CN104152382B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ivfcaas0003，保藏登记号为CGMCC NO.8230。本发明还保护解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在抑制植物病原菌和/或固氮和/或溶磷和/或解钾中的应用。本发明还保护解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的发酵物。本发明对于植物病原菌引起的相关疾病的防治具有重大价值，对于植物的栽培，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为无孢科、丝核菌属半知菌真菌,是一种严重为害农作物的土传病原菌，可引起稻、麦、棉和多种蔬菜瓜果等的病害，一般用化学农药防治。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌属半知菌类(Imperfecti fungi)、从梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)。
辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是具有重大危险性的病原卵菌，其寄主范围较广，可引致辣椒、番茄、茄子、黄瓜、南瓜等多种重要蔬菜作物的疫病。
利用生物防治土传病害是一种行之有效的防治措施，是植物保护中不可缺少的组成部分。特别是利用自然界原本存在的植物根际有益微生物对靶标病原微生物的拮抗作用,来控制病原微生物的危害,具有较小的环境风险,是一种与环境友好的防治技术。随着人们对食品安全、生态安全的重视,生物防治是实现现代农业可持续发展的重要策略之一。
发明内容
本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ivfcaas0003，已于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNO.8230。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ivfcaas0003简称解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003。
本发明还保护解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在抑制植物病原菌中的应用。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 36124、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438、辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)：ACCC 32576、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)：ACCC 36127或黑曲霉(Aspergillus niger)：ACCC 30005。
本发明还保护解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在固氮和/或溶磷和/或解钾中的应用。所述固氮指的是将空气中的游离氮转化为化合态氮。所述溶磷指的是将植物不能直接利用的磷(例如蛋黄中的卵磷脂)转变成植物能利用的可溶性磷。所述解钾指的是将植物不能利用的钾(例如钾长石中的矿物质形式的钾)转变成植物能利用的可溶性钾。
本发明还保护解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在制备产品中的应用；所述产品的用途为(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中的至少一种：(Ⅰ)抑制植物病原菌；(Ⅱ)固氮；(Ⅲ)溶磷；(Ⅳ)解钾。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 36124、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438、辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC37300、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)：ACCC32576、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)：ACCC 36127或黑曲霉(Aspergillus niger)：ACCC 30005。所述固氮指的是将空气中的游离氮转化为化合态氮。所述溶磷指的是将植物不能直接利用的磷(例如蛋黄中的卵磷脂)转变成植物能利用的可溶性磷。所述解钾指的是将植物不能利用的钾(例如钾长石中的矿物质形式的钾)转变成植物能利用的可溶性钾。
本发明还保护一种产品，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003；所述产品的用途为(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中的至少一种：(Ⅰ)抑制植物病原菌；(Ⅱ)固氮；(Ⅲ)溶磷；(Ⅳ)解钾。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 36124、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438、辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC37300、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)：ACCC32576、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)：ACCC 36127或黑曲霉(Aspergillus niger)：ACCC 30005。所述固氮指的是将空气中的游离氮转化为化合态氮。所述溶磷指的是将植物不能直接利用的磷(例如蛋黄中的卵磷脂)转变成植物能利用的可溶性磷。所述解钾指的是将植物不能利用的钾(例如钾长石中的矿物质形式的钾)转变成植物能利用的可溶性钾。
本发明还保护解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在制备式(Ⅰ)所示化合物中的应用；
本发明还保护一种发酵解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的方法，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中，使其初始浓度为3×107cfu/mL，然后30℃、160rpm振荡培养48h。
本发明还保护解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的发酵物。所述发酵物具体可为如下方法制备得到的发酵物：将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中，使其初始浓度为3×107cfu/mL，然后30℃、160rpm振荡培养48h，得到发酵物(即整个发酵体系)。
本发明还保护一种抑制植物病原菌的产品，为如下(a)或(b)：(a)将所述发酵物离心(离心参数具体可为：4℃、10000rpm离心10min)，收集上清液；(b)取(a)得到的上清液，加入HCl水溶液直至pH为2.0，静置(静置条件具体可为：4℃静置12小时)后离心(离心参数具体可为：4℃、12000rpm离心10min)，收集沉淀，用丙酮抽提并收集上清液，抽干有机溶剂。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 36124、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438、辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)：ACCC 32576、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)：ACCC 36127或黑曲霉(Aspergillus niger)：ACCC 30005。
本发明还保护一种生物菌肥，其制备方法包括如下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003单菌落接种到液体NB培养基，30℃、160rpm振荡培养24h，得第一培养物；
(2)将3体积份所述第一培养物与97体积份YSB液体培养基混合，30℃、180rpm振荡培养48h，得第二培养物；
(3)将所述第二培养物按10％体积比的接种量转接至固态发酵培养基，混匀后30℃静置培养5天，得到第三培养物；所述固态发酵培养基的组成如下：50％质量比为小麦麦麸、30％质量比的花生壳粉末、10％质量比的棉籽粕、0.5％质量比的葡萄糖和9.5％质量比的草炭；
(4)将所述第三培养物进行风干，直至含水量为15％以下(含水量具体可为10％)，即为生物菌肥。
本发明还保护所述生物菌肥在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或抑制植物病原菌植物侵染植物中的应用。所述植物为黄瓜或番茄。所述促进植物生长体现为促进株高、茎粗、茎叶鲜重、根系鲜重、根体积和壮苗指数中的至少一项增加。所述植物病原菌可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。所述植物病原菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 36124、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)：ACCC 37438、辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)：ACCC 32576、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)：ACCC 36127或黑曲霉(Aspergillus niger)：ACCC 30005。
本发明对于植物病原菌引起的相关疾病的防治具有重大价值，对于植物的栽培，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。
附图说明
图1为在LB固体培养基上30℃培养48h后的单菌落形态照片。
图2为革兰氏染色后镜检的照片。
图3为固氮能力定性测定的照片。
图4为溶磷能力定性测定的照片。
图5为解钾能力定性测定的照片。
图6为菌株对蔬菜苗期病害的拮抗能力的照片。
图7为实施例4中培养基的优化的实验结果。
图8为实施例4中发酵条件的优化的实验结果。
图9为实施例5的结果-立枯丝核菌。
图10为实施例5的结果-尖孢镰刀菌。
图11为实施例5的结果-辣椒疫霉。
图12为实施例5的结果-草酸青霉菌。
图13为实施例5的结果-串珠镰刀菌。
图14为实施例5的结果-黑曲霉。
图15为实施例6中洗脱过程的图谱。
图16为实施例6中部分洗脱峰的抑菌效果。
图17为实施例6中MALDI-TOF-MS分析的结果。
图18和图19为为实施例6中ESI-Q-TOF-MS分析的结果。
图20为实施例8的结果。
图21为实施例9的结果。
图22为实施例10的结果-立枯丝核菌。
图23为实施例10的结果-尖孢镰刀菌。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。取钾长石，研磨后过100目筛，收集粒径为100目以下的粉末并水洗，阴凉干燥，得到钾长石粉。
实施例1、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的获得和鉴定
一、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的获得
2012年9月，从北京市海淀区采集黄瓜根际土壤，采用平板稀释法得到若干菌株，将其中一株命名为ivfcaas0003。
二、菌株ivfcaas0003的鉴定
1、菌株ivfcaas0003的形态学鉴定
在LB固体培养基上30℃培养48h后的单菌落形态照片见图1，形成灰色不透明的近圆形菌落，菌落直径3-5mm，半球形隆起，菌落表面不光滑有褶皱，具同心轮纹，不透明，边缘整齐，无光泽，菌落质地粘稠，挑起时呈不易拉断的丝状，有弹性。液体静置培养时，有菌膜生成。穿刺接种培养菌体在试管的培养基内云雾状扩散生长，表明有运动性。革兰氏染色后镜检的照片见图2，菌体紫色，为革兰氏阳性菌，菌体短杆状，多单生，大小为0.5-1×1.5-2.5um，形成椭圆形芽孢。
2、菌株ivfcaas0003的生理生化鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》，对糖醇利用、硝酸盐还原、大分子利用、各种酶类的利用以及生长温度、耐盐性等30项生理生化指标进行测定。结果见表1。
表1菌株ivfcaas0003的主要生理学特性(“+”为阳性，“－”为阴性)
| 项目 | 结果 | 项目 | 结果 | 项目 | 结果 | 项目 | 结果 |
| 接触酶 | + | 纤维二糖 | － | V－P测定 | + | 需要NaCl和KCl | － |
| 氧化酶 | － | 蜜糖 | － | 葡萄糖产气 | - | 生长pH 5营养肉汤 | + |
| 厌氧生长 | － | 半乳糖 | － | 水解酪朊 | + | 生长pH 9营养肉汤 | + |
| D－葡萄糖 | + | 山梨糖 | － | 明胶液化 | + | 在2％NaCl上生长 | + |
| 蔗糖 | + | 山梨醇 | － | 水解淀粉 | + | 在5％NaCl上生长 | + |
| D-甘露醇 | + | 海藻糖 | + | 利用柠檬酸盐 | + | 在7％NaCl上生长 | + |
| 麦芽糖 | + | 七叶苷 | + | 利用丙酸盐 | － | 在10％NaCl上生长 | + |
| D－核糖 | + | 鼠李糖 | － | 酪氨酸水解 | － | 生长温度5℃ | + |
| 乳糖 | － | 松三糖 | － | 苯丙氨酸脱氨酶 | － | 生长温度10℃ | + |
| 甘露糖 | － | D－甘露醇 | － | 卵黄卵磷脂酶 | + | 生长温度30℃ | + |
| L－阿拉伯糖 | + | 菊糖 | + | 硝酸盐还原到亚硝酸 | + | 生长温度50℃ | + |
| 果糖 | － | 水杨素 | － | 精氨酸双水解酶 | + | 生长温度60℃ | － |
3、菌株ivfcaas0003的分子鉴定
菌株ivfcaas0003的16S rRNA的编码序列如序列表的序列1所示。
三、菌株的保藏
基于步骤二中的形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定的结果，菌株ivfcaas0003属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ivfcaas0003已于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.8230。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ivfcaas0003简称解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003。
实施例2、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的促生特性
无氮改良ACCC55培养基：蔗糖10g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO31g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂1.5％-2.0％，pH 7.0-7.2。
蒙金娜有机磷固体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaC15.0g、Agar 15g、水1000mL，pH7.0，分装灭菌，临用时每50mL加入3mL蛋黄溶液(蛋黄溶液即新鲜蛋黄与0.9％生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂)。
孟金娜有机磷液体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaC15.0g、水1000mL，pH7.0分装灭菌，临用时每50mL加入3mL蛋黄溶液(蛋黄溶液即新鲜蛋黄与0.9％生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂)。
解钾固体培养基：蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeCl30.005g、Na2HPO42g、钾长石粉(提供难利用的钾)5g、CaCO30.1g、FeCl30.005g、蒸馏1000mL、琼脂20g，pH7.1-7.4。
解钾液体培养基：蔗糖5g、MgS04·7H2O 0.5g、FeCl30.005g、Na2HPO42g、钾长石粉(提供难利用的钾)5g、CaCO30.1g、FeCl30.005g、蒸馏1000mL，pH7.1-7.4。
无钾液体培养基：蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeCl30.005g、Na2HPO42g、CaCO30.1g、FeCl30.005g、蒸馏1000mL，pH7.1-7.4。
一、固氮能力(即将空气中的游离氮转化为化合态氮的能力)的测定
圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)：CGMCC 1.233。
1、定性测定
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003划线接种在无氮改良ACCC55培养基平板上，28℃培养2d后拍照。照片见图3，解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003生长状态良好，表明其具有固氮能力。
2、固氮酶活性的测定(乙炔还原法)
实验组：在15×150mm螺口试管中加入5ml无氮改良ACCC55培养基制成斜面，接种解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003，28℃培养72h后换橡胶塞，抽出气体2.5ml，注入乙炔气体2.5ml，然后28℃反应2h；然后抽出100μl气体并用气相色谱仪测定乙烯含量；然后收取斜面上的菌，提取总蛋白并采用Bradford法检测总蛋白含量；
阴性对照组：不接种解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003，其它同实验组。
阳性对照组：用圆褐固氮菌代替解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003，其它同实验组。
固氮酶活性[nmol/(mg·h)]＝C2H4(nmol)/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)]，其中C2H4(nmol)＝1000×C2H4体积(μl)×273×P/[22.4×(273+t)×760]，P为气压(mm汞柱)，t为反应温度(℃)。
每组设置6个重复处理，结果取平均值。
解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的固氮酶活性为102.42±18.84 nmol/mg·h，圆褐固氮菌的固氮酶活性为118.84±20.97 nmol/mg·h。
二、溶磷能力(即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力)的测定
1、定性测定
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003点接种于蒙金娜有机磷固体培养基上，28℃培养5d，拍照并计算D/d值(溶磷圈直径D与菌落直径d的比值)。
设置6个重复处理，结果取平均值。
照片见图4。解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在蒙金娜有机培养基上生长良好，能形成明显的溶磷圈，溶磷圈直径为2.63±0.04cm，菌落直径为0.95±0.21cm，D/d值为2.83±0.59。
2、定量测定
(1)用无菌水将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003制备成菌浓度为109cfu/mL的菌悬液。
(2)将步骤(1)得到的菌悬液121℃高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。
(3)实验组：将1mL步骤(1)得到的菌悬液接种至50mL孟金娜有机磷液体培养基，28℃、180rpm振荡培养5d，然后将整个培养体系转移至无菌的50mL离心管，加入0.5g无磷活性碳，然后采用KQ-500DB型数控超声波清洗器进行超声波细胞破碎(处理时间为20min，释放出细胞内的有效磷)，然后4℃、10000rpm离心15min，取上清液。用1mL步骤(2)得到的灭活菌液代替步骤(1)得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。
(4)取步骤(3)得到的上清液，采用钼酸铵比色法检测可溶性磷含量。
P＝K×V/V1；P:有效磷增量；K:从标准曲线查得显色液的磷含量(mg/L)；V:显色时溶液定容的体积(mL)；V1:显色时吸取上清液的体积(mL)。
溶磷量＝实验组的P值-对照组的P值。
每组设置6个重复处理，结果取平均值。
溶磷量为104.37±1.91mg/L。
三、解钾能力(即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力)的测定
1、定性测定
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003划线接种于解钾固体培养基上，28℃培养5d，拍照。照片见图5。解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在解钾固体培养基平板上生长良好。
2、定量测定
(1)用无菌水将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003制备成菌浓度为109cfu/mL的菌悬液。
(2)将步骤(1)得到的菌悬液121℃高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。
(3)实验组：将5mL步骤(2)得到的菌悬液接种至100mL解钾液体培养基，28℃、180rpm培养7d，然后4℃、10000rpm离心10min，取上清液。用1mL步骤(2)得到的灭活菌液代替步骤(1)得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。
(4)取步骤(3)得到的上清液，利用火焰分光光度计法测钾含量。
解钾量＝实验组的钾含量-对照组的钾含量。
每组设置6个重复处理，结果取平均值。
解钾量为1.14±0.04mg/L。
实施例3、菌株对蔬菜苗期病害的拮抗能力
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。
辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300。
1、将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种于LB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养24h，6000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用无菌水悬浮，得到108cfu/ml的菌悬液。
2、实验组：取PDA培养基平板，在中央放置直径为5mm的立枯丝核菌菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液(每个点距离立枯丝核菌菌饼边缘的垂直距离均为2.5cm，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液)，28℃对峙培养72h。用无菌水代替步骤1制备的菌悬液进行上述操作，作为对照组。
3、实验组：取PDA培养基平板，在中央放置直径为5mm的尖孢镰刀菌菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液(每个点距离尖孢镰刀菌菌饼边缘的垂直距离均为2.5cm，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液)，28℃对峙培养120h。用无菌水代替菌悬液进行上述操作，作为对照组。
4、实验组：取PDA培养基平板，在中央放置直径为5mm的辣椒疫霉菌饼，然后在4个点滴加步骤1得到的菌悬液(每个点距离辣椒疫霉菌饼边缘的垂直距离均为2.5cm，每个点滴加2微升步骤1制备的菌悬液)，28℃对峙培养120h。用无菌水代替菌悬液进行上述操作，作为对照组。
步骤2、步骤3和步骤4完成后，拍照并计算抑菌带直径(6个重复处理的平均值)。
抑菌带直径＝抑菌圈直径-解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的菌落直径。
照片见图6。解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003可有效抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和辣椒疫霉，抑菌带直径分别为0.85±0.1061cm、1.5667±0.1155cm、0.8±0.1154cm。
实施例4、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003抗菌物质的发酵
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。
一、培养基的优化
分别采用如下十种培养基作为待测培养基：
NB培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
LB培养基：酵母膏5.0g、胰蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
BPY培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、NaCl 5.0g、葡萄糖10.0g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
NYD培养基：牛肉膏8.0g、酵母膏3.0g、葡萄糖1.0g、蒸馏水1000 ml，pH7.0-7.2。
PDB培养基：马铃薯200.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
YSB培养基：蔗糖20.0g、酵母膏20.0g、牛肉膏15g、MgSO4·7H2O 0.06g、FeSO4·7H2O0.009g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
Landy培养基：葡萄糖20.0g、L-谷氨酸钠5.0g、MgSO40.5g、KCl 0.5g、KH2PO41.0g、FeSO40.15mg、MnSO45.0mg、CuSO40.16mg、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
Landy优化培养基1(简称L-1培养基)：葡萄糖42.0g、L-谷氨酸钠14.0g、MgSO40.5g、KCl 0.5g、KH2PO41g、FeSO40.15mg、MnSO45.0mg、CuSO40.16mg、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
Landy优化培养基2(简称L-2培养基)：葡萄糖10.0g、L-谷氨酸钠5.0g、MgSO40.5g、KCl 0.78g、KH2PO41.0g、FeSO40.05mg、MnSO45.0mg、CuSO40.16mg、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
Landy优化培养基(简称L-3培养基)：葡萄糖8.13g、L-谷氨酸钠4.2g、NH4NO36.14g、MgSO40.5g、KCl 0.5g、KH2PO41.0g、FeSO40.15mg、MnSO44.87mg、CaCl23.98g、CuSO40.16mg、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到待测培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在待测培养基中的初始浓度为3×107cfu/mL)，28℃、180rpm振荡培养48h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，然后将上清液用0.22微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。
1、用无菌生理盐水将尖孢镰刀菌的孢子制备成浓度为107个/mL的孢子悬液。
2、待测溶液的抑菌效果检测(杯碟法)
(1)制备双层平板培养
底层：在培养皿中加入10ml融化的PDA培养基，静置冷却凝固。
上层：在10mL 55℃左右的PDA培养基中加入0.1mL步骤1制备的孢子悬液，然后倒入装有底层的培养皿，静置冷却凝固。
(2)在步骤(1)制备的双层平板上放置牛津杯(各个牛津杯的间距为2.5cm),每个牛津杯内加入100μl待测溶液，4℃静置12h，然后28℃培养72h，然后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。每种待测溶液设置三个重复处理。
结果见图7，采用YSB培养基进行培养，解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的发酵上清液的抑菌效果最好，抑菌圈直径为21.65mm。
二、发酵条件的优化
1、初始菌浓度的优化
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在YSB培养基中的初始浓度为0.5×107、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107或10×107cfu/mL)，30℃、160rpm振荡培养48h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，然后将上清液用0.22微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。
按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8A。
2、发酵起始pH值的优化
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH5.0、6.0、7.0、8.0或9.0的YSB培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在YSB培养基中的初始浓度为3×107cfu/mL)，30℃、160rpm振荡培养48h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，然后将上清液用0.22微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。
按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8B。
3、培养温度的优化
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在YSB培养基中的初始浓度为3×107cfu/mL)，某一温度(20℃、25℃、30℃、35℃或40℃)、160rpm振荡培养48h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，然后将上清液用0.22微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。
按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8C。
4、转速的优化
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在YSB培养基中的初始浓度为3×107cfu/mL)，30℃、某一转速(100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm或220rpm)振荡培养48h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，然后将上清液用0.22微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。
按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8D。
5、培养时间的优化
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在YSB培养基中的初始浓度为3×107cfu/mL)，30℃、160rpm振荡培养某一时间(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56或60h)，检测OD600nm值，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液，然后将上清液用0.22微米滤膜过滤，收集滤液，即为待测溶液。
按照步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，结果见图8E。
步骤1至5的结果表明，最优发酵条件如下：解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在发酵体系的初始浓度为3×107cfu/mL，采用pH7.0的YSB培养基、30℃、160rpm振荡培养48h。在最优发酵条件下，待测溶液的抑菌圈直径为26.78mm/100μl。
实施例5、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003抗菌物质的提取
选取三种蔬菜苗期病害(立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉)和三种引起粮食霉变的三株真菌(草酸青霉、串珠镰刀菌、黑曲霉)为指示菌。
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。
辣椒疫霉(Phytophthora capsisi)：ACCC 37300。
草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)：ACCC 32576。
串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)：ACCC 36127。
黑曲霉(Aspergillus niger)：ACCC 30005。
1、将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在YSB培养基中的初始浓度为3×107cfu/mL)，30℃、160rpm振荡培养48h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。
2、硫酸铵沉淀法
取100mL步骤1得到的上清液，冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度分别达到20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，4℃静置12小时；然后4℃、12000rpm离心20min，收集沉淀；向沉淀中加入10ml、pH7.0、20mmol/L的磷酸缓冲液溶解以溶解沉淀，得到待测溶液。
3、盐酸沉淀有机溶剂抽提法
取100mL步骤1得到的上清液，冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入6mol/L HCl水溶液直至pH为2.0，4℃静置12小时；然后4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀；取沉淀，用5倍体积的有机溶剂(甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯或正丁醇)抽提后4℃、10000r/min离心10min，分别收集上清液(上清液甲)和沉淀；取沉淀，再次用5倍体积的有机溶剂(甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯或正丁醇)抽提后4℃、10000r/min离心10min，收集上清液(上清液乙)；合并上清液甲和上清液乙，真空抽干有机溶剂，残留物用10ml、pH7.0、20mmol/L的磷酸缓冲液溶解，即为待测溶液。
4、分别检测步骤2和步骤3得到的各个待测溶液的抑菌效果(杯碟法)
(1)用无菌生理盐水将指示菌的孢子制备成浓度为1×107个/mL的孢子悬液。
(2)制备双层平板培养
底层：在培养皿中加入10ml融化的PDA培养基，静置冷却凝固。
上层：在10mL 55℃左右的PDA培养基中加入0.1mL步骤(1)制备的孢子悬液，然后倒入装有底层的培养皿，静置冷却凝固。
(3)在步骤(2)制备的双层平板上放置牛津杯(各个牛津杯的间距为2.5cm),每个牛津杯内加入100μl待测溶液，4℃静置12h，然后28℃培养72h，然后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。每种待测溶液设置三个重复处理。
结果见图9至图14。盐酸沉淀有机溶剂抽提法提取抗菌物的效果优于硫酸铵沉淀法。盐酸沉淀有机溶剂抽提法中，采用丙酮的抽提效果最好。
实施例6、抗菌物的制备和鉴定
1、将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003接种到pH7.0的YSB培养基中(解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003在YSB培养基中的初始浓度为3×107cfu/mL)，30℃、160rpm振荡培养48h，然后4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。
2、取100mL步骤1得到的上清液，冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入6mol/L HCl水溶液直至pH为2.0，4℃静置12小时；然后4℃、12000rpm离心10min，收集沉淀；取沉淀，用5倍体积的丙酮抽提后4℃、10000r/min离心10min，分别收集上清液(上清液甲)和沉淀；取沉淀，再次用5倍体积的丙酮抽提后4℃、10000r/min离心10min，收集上清液(上清液乙)；合并上清液甲和上清液乙，真空抽干有机溶剂，残留物用10ml、pH7.0、20mmol/L的磷酸缓冲液溶解，然后冷冻干燥，得到粉末状干物质。
3、高pH条件下的反向色谱分离
(1)称取1mg步骤2得到的粉末状干物质，用100μl流动相A溶解，然后14000g离心20min，取上清。
(2)将步骤(1)得到的上清加入10KD超滤管(Millipore，Catalog Number：UFC5010BK)，13000g离心10min，收集管底部溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液上样于C18柱RP-HPLC[Durashell-C184.6mm×250mm色谱柱，(Agela，Catalog Number：DC952505-0)]，然后用洗脱液进行洗脱。洗脱过程为80min，洗脱液由流动相A和流动相B组成，洗脱初始时刻至洗脱终止时刻流动相B在洗脱液中的体积分数由20％线性上升至80％，洗脱液流速为1.5ml/min。检测波长为214nm。流动相A(pH10)：由98％体积份超纯水和2％体积份乙腈组成。流动相B(pH10)：由98％体积份乙腈和2％体积份超纯水组成。
洗脱过程的图谱见图15，显示具有20个洗脱峰。分别收集各个洗脱峰并冷冻干燥。
将各个洗脱峰的冷冻干燥产物用10ml、pH7.0、20mmol/L的磷酸缓冲液溶解，即为待测溶液。按照实施例4的步骤一的2的方法检测待测溶液的抑菌效果，部分结果见图16，组分20具有抗菌活性。
4、对组分20进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析
取组分20，用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption ionization-time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)(日本Shimadzu科学仪器公司)准确分析其分子量。条件为：337nm N2激光束电离，电压20kV，飞行距离为1.6m。
结果见图17。组分20的质子离子峰(M+H)+为1055.6Da，表明该组分的分子量为1054.6Da，峰1073推测为组分20环肽在去离子水中发生断裂后加H2O(18),峰1095为1073+Na(22)，三个为同一种物质。
5、对组分20进行电喷雾-三重四极杆质谱-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)分析。
利用电喷雾质谱ESI/MS测定化合物的分子量(一级质谱)，其中电喷雾毛细管电压32V、喷雾电压5kV、毛细管温度320℃，正离子方式检测。结果见图18。质子离子峰(M+2H)+528.2955为P20的二电荷形态，即组分P20的精确分子量为1054.58Da，1073峰推测为组分20环肽在去离子水中发生断裂后加H2O(18),1095峰为1073+Na(22)，三个为同一种物质。这与前面MALDI-TOF-MS测得的结果(1054.6 Da)相符合。
因为质子离子峰(M+2H)+528.2955和1095.5314不能完全打碎，将质荷比(m/z)为1073.5945 Da的离子峰作为母离子，用Q-TOF-MS分析组分P4的典型碎片离子峰。碰撞池中碰撞气体为氦气,碰撞电压为175 V。结果见图19。组分P4对应的母离子主要被分为b型和y型离子。其中，主要的b型离子为b1(m/z 945.5052),b2(m/z 813.4485),b3(m/z699.3843),b4(m/z 650.3862),主要的y型离子为y1(m/z 352.2582),y2(m/z439.2920),y3(m/z 553.3519),y4(m/z 650.3862)。
对肽链氨基酸序列的分析可知，母离子(m/z 1073.5989)与b1(m/z 945.5052)的差值为128.0937，代表谷氨酰胺(Gln Q)；b2(m/z 813.4485)和b3(m/z 699.3843)之间的差值114.6042，代表天冬酰胺(Asn N)；b2(m/z 813.4485)和b4(m/z 650.3862)之间的差值163.0623，代表酪氨酸(Tyr Y)。
y1(m/z 352.2582)刚好是一个Asn残基114.04293与238的分子量，表明组分P4包含具有15个碳原子的β氨基脂肪酸，y2(m/z 439.2920)和y1(m/z352.2582)之间的差值87.0338，可以解释为组分P4的分子结构中从N末端丢失了丝氨酸(Ser S)；同理，y3(m/z 553.3519)和y2(m/z 439.2920)之间的差值114.0599代表谷氨酰胺(Gln N)，y4(m/z650.3862)和y3(m/z 553.3519)之间的差值97.0343代表脯氨酸(Pro P)。
另外，离子峰(m/z 70.0656)为脯氨酸或天冬氨酸(Pro or Asn)的特征峰，离子峰(m/z 101.0697)为谷氨酰胺或赖氨酸(Gln or Lys)的特征峰，离子峰(m/z 136.0746)酪氨酸(Tyr)的特征峰，证实脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)的存在。
根据以上的质谱分析，再结合前面的氨基酸组成分析，可以确定组分20为含有15个碳原子的Iturin A，其分子式如下：
每毫升步骤1得到的上清液中含有1.2μg组分20。
实施例7、解淀粉芽孢杆菌的固态发酵
固态发酵培养基的组成如下：小麦麦麸50％(质量比)、花生壳粉末30％(质量比)、棉籽粕10％(质量比)、葡萄糖0.5％(质量比)和草炭9.5％。固态发酵培养基的含水量为40％。
步骤1：将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003单菌落接种到液体NB培养基中，30℃、160rpm振荡培养24h，得第一培养物；
步骤2：将3体积份所述第一培养物与97体积份YSB液体培养基混合，30℃、180rpm振荡培养48h，得第二培养物；
步骤3：将第二培养物做为固态发酵的种子液(第二培养物中，解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的菌浓度为109cfu/mL)，按10％(体积比)的接种量转接至固态发酵培养基，混匀后30℃静置培养5天，得到第三培养物。步骤3中：静置培养的第2天，培养体系中的解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的菌浓度为8.7×109cfu/g。静置培养的第5天，培养体系中的解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的菌浓度为7.6×1010cfu/g。
步骤4：将第三培养物进行风干，直至含水量为10％(实际应用中，含水量为15％以下均可)，即为解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥，粉碎并装袋。
将解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥室温保存6个月后，解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003的菌浓度为7.6×1010cfu/g。
实施例8、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥在番茄工厂化育苗中的应用
育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1；体积比；草炭购自黑龙江桦美泥炭有限公司，蛭石和珍珠岩均购自河北省灵寿县京石矿产加工厂。
番茄中杂9号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
实验组：将每升育苗基质与10g实施例7制备的解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。
播种28天后的照片见图20。
播种30天后，测量植株生长的各个参数，结果见表2(进行三次重复实验，每次重复实验每组测量20株植株，结果取平均值)。壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×全株干重(g)。
表2播种30天后实验组和对照组植株的各个参数的测量结果
播种30天后，将各组的栽培基质风干，检测其中有效氮的含量、有效磷的含量和有效钾的含量。检测有效氮的含量的方法为碱解扩散法，检测有效磷的含量的方法为0.5mol/L碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，检测有效钾的含量的方法为1mol/L醋酸铵浸提-火焰光度计法；参考文献：杨剑虹，王成林，代亨林.土壤农化分析与环境监测[M].中国大地出版社，2008.182－184，282－290。结果见表3。实施例7制备的解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥可明显提高栽培基质中有效氮、有效磷和有效钾的含量。
表3解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥对栽培基质中矿质元素含量的影响
| 有效氮(mg/g) | 有效磷(mg/g) | 有效钾(mg/g) | |
| 对照组 | 73.25±2.13 | 109.99±4.54 | 196.95±9.23 |
| 实验组 | 846.63±36.31 | 271.01±3.98 | 1417.29±49.81 |
实施例9、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥在黄瓜工厂化育苗中的应用
育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1；体积比；草炭购自黑龙江桦美泥炭有限公司，蛭石和珍珠岩均购自河北省灵寿县京石矿产加工厂。
黄瓜中农6号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
实验组：将每升育苗基质与10g实施例7制备的解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。
播种28天后的照片见图21。
播种30天后，测量植株生长的各个参数，结果见表4(进行三次重复实验，每次重复实验每组测量20株植株，结果取平均值)。壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×全株干重(g)。
表4播种30天后实验组和对照组植株的各个参数的测量结果
实施例10、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥对立枯丝核菌引起的黄瓜病害和尖孢镰刀菌引起的黄瓜病害的防效
育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1；体积比；草炭购自黑龙江桦美泥炭有限公司，蛭石和珍珠岩均购自河北省灵寿县京石矿产加工厂。
黄瓜中农6号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 37438。
一、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥对立枯丝核菌的防效
实验组：将每升育苗基质与10g实施例7制备的解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥和0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组100个植株。
播种10天后的照片见图22(圆圈内为发病植株)。由立枯丝核菌引起的立枯病的发病症状为幼苗茎基部产生褐色病斑(初为水渍状，并很快扩展、溢缩变细如“线”样)，子叶尚未凋萎仍为绿色，从茎基部(或茎中部)突然倒伏而贴于床面，幼茎逐渐萎缩直至幼苗变褐枯死。
播种25天后，统计存活率(三组的平均值)。实验组的存活率为67.53％，对照组的存活率为23.06％。
二、解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥对尖孢镰刀菌的防效
实验组：将每升育苗基质与10g实施例7制备的解淀粉芽孢杆菌ivfcaas0003菌肥和0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组100个植株。
播种15天后的照片见图23(圆圈内为发病植株)。由尖孢镰刀菌引起的枯萎病的发病症状为受害幼苗萎蔫死亡(尖孢镰刀菌会侵染寄主植物的维管束系统，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡)。
播种25天后，统计存活率(三组的平均值)。实验组的存活率为70.27％，对照组的存活率为20.80％。
Claims (8)
1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其保藏编号为CGMCC NO.8230。
2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的应用；所述应用为抑制植物病原菌和/或固氮和/或溶磷和/或解钾；所述植物病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)或黑曲霉(Aspergillus niger)。
3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中的至少一种：(Ⅰ)抑制植物病原菌；(Ⅱ)固氮；(Ⅲ)溶磷；(Ⅳ)解钾；所述植物病原菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。
4.一种活性成分为权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的产品；所述产品的用途为(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中的至少一种：(Ⅰ)抑制植物病原菌；(Ⅱ)固氮；(Ⅲ)溶磷；(Ⅳ)解钾；所述植物病原菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。
5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在制备式(Ⅰ)所示化合物中的应用；
6.一种发酵权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌接种到pH7.0的YSB培养基中，使其初始浓度为3×107cfu/mL，然后30℃、160rpm振荡培养48h。
7.一种生物菌肥，其制备方法包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的单菌落接种到液体NB培养基，30℃、160rpm振荡培养24h，得第一培养物；
(2)将3体积份所述第一培养物与97体积份YSB液体培养基混合，30℃、180rpm振荡培养48h，得第二培养物；
(3)将所述第二培养物按10％体积比的接种量转接至固态发酵培养基，混匀后 30℃静置培养5天，得到第三培养物；所述固态发酵培养基的组成如下：50％质量比为小麦麦麸、30％质量比的花生壳粉末、10％质量比的棉籽粕、0.5％质量比的葡萄糖和9.5％质量比的草炭；
(4)将所述第三培养物进行风干，直至含水量为15％以下，即为生物菌肥。
8.权利要求7所述生物菌肥在促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物发生植物病原菌侵染引起的相关疾病中的应用；所述植物病原菌为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、草酸青霉菌、串珠镰刀菌或黑曲霉。
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