CN104147139A - 桂花多酚提取物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从桂花中提取的植物多酚类提取物的用途；用于制备5α-还原酶活性抑制剂。相应的，桂花多酚提取物的制备方法为包括以下步骤：1)、将桂花与提取剂水溶液按照1g/15～60ml的料液比混合后于200～500KPa的压力下，80～200W功率进行微波提取，提取时间为3～20min；重复上述提取；2)、所得滤液合并后进行干燥处理，得桂花多酚提取物。

Description

桂花多酚提取物的用途

本发明是申请日为2013-05-08，申请号为201310169455.1的《桂花多酚提取物及其制备方法和用途》的分案申请。

技术领域

本发明涉及农副产品深加工及综合利用领域。更具体地涉及一种从桂花中提取的植物多酚类提取物及其制法和用途。

背景技术

桂花Osmanthus fragrans Lour.又名木犀、九里香、金粟，是我国十大传统名花之一，既是著名的香料植物，也是优良的园林绿化树种，兼有良好的生态效益、社会效益和经济效益。桂花在我国栽培历史悠久，在四川、云南、浙江、广西、湖北等省区均有野生；淮河流域至黄河下游以南各地普遍地栽，以北则以盆栽居多。全世界约有桂花品种40种，我国有27种，是桂花的主要分布中心，种质资源极其丰富。

桂花是传统的香花植物，花虽小，但香味持久稳定。我国拥有悠久的食用桂花传统，早在2000年前，就用桂花制酒、制花茶，近年来随着桂花种植面积的不断扩大以及食品工业的迅速发展，桂花糕、桂花酱等产品也得到大规模生产。

桂花含有丰富的营养物质。桂花中总氨基酸含量高达13.78％，其中人体必需氨基酸为6.26％，占氨基酸总量的45.55％，且氨基酸的配比合理，是一种优质蛋白质。此外桂花含有丰富的维生素、胡萝卜素和各种微量元素，钾、铁、锌。关于桂花次级代谢产物的研究，主要集中在其精油提取与芳香成分分析。Li-mei Wang等(2009)考察了不同开花期桂花的精油成分差异，发现桂花精油中含有多种包括芳樟醇及其氧化物、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、橙花醇等20余种有效成分。Chun-Di Hu等(2010)更进一步发现桂花精油含有高达73种成分。在其他生物活性物质方面研究较少。Chien-Ya Hung等(2012)对桂花中酚类成分进行了分离鉴定，发现其含有芦丁、毛蕊花苷等5种酚类化合物。桂花具有抗氧化、抗炎等生物活性，并且在神经保护、抑制黑色素形成方面表现出一定的效果，但其功效与成分之间的联系少有研究。

微波提取实际上主要是微波对提取溶剂及样品的加热作用。微波加热有两种机理，即离子传导和偶极子转动，该原理使微波可产生瞬间高温，因此提取时间短；微波在传输过程中，遇到不同物料时，会产生反射、吸收和穿透现象。当微波能穿透介质时，即微波对样品内部直接加热，这样避免发生传统加热方式从单一部位加热的问题，因而使微波加热具有加热均匀的优点。同时，由于物料所组成的各个部分的介电性质往往不同，微波就对这种物料呈现出选择加热的特性。高压微波辅助提取是在密闭提取罐中进行，其内部压力可达1MPa以上，因此溶剂沸点比常压下的溶剂沸点提高了许多，从而使微波提取可以达到常压下使用同样溶剂所达不到的提取温度，既可以提高提取效率又不致于分解待测提取物。

据WHO国际肿瘤研究理事会(IARC)负责人报道，到2020年全球肿瘤发病率将上升50％，到每年1500万。恶性肿瘤的临床治疗方法迄今已经发展多种如手术切除、化疗、放疗等，但是这些治疗方法在杀死肿瘤细胞的同时，也会对正常机体造成极大的损害，副作用很大。通过天然活性物质辅助作用，减少临床用药剂量或手术强度，具有重大的研究意义。针对桂花有效成分及其生物活性研究的局限性，拓展桂花有效成分的研究，并将其应用于肿瘤的防治，具有重大的开发意义。

5α-还原酶(5α-reductase)是依赖还原性辅酶Ⅱ(NADPH)的膜蛋白酶，它能催化睾酮(T)转化为二氢睾酮(DHT)，T和DHT作用于同一种雄激素受体，但DHT的催化活性更强，对雄激素受体有较强的亲和力，所以5α-还原酶的催化转化作用能够放大雄激素反应，进而可能引起假两性畸形、痤疮、雄激素源性脱发、女性多毛症等症状，同时与前列腺增生甚至前列腺癌的发生也密不可分，因此寻找高效5α-还原酶抑制剂具有重要的意义。研究者发现某些植物化学素如杨梅素、黄檀酚、凤仙花提取物等(Matsuda H,2001；Shirota O,2003；Ishiguro K,2000.)具有一定程度的5α-还原酶抑制活性，国内常用的治疗前列腺增生的中成药前列康的主要活性成分之一也被证明是油菜花粉中的一种多聚醚，研究提示天然植物化学素是作为5α-还原酶抑制剂的优质来源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种桂花多酚提取物及其制备方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种桂花多酚提取物的制备方法，包括步骤：

1)、采用高压微波提取法：

将桂花与提取剂水溶液按照1g/15～60ml的料液比混合后于200～500KPa的压力下，80～200W功率进行微波提取，提取时间为3～20min；过滤，得滤饼和首次滤液；

以滤饼替代桂花重复上述微波提取和过滤至少一次，得再次滤液；

所述提取剂水溶液中提取剂的体积浓度为70％～90％；

2)、将步骤1)所得的首次滤液和再次滤液合并后进行干燥处理，得桂花多酚提取物。

作为本发明的桂花多酚提取物的制备方法的改进：提取剂为丙酮、甲醇或乙醇。

作为本发明的桂花多酚提取物的制备方法的进一步改进：步骤2)中的干燥为减压干燥、冷冻干燥、薄膜干燥中的至少一种。

作为本发明的桂花多酚提取物的制备方法的进一步改进：步骤1)中微波提取压力为300～450KPa，功率为80～120W。

作为本发明的桂花多酚提取物的制备方法的进一步改进：提取剂水溶液为体积浓度80％的丙酮水溶液，料液比1g/45ml，压力为300KPa，100W微波提取3min。

本发明还同时提供了上述方法制备而得桂花多酚提取物：该桂花多酚提取物中总酚重量含量为30％～70％。

作为本发明的桂花多酚提取物的改进：总酚中，酚酸的重量含量为0.5％～2％，苯乙醇苷的重量含量为50％～80％。

作为本发明的桂花多酚提取物的进一步改进：酚酸中，绿原酸的重量含量为40％～70％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸的质量比为25～50：5～15：6～10；苯乙醇苷中，毛蕊花苷的重量含量为80％～95％。

备注说明：本发明所述的酚酸包含绿原酸、咖啡酸和对香豆酸，所述的苯乙醇苷包括毛蕊花苷。

本发明还同时提供了上述方法制备而得的桂花多酚提取物的用途，在制备用于抗肿瘤的药物或保健品中的应用。

本发明还同时提供了上述方法制备而得的桂花多酚提取物的另一种用途，用于抑制5α-还原酶活性(即，在制备5α-还原酶活性抑制剂中的应用)。

本发明的桂花多酚提取物可制成组合物，该组合物中含有0.01wt％～99.9wt％(更佳的，0.1wt％-90wt％)本发明所述的桂花多酚提取物，以及含有可接受的载体(包括药品、食品或化妆品中可接受的载体)。

本发明人经过深入研究，对桂花有效成分进行了提取分离，获得了一种可有效抗癌的多酚提取物---桂花多酚提取物，对该提取物的研究表明，该提取物主要含绿原酸、咖啡酸、对香豆酸以及毛蕊花苷等成分。

如本文所用，桂花是指木犀科木犀属植物桂花的花。可作为本发明原料的桂花可以是桂花鲜花、桂花干花、桂花茶及以桂花为原料的其他产品或经蒸馏提取后的桂花残渣。优选原料是桂花鲜花、桂花干花。

本发明采用的原料可以进行预处理，也可以不经过预处理。一种优选原料是粉末形式的桂花。例如，收集新鲜桂花或添加桂花的其他产品，干燥至水分含量(重量)10％以下，粉碎至约20～40目的粉末。

可用于本发明的桂花品种和产地没有特别限制，可以是不同品种的桂花，如金桂、银桂等，也可以来自不同产地如广西、浙江等。优选香味浓郁的金桂花。

本发明的桂花多酚提取物宜采用高压微波技术提取，虽然也可用其他方法提取。

一种优选的方法是采用高压微波提取技术从桂花及其相关产品中或桂花渣提取多酚类化合物。在一优选例中，提取剂为80％(体积浓度)丙酮，提取压力为200～500KPa，料液比1:15～1:60(g/ml)，微波提取3～20min。

在更优选例中，将约20-40目桂花粉末(水分重量含量≤10％)加入于智能微波消解仪的聚四氟乙烯材料制成的内杯中，提取剂选用80％(体积浓度)丙酮，料液比1:15-1:45(g/ml)，控制压力200～500KPa，80～200W微波处理3～20min，离心，重复提取2次以上，过滤合并上清液(即，滤液)，上清液经真空旋转蒸发浓缩，低温干燥后得桂花多酚提取物。

本发明的桂花多酚提取物是一种以毛蕊花苷为主的多酚混合物。用福林酚法检测，以绿原酸为标准品，测得桂花多酚提取物中总酚含量为30％～70％，更佳的40％～60％；用紫外分光光度法测定总酚中苯乙醇苷质量分数为50％～80％，更佳的60％～75％；用HPLC分析酚酸及苯乙醇苷的组成，其中酚酸中绿原酸含量为40％～70％，更佳的45％～65％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸质量比为25～50：5～15：6～10，更佳的25～45：5～12：7～9，苯乙醇苷中毛蕊花苷含量为80％～95％，更佳的82％～92％。

本发明的桂花多酚提取物具有抗肿瘤及抑制5α-还原酶活力的生物活性，因此可用于制备抗肿瘤或具有5α-还原酶抑制作用的药物、保健品和食品。因此，本发明还提供了一种含有桂花多酚提取物作为有效成份的组合物(包括药物组合物、保健品组合物、食品组合物和化妆品组合物等)，这些组合物可用于预防、治疗或辅助治疗肿瘤细胞增殖。

在获得桂花多酚提取物后，可用常规方法将其与药学上、食品学上或保健品或化妆品上可接受的载体、赋形剂或稀释剂相混合，形成本发明的药物组合物、食品组合物或保健品组合物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

以药物组合物或保健品组合物为例，它们可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其他合适的形状。本发明桂花多酚提取物的含量通常为组合物重量的1％～99％，较佳地为2％～96％，更佳地为5％～90％，最佳地15％～80％。

保健品组合物可以为单剂或多剂形式。按施用剂量计，通常含有10～2000mg/剂，较佳地约20～1000mg/剂，更佳地50～500mg/剂。

本发明的保健品组合物可以通过常规途径进行给药，优选方式是口服。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明保健品的施用量，按活性物质计算，通常为每天约桂花多酚提取物0.1～500mg/kg体重，较佳地约0.5～50mg/kg体重。此外，本发明的制剂还可与其他辅助制剂一起使用，例如，其他辅助制剂包括各种现有的抗癌活性物质或抗氧化活性物质。

本发明具有如下优点：

(a)提供了一种来源广阔、组成明晰、品质优良、质量可控、用途广泛并具有多种生理和药理活性的桂花多酚提取物。

(b)通过高压微波提取技术实现了桂花及其相关产品中多酚的高效提取，操作工艺简便。

综上所述，多酚是含有多元酚羟基的一类化合物，在自然界分布极为广泛。植物多酚种类繁多，主要包括酚酸、黄酮等，研究表明具有清除自由基、抗氧化、缓解动脉粥样硬化抗菌剂抗肿瘤等多种生理活性。食用花卉中含有大量多酚类物质，而桂花作为常见的食用花卉之一，品种丰富，开发潜力大，因此从桂花中得到多酚提取物并拓展其保健功能具有重要开发意义。

本发明通过超声波辅助提取技术实现了桂花及其相关产品中多酚的高效提取，操作工艺简便，且发现该提取物具有良好的抗癌功效，在食品、保健品、药品中有广泛的应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷对照品及桂花样品HPLC分离结果图谱，图谱显示，1、10.1min左右为绿原酸，2、12.8min左右为咖啡酸，3、19.3min左右为对香豆酸，4、30.7min左右为毛蕊花苷。

图2是桂花桂花多酚提取物HPLC分离结果图谱，其中B图为A图中8-22min放大效果图。与对照品图谱对应，1、10.1min左右为绿原酸，2、12.8min左右为咖啡酸，3、19.3min左右为对香豆酸，4、30.7min左右为毛蕊花苷；

图3分别为绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷的结构图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

检测通用方法为：

1)、桂花多酚提取物中总酚含量测定——福林酚法

以绿原酸为对照，采用福林酚法测定总酚。取500ul样品(稀释一定倍数，即每ml样品中含有2mg的桂花多酚提取物)或标准液(浓度为10-150μg/ml的绿原酸甲醇溶液)，添加50ul2M的福林酚，混匀反应5-8min，加入1ml1M的NaOH，用水定容至6ml，常温反应90min后760nm波长测定吸光度，并计算总酚的绿原酸当量浓度。

2)、桂花多酚提取物种苯乙醇苷含量测定——紫外分光光度法

以毛蕊花苷为对照，采用紫外分光光度法测定总乙醇苷。将一定量样品(每ml样品中含有8mg的桂花多酚提取物)通过D-101大孔树脂吸附依次用样品体积25倍的水及20％(v/v)乙醇洗脱，弃去洗脱液，后以50倍体积70％乙醇(v/v)洗脱，搜集洗脱液，蒸干，甲醇定容。330nm波长下测定吸光度，并计算毛蕊花苷当量浓度。

3)、桂花多酚提取物的有效成分分析——高效液相色谱法(HPLC)

通过HPLC分离法对桂花多酚提取物进行成分分离和分析。

HPLC分离方法：采用Phenomenex Synergi4μhydro-RP80A(250*4.6mm)色谱柱；流动相：A(乙酸水溶液，pH2.74)、B(乙腈)，柱温38℃，流速0.8ml/min；在200～600nm之间进行紫外扫描，梯度洗脱程序如下：

表1梯度洗脱程序

时间/min	A％	B％
			0	95	5
2	92	8
			15	84	16
35	75	25
			50	5	95
51	0	100
			55	0	100
56	95	5
			60	95	5

以下实施例中所述的桂花粉末是指新鲜桂花干燥至水分含量(重量)10％以下，粉碎至约20～40目所得的粉末，重量为100g。

实施例1、

将约20-40目桂花粉末加入智能微波消解仪的聚四氟乙烯材料制成的内杯中，提取剂选用80％丙酮(即体积浓度为80％的丙酮水溶液)，料液比1:15(g/ml)，控制压力200KPa，80W微波处理3min，过滤，再重复提取2次(即，以滤渣替代桂花粉末，依次重复上述微波处理和过滤2次)，合并3次提取所得的滤液，滤液45℃真空旋转蒸发浓缩，浓缩液经-80℃预冻后真空冷冻干燥至恒重，得桂花多酚提取物，得率为15.1％。

对提取物进行成分测定及分析，结果如图1、2所示。图1、2表明，该提取物含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷。比色法与HPLC法分析桂花多酚提取物的成分含量，其总酚含量为30.5±1.3％。总酚中，绿原酸含量为0.25±0.01％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸质量比为30：5：6；苯乙醇苷含量为65.2±3.2％，苯乙醇苷中毛蕊花苷含量为87.6±1.1％。

实施例2、

将约20-40目桂花粉末加入智能微波消解仪的聚四氟乙烯材料制成的内杯中，提取剂选用80％丙酮，料液比1:25(g/ml)，控制压力200KPa，80W微波处理5min，过滤，再重复提取2次(即，以滤渣替代桂花粉末，依次重复上述微波处理和过滤2次)，合并3次提取所得的滤液，滤液45℃真空旋转蒸发浓缩，浓缩液经-80℃预冻后真空冷冻干燥至恒重，得桂花多酚提取物，得率为23.5％。

对提取物进行成分测定及分析，该提取物含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷。比色法与HPLC法分析桂花多酚提取物的成分含量，其总酚含量为59.7±1.1％。总酚中，绿原酸含量为0.4±0.015％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸质量比为35：15：6；苯乙醇苷含量为71.5±1.9％，苯乙醇苷中毛蕊花苷含量为85.7±2.3％。

实施例3、

将约20-40目桂花粉末加入于智能微波消解仪的聚四氟乙烯材料制成的内杯中，提取剂选用80％丙酮，料液比1:35(g/ml)，控制压力300KPa，80W微波处理8min，过滤，再重复提取2次(即，以滤渣替代桂花粉末，依次重复上述微波处理和过滤2次)，合并3次提取所得的滤液，滤液45℃真空旋转蒸发浓缩，浓缩液经-80℃预冻后真空冷冻干燥至恒重，得桂花多酚提取物，得率为25.1％。

对提取物进行成分测定及分析，该提取物含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷。比色法与HPLC法分析桂花多酚提取物的成分含量，其总酚含量为60.8±2.1％。总酚中，绿原酸含量为0.4±0.01％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸质量比为40：15：7；苯乙醇苷含量为61.6±0.9％，苯乙醇苷中毛蕊花苷含量为87.1±2.5％。

实施例4、

将约20-40目桂花粉末加入于智能微波消解仪的聚四氟乙烯材料制成的内杯中，提取剂选用80％丙酮，料液比1:40(g/ml)，控制压力400KPa，100W微波处理8min，过滤，再重复提取2次(即，以滤渣替代桂花粉末，依次重复上述微波处理和过滤2次)，合并3次提取所得的滤液，滤液45℃真空旋转蒸发浓缩，浓缩液经-80℃预冻后真空冷冻干燥至恒重，得桂花多酚提取物，得率为28.0％。

对提取物进行成分测定及分析，该提取物含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷。比色法与HPLC法分析桂花多酚提取物的成分含量，其总酚含量为51.5±1.3％。总酚中，绿原酸含量为0.8±0.01％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸质量比为45：12：6；苯乙醇苷含量为68.8±1.7％，苯乙醇苷中毛蕊花苷含量为88.5±2.1％。

实施例5

将约20-40目桂花粉末加入于智能微波消解仪的聚四氟乙烯材料制成的内杯中，提取剂选用80％丙酮，料液比1:45(g/ml)，控制压力300KPa，100W微波处理3min，过滤，再重复提取2次(即，以滤渣替代桂花粉末，依次重复上述微波处理和过滤2次)，合并3次提取所得的滤液，滤液45℃真空旋转蒸发浓缩，浓缩液经-80℃预冻后真空冷冻干燥至恒重，得桂花多酚提取物，得率为30.4％。

对提取物进行成分测定及分析，该提取物含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷。比色法与HPLC法分析桂花多酚提取物的成分含量，其总酚含量为63.6±3.2％。总酚中，绿原酸含量为0.25±0.01％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸质量比为50：15：10；苯乙醇苷含量为60.1±1.5％，苯乙醇苷中毛蕊花苷含量为89.3±1.3％。

该实施例5所得总酚含量最高，达到桂花干花的19.3％。

为了充分证明本发明的技术优势所在，发明人还进行了如下的对比例：

比例1-1～1-对比例1-4、仅仅将提取剂由80％丙酮分别改成60％丙酮、100％丙酮、80％甲醇、80％乙醇；其余均等同于实施例5。

对提取物进行成分测定及分析，该提取物含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷。具体含量如表2所述。

表2

比例2-1、将控制压力300KPa、100W微波处理3min改成“控制压力200KPa、100W微波处理3min”，其余均等同于实施例5。

比例2-2、将控制压力300KPa、100W微波处理3min改成“控制压力500KPa、100W微波处理3min”，其余均等同于实施例5。

比例2-3、将控制压力300KPa、100W微波处理3min改成“控制压力300KPa、200W微波处理3min”，其余均等同于实施例5。

比例2-4、将控制压力300KPa、100W微波处理3min改成“控制压力300KPa、80W微波处理20min”，其余均等同于实施例5。

对比例2-5、将料液比由1:45(g/ml)改成1:20(g/ml)，其余均等同于实施例5。

对比例2-6、将料液比由1:45(g/ml)改成1:60(g/ml)，其余均等同于实施例5。

将对比例2-1～对比例2-6所得的提取物进行成分测定及分析，该提取物中均含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸和毛蕊花苷。具体含量如表3所述。

表3

实验1、桂花多酚提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用

①细胞株及培养条件

人乳腺癌细胞(MCF-7、MDA)，人前列腺癌细胞(PC-3、LN-CaP)，培养基为RPMI-1640，含10％灭活胎牛血清，5％二氧化碳孵箱中37℃培养。

②MTT比色法检测细胞增殖率

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100ul细胞悬液，细胞放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药，细胞放入培养箱培养24h。药物作用结束后，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)，培养3-4h，终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ulDMSO,37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟。后用酶标仪检测490nm各孔的吸光度(A)值记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率(IR)。IR＝[1-(用药组测定的平均A值/对照孔测定的平均A值)]×100％，并通过SPSSl7.0软件进行回归分析，计算IC₅₀值(半致死抑制浓度)，对桂花多酚提取物进行评价。

表4、各实施例和对比例中的桂花多酚提取物对各肿瘤细胞的IC₅₀值

IC50(ug/ml)	MCF-7	MDA	PC-3	LN-CaP
					实施例1	690.9	503.7	250.4	318.1
实施例2	630.5	490.2	189.8	220.2
					实施例3	604.5	450.3	140.2	193.9
实施例4	653.2	499.8	177.6	211.1
					实施例5	534.4	399.3	136.6	140.2
对比例1-1	598.7	453.8	250.4	318.1
					对比例1-2	624.5	509.2	169.8	220.2
对比例1-3	604.4	465.3	160.2	193.9
					对比例1-4	673.2	498.9	177.6	211.1
对比例2-1	544.4	429.3	156.3	180.2
					对比例2-2	590.9	501.1	250.4	288.1

对比例2-3	610.5	491.8	189.8	251.8
					对比例2-4	684.5	480.3	190.2	310.9
对比例2-5	693.2	489.8	224.6	218.1
					对比例2-6	552.4	423.5	146.6	194.2

实验2、桂花多酚提取物对5α-还原酶活性的抑制作用

①大鼠5α-还原酶的制备

取清洁级雌性SD大鼠3只，禁食不禁水过夜后脱颈椎处死，取出肝脏冰台上剪碎。用预冷的缓冲液在玻璃匀浆器制成1:5匀浆，在4℃下，10000g离心力下离心15min，取胞浆部分100000g离心力下离心1h，倒掉上清，沉淀即为粗微粒提取物。加入一定体积缓冲液，并用匀浆器进行匀浆悬浮。分装，-80℃冰箱保存。

②5α-还原酶的活性测定

a.5α-还原酶的活性测定体系：0.5mL20μM磷酸缓冲液(pH＝6.5)，0.1mL50％乙醇(反应管)或样品溶液(样品管)，150μL0.5mg/mL睾酮，250μL0.8mg/mL NADPH，添加0.5mL浓度依次为0、0.96、1.92、2.88、3.84、4.80mg/mL酶提取物。在37℃下反应30分钟后，加入2.5mL二氯甲烷使反应停止，然后加入0.25mL的100μg/mL丙基羟苯酸酯作为内标，摇晃60s，在400g离心力下离心10min。

b.HPLC测定酶活性：移出约1ml有机相并蒸干，残留物溶于1.5ml甲醇，取10μL高效液相进样测定残留睾酮与内标峰面积的比值并记为r反应，r反应值低说明酶活性高。色谱条件：luna C18(2)柱(4.6×250mm,5μm)；柱温：40℃；进样量：10μL；流速：1mL/min；流动相：65％甲醇，检测波长：242nm。

样品对5α-还原酶抑制率＝(r_样品-r_反应)/(r_空白-r_反应)×100％；

注：r_空白---反应启动前加入二氯甲烷使得酶失活，测定酶空白管值；

c.相同的方法以非那雄胺为对照进行试验，计算桂花多酚提取物的非那雄胺当量。

表5、各实施例和对比例中的桂花多酚提取物对5α-还原酶抑制作用

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.桂花多酚提取物的用途，其特征是：用于制备5α-还原酶活性抑制剂。

2.根据权利要求1所述的桂花多酚提取物的用途，其特征是：桂花多酚提取物的制备方法包括以下步骤：

1)、采用高压微波提取法：

将桂花与提取剂水溶液按照1g/15～60ml的料液比混合后于200～500KPa的压力下，80～200W功率进行微波提取，提取时间为3～20min；过滤，得滤饼和首次滤液；

以滤饼替代桂花重复上述微波提取和过滤至少一次，得再次滤液；

所述提取剂水溶液中提取剂的体积浓度为70％～90％；

2)、将步骤1)所得的首次滤液和再次滤液合并后进行干燥处理，得桂花多酚提取物。

3.根据权利要求2所述的桂花多酚提取物的用途，其特征是：所述提取剂为丙酮、甲醇或乙醇。

4.根据权利要求3所述的桂花多酚提取物的用途，其特征是：所述步骤2)中的干燥为减压干燥、冷冻干燥、薄膜干燥中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的桂花多酚提取物的用途，其特征是：所述步骤1)中微波提取压力为300～450KPa，功率为80～120W。

6.根据权利要求5所述的桂花多酚提取物的用途，其特征是：提取剂水溶液为体积浓度80％的丙酮水溶液，料液比1g/45ml，压力为300KPa，100W微波提取3min。

7.根据权利要求2～6中任一桂花多酚提取物的用途，其特征是：该桂花多酚提取物中总酚重量含量为30％～70％。

8.根据权利要求7所述的桂花多酚提取物的用途，其特征是：所述总酚中，酚酸的重量含量为0.5％～2％，苯乙醇苷的重量含量为50％～80％。

9.根据权利要求8所述的桂花多酚提取物的用途，其特征是：所述酚酸中，绿原酸的重量含量为40％～70％，绿原酸、咖啡酸及对香豆酸的质量比为25～50：5～15：6～10；苯乙醇苷中，毛蕊花苷的重量含量为80％～95％。