表面涂层，以获得小于5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、115、120mN/m或更高的表面张力。进一步地，在一些情况下，本文公开的装置和方法使用表面涂层，例如，包含硅烷的表面涂层，以获得大于115、110、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6mN/m或更低的表面张力。
在通过引用而全文并入本文的Arkles等人(Silanes and Other CouplingAgents,Vol.5v:The Role of Polarity in the Structure of Silanes Employed inSurface Modification.2009)的表1和表2中描述了表面涂层(例如，包含硅烷的表面涂层)的非限制性示例的水接触角和表面张力。所述表格复制如下。
表1
光滑平面上的水接触角(度)
表2
临界表面张力(mN/m)
在一些实施方案中，本文所述的装置包含表面，其中所述表面的一个或多个区域包含多个第二分子，其中所述多个第二分子结合至表面，缺少能够与核苷结合的反应性基团，并且对于普通寡核苷酸合成的条件来说是惰性的(根据选定的化学法，固体表面可在单体添加期间在本体溶剂界面缺乏游离羟基、氨基或羧基基团)。
在一些实施方案中，本文公开的装置的表面上层叠有一个或多个不同的化合物层。这类感兴趣的层可包括但不限于无机层和有机层，诸如金属、金属氧化物，聚合物、有机小分子等。非限制性聚合物层包括肽、蛋白质、核酸或其模拟物(例如，肽核酸等)、多糖、磷脂、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯，以及本文所述的或除此之外本领域中已知的任何其他合适的化合物。在一些情况下，聚合物为杂聚物。在一些情况下，聚合物为均聚物。在一些情况下，聚合物包含功能部分或为缀合的。
在一些情况下，装置表面的一个或多个区域在合成的第一个循环开始之前，或在寡核苷酸合成过程的前几个循环之前或期间包含反应性部分，其中所述反应性部分可在寡核苷酸合成反应的一个、两个、三个、四个、五个或更多个循环之后快速被消耗到不可测量的密度。在一些实施方案中，表面被进一步优化用于孔或洞润湿，(例如，通过诸如乙腈和乙二醇醚等常用有机溶剂或水性溶剂，相对于周围表面)。
形成功能化表面的方法
本文公开了用于以低错误率、低遗漏率、高产量和高寡核苷酸呈现的方式合成多核苷酸的装置。在一些实施方案中，可以以适合于寡核苷酸合成的各种方式来调节涂覆表面的表面特性。本文公开的装置包含具有不同的润湿性特征和不同的偶联核苷的能力的表面。在一些实施方案中，本文公开的装置包含具有多个活性区域的表面，其中每个活性区域表现出高表面能并且包含含有高能分子的第一分子，其中所述第一分子与装置的表面和核苷结合，从而支持与表面的偶联反应。在一些实施方案中，所述多个活性区域中的每一个被钝化区域围绕，其中所述钝化区域包含表现出低表面能的第二分子，其中所述第二分子结合至表面并且缺少能够与核苷结合的反应性基团，从而防止与表面的偶联反应。在一些实施方案中，所述核苷包括核酸单体。
本文提供了装置表面功能化方法，其包括：(a)提供具有包含二氧化硅的表面的装置；和(b)使用本文所述的或其他方式本领域中已知的合适的硅烷化剂(例如，有机官能烷氧基硅烷分子)来使所述表面得以硅烷化。在一些情况下，有机官能烷氧基硅烷分子包括二甲基氯十八烷基硅烷、甲基二氯十八烷基硅烷、三氯十八烷基硅烷、三甲基十八烷基硅烷、三乙基十八烷基硅烷或其任意组合。在一些情况下，表面包含用聚乙烯/聚丙烯(通过γ辐射或铬酸氧化并还原成羟烷基表面而功能化)、高度交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯(通过氯甲基化衍生化，并胺化成苄胺功能表面)、尼龙(末端氨基己基基团是直接反应性的)功能化或以还原的聚四氟乙烯来刻蚀。
为了获得具有低密度核苷偶联剂的表面，将活性功能化剂和钝化功能化剂的混合物混合并沉积在本文公开的装置表面的多个预定区域。在一些实施方案中，活性功能化剂和钝化功能化剂的混合物提供具有少于饱和量的活性功能化剂的装置表面区域，因此降低了特定区域中功能化剂的密度。结合至本文公开的表面的试剂的混合物可沉积在表面的预定区域上，其中涂覆的表面提供的合成多核苷酸的密度比从仅包含活性功能化剂的表面区域延伸的合成多核苷酸的密度小约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。该混合物可包含(i)结合表面并且与核苷偶联的硅烷和(ii)结合至表面并且不偶联核苷的硅烷，该硅烷沉积在本文公开的装置表面的预定区域上，其中所述装置的涂覆表面提供的合成多核苷酸的密度比从包含(i)结合表面并且与核苷偶联的硅烷但不包含(ii)结合表面并且不偶联核苷的硅烷的表面区域延伸的合成多核苷酸的密度小约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。可以用稀释量的本文公开的活性功能化剂处理表面的预定区域，以使合成多核苷酸的密度与涂覆有非稀释量的活性功能化剂的相同表面相比降低约50％。
可任选地包含在本文公开的混合物中的一种示例性活性功能化剂是3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。例如，该混合物可包括3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷或丙基三甲氧基硅烷；或3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷和丙基三甲氧基硅烷。
围绕用混合物沉积的那些区域的区域可以涂覆有具有较低表面能的钝化功能化剂。在一些情况下，该钝化功能化剂为氟硅烷。示例性氟硅烷包括(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷、全氟辛基三氯硅烷、全氟辛基三乙氧基硅烷和全氟辛基三甲氧基氯硅烷。
更广泛地，活性功能化剂可包括硅烷，例如氨基硅烷。在一些情况下，活性功能化剂包括一旦被活化就可与核苷(例如核苷亚磷酰胺)偶联的硅烷。活性功能化剂可以是具有比钝化功能化剂更高的表面能的硅烷，所述钝化功能化剂沉积在位于该硅烷所沉积的预定区域之外的表面区域上。在一些情况下，混合物中的两种分子类型均包括硅烷，其中所述混合物沉积在表面上。在一个实例中，混合物中的一种分子是结合表面并与核苷偶联的硅烷，混合物中的另一种分子是结合至表面并且不偶联核苷的硅烷。在这样的情况下，混合物中的两种分子在沉积在表面上时提供具有比周围区域更高的表面能的区域。
本文公开的混合物中的试剂选自合适的反应性和惰性部分，其将反应性基团的表面密度稀释至下游反应所需的水平，其中两种分子具有类似的表面能。在一些情况下，在寡核苷酸合成反应中反应形成生长的寡核苷酸的部分表面官能团的密度为约0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0、50.0、75.0或约100.0μmol/m2。
本文公开的混合物可包含至少2、3、4、5种或更多种不同类型的功能化剂。混合物可包含1、2、3种或更多种硅烷。沉积在本文公开的表面上的混合物中的至少两种类型的表面功能化剂之间的比率的范围可为约1:1至1:100，其中与不偶联核苷的功能化剂相比，活性功能化剂被稀释更多。在一些情况下，沉积在本文公开的表面上的混合物中的至少两种类型的表面功能化剂的比率为约1:100至1:2500，其中与不偶联核苷的功能化剂相比，活性功能化剂被稀释更多。
沉积在本文公开的表面上的混合物中的至少两种类型的表面功能化剂的示例性比率包括至少1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:2500、1:3000或1:5000，其中与不偶联核苷的功能化剂相比，活性功能化剂被稀释更多。混合物中的至少两种类型的表面功能化剂之间的示例性具体比率为约1:2000，其中与不偶联核苷的功能化剂相比，活性功能化剂被稀释更多。
混合物中的至少两种类型的表面功能化剂之间的另一示例性具体比率为约1:2000，其中与不偶联核苷的功能化剂相比，活性功能化剂被稀释更多。
沉积在表面上的钝化功能化剂可为氟硅烷分子。示例性氟硅烷分子为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷和全氟辛基三氯硅烷。沉积在本文公开的表面上的混合物可包含结合表面和核苷亚磷酰胺的硅烷，该硅烷被结合至表面但不与核苷亚磷酰胺结合的硅烷以约1:100至约1:2500稀释。在一些情况下，沉积在本文公开的表面的硅烷分子以约1:2000稀释。
为了在本文公开的装置表面上的特定位置处获得活性剂密度的降低，在沉积混合物本身之前，在用于核酸延伸的区域处沉积混合物的非核苷分子。在一些情况下，沉积在本文公开的表面上的混合物包含以约1:2000的比率稀释的3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。沉积在本文公开的表面上的混合物可包含在丙基三甲氧基硅烷中以约1:2000的比率稀释的3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷。在一个实例中，在沉积丙基三甲氧基硅烷和3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷的混合物之前，首先在本文所述的表面的用于核酸延伸的区域处沉积丙基三甲氧基硅烷。在一些情况下，在多核苷酸合成的位点处沉积的硅烷选自11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-缩水甘油基氧基丙基/三甲氧基硅烷和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺，或者表面的一部分被功能化或修饰成与功能化或修饰之前的表面或表面部分相比更亲水或更疏水。
本文提供了包含表面的装置，所述表面具有包含两种或更多种分子的预定的第一区域，其中所述两种或更多种分子中的每一种具有不同的偶联核苷的能力并且具有相似的水接触角。在一些情况下，如在一个或多个光滑或平面等效表面上测得的，所述两种或更多种分子之间的水接触角的差异小于40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°。在一些情况下，第一区域被第二区域围绕，其中如在一个或多个光滑或平面等效表面上测得的，所述第一和第二区域具有大于90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角的差异。在一些情况下，第一区域被第二区域围绕，其中如在一个或多个光滑或平面等效表面上测得的，所述第一和第二区域具有至少90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角的差异。除非另有说明，否则本文提及的水接触角对应于在所讨论的表面的非弯曲、平滑或平面等效物上进行的测量。
从头多核苷酸合成方法
本文所述的具有修饰的表面的装置可用于从头合成过程。一个这样的过程的示例性工作流程一般分为以下阶段：(1)从头合成单链多核苷酸文库，(2)连接多核苷酸以形成更大的片段，(3)错误校正，(4)质量控制，以及(5)运输，图9。在从头合成之前，预选预期的核酸序列或核酸序列组。例如，预选一组基因用于生成。
一旦选择用于生成的预选核酸，则设计预定的多核苷酸文库用于从头合成。用于生成高密度多核苷酸阵列的各种合适的方法是已知的。在工作流程示例中，提供了表面层901。在该示例中，改变表面的化学性质以改进多核苷酸合成过程。生成低表面能的区域以排斥液体，同时生成高表面能的区域以吸引液体。表面本身可以是平面表面的形式或者包含形状的变化，例如增加表面积的突起或微孔。在工作流程示例中，如在通过引用以其全文并入本文的国际专利申请公开WO/2015/021080中所公开的，所选择的高表面能分子具有支持DNA化学过程的双重功能。
在固体支持物上进行多核苷酸阵列的原位制备，并利用单核苷酸延伸过程平行延伸多个寡聚物。装置如多核苷酸合成仪(材料沉积装置)被设计为以逐步方式释放试剂，使得多个多核苷酸平行地一次延伸一个残基，以生成具有预定核酸序列902的寡聚物。在一些情况下，多核苷酸在该阶段从表面上切下。切割可包括例如使用氨或甲胺的气体切割。
将生成的多核苷酸文库放置于反应室中。在该示例性工作流程中，反应室(也被称为“纳米反应器”)为硅涂覆的孔，其含有PCR试剂并降低到多核酸文库903上。在多核苷酸密封904之前或之后，添加试剂以从表面释放多核苷酸。在示例性工作流程中，多核苷酸在纳米反应器密封905之后释放。一旦释放，单链多核苷酸的片段杂交以跨越整个长程DNA序列。部分杂交905是可能的，因为每个合成的多核苷酸被设计为具有与池中的至少一个其他多核苷酸重叠的一小部分。
杂交后，开始PCA反应。在聚合酶循环过程中，多核苷酸与互补片段退火并且空位由聚合酶填充。根据那些多核苷酸彼此发现，每个循环随机增加各个片段的长度。片段之间的互补性允许形成完整的大跨度双链DNA 906。
在PCA完成之后，将纳米反应器与表面分开907并定位成与聚合酶相互作用908。密封后，纳米反应器经历PCR 909并形成较大的核酸。在PCR之后910，打开纳米室911，添加错误校正试剂912，将腔室密封913并进行错误校正反应以从双链PCR扩增产物中去除互补性差的错配碱基对和/或链914。打开并分离纳米反应器915。错误校正产物接下来经历另外的处理步骤如PCR和分子条形码化，随后包装922用于运输923。
在一些情况下，采取质量控制措施。在错误校正之后，质量控制步骤包括例如与具有用于扩增错误校正产品的测序引物的晶片进行相互作用916，将晶片密封到含有错误校正扩增产物的腔室中917，并执行另一轮扩增918。打开纳米反应器919，并且合并产物920并进行测序921。在做出可接受的质量控制检测之后，包装产品922准许进行运输923。
本文所述的装置包含活性功能化的表面，其被配置用于支持多核苷酸的附接和合成。合成的多核苷酸包括含有修饰的和/或非标准的碱基和/或修饰的骨架的多核苷酸。在多种方法中，在本文公开的装置上合成具有预选序列的多核苷酸的文库。在一些情况下，一种或多种多核苷酸与文库中的另一种多核苷酸具有不同的序列和/或长度。通过改变表面的一个或多个特征和/或待合成的多核苷酸序列；用于表面功能化和/或多核苷酸合成的一种或多种方法；或其组合来控制和调节在表面上合成的每种多核苷酸的化学计量。在一些情况下，控制本文公开的装置的解析座位上的生长多核苷酸的密度允许以低错误率合成多核苷酸。
本文提供了包含表面的装置，该表面支持在共同支持物上的可寻址位置处合成具有不同预定序列的多种多核苷酸。本文公开的装置的表面可支持合成超过2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、10,000,000种或更多种不相同的多核苷酸。
在一些情况下，至少一部分多核苷酸具有相同的序列或被配置为以相同的序列合成。本文公开的装置提供了用于生长具有至少约10、20、30、50、60、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、1000、2000个碱基或更长的多核苷酸的表面环境。本文提供了包含表面的装置，该表面支持至少约10、20、30、50、60、70、75、80、90、100、120、150、200、300、400、500、600、700、800个或更多个碱基的合成。
可合成多核苷酸文库，其中不同多核苷酸的群体被组装以生成包含至少约500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、40,000或50,000个碱基的较大核酸。本文所述的多核苷酸合成方法可用于生成包含至少500、1,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,100,000、1,200,000、1,300,000、1,400,000、1,500,000、1,600,000、1,700,000、1,800,000、1,900,000、2,000,000、2,200,000、2,400,000、2,600,000、2,800,000、3,000,000、3,500,000、4,00,000或5,000,000种不同多核苷酸的多核苷酸文库。在一些情况下，在座位内合成至少约1pmol、10pmol、20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、150pmol、200pmol、300pmol、400pmol、500pmol、600pmol、700pmol、800pmol、900pmol、1nmol、5nmol、10nmol、100nmol或更多的多核苷酸。
使用包含沉积合成所需试剂的多核苷酸合成仪材料沉积装置的系统在本文所述的表面上合成多核苷酸，图10。用于多核苷酸合成的试剂包括，例如，用于多核苷酸延伸的试剂和洗涤缓冲液。作为非限制性实例，多核苷酸合成仪沉积偶联剂、加帽剂、氧化剂、解封闭剂、乙腈和气体如氮气。此外，多核苷酸合成仪任选地沉积用于制备和/或用于维持装置完整性的试剂。多核苷酸合成仪包含材料沉积装置，该装置可沿X-Y方向移动以与装置表面的位置对准。多核苷酸合成仪还可沿Z方向移动以密封装置表面，从而形成解析反应器。
本文提供了这样的方法，其中可平行合成至少或约至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、10000、50000、100000种或更多种核酸。在装置内合成的核酸的总摩尔质量或每种核酸的摩尔质量可为至少或至少约10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、25000、50000、75000、100000皮摩尔或更大。
本文公开的多核苷酸合成方法包括不依赖于酶的方法。与本文提供的装置一起使用的合成方法的实例是包含亚磷酰胺化学法的合成方法，图11。通常，在具有用于亚磷酰胺化学法的适当修饰的单体如单核苷酸、二核苷酸或更长的寡核苷酸沉积之后，可至少一次地进行下列步骤中的一个或多个，以实现高质量聚合物的原位分步合成：1)偶联，2)加帽，3)氧化，4)硫化，以及5)解封闭(脱三苯甲基化)。洗涤步骤通常介于步骤1至5之间。
本文提供了这样的方法，其中多核苷酸错误率取决于多核苷酸合成中的一个或多个化学步骤的效率。在一些情况下，多核苷酸合成包括亚磷酰胺法，其中生长的多核苷酸链的碱基与亚磷酰胺偶联。碱基的偶联效率与错误率有关。例如，较高的偶联效率与较低的错误率相关。在一些情况下，本文所述的装置和/或合成方法允许大于98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％或99.99％的偶联效率。在一些情况下，多核苷酸合成方法包括双重偶联方法，其中生长的多核苷酸链的碱基与亚磷酰胺偶联，洗涤并干燥该多核苷酸，然后用亚磷酰胺再次处理。亚磷酰胺多核苷酸合成方法中解封闭的效率也与错误率有关。在一些情况下，本文所述的装置和/或合成方法允许5’-羟基保护基团以大于98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％或99.99％的效率移除。通过使脱嘌呤副反应最小化可以降低错误率。
多核苷酸合成方法通常涉及以下步骤的迭代序列：将受保护的单体施加于活性功能化表面(例如，座位)以与该活化的表面、连接体或与先前脱保护的单体连接；使所施加的单体脱保护，使得其可与随后施加的受保护的单体反应；以及施加另一种受保护的单体进行连接。一个或多个中间步骤包括氧化或硫化。在一些情况下，一个或多个洗涤步骤在一个或全部步骤之前或之后。
本文公开的方法提供至少20,000种或更多种不相同的多核苷酸的合成，每种多核苷酸的长度为至少30个碱基，其中所述至少20,000种不相同的多核苷酸中的每一个从图案化表面的不同座位延伸。本文公开的方法提供了共同编码至少200个预选核酸的至少20,000种不相同的多核苷酸，在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，该多核苷酸具有小于1/1000个碱基的总错误率。本文公开的方法提供至少6,000种或更多种不相同的多核苷酸的合成，每种多核苷酸的长度为至少30个碱基，其中所述至少6,000种不相同的多核苷酸中的每一个从图案化表面的不同座位延伸。本文公开的方法提供了共同编码至少50个预选核酸的至少6,000种不相同的多核苷酸，在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，该多核苷酸具有小于1/1000个碱基的总错误率。本文公开的方法提供至少100,000种或更多种不相同的多核苷酸的合成，每种多核苷酸的长度为至少30个碱基，其中所述至少100,000种不相同的多核苷酸中的每一个从图案化表面的不同座位延伸。本文公开的方法提供了共同编码至少750个预选核酸的至少100,000种不相同的多核苷酸，并且在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，该多核苷酸具有小于1/1000个碱基的总错误率。在一些情况下，与预定序列相比，总错误率小于1/1500个碱基、小于1/2000个碱基、小于1/3000个碱基或更小。本文提供的表面提供低错误率。
本文提供了用于多核苷酸合成的系统，其包括：材料沉积装置，该装置包含用于多核苷酸合成的多种试剂和用于沉积所述用于多核苷酸合成的多种试剂的多个喷嘴；用于控制所述用于多核苷酸合成的多种试剂从所述多个喷嘴中的释放的计算机；以及本文公开的用于接收所述用于多核苷酸合成的多种试剂的平板。
具有低错误率的寡核苷酸文库
术语“错误率”在本文中还可指由生成的多核苷酸所编码的总体序列与一种或多种预定的较长核酸(例如，基因)的序列进行的比较。总“错误率”是指所合成的核酸与其旨在编码的预定序列相比的总体错误率。错误率包括错配错误率、缺失错误率、插入错误率、插入/缺失错误率，其任何组合。本文的方法和装置为具有至少20,000、40,000、60,000、80,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、1,000,000或2,000,000种或更多种多核苷酸的合成多核苷酸文库提供低错误率。座位可以被配置成包含多核苷酸群体，其中所述群体可以被配置成包含具有相同或不同序列的多核苷酸。
本文所述的装置和方法为遇到的各种类型的错误提供了较低的总错误率。各种类型的错误率包括合成的多核苷酸文库的缺失、插入或置换。在一些情况下，合成的多核苷酸的总错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低。这些错误率可以是对于所合成多核苷酸的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更多而言的。
本文所述的方法提供了平均缺失错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:1700、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低的多核苷酸的合成。本文所述的方法提供了总缺失错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:1700、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低的多核苷酸的合成。本文所述的方法提供了总插入错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低的多核苷酸的合成。本文所述的方法提供了总插入错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低的多核苷酸的合成。本文所述的方法提供了总置换错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低的多核苷酸的合成。本文所述的方法提供了总插入错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低的多核苷酸的合成。本文所述的方法提供了总置换错误率为约1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或更低的多核苷酸的合成。每种合成多核苷酸的各个类型的错误如缺失、插入或置换的总错误率或错误率可以是对于所合成寡核苷酸的50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更多而言的。
在经常观察到特定的核碱基与错误率的增加(例如由于缺失或插入错误率)有关的一些情况下，预定序列被设计为使有错误倾向的核碱基被另一碱基替换，使得该替换不会改变序列编码的密码子。在观察到特定的核碱基经常与错误率的降低(例如由于缺失或插入错误率)有关的一些情况下，预定序列被设计为使一个或多个其他有错误倾向的核碱基被低错误倾向的核碱基替换，使得该替换不会改变序列编码的密码子。
多核苷酸释放和组装
使用本文所述的方法和装置合成的多核苷酸任选地从合成它们的表面释放。在一些情况下，在该阶段从表面上切割多核苷酸。切割可包括例如使用气态氨或气态甲胺的气体切割。单个簇中的座位共同对应于编码单个基因的序列，并且当切割时，该序列可以保留在簇内座位的表面上。施加氨气用于同时使在合成步骤中受保护的磷酸基团脱保护，即移除吸电子氰基基团。一旦从表面释放，多核苷酸可以组装成更大的核酸。合成的多核苷酸可用作例如基因组装/合成、定点诱变、核酸扩增、微阵列和测序文库的组分。
本文提供了这样的方法，其中预定序列的多核苷酸被设计为共同跨越靶序列如基因的大区域。在一些情况下，通过连接反应连接合成的多核苷酸来生成较大的多核苷酸。连接反应的一个实例是聚合酶链组装(PCA)。在一些情况下，至少一部分多核苷酸被设计为包含作为通用引物结合的基底的附加区域。对于PCA反应，预先合成的多核苷酸包括彼此的重叠(例如，具有重叠序列的4、20、40个或更多个碱基)。在聚合酶循环过程中，多核苷酸与互补片段退火，并随后通过聚合酶进行补平。每个循环因此根据多核苷酸彼此找到而随机增加各个片段的长度。片段之间的互补性允许形成完整的大跨度双链DNA。在一些情况下，在PCA反应完成之后，使用错配修复检测酶来进行错误校正步骤以去除序列中的错配。一旦生成较大的靶序列片段，就可以对该片段进行扩增。例如，在一些情况下，包含5’和3’末端衔接子序列的靶序列在聚合酶链式反应(PCR)中进行扩增，所述PCR包括修饰的引物，例如与衔接子序列杂交的含有尿嘧啶的引物。
本文提供了这样的方法，其中在多核苷酸合成之后，一个簇内的多核苷酸从它们各自的表面释放并合并到公共区域如孔中。在一些情况下，合并的多核苷酸在孔内被组装成更大的核酸如基因。在一些情况下，从在本文公开的装置表面上合成的多核苷酸组装了至少约1、10、50、100、200、240、500、1000、10000、20000、50000、100000、1000000种或更多种核酸。在一些情况下，每个组装的核酸包括基因。在一些情况下，每个组装的核酸包括载体或质粒序列。
传递印刷(pass-printing)方案可以用于将试剂递送到簇中的座位，以及将合成反应产物转移到另一位置。使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或10次传递来递送试剂。在一些情况下，在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，通过本文所述的方法生成的组装的核酸具有低错误率。在一些情况下，在没有校正错误的情况下，与预定序列相比，通过本文所述的方法生成的组装的核酸具有小于1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000个碱基的错误率。
对准标记
在沉积过程中，表面上的参考点被机器用于进行校准目的。本文所述的表面可包含基准标记、全局对准标记、平版印刷术对准标记或其组合。基准标记通常放置在装置的表面上，如簇的阵列1200，以促进这类装置与系统的其他组件对准；图12示出了示例性排列。本文公开的装置的表面可具有一个或多个基准标记，例如2、3、4、5、6、7、8、12、10个基准标记。在一些情况下，基准标记可用于微流体装置的全局对准。
基准标记可具有各种形状和大小。在一些情况下，基准标记具有正方形、圆形、三角形、十字形、“X”、加号、减号或其任何组合的形状。在一些实例中，基准标记具有加号的形状1205。在一些情况下，基准标记包含多个符号。示例性基准标记可包含一个或多个加号1210，例如，2、3、4或更多个加号。在一个实例中，基准标记包含4个加号。
基准标记可位于本文公开的装置的表面上。基准标记可距表面的中心约0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、100μm、1000μm、2000μm、5000μm、7000μm、8000μm、9000μm或10,000μm。在一些情况下，基准标记位于距表面部分的边缘约0.1mm至约10mm，例如距边缘约0.5mm。在一些情况下，基准位于距簇约1mm至10mm，例如1.69mm处。在一些情况下，基准标记的中心到表面在一个维度上的最近角的距离为约0.5mm至约10mm，例如约1mm。在一些情况下，基准标记在一个维度上的长度为约0.5mm至约5mm，例如约1mm。在一些情况下，基准标记的宽度为约0.01mm至约2mm，例如0.05mm。
全局对准标记可具有各种形状和大小。全局对准标记放置在本文所述的装置的表面上，以促进这类装置与系统的其他组件对准；图13示出了示例性排列。示例性全局对准标记具有正方形、圆形、三角形、十字形、“X”、加号、减号或其任何组合的形状。示例性全局对准标记包括圆1325或加号标记1345的形状。在一些情况下，全局对准标记位于基底部分的边缘附近，如标记1305、1310、1315、1320、1330、1335和1340的位置所示。全局对准标记可包含多种符号。在一些情况下，全局对准标记包含一个或多个圆，例如2、3、4或更多加号。
全局对准标记可位于本文公开的装置的表面上。在一些情况下，全局对准标记距表面的中心约0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、100μm、1000μm、2000μm、5000μm、7000μm、8000μm、9000μm或10,000μm。在一些情况下，全局对准标记距表面的边缘约0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、100μm、1000μm、2000μm、5000μm、7000μm、8000μm、9000μm或10,000μm。在一些情况下，全局对准标记的大小为约0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、750μm或1000μm。在实例的排列中，全局对准标记的直径为约125μm，并且位于距装置表面的边缘约1000μm处。本文公开的装置的表面可包含一个或多个全局对准标记，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个标记。全局对准标记之间的距离可为约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、100μm、500μm、1000μm、2000μm、5000μm、7000μm、8000μm、9000μm或10,000μm。
计算机系统
本文提供了使用光引导的方法、流动通道和点样法、喷墨法、基于针的方法或基于珠子的方法将预合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列附接至支持物及其原位合成的方法。在一些情况下，使用点样法将预合成的寡核苷酸附接至支持物或合成，其中单体溶液通过从在区域之间移动的分配器逐滴沉积。在一个实例中，使用机械波致动的分配器将寡核苷酸点样在支持物上。
本文所述的系统可进一步包括用于向具有多个支持物结合的寡核苷酸的第一斑点(或特征)提供小液滴的构件。该小液滴可包括一种或多种组合物，该组合物包含核苷酸或具有待添加的特定或预定核苷酸的寡核苷酸(本文中也称为核苷酸添加构建体)，和/或允许进行杂交、变性、链延伸反应、连接以及消化中的一个或多个的试剂。在一些情况下，在任一个重复中，可将不同的组合物或不同的核苷酸添加构建体沉积在支持物上的不同位置处，以便生成预定的寡核苷酸序列的阵列(具有不同的预定寡核苷酸序列的支持物的不同特征)。一种特别有用的组合物沉积方法是将一个或多个小液滴(每个小液滴都含有所需试剂(例如核苷酸添加构建体))从与支持物表面间隔开的脉冲喷射装置沉积到支持物表面上或者内建于支持物表面的特征上。
当具有解析特征的基底具有不同部分(例如，不同的多核苷酸序列)的多个区域，使得在基底上的特定预定位置(即，“地址”)处的区域(即，基底的“特征”或“斑点”)将检测特定靶标或特定类别的靶标(尽管特征可能偶然检测该位置的非靶标)时，该具有解析特征的基底是“可寻址的”。基底特征通常，但并不需要被间隙隔开。在一些情况下，特征可以内建于基底中并且可创造出一维、二维或三维微流体几何结构。“基底布局”是指特征如位于基底上的特征的一个或多个特性、一个或多个特征维度以及在给定位置处的分子的指示。
本文所述的任何系统均可以可操作地连接至计算机，并且可以本地或远程地通过计算机进行自动化。本文公开的方法可进一步包括计算机系统上的软件程序及其使用。相应地，对于分配/抽真空/再填充功能的同步如编排和同步材料沉积装置运动、分配动作和真空致动的计算机化控制处于本发明的范围内。计算机系统可被编程为在用户指定的碱基序列与材料沉积装置的位置之间接合，以将正确的试剂递送至基底的指定区域。
图14中示出的计算机系统1400可被理解为能够从介质1411和/或网络端口1405读取指令的逻辑设备，其可任选地连接至具有固定介质1412的服务器1409。该系统可包括CPU1401、磁盘驱动器1403、任选的输入设备如键盘1415和/或鼠标1416以及任选的监视器1407。可通过示出的通信媒介实现与本地或远程位置处的服务器的数据通信。通信媒介可包括传输和/或接收数据的任何手段。例如，通信媒介可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可提供经由万维网的通信。可以预期有关本公开内容的数据可经过这样的网络或连接而传输，以便由用户方1422接收和/或审阅。
图15是示出可与本发明的示例实施方案结合使用的计算机系统1500的第一示例架构的框图。示例计算机系统可包括用于处理指令的处理器1502。处理器的非限制性实例包括：Intel XeonTM处理器、AMD OpteronTM处理器、Samsung 32-bit RISC ARM 1176JZ(F)-S v1.0TM处理器、ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100TM处理器、ARM Cortex-A8 Apple A4TM处理器、Marvell PXA 930TM处理器或功能上等效的处理器。多个执行线程可用于并行处理。在一些实施方案中，也可以使用多个处理器或具有多核的处理器，无论是在单一计算机系统中，在群集中，还是通过包含多个计算机、蜂窝电话和/或个人数据助理设备的网络跨系统分布。
高速缓冲存储器1504可连接至或并入处理器1502，以提供由处理器1502新近或频繁使用的指令或数据的高速存储器。处理器1502通过处理器总线1508连接至北桥1506。北桥1506通过存储器总线1512连接至随机存取存储器(RAM)1510，并管理处理器1502对RAM1510的访问。北桥1506还通过芯片集总线1516连接至南桥1514。南桥1514又连接至外围总线1518。外围总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外围总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片集，并管理在处理器、RAM与外围总线1518上的外围组件之间的数据传送。在一些供选择的架构中，北桥的功能性可以并入处理器，而不是使用单独的北桥芯片。在一些实施方案中，系统1500可包括附接至外围总线1518的加速器卡2022。加速器可包括现场可编程门阵列(FPGA)或用于加速某个处理的其他硬件。例如，加速器可用于适应性数据重建或用来评估在扩展集处理中使用的代数表达式。
软件和数据存储在外部存储器1524中并可加载至RAM 1510和/或高速缓冲存储器1504中，以供处理器使用。系统1500包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MACOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能上等效的操作系统，以及在操作系统顶部运行的、用于根据本发明的示例实施方案管理数据存储和优化的应用软件。在该实例中，系统1500还包括与外围总线连接的网络接口卡(NIC)1520和1521，以提供与外部存储如网络附加存储(NAS)和可用于分布式并行处理的其他计算机系统的网络接口。
图16是显示了具有多个计算机系统1602a和1602b、多个蜂窝电话和个人数据助理1602c以及网络附加存储(NAS)1604a和1604b的网络1600的示图。在示例实施方案中，系统1602a、1602b和1602c可管理数据存储并优化对存储在网络附加存储(NAS)1604a和1604b中的数据的数据访问。数学模型可用于该数据并使用跨计算机系统1602a和1602b和蜂窝电话以及个人数据助理系统1602c的分布式并行处理进行评估。计算机系统1602a和1602b和蜂窝电话以及个人数据助理系统1602c也可提供对存储在网络附加存储(NAS)1604a和1604b中的数据的适应性数据重建的并行处理。图16仅示出了一个实例，而多种多样的其他计算机架构和系统可与本发明的多个实施方案一起使用。例如，刀片式服务器可用来提供并行处理。处理器刀片可通过背板连接，以提供并行处理。存储还可通过单独的网络接口连接至背板或作为网络附加存储(NAS)。在一些情况下，处理器可维持单独的存储空间并通过网络接口、背板或其他连接器传输数据以便由其他处理器并行处理。在其他实施方案中，部分或全部的处理器可使用共享的虚拟地址存储空间。
图17是根据示例实施方案使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统1700的框图。该系统包括可访问共享的存储器子系统1704的多个处理器1702a-f。该系统中并入存储器子系统1704中的多个可编程硬件存储算法处理器(MAP)1706a-f。MAP 1706a-f中的每一个可包括存储器1708a-f和一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)1710a-f。MAP提供了可配置的功能单元，并且可向FPGA1710a-f提供特定算法或算法的部分，以便与各自的处理器密切协调处理。例如，在示例实施方案中，MAP可用来评估与数据模型相关的代数表达式以及用来进行适应性数据重建。在该实例中，每一个MAP可被用于这些目的的所有处理器全局访问。在一种配置中，每一个MAP可使用直接存储器访问(DMA)以访问相关联的存储器1708a-f，使其独立于且异步于各自的微处理器1702a-f而执行任务。在这一配置中，MAP可将结果直接提供给另一MAP以用于流水处理和并行执行算法。
软件和数据存储在外部存储器1724中并可加载至RAM 1710和/或高速缓冲存储器1704中，以供处理器使用。系统1700包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MACOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能上等效的操作系统，以及在操作系统顶部运行的、用于根据本发明的示例实施方案管理数据存储和优化的应用软件。在该实例中，系统1700还包括与外围总线连接的网络接口卡(NIC)1720和1721，以提供与外部存储如网络附加存储(NAS)和可用于分布式并行处理的其他计算机系统的网络接口。
以上计算机架构和系统仅为实例，并且多种多样的其他计算机、蜂窝电话和个人数据助理架构和系统可与示例实施方案结合使用，其包括使用普通处理器、协处理器、FPGA和其他可编程逻辑设备、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)和其他处理和逻辑元件的任何组合的系统。在一些情况下，全部或部分计算机系统可用软件或硬件来实现。任何种类的数据存储介质可与示例实施方案结合使用，其包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附加存储(NAS)和其他的本地或分布式数据存储设备和系统。
计算机系统可使用在任何上述或其他计算机架构和系统上执行的软件模块来实现。在其他实例中，系统的功能可部分或完全地在固件、可编程逻辑设备如现场可编程门阵列(FPGA)、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件中实现。例如，集处理器(Set Processor)和优化器可通过使用硬件加速器卡如加速器卡用硬件加速方式实现。
实施例
对于本领域技术人员而言，阐述以下实施例以更清楚地说明本文所公开的实施方案的原理和实践，并且这些实施例不应被解释为限制任何要求保护的实施方案的范围。除非另有说明，否则所有份数和百分比均以重量计。
实施例1：纹理化硅阵列
将立柱阵列蚀刻到二氧化硅晶片中以使表面积增加2至3倍。图18-21示出了微流体装置的图像。图18和19是微流体装置的顶视图图像。图20是微流体装置在52度下的侧视图图像，其尺度能够区分纹理化表面的立柱。图21是纹理化微流体装置的侧视图。
制造具有以下特征的纹理化硅阵列：测得的蚀刻立柱的高度为746nm、立柱顶部的宽度为272nm并且立柱底部的宽度为264nm，以及“覆盖(cap)”立柱的热氧化物层的厚度为74nm。
图22A-22B示出了微流体装置的另外的图像。图22A是微流体装置的侧视图图像，其突出了座位的宏观几何形状。图22B是微流体装置的侧视图图像，其尺度能够区分纹理化表面的立柱。在该实例中，晶片含有测量长度为140mm的芯片90mm，其中该晶片含有6,144个簇的96x 64阵列，并且其中每个簇的水平和垂直间距为1.125mm。进一步地，每个簇均含有121个座位/簇，每个芯片产生743,424个可单独寻址的寡核苷酸位点。
在第二批纹理化硅阵列中，测得的蚀刻立柱的高度为746nm、立柱顶部的宽度为272nm，并且立柱底部宽度为264nm。热氧化物层“覆盖”该立柱，用作硅蚀刻的掩模，并且该热氧化物层的厚度为74nm。
产生第二批纹理化硅阵列并蚀刻以使立柱具有以下特征：测得的蚀刻立柱的高度为304nm、立柱顶部的宽度为263nm并且立柱底部的宽度为308nm，并且“覆盖”立柱的热氧化物层的高度为151nm。
产生第三批纹理化硅阵列并蚀刻以使立柱具有以下特征：测得的蚀刻立柱的高度为432nm、立柱顶部的宽度为266nm并且立柱底部的宽度为325nm，并且“覆盖”立柱的热氧化物层的高度为141nm。
产生第四批纹理化硅阵列并蚀刻以使立柱具有以下特征：测得的蚀刻立柱的高度为519nm、立柱顶部的宽度为277nm并且立柱底部的宽度为33nm，并且“覆盖”立柱的热氧化物层的高度为123nm。
实施例2：具有用于多核苷酸延伸的纹理化座位的阵列的设计、制造和分析
阵列设计。制造具有针对蚀刻立柱设计的以下特征的硅板：阵列A：立柱顶部的氧化物“帽”的高度为122nm；立柱的蚀刻深度为301nm；并且底部的立柱宽度为320nm；以及阵列B：立柱顶部的氧化物“帽”的高度为112nm；立柱的蚀刻深度为426nm；并且底部的立柱宽度为316nm。
在制造的具有纹理化座位的板上的合成。每一个硅板均含有簇阵列，每个簇具有用于核苷酸延伸的离散位置(“座位”)。图23A-23B描绘了进行多核苷酸合成反应之后的座位簇的低放大倍数图像。图23A描绘了非纹理化座位的簇的图像。图23B描绘了纹理化座位的簇的图像。
制造了具有三种不同条件的座位簇的硅板：非纹理化、“外”纹理化或“内”纹理化。每个簇含有121个用于多核苷酸合成的座位。化学合成的方法与实施例4中描述的方法相似。合成的多核苷酸的长度为约80至约100个碱基。
图3A和3B分别描绘了内纹理化座位簇和内纹理化座位的图示。在这样的排列中，核苷偶联试剂沉积在表面上，直到试剂延伸超出蚀刻的纹理化区域。装置的表面包含纹理化部分330，活性部分320和钝化部分340。每个座位均呈圆形，并且每个座位的总直径(核苷试剂偶联沉积区域)为60um。每个座位内的纹理化区域的直径也呈圆形且为55um。因此，纹理化区域的边缘与座位的边缘之间的距离为2.5um。表面制备的方法与实施例4中描述的方法相似。
图24A-24B分别描绘了在多核苷酸合成后的非纹理化座位簇和内纹理化座位簇的高放大倍数图像。图24B描绘了纹理化座位簇的图像，其中纹理化座位2410包含钝化区域2420、没有纹理的活性区域2412和具有纹理的活性区域2414，该活性区域涂覆有用于核苷偶联的试剂，并且该钝化区域涂覆有缺少用于核苷偶联的反应性基团的试剂。
图25A和25B分别描绘了外纹理化座位簇和外纹理化座位的图示，其中外纹理化座位的纹理化部分的边界完全位于涂覆有核苷偶联剂的座位的边界之外。装置的表面包含纹理化部分2530、活性部分2520和钝化部分2540。每个座位均呈圆形，并且每个座位的总直径(核苷试剂偶联沉积区域)为50um。跨越并延伸超出每个座位的纹理化区域的直径也呈圆形且为55um。因此，纹理化区域的边缘与内核苷偶联座位的边缘之间的距离为2.5um。
图27A-27B描绘了多核苷酸合成后的外纹理化座位的图像。图27A描绘了外纹理化座位2710的簇的图像。图27B描绘了外纹理化座位2710的高放大倍数图像，其中外纹理化座位2710包含钝化区域2720、没有纹理的活性区域2712和具有纹理的活性区域2714，该活性区域涂覆有用于核苷偶联的试剂，并且该钝化区域涂覆有缺少用于核苷偶联的反应性基团的试剂。
如图28所示设计具有棋盘阵列的板：多组16个外纹理化座位簇2803、多组16个内纹理化座位簇2802和一组16个非纹理化座位对照簇2804。施加不同的小液滴体积，在多核苷酸合成和提取小液滴沉积后进行图像捕获。每组右角的暗点表示小液滴。图29A-29D描绘了表面上的小液滴的图像，其中小液滴的体积分别等于200nL、275nL、350nL和425nl。
与“外部”设计的对准相比，核苷酸偶联试剂延伸超出纹理化区域的“内部”设计显示出簇上小液滴的改善的对准。小液滴体积的变化不会显著影响小液滴对准。
遗漏率。图30A-30D描绘了包含内纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的两个示例性装置的遗漏率(即，在测序分析后旨在合成但未检测到的多核苷酸的频率)。对于图30A-30B，蚀刻深度为304nm并且纹理宽度为约320nm，对于图30C-30D，蚀刻深度为426nm并且纹理宽度为约316nm。图30A描绘了内纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的遗漏率(平均值/座位)。图30B描绘了对于第一装置，每个座位簇的内纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的遗漏率。图30C描绘了在类似装置上第二次运行后，内纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的每个座位的遗漏率。图30D描绘了在类似装置上第二次运行后，每个座位簇的内纹理化座位、外纹理化座位和非纹理化座位的遗漏率。
根据图30A和30B，当分别按照设备和簇归一化时，内纹理化座位显示出比外纹理化座位低得多的遗漏率。
寡核苷酸产量。测量了非纹理化座位、外纹理化座位和内纹理化座位中每个座位的平均碱基计数，如表3中总结。与非纹理化和外纹理化条件相比，内纹理化座位显示出增加的碱基产量。
表3.
串扰。当意外提取到来自相邻簇的多核苷酸时发生串扰。平均而言，内部簇的串扰发生率为0.8％，而外部簇的串扰发生率为1.8％，显示出内部簇排列有1.0％的改善。
实施例3：湿法沉积的含有机硅的分子的图案化
用沉积在晶片上不同位置的单个有机层处理二氧化硅晶片，以产生具有高表面能和与核苷偶联的能力的座位。选择抛光的硅的顶部上1000埃的二氧化硅表面。通过使用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺在乙醇和乙酸中的1％溶液沉积在表面上并处理4小时的湿法工艺，随后将晶片置于150摄氏度的热板上达14小时，从而在表面上获得受控的羟基基团表面密度。
将MEGAPOSIT SPR 3612光致抗蚀剂层沉积在N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺的上方。在这种情况下，有机层是光致抗蚀剂的粘合促进剂。通过暴露于穿过荫罩的紫外光使光致抗蚀剂层图案化。通过氧等离子体将光致抗蚀剂图案转移到有机层中。然后剥离光致抗蚀剂，露出用于生物分子偶联的区域的图案。良好地解析处具有80个直径为约80μm的圆盘的簇。
多核苷酸从表面延伸。在没有粘合促进剂层的情况下进行的光刻工艺不会导致具有延伸的多核苷酸的有组织的座位(数据未示出)。在使用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺层进行的光刻工艺所处理的表面上进行的多核苷酸延伸得到位于圆盘簇内的具有直径为80μm的多核苷酸的清晰小圆盘。
实施例4：在多核苷酸合成装置上合成50-聚体序列
将多核苷酸合成装置组装至流动池中，该流动池与Applied Biosystems(ABI394DNA合成仪)连接。将该多核苷酸合成装置用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(Gelest，CAS号156214-80-1)均匀地功能化，并用于使用本文所述的寡核苷酸合成方法来合成50bp的示例性寡核苷酸(“50-聚体寡核苷酸”)。该50-聚体的序列如SEQ IDNO.:1中所述。
5’AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3’(SEQ ID NO.:1)，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)，是一种能够在脱保护过程中使寡核苷酸从表面上释放的可切割的连接体。使用根据表4中的方案的标准DNA合成化学法(偶联、加帽、氧化和解封闭)和ABI合成仪完成合成。
表4.
亚磷酰胺/活化剂组合以类似于本体试剂通过流动池的递送的方式进行递送。当在全部时间内保持环境被试剂“润湿”时，不进行干燥步骤。从ABI 394合成仪中去除限流器，以使得能够更快速流动。在没有限流器的情况下，酰胺类(amidites)(在ACN中0.1M)、活化剂(在ACN中的0.25M苯甲酰基硫基四唑(“BTT”；来自GlenResearch的30-3070-xx))和Ox(在20％吡啶、10％水和70％THF中的0.02M I2)的流速大致为约100uL/sec，乙腈(“ACN”)和加帽试剂(帽A和帽B的1:1混合物，其中帽A是在THF/吡啶中的乙酸酐，帽B是在THF中的16％1-甲基咪唑(1-methylimidizole))的流速大致为约200uL/sec，解封闭剂(在甲苯中的3％二氯乙酸)的流速大致为约300uL/sec(与之相比，在有限流器的情况下，所有试剂均为约50uL/sec)。观测完全排出氧化剂的时间，相应地调节化学品流动时间的时间选择，并在不同的化学品之间引入额外的ACN洗涤。寡核苷酸合成之后，芯片在75psi下在气态氨中脱保护过夜。将五滴水施加到表面上以回收多核苷酸(图31A)。随后在BioAnalyzer小RNA芯片上分析所回收的多核苷酸(图31B)。
实施例5：在多核苷酸合成装置上合成100-聚体序列
使用在实施例2中描述的用于合成50-聚体序列的相同过程，在两个不同的硅芯片上合成100-聚体寡核苷酸(“100-聚体寡核苷酸”；5’CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3’，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)；SEQ ID NO.:2)，第一个用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺均匀地功能化，而第二个用11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷和正癸基三乙氧基硅烷的5/95混合物功能化，并在BioAnalyzer仪器上分析从表面提取的寡核苷酸(图32)。
在50uL PCR混合物(25uL NEB Q5主混合物，2.5uL 10uM正向引物，2.5uL 10uM反向引物，从表面提取的1uL寡核苷酸，和加至50uL的水)中使用正向(5’ATGCGGGGTTCTCATCATC3’；SEQ ID NO.:3)和反向(5’CGGGATCCTTATCGTCATCG3’；SEQ IDNO.:4)引物，使用下列热循环程序，进一步PCR扩增来自两个芯片的全部十个样品：
98C，30sec
98C，10sec；63C，10sec；72C，10sec；重复12个循环
72C，2min。
PCR产物还在BioAnalyzer上运行(数据未示出)，在100-聚体位置处显示尖锐峰。然后，对PCR扩增的样品进行克隆，并进行Sanger测序。表5总结了从来自芯片1的斑点1-5采集的样品和从来自芯片2的斑点6-10采集的样品的Sanger测序结果。
表5.
斑点 错误率 循环效率
1 1/763bp 99.87％
2 1/824bp 99.88％
3 1/780bp 99.87％
4 1/429bp 99.77％
5 1/1525bp 99.93％
6 1/1615bp 99.94％
7 1/531bp 99.81％
8 1/1769bp 99.94％
9 1/854bp 99.88％
10 1/1451bp 99.93％
因此，合成的寡核苷酸的高质量和均匀性在具有不同表面化学的两个芯片上重复。总体上，89％，相当于被测序的262个100-聚体中的233个是没有错误的完美序列。
图28和29分别显示了从斑点8和7采集的样品的比对图，其中“x”表示单碱基缺失，“星号”表示单碱基突变，而“+”表示在Sanger测序中的低质量斑点。图33中比对的序列共同表示约97％的错误率，其中29个读数中的28个对应于完美序列。图34中比对的序列共同表示约81％的错误率，其中27个读数中的22个对应于完美序列。最后，表6总结了从来自斑点1-10的寡核苷酸样品中获得的序列的错误特征。
表6.
实施例6：纳米反应器
将纳米反应器密封至硅晶片。晶片含有从DNA合成反应生成的核酸。将基因组装试剂添加至反应室。基因扩增发生在解析的包围体(enclosure)中。反应室包括编码不同预定序列的核酸。一系列酶促反应导致扩增的核酸连接到2千碱基基因中。
实施例9：组装的核酸的错误校正
约1kb的基因(SEQ ID NO.:5；表7)使用6种购买的寡核苷酸(在PCA期间各5nM)(Ultramer；SEQ ID NO.:6-11；表7)组装，并在PCA反应中使用具有0.02U/uL Q5热启动高保真度聚合酶和100uM dNTP的1x NEB Q5缓冲液如下进行组装：
1个循环：98C，30sec
15个循环：98C，7sec；62C 30sec；72C，30sec
1个循环：72C，5min。
表7.
预计Ultramer寡核苷酸具有至少1/500个核苷酸的错误率，更有可能至少1/200个核苷酸或更大。
在使用正向引物(5’ATGACCATGATTACGGATTCACTGGCC3’SEQ ID NO.:12)和反向引物(5’GATAGAGATTCGGGATTTCGGCGCTCC3’SEQ ID NO.:13)的PCR反应中，使用具有0.02U/uLQ5热启动高保真度聚合酶、200uM dNTP和0.5uM引物的1x NEB Q5缓冲液如下扩增组装的基因：
1个循环：98C，30sec
30个循环：98C，7sec；65C 30sec；72C，45sec
1个循环：72C，5min。
在生物分析仪中分析扩增的组装基因并克隆。对来自约24个克隆的小量制备物进行Sanger测序。生物分析仪分析提供了未校正的基因的宽峰和尾，表示高错误率。测序显示出1/789的错误率(数据未示出)。随后使用CorrectASE(Life Technologies,www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A14972)根据厂商的说明书进行两轮错误校正。在第一轮和第二轮之后在生物分析仪中类似地分析所得基因样品并克隆(数据未示出)。挑取24个克隆以供测序。测序结果表明，在第一轮和第二轮的错误校正之后，错误率分别为1/5190bp和1/6315bp。
实施例7：用于合成长度小于1.8Kb的基因的多核苷酸分布
选择240个基因用于从头合成，其中基因的长度范围为701至1796个碱基对。将每个基因的基因序列分成较小的片段，该片段编码长度范围在50至90个多核苷酸之间的多核苷酸，其中每个核苷酸具有20至25个核苷酸重叠序列。分布图在图35中描绘，其中X轴描绘了多核苷酸长度，Y轴描绘了合成的多核苷酸数目。使用类似于实施例3的方案，在含硅分子涂覆的表面上合成总计大约5,500种多核苷酸，并使用聚合酶链组装反应将每个寡核苷酸的重叠序列与不同寡核苷酸退火而进行组装，以形成基因。
实施例8：用于合成长基因序列的多核苷酸分布
将长度大于1.8kb的单个基因的基因序列分成较小的片段，该片段编码长度范围在50至120个核苷酸之间的多核苷酸，其中每个核苷酸具有20至25个核苷酸重叠序列。共合成了90种不同的设计排列。分布图在图36中描绘，其中X轴描绘了多核苷酸长度，Y轴描绘了合成的多核苷酸数目。使用类似于实施例4的方案，在含有机硅分子涂覆的表面上合成多核苷酸，并使用聚合酶链组装反应将每个寡核苷酸的重叠序列与不同寡核苷酸退火而进行组装，以形成基因。
实施例9：用于稀释核苷偶联剂的两步沉积工艺
进行了多种表面制备方法，包括：(i)在光刻之前进行活性化学气相沉积(CVD)步骤；(ii)在光刻后进行活性化学气相沉积(CVD)步骤；以及(i)在光刻后进行稀释活性化学气相沉积(CVD)步骤。
在氧等离子体中单独清洁具有氧化硅层的第一硅装置(称为“HAPS”芯片)。含有机硅的分子(N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺，HAPS)沉积在氧化硅上称为座位的预定位置处。用AZ抗蚀剂涂覆表面，然后进行烘烤。将表面在氧等离子体中再次清洁，氟化(沉积(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷)，然后剥离。
在氧等离子体中单独清洁具有氧化硅层的第二硅装置(称为“100％GOPS-1”芯片)。含有机硅的分子(3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPS))沉积在氧化硅上，称为座位的预定位置处。用AZ抗蚀剂涂覆表面，然后进行烘烤。将表面在氧等离子体中再次清洁，氟化(沉积(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷)，然后剥离。
在氧等离子体中单独清洁具有氧化硅层的第三硅装置(称为“100％GOPS-2”芯片)。在清洁后立即用AZ抗蚀剂涂覆表面，然后在90摄氏度下烘烤7分钟。将表面在氧等离子体中再次清洁，在YES CVD系统中氟化((十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷)，然后剥离。在100摄氏度的腔室温度下，在1托下用100％GOPS处理表面1小时。最后，将表面在室温下在水中活化30分钟。
对于稀释的活性剂沉积方案，在氧等离子体中单独清洁具有氧化硅层的第四硅装置(称为“稀释的GOPS”芯片)。在清洁后立即用AZ抗蚀剂涂覆表面，然后在90摄氏度下烘烤7分钟。将表面在氧等离子体中再次清洁，在YES CVD系统中氟化((十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷)，然后剥离。在100摄氏度的腔室温度下，在3.5托下用100％丙基三甲氧基硅烷处理表面15小时。用水处理表面30分钟，然后进行第二沉积步骤。在第二沉积步骤中，将0.05％GOPS和99.95％丙基三甲氧基硅烷的混合物沉积在表面上，并在100℃的腔室温度、3.5托下处理1.5小时。最后，将表面在室温下在水中活化30分钟。对于制备的每种装置，能够偶联核苷的分子(HAPS和GOPS)沉积在表面上的所述位置—座位处，并且座位排列成簇。
实施例10：低密度多核苷酸表面的表征
在实施例9中所制备的表面上合成长度为30、50和80个核苷酸的多核苷酸。使用FRT工具(MicroProf 100，Fries Research and Technology，GmbH，Germany)测量合成后DNA的厚度。FRT工具在簇扫描并测量光的反射率，该反射率对应于表面上材料的量。30、50和80-聚体生长的结果的总结在图37A中示出。在合成80-聚体的情况下，稀释的GOPS表面产生的DNA厚度是100％GOPS-2和HAPS芯片的52％。
还进行了来自簇的荧光测量的Qubit分析。对30、50和80-聚体生长的分析的总结在图37B中的图表中。对于30、50和80-聚体，稀释的GOPS芯片得到的DNA密度是100％GOPS-2或HAPS芯片的42％。
实施例11：低密度多核苷酸表面的缺失错误率分析
在实施例9中所制备的表面上合成长度为30、50和80个核苷酸的多核苷酸，将其从表面气体切割，并使用Illumina MiSeq进行序列分析。针对在稀释的GOPS表面上合成的多核苷酸来确定缺失错误率。总缺失错误率为0.060％，或1/1674个碱基。对来自稀释的GOPS芯片的对照多核苷酸的测序得到的缺失率为0.070％。按照距表面的距离，在特定碱基处进行了缺失错误率频率的分析，并且结果在图38中的图中示出。值得注意的是，对于较接近表面的碱基，稀释的GOPS表面得到的缺失错误率频率比距表面较远的碱基的错误率频率小两倍。换句话说，与分析的其他表面相比，稀释的GOPS表面导致在更接近表面的碱基处观察到的缺失错误率增加的减少。总的来说，稀释的GOPS表面导致较低的超过背景错误率水平的平均缺失错误率，表8。
表8.
实施例12：包含纹理化表面的装置的性能
制造微流体装置以增加表面积。将立柱的阵列蚀刻到二氧化硅晶片中以使表面积增加2至3倍。进行许多步骤以制作纹理化表面。通过等离子体增强工艺(PECVD)为一侧抛光的起始二氧化硅晶片增加纹理化层。使用采用全氟辛基三氯硅烷的钝化涂层。将硅反应性离子蚀刻和抗蚀剂带添加至芯片，然后进行表面氧化。热氧化物层用作硅的蚀刻掩模。通过平板印刷术印刷基准层，之后最终的氧化物蚀刻产生纹理化的硅芯片。该表面的立柱宽度为待延伸的所需多核苷酸的长度的约2倍。
表9中提供了示例性宽度的图表，其基于0.34nm/碱基的近似长度。
表9.
碱基数目 寡核苷酸长度(nm) 立柱或凹陷的宽度(nm)
1 0.34 0.68
10 3.4 6.8
100 34 68
200 68 136
300 102 204
制备具有簇的16x 16阵列的硅装置，每个簇具有121个座位，该装置总计具有30,976个座位。每个簇包括多个4座位的组，其中每个座位位于不同的设计特征的顶部，如表10中概述。
表10.
设计 宽度w(nm) 间距p(nm) 深度d(nm)
D1 200 400 250-1000
D2 300 600 250-1000
D3 400 800 250-1000
D4 无纹理 无纹理 无纹理
每个座位涂覆有环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷(GOPS)，其结合表面并与核苷亚磷酰胺偶联。在装置上进行多核苷酸合成，并测量合成多核苷酸的DNA厚度、DNA质量和错误率。
实施例13：根据纹理设计的错误率
根据实施例12中概述的表10的设计D1、D2和D3，以500nm的蚀刻深度制造了具有增加的表面积的微流体装置。图39示出，纹理化设计D1、D2和D3的平均缺失率约为1/1000，而D4的非纹理化设计的平均缺失率为1.3/1000。纹理化设计D1、D2和D3的平均缺失率低于非纹理化D4的平均缺失率。对于纹理化设计D1、D2和D3，以及非纹理化设计D4，平均插入率大致相同，均为2/1000。
实施例14：根据纹理设计的产量增强
采用根据实施例12中概述的表10的设计D1、D2和D3的尺寸，以250nm、500nm、750nm和1000nm的蚀刻深度制造了具有纹理化表面的微流体装置。在每种条件下合成长度为92个碱基的多核苷酸。图40示出了对于相对于平坦表面归一化的纹理化表面，测量的产量和每个装置提取的DNA的量。在250nm的蚀刻深度下的纹理化表面的产量增加为约1.5，在500nm和750nm的蚀刻深度下的产量为约2-3，而在1000nm的蚀刻深度下的产量为约3-4。基于表面积计算结果来计算预期的产量增加。如图40所示，纹理化设计的测量的产量增强与预期产量增强的表面积计算结果成比例。
实施例15：根据寡核苷酸碱基的缺失率
采用根据实施例12中概述的表10的设计D1、D2和D3的尺寸，以250nm、500nm、750nm和1000nm的蚀刻深度制造了具有纹理化表面的微流体装置。在不同表面类型上合成长度为92个碱基的多核苷酸。图41图示了寡核苷酸的不同碱基的不同缺失率，这取决于微流体装置中的凹陷的蚀刻深度。对于碱基A、C、G和T，1000nm的蚀刻深度提供了具有14/10,000至18/10,000的缺失率的寡核苷酸。750nm的蚀刻深度提供了具有14/10,000至17/10,000的略低缺失率的寡核苷酸。500nm和250nm的蚀刻深度提供了具有10/10,000(或1/1000)至12/10,000的缺失率的寡核苷酸。总的来说，250nm和500nm的蚀刻深度得到的缺失率比750nm和1000nm的蚀刻深度更低。
实施例16：根据纹理条件或蚀刻深度的缺失率
采用根据实施例12中概述的表10的设计D1、D2和D3的尺寸，以250nm、500nm、750nm和1000nm的蚀刻深度制造了具有纹理化表面的微流体装置。在不同的表面类型上合成长度为92个碱基的多核苷酸。图42和图43图示了与非纹理化设计D4相比，不同纹理条件的相对缺失率。
实施例17：根据碱基或纹理条件的插入率
采用根据实施例12中概述的表9的设计D1、D2和D3的尺寸，以250nm、500nm、750nm和1000nm的蚀刻深度制造了具有纹理化表面的微流体装置。在不同的表面类型上合成长度为92个碱基的多核苷酸。图44图示了寡核苷酸的不同碱基的不同插入率，这取决于微流体装置中的凹陷的蚀刻深度。对于碱基A、C和T，750nm和1000nm的蚀刻深度提供具有约4/1000的插入率的寡核苷酸，而250nm和500nm的蚀刻深度提供具有约2/1000的插入率的寡核苷酸。对于碱基G，750nm和1000nm的蚀刻深度提供具有约2/1000的插入率的寡核苷酸，而250nm和500nm的蚀刻深度提供具有约1.5/1000的插入率的寡核苷酸。
实施例18：根据纹理条件的相对插入率
采用根据实施例12中概述的表10的设计D1、D2和D3的尺寸，以250nm、500nm、750nm和1000nm的蚀刻深度制造了具有纹理化表面的微流体装置。在不同的表面类型上合成长度为92个碱基的多核苷酸。图45图示了与非纹理化设计D4相比，不同纹理条件的相对插入率。D1、D2和D3的纹理化表面的插入率与非纹理化表面的插入率相似，相对插入率为约1.0。
实施例19：256个簇的阵列
制备微流体装置。每个装置均为200mm晶片，双面抛光。SOI晶片具有排列在200mm晶片中的21个芯片。每个芯片的大小均为32mm x 32mm，并且包含簇的16x 16阵列。阵列中总共存在256个簇。121个反应位点位于单个簇中，每个芯片提供30,976个可单独寻址的寡核苷酸位点。每个簇间距为1.125mm。每个反应位点的直径为约50μm。
实施例20：基准标记
制备具有簇的16x 16阵列的二氧化硅。每个簇包括4座位的组，其中每个座位紧邻具有多条线的三个基准标记之一，其中线宽在表11中列出。每个基准设计均呈加号的形状805。一个区域包括紧邻的多个基准标记810。
表11.
设计 宽度w(um) 间距p(um)
1 0.2 0.4
2 0.3 0.6
3 0.4 0.8
每个座位涂覆有含有机硅的分子，该分子结合表面并与核苷亚磷酰胺偶联(例如，HAPS或GOPS)。在装置上进行多核苷酸合成，并使用基准标记进行测量以将表面与系统的其他组件校正对准。
实施例21：全局对准标记
制备具有簇的16x 16阵列的硅装置。使用全局对准标记将表面1000与系统的其他组件对准。全局对准标记1005、1010、1015、1020、1035和1040位于表面1000的基本上平面的基底部分上的位置处并且靠近装置的边缘。详细的圆形标记1025和加号标记1045在图10中的展开视图中示出。
实施例22：用稀释的活化剂涂覆纹理化表面
制造用于多核苷酸合成的装置。每个装置均为200mm，双面抛光。SOI晶片具有排列在200mm晶片中的21个芯片。每个芯片的大小均为32mm x 32mm，并且包含簇的16x 16阵列。阵列中总共存在256个簇。121个反应位点位于单个簇中，每个芯片提供30,976个可单独寻址的寡核苷酸位点。每个簇间距为1.125mm。每个反应位点的直径为约50μm。通过如实施例12中所述的方法将每个芯片的表面纹理化，以包括具有表1中列出的纹理设计之一的凹陷。
用于多核苷酸合成的装置通过用氧等离子体处理单独清洁。清洁后立即用AZ抗蚀剂涂覆表面，然后在90摄氏度下烘烤7分钟。通过用氧等离子体处理再次清洁表面，将其在YES CVD系统中氟化(沉积(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷)，并剥离。在100摄氏度的腔室温度下，在3.5托下用100％丙基三甲氧基硅烷处理表面15小时。用水处理表面30分钟，然后进行第二沉积步骤。在第二沉积步骤中，0.05％GOPS和99.95％丙基三甲氧基硅烷的混合物沉积在表面上，并在100摄氏度的腔室温度、3.5托下处理1.5小时。最后，将表面在室温下在水中活化30分钟。每个装置的表面上的反应位点包含稀释的GOPS。每个反应位点均被涂覆有(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷的表面围绕。
实施例23：备选的寡核苷酸合成方案
遵循与实施例9类似的方案，其中该方案包括另外的乙腈洗涤。紧临解封闭过程之前进行额外的乙腈洗涤流程。还在解封闭过程之后立即进行额外的乙腈洗涤流程。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是这些实施方案仅通过举例的方式提供对于本领域技术人员来说是显而易见的。在不脱离本发明的情况下本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。

Claims (39)

1.一种用于多核苷酸合成的装置，所述装置包含：
包含表面的固体支持物；
在所述表面上的多个座位，其中每个所述座位包含：
内部区域，其中所述内部区域包含多个凹陷或突起；以及
包含多个第一分子的外部区域，其中所述外部区域跨越并延伸超出所述内部区域，并且其中每个所述第一分子均结合至所述表面并包含能够与核苷结合的反应性基团。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述多个座位排列成簇。
3.如权利要求2所述的装置，其中每个簇包含50至500个座位。
4.如权利要求2所述的装置，其中每个簇包含约121个座位。
5.如权利要求1所述的装置，其中所述外部区域的直径为至多100um。
6.如权利要求1所述的装置，其中所述外部区域的直径为约60um。
7.如权利要求6所述的装置，其中所述内部区域的直径为约55um。
8.如权利要求1所述的装置，其中所述内部区域的直径是所述外部区域的直径的80％至95％。
9.如权利要求1所述的装置，其中所述内部区域的直径比所述外部区域的直径短2um至20um。
10.如权利要求1所述的装置，其中所述内部区域的直径比所述外部区域的直径短约5um。
11.如权利要求1所述的装置，其中每个所述凹陷或突起的蚀刻深度为100um至1000nm。
12.如权利要求1所述的装置，其中每个所述凹陷或突起的蚀刻深度为200um至500nm。
13.如权利要求1所述的装置，其中每个所述凹陷或突起的宽度为100um至500um。
14.如权利要求1所述的装置，其中每个所述凹陷或突起的宽度为300um至330um。
15.如权利要求1所述的装置，其中每个所述凹陷或突起的间距长度是所述凹陷或突起的宽度的约2至3倍。
16.如权利要求1所述的装置，其中每个所述凹陷或突起的深度是间距长度的约60％至125％。
17.如权利要求1所述的装置，其中每个所述凹陷或突起的间距为至多1um。
18.如权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物的拉伸强度为1 MPa至300 MPa。
19.如权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物的拉伸强度为1 MPa至10 MPa。
20.如权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物的刚度为1GPa至500 GPa。
21.如权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物的刚度为1GPa至10 GPa。
22.如权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物包括尼龙、硝酸纤维素或聚丙烯。
23.如权利要求1所述的装置，其中所述固体支持物包括硅、二氧化硅、氮化硅、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、金或铂。
24.如权利要求1所述的装置，其中每个所述第一分子均为硅烷。
25.如权利要求24所述的装置，其中所述硅烷为氨基硅烷。
26.如权利要求25所述的装置，其中每个所述第一分子均为N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-碘-丙基三甲氧基硅烷或辛基氯硅烷。
27.如权利要求1所述的装置，其进一步包含多个第二分子，其中所述多个第二分子位于围绕每个所述座位的所述外部区域的区域中的表面上，并且其中每个所述第二分子均结合至所述表面但缺少能够与所述核苷结合的反应性基团。
28.如权利要求27所述的装置，其中每个所述第二分子均为氟硅烷。
29.如权利要求28所述的装置，其中所述氟硅烷为(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷、全氟辛基三氯硅烷、全氟辛基三乙氧基硅烷或全氟辛基三甲氧基氯硅烷。
30.一种多核苷酸合成方法，其包括：
(a)提供多核苷酸的预定序列；
(b)提供如权利要求1至29中任一项所述的装置；以及
(c)合成所述多核苷酸。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸包括至少30,000种不相同的多核苷酸。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述至少30,000种不相同的多核苷酸编码至少750个基因。
33.如权利要求31所述的方法，其中与多核苷酸的所述预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸的总错误率小于1/1000个碱基。
34.如权利要求31所述的方法，其中与所述多核苷酸的所述预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸的总错误率小于1/1500个碱基。
35.如权利要求31所述的方法，其中与所述多核苷酸的所述预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸中的至少80％没有错误。
36.如权利要求31所述的方法，其中与所述多核苷酸的所述预定序列相比，所述至少30,000种不相同的多核苷酸中的至少89％没有错误。
37.一种基因合成方法，其包括：
(a)提供多核苷酸的预定序列；
(b)提供如权利要求1至29中任一项所述的装置；
(c)合成所述多核苷酸；以及
(d)组装所述多核苷酸以形成多个基因。
38.如权利要求37所述的方法，其进一步包括在步骤(d)之前释放所述多核苷酸。
39.一种用于多核苷酸合成的系统，所述系统包含：
(a)材料沉积装置，其包含用于多核苷酸合成的多种试剂和用于沉积所述用于多核苷酸合成的多种试剂的多个喷嘴；
(b)用于控制所述用于多核苷酸合成的多种试剂从所述多个喷嘴中的释放的计算机；以及
(c)用于合成多核苷酸的如权利要求1至29中任一项所述的装置。
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