CN104120172A - 精神分裂症的基因标志物及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组可用于诊断精神分裂症的标志基因，所述标志基因可用于制备诊断精神分裂症的检测试剂或检测试剂盒。基于该标志基因，本发明还提供了用于诊断精神分裂症的检测试剂盒、检测试剂和基因芯片或阵列，以及利用该标志基因诊断精神分裂症的方法。本发明的方法简便易行，诊断结果可靠并且兼顾了灵敏度和特异度。

Description

精神分裂症的基因标志物及其使用方法和应用

技术领域

本发明涉及医学领域。具体地说，本发明涉及用于精神分裂症的基因标志物及其使用方法和应用。

背景技术

精神分裂症(Schizophrenia)是一种常见的精神疾病，全球人群中的患病率为0.3%-0.7%[1]。精神分裂症多起病于青壮年，常有感知、思维、情感、行为等多方面的障碍和精神活动的不协调，严重影响患者的身体功能和生活质量。尽管一些患者可以通过治疗得以康复，但大多数会经历长期反复发作，因此精神分裂症不仅是个人的疾病，同时也是一个不可小觑的社会问题，对其家庭、卫生保健系统和整个社会都会造成明显的经济负担。

目前，临床上对精神分裂症的诊断主要是根据病人的详细病史与精神症状，再参考其发病年龄、病期、病程等来做综合判断，因此总体上是一个依赖于医生主观经验的过程，诊断结果常常因人而异。为了使精神分裂症的诊断更加客观化，提高诊断的一致性和准确度，近年来，世界各地的科研工作者一直致力于寻找精神分裂症的生物标志物，建立有效的检测方法。生物标志物指可供客观测定和评价的普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。生物标志物的化学本质可以是DNA、RNA、蛋白或代谢物，一般从体液获得。将生物标志物应用于精神分裂症，可以有效辅助当前诊断中不确定的人为因素，减少错/误诊率并有助于指导用药和康复过程。

因此，本领域急需可用于诊断精神分裂症的生物标志物，该标志物应该是可靠，还应具备良好的灵敏度和特异度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于可靠、灵敏和特异地诊断精神分裂症的生物标志物以及利用所述生物标志物诊断精神分裂症的方法。

在第一方面，本发明提供选自下组中至少一种基因的用途，所述基因用于制备诊断精神分裂症的检测试剂或检测试剂盒：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因的核苷酸序列至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的基因。

在一优选例中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3。

在另一优选例中，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

在进一步的优选例中，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

在另一优选例中，所述检测试剂是探针、引物、核酸芯片或阵列。

在另一优选例中，所述探针是taqman-MGB(minorgroove binderoligodeoxynucleotide conjugate,MGB-ODN)探针。

在另一优选例中，所述芯片是Taqman微流体芯片。

在第二方面，本发明提供一种用于诊断精神分裂症的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)检测选自下组中至少一种基因的检测试剂；和

(2)描述利用(1)所述检测试剂检测选自下组中至少一种基因的使用方法的使用说明书；

所述基因是：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的核苷酸序列的基因。。

在一优选例中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3。

在另一优选例中，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

在另一优选例中，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

在另一优选例中，所述检测试剂是探针、引物、核酸芯片或阵列。

在第三方面，本发明提供一种核酸芯片或阵列，所述芯片或阵列上具有检测选自下组中至少一种基因的探针：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的核苷酸序列的基因。

在一优选例中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3。

在另一优选例中，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

在另一优选例中，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

在第四方面，本发明提供一种精神分裂症的诊断方法，所述方法包括检测选自下组中至少一种基因的表达量是否降低：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的核苷酸序列的基因。

在一优选例中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3。

在另一优选例中，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

在进一步的优选例中，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了RNA反转录实验步骤。

图2显示了定制芯片的示意图(阴影部分为与本实验相关的小孔反应室)。

图3显示了Realtime-PCR扩增曲线图。

图4显示了3个基因在训练集的正常和疾病组中的表达量箱式图。

图5显示了训练集和验证集的ROC曲线图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现精神分裂症患者中ZNF184、ZSCAN12和HIST1H4I基因的mRNA表达量均显著降低，从而利用该3个基因为生物标志物可以有效区分精神分裂症患者和正常人，进而可用于诊断精神分裂症。在此基础上完成了本发明。

1.术语定义

本文所用的术语“标志基因”或“精神分裂症标志基因”或类似的术语在本文可以互换使用，它们具有相同的含义，均表示可用于诊断精神分裂症的基因；换言之，该基因的表达量显著降低可以作为诊断精神分裂症的指标。

本文用于描述标志基因表达量的术语“显著降低”表示，与取自健康对象的血液白细胞中标志基因或其变体的表达水平相比，该标志基因的表达量有统计学上显著的降低或不足。具体地说，就是用统计学上的Student’s t检验来比较健康对象和病人的血液白细胞中标志基因的表达水平，若得出的P值小于0.05，则认为两者的差别达到了统计学上的显著水平。

“引物”表示当与DNA的一条链配对时在有合适的聚合试剂存在下能启动引物延伸产物合成的寡核苷酸。为使扩增效率最大，引物优选单链，但或者可以是双链。引物足够长从而能在聚合试剂存在时引发合成延伸产物。引物的长度取决于许多因素，包括：应用领域、所采用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。可选出与模板序列“基本上互补”的引物，设计这些引物设计能与模板杂交并用作合成的起点。“基本上互补”表示该引物的互补性足够与靶多核苷酸杂交。引物和所设计的与其杂交的模板最好不含错配，但这不是必需的。例如，可将非互补核苷酸残基连接在引物的5’末端，而该引物序列的其余部分与模板互补。鉴于本领域的现有知识以及本发明的教导，本领域技术人员可以根据本发明的基因和具体需求自主设计引物。

本文所用的术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。

例如，在具体的优选实施方式中，本发明利用taqman-MGB(minorgroove binderoligodeoxynucleotide conjugate,MGB-ODN)探针。TaqMan探针是一条和模版互补的基因特异性探针，探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团(受体)，在反应初始(探针完整)时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性(也就是切口平移)切割掉探针5'端的报告基团-游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子(报告基团)形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。MGB探针3'端采用了非荧光性的淬灭基因-淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindole tripetide,DPI3)，可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值-而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一个15bp的MGB探针的信噪比大于6。

当然，鉴于本领域的现有知识以及本发明的教导，本领域技术人员还可以根据本发明的基因和具体需求设计其它可用于实施本发明的探针，而不限于本发明实施例中具体使用的探针。

本文所用的术语“芯片”或“阵列”在本文可以互换使用，它们具有相同的含义，均表示具有寡核苷酸探针的基板，在该基板表面的已知不连续位置沉积了不同的已知序列。例如，该基板可以是如美国专利号5,424,186所述的两维基板形式。这种基板可用于合成两维空间寻址的寡核苷酸(矩阵)阵列。或者，该基板的特征在于通过将两维平面的薄片卷成三维管状构型而形成管状阵列。该基板也可采取与光纤表面相连的微球或珠形式，例如Chee等在WO00/39587中所述的那样。这些寡核苷酸阵列至少具有两种不同的元件，其密度为每cm²至少400个元件。在某些实施方案中，这些阵列的密度可以是每cm²约500、至少一千、至少一万、至少十万、至少一百万或至少一千万个元件。例如，该基板可以是硅或玻璃，具有载玻片或盖玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物构成。当在该基板上进行试验的方法包括光检测时，可用透光的基板。该术语也指探针阵列和与其相连形成芯片一部分的基板。

例如，在具体的优选实施方式中，本发明利用Taqman微流体芯片，该芯片上预先固定了引物和探针。同样，鉴于本领域的现有知识以及本发明的教导，本领域技术人员也可以根据本发明的基因和具体需求设计其它可用于实施本发明的芯片，而不限于本发明实施例中具体使用的。

本文所用的术语“序列相同性”指二序列在比较窗上根据核苷酸对核苷酸的相同性程度。因此，“序列相同性百分比”可通过以下步骤计算：在比较窗上比较两条最佳比对的序列，测定两条序列中相同的核苷酸碱基(例如，A、T、C、G、I)的位置数得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口的总位置数(即，窗口大小)，再将结果乘以100得到序列相同性百分比。为本发明的目的，应将“序列相同性”理解为用DNASIS计算机程序(适用于windows的2.5版；购自Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，加利福尼亚，美国)，采用该软件所附参考手册中使用的标准默认(参数)计算的“匹配百分比”。

为比对比较窗口，可通过计算机执行算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package Release7.0，Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA)或通过目测和所选择的各种方法之一产生的最佳比对(即导致比较窗口上最高同源性百分比)，对诸序列进行最佳比对。也可参考如Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.，25:3389所述的BLAST程序族进行比对。序列分析的详述可见Ausubel等，《最新分子生物学方法》(Current Protocols in MolecularBiology)的第15章，第19.3单元，John Wiley&Sons Inc，1994-1998。

2.本发明的精神分裂症标志基因及其应用

本发明的目的在于研究和寻找辅助精神分裂症疾病诊断的生物标记物，采用ROC曲线(receiver operating characteristic curve)工具来衡量生物标志物组合性能的高低。疾病诊断是区分病人和正常人的问题，在数学上是一个二分问题，即将实例分成阳性(positive)或阴性(negative)，因此生物标志物组合实质上相当于一个分类器。分类的正误，会出现四种情况：如果一个实例是阳性并且被预测成阳性，即为真阳性(True Positive,TP)；如果实例是阴性但被预测成阳性，称之为假阳性(FalsePositive,FP)。相应地，如果实例是阴性且被预测成阴性，称之为真阴性(TrueNegative,TN)，阳性但被预测成阴性则为假阴性(False Negative,FN)。分类器的分类能力，以灵敏度(sensitivity)和特异度(specificity)来衡量。其中，灵敏度亦即真阳性率(true positive rate,TPR)，计算公式为TPR=TP/(TP+FN)，表示分类器所识别出的阳性实例占所有阳性实例的比例。特异度亦即真阴性率(True Negative Rate,TNR)，计算公式为TNR=TN/(FP+TN)，表示分类器所识别出的阴性实例占所有阴性实例的比例。对于一个具体的分类器，确定了分类的阀值就确定了相应的灵敏度和特异度。假设阀值以上判断为阳性，阀值以下判断为阴性，那么减小阀值固然固然能识别出更多的阳性个体，也就是提高了识别出的阳性实例占所有阳性实例的比例(即灵敏度，TPR)，但同时也将更多的阴性实例当作了阳性实例，降低了特异度。改变分类器的阀值，将对应的灵敏度和特异度描绘在以1-特异度为横坐标、灵敏度为纵坐标的二维空间，就绘制出ROC曲线。ROC曲线最重要的属性是曲线下面积(Area under the curve,AUC)。根据AUC的大小将分类器分为四个等级：

AUC	等级	诊断能力
			0.9-1.0	A	非常好
0.8-0.9	B	良好
			0.7-0.8	C	一般
0.6-0.7	D	较差
			0.5-0.6	F	很差

本发明在24位临床诊断为精神分裂症的病人和24位正常人的样本中，使用基于实时定量PCR(RT-PCR)方法的Taqman Low Density Array(TLDA)技术，测定血液白细胞中ZNF184(SEQ ID NO:1)、ZSCAN12(SEQ ID NO:2)和HIST1H4I(SEQ IDNO:3)这3个基因的mRNA表达量，分别以这些表达量或它们的线性组合为生物标志物，可以实现对精神分裂症和正常人样本的有效区分，从而能诊断精神分裂症。

所鉴定的标志基因可用于设计特异性寡核苷酸探针和相应引物。这种探针和引物可以是能与标志基因序列特异性杂交的任何长度，其至少长约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500个核苷酸，而探针可长达本发明标志基因序列的全长。探针也可在其5’和/或3’末端包含其它序列从而能延伸超出与其杂交的靶序列。

当联用核酸扩增方法时，这些探针和引物能快速分析生物学样品(例如，外周血样品)来检测或定量测定标志基因的转录产物(主要指mRNA)。这种方法包括本领域已知或本文所述用于复制或增加靶核酸或其互补序列的拷贝数或含量的任何方法或技术。

鉴于本发明的教导和本领域的现有技术，本领域普通技术人员应该理解，本发明基因的核苷酸序列中可能存在一定程度的自然突变，但并不影响该基因的正常功能；换言之，本领域普通技术人员应该明白，检测这些基因突变体也能实现诊断精神分裂症的目的。

因此，在具体的实施方式中，本发明的标志基因选自下组：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因(请提供3种基因的核苷酸序列)；或

(b)含有与(a)所述基因至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的核苷酸序列的基因。

在优选的实施方式中，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

在进一步优选的实施方式中，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

鉴于本发明的教导，本领域技术人员应该明白本发明的标志基因可用于制备诊断精神分裂症的检测试剂或检测试剂盒。

在具体的实施方式中，所述检测试剂是探针、引物、核酸芯片或阵列。

基于所述精神分裂症标志基因，本发明还提供一种用于诊断精神分裂症的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)检测本发明精神分裂症标志基因的检测试剂；和

(2)描述利用(1)所述检测试剂检测本发明精神分裂症标志基因的使用方法的使用说明书。

在具体的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3所示基因。

在优选的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3所示基因中任意两种基因的组合。

在进一步优选的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2和3所示三种基因的组合。

在具体的实施方式中，所述检测试剂是探针、引物、核酸芯片或阵列。

基于所述精神分裂症标志基因，本发明还提供一种核酸芯片或阵列，所述芯片或阵列上具有检测本发明精神分裂症标志基因的探针。

在具体的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3所示基因。

在优选的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3所示基因中任意两种基因的组合。

在进一步优选的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2和3所示三种基因的组合。

本发明还提供一种精神分裂症的诊断方法，所述方法包括检测本发明所述精神分裂症标志基因的表达量是否降低。

在具体的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3所示基因。

在优选的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2或3所示基因中任意两种基因的组合。

在进一步优选的实施方式中，所述基因是SEQ ID NO:1、2和3所示三种基因的组合。

此外，基于本发明的教导和本领域的现有技术，本领域技术人员还应明白，可以根据具体的需要采用不同的线性方程，选择不同的阈值以获得所需的灵敏度或特异度。例如，医生可以根据实施例1和2提供的表格查找所需的某个敏感度和特异度组合所对应的Y值的阈值。

本发明的优点：

1.本发明提供了可用于诊断精神分裂症的标志基因；

2.利用该标志基因对精神分裂症进行诊断得到的结果可靠，并且兼顾了诊断灵敏度和特异度，极具临床价值。

3.本发明方法操作简便易行。

材料与方法

1.样本

1.1研究组：24例首发或经长期停药的长沙精神分裂症病人

入组标准：

入组前4周内未用过任何抗精神病药物治疗。

符合DSM-Ⅳ诊断标准的精神分裂症病人。

签署知情同意书。

排除标准：

伴躯体疾病。

伴其他精神障碍或物质滥用史。

1.2对照组：年龄、性别及生活区域(城市或农村)与疾病组匹配的病人配偶或无血缘关系的健康人。

按男女平衡的原则，随机挑选14例病人，根据这14例病人筛选年龄性别匹配的健康对照，然后将此14对样本设定为训练集，用于寻找潜在的用于诊断的生物标记物；剩下10对样本设定为验证集，用于检验由训练集产出的生物标记物在实际样本中的诊断能力。样本的基本信息如表一所示，各项参数在正常人和精神分裂症两组中比较后均无统计显著性差异。

表1.样本基本信息

2.方法

2.1.血样采集

2.1.1在受试者经过10-12小时的空腹过夜后，第二天清晨用EDTA抗凝采血管采集病人新鲜全血2ml，迅速置于有冰袋的环境，并在30分钟内进入后续总RNA提取。

2.2.总RNA提取

2.2.1在15ml RNase-free的离心管中加入2ml全血以及10ml提前预冷的1×红细胞裂解液(天根生化科技有限公司)，涡旋混匀。

2.2.2将混合液在冰上孵育20分钟，孵育过程中涡旋振荡混匀2次。

2.2.34℃下，2100rpm(约400×g)离心10分钟，将上清完全去除。

2.2.4在白细胞沉淀中继续加入4ml1×红细胞裂解液，重悬细胞。

2.2.54℃下，2100rpm(约400×g)离心10分钟，将上清完全去除。

2.2.6在白细胞沉淀中加入1ml TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，转移所有液体至1.5ml RNase-free的离心管中。

2.2.7用5ml注射器反复吹打混合液10次，使TRIzol与白细胞充分接触后，室温(15-30℃)放置5分钟，使核蛋白复合物充分裂解。

2.2.8继续加入200μl氯仿，手工用力振荡混匀15s，室温(15-30℃)孵育2-3分钟。

2.2.94℃下，12000×g离心15分钟。离心后样品分成两相，下层红色的酚-氯仿相和上层无色的水相。

2.2.10将水相转移至另一1.5ml RNase-free的离心管中，加入1μl Glycogen(20mg/ml)和0.5ml异丙醇，混匀，-20℃下放置2小时。

2.2.114℃下，12,000×g离心40分钟，管底出现白色胶状沉淀，弃上清。

2.2.12加入1ml75%乙醇，漩涡混匀，悬浮沉淀。

2.2.134℃下，7500×g离心5分钟，尽量弃上清。

2.2.14室温晾干5-10分钟至沉淀刚好透明。

2.2.15加入RNase-free H₂O20μl，吹打数下助溶后，于-80℃环境中保存。

2.3.RNA质量检验

2.3.1提取到的RNA溶液由分光光度法(Nanodrop Technologies,Rockland,DE,USA)测定得到浓度值和260/280的值。

2.3.2由电泳方法(Agilent2100bioanalyzer，Agilent Technologies)测定得到表征RNA分子完整程度的RIN值。

2.3.3筛选满足RIN值>7.5,260/280的值介于1.7和2之间的RNA样本为合格样本，进入后续实验操作。

2.4.反转录实验

每个样本取1μg在上述操作中提取的合格的总RNA，使用PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TAKARA Biotechnology(DALIAN)CO.,LTD)进行反转录，合成cDNA。操作步骤同试剂盒的说明书，如图1所示。简述如下：

2.4.1根据RNA浓度，在0.2ml RNase-free的离心管中加入一定体积的总RNA溶液，使加入的RNA总量为1μg，再加入2μl5×gDNA Eraser Buffer,1μl gDNAEraser，再加入一定体积的RNase-free dH₂O使总反应体系达到10μl。

2.4.2涡旋混匀，在PCR仪中42℃恒温2分钟后，降至4℃取出。

2.4.3在反应体系中继续加入1μl PrimeScriptRT Enzyme Mix I，4μl RT PrimerMix，4μl5×PrimeScript Buffer2和1μl RNase-free dH₂O(反应体系达到20μl)。

2.4.4涡旋混匀后，PCR仪中37℃恒温15分钟，然后85℃恒温5秒，最后降至4℃取出，于-20℃储存。

注：为了保证反应液配制的准确性，加样时，按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中。加样操作全部在冰上进行。

2.5.Taqman Low Density Assay(TLDA)实验

2.5.1使用Taqman在线的探针选择系统gene expression assay searchtool(http://bioinfo.appliedbiosystems.com/genome-database/gene-expression.html)查得编号为Hs00300276_m1，Hs00207021_m1，Hs00747477_s1的探针可分别用于检测ZNF184，ZSCAN12和HIST1H4I基因的表达量。

2.5.2委托Life Technology公司制作定制芯片，把所选的探针预先置入Taqman检测芯片中(图2)。定制芯片为384孔板，分为8条微流体加样泳道，每条泳道可以加1个样本。每个样本可以通过泳道流到“沿途”的48个小孔反应室中，每个反应室可以独立进行实时定量PCR反应(real-time PCR)。我们设计每个样本的每个基因做两次平行检测，理论上1条泳道最多可以同时检测1个样本中的24个基因，因此该方法能够完全满足本实验中同时对3个基因进行定量检测的要求。

2.5.3每个样本取2μl经过反转录的cDNA混合液，加入55μl Taqman UniversalPCR Master Mix(2×)和53μl RNase-free H2O，得到约110μl的反应混合液。取其中100μl小心加入某个泳道上方的加样槽中(过程中避免气泡产生)。

2.5.4加满一块芯片后(共8个样)，将芯片正确放入特制的离心架上，1200rpm离心1分钟，然后再1200rpm离心1分钟，此时样本已经进入各个小孔反应室中。

2.5.5使用特制封口机将芯片进行封口，使各个小孔反应室完全相互隔离。封好口后，剪下加样槽。

2.5.6在Applied Biosystems7900HT仪器上进行TLDA模块下的real time PCR反应。其中反应的温度程序设置如下：2min(50℃)+10min(94.5℃)+[30s(97℃)+1min(59.7℃)](重复40次)。

2.6.数据处理

2.6.1将仪器获得的原始数据从软件SDS v.2.3(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)中导出到软件RQ Manager software v1.2(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)中进行基线调整和阈值设置等预处理。阈值是扩增曲线坐标图上的一个Y值。一个基因对应一个阈值，这个阈值在该基因所有扩增曲线上所截的位置均位于曲线的指数扩增区段。截取到的交点所对应的X值即为Ct值(循环数)。

2.6.2由于每个样本的每个基因均有两次重复测定，最终的Ct值采用两者的平均值(平均Ct值)。为保证数据质量，如果两次重复测量中有任何一次失败或者两次测得的Ct值之间的差值达到0.5以上，则视该样本的平均Ct值为缺失值。

2.6.3我们以管家基因beta-actin(β-肌动蛋白)的表达量为内部参考值(内参)来校正不同样本在RNA总浓度上的差别。对每个样本而言，三个目的基因的最终表达量以相对表达量的形式呈现，它的计算公式为2^-ΔCt，其中ΔCt=目的基因的平均Ct值-同样本中beta-actin基因的平均Ct值。

2.6.4针对三个目的基因在不同样本中的最终表达量，可以进行后续的统计分析。Student’s t检验得到的P值可以表征目的基因在两组中表达的差异程度，具体的差异量用倍数比表示。用于诊断的线性方程的拟合以及受试者工作曲线(ROC)的计算和绘制在R-Studio软件中完成。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。

实施例

实施例1.

基因ZNF184、ZSCAN12和HIST1H4I以及内参基因ACTB的实时定量PCR的扩增曲线如图3所示(显示各个基因20条扩增曲线的重叠图，包含了10个样本)。曲线的形状都较正常，阈值的设定(绿横线)符合基本要求，其中Beta-actin基因(ACTB)在不同样本中的表达(Ct值)基本稳定，符合其作为内参基因的特征。其中一个正常人样本的ZNF184基因的表达值不符合数据筛选要求而作为缺失值处理。三个基因在训练集样本中的表达情况见箱式图(图4)，它们在病人中的表达量都降低了。

用Student’s t-test对三个基因在两组中的差异作分析得到结果如表2所示，它们的p值均小于0.05，表明这三个基因的表达量在两组中均存在统计学显著的差异性(即，在病人组中显著降低)。

表2.目的基因在训练集正常和疾病组中的表达差异情况

Gene	t-test p值	倍数比
			ZNF184	0.0030	-1.45
ZSCAN12	0.0039	-1.56
			HIST1H4I	0.0033	-1.56

运用逻辑斯蒂回归，在模型训练集中构建用于疾病诊断的线性组合方程为：

Y=Log(P/(1-P))=6.28+750.66×c(ZNF184)-8859.74×c(ZSCAN12)-4116.17×c(HIST1H4I)

其中“P”表示患病的概率，1为患病，0为不患病；“c(gene)”表示该基因在血液白细胞中测得的相对表达量。

使用该方程能基于三个基因的表达量得到对患病情况的一个概率估计值(P)。在训练集和测试集中分别作ROC曲线，可以对其诊断效果做一个评价，结果如图5所示，其中训练集的曲线下面积(AUC)为0.8791(置信区间(CI):0.7439-1)，验证集的AUC为0.9(CI:0.7661-1)，达到“良好”级别的诊断效果。以Y=0.166为阈值，小于该阈值判为疾病，大于该阈值则判为正常，可以得到这个生物标志物组合在训练集中的诊断灵敏度为0.786，诊断特异性为0.923；在验证集中的诊断灵敏度为0.9，诊断特异性为0.7。

表3.ZNF184、ZSCAN12和HIST1H4I联用的诊断特异性/敏感度查询表

Y=Log(P/(1-P))=6.28+750.66×c(ZNF184)-8859.74×c(ZSCAN12)-4116.17×c(HIS

T1H4I)

实施例2.

重复实施例1，但各自利用基因ZNF184、ZSCAN12和HIST1H4I以及它们两两之间的组合。

用于诊断的线性方程均为运用逻辑斯蒂回归在模型训练集中构建，其中“P”表示患病的概率，1为患病，0为不患病；“c(基因)”表示该基因在血液白细胞中被测得的相对表达量。

各诊断标记物以及它们两两组合下的诊断特异性/敏感度查询表均基于所有样本得出，具体查询表如下所示。

表4.单用ZNF184的诊断特异性/敏感度查询表

Y=c(ZNF184)

表5.单用ZSCAN12的诊断特异性/敏感度查询表

Y=c(ZSCAN12)

表6.单用HIST1H4I的诊断特异性/敏感度查询表

Y=c(HIST1H4I)

表7.ZNF184和ZSCAN12联用的诊断特异性/敏感度查询表

Y=Log(P/(1-P))=5.118-1279.298×c(ZNF184)-9799.667×c(ZSCAN12)

表8.ZNF184和HIST1H4I联用的诊断特异性/敏感度查询表

Y=Log(P/(1-P))=6.044-7337.408×c(ZNF184)-4267.288×c(HIST1H4I)

表9.ZSCAN12和HIST1H4I联用的诊断特异性/敏感度查询表

Y=Log(P/(1-P))=6.024-7805.622×c(ZSCAN12)-4152.998×c(HIST1H4I)

讨论：

由实施例1和2可以明确看出：使用ZNF184，ZSCAN12与HIST1H4I这三个基因表达值的任意组合，诊断能力均能达到“良好”。

其中：

单独使用ZNF184基因的表达值，训练集样本中ROC曲线的曲线下面积(AUC)为0.8297，验证集样本中的AUC为0.89，在所有样本中的AUC为0.8514；单独使用ZSCAN12，训练集样本中ROC曲线的AUC为0.8367，验证集样本中的AUC为0.9，在所有样本中的AUC为0.8576；单独使用HIST1H4i，训练集样本中ROC曲线的AUC为0.8265，验证集样本中的AUC为0.87，在所有样本中的AUC为0.8472。

ZNF184与ZSCAN12联合作为诊断标记物时，使用方程：

Y=Log(P/(1-P))=5.118-1279.298×c(ZNF184)-9799.667×c(ZSCAN12)，训练集样本中ROC曲线的AUC为0.8265，验证集样本中的AUC为0.9，在所有样本中的AUC为0.8507；

ZNF184与HIST1H4I联合作为诊断标记物时，使用方程：

Y=Log(P/(1-P))=6.044-7337.408×c(ZNF184)-4267.288×c(HIST1H4I)，训练集样本中ROC曲线的AUC为0.8061，验证集样本中的AUC为0.9，在所有样本中的AUC为0.8420；

ZSCAN12与HIST1H4I联合作为诊断标记物时，使用方程：

Y=Log(P/(1-P))=6.024-7805.622×c(ZSCAN12)-4152.998×c(HIST1H4I)，训练集样本中ROC曲线的AUC为0.8571，验证集样本中的AUC为0.9，在所有样本中的AUC为0.8663；

将ZNF184，ZSCAN12与HIST1H4I三者联合作为诊断标记物时，使用方程：

Y=Log(P/(1-P))=6.28+750.66×c(ZNF184)-8859.74×c(ZSCAN12)-4116.17×c(HIST1H4I)，训练集样本中ROC曲线的AUC为0.8724，验证集样本中的AUC为0.9，在所有样本中的AUC为0.8733。

实施例3.

根据“材料与方法”部分所述的标准选择30例首发或经长期停药的长沙精神分裂症病人以及30例对照组；对上述样本进行双盲检测，检测上述样本中ZNF184和/或ZSCAN12和/或HIST1H4I基因的表达量，然后分别利用实施例1和2提供的线性方程以及阈值来诊断检测对象是否患有精神分裂症。

结果：

单用ZNF184基因的表达值，检测的准确性为78.5%(灵敏度76%，特异度为81%，阈值为4.56*E-04)；单用ZSCAN12，检测的准确性为83.4%(灵敏度为79.3%，特异度为87.5%，阈值为3.95*E-04)；单用HIST1H4I，检测的准确性为80.8%(灵敏度为82.8%，特异度为78.8%，阈值为5.57*E-04)。

ZNF184与ZSCAN12联合作为诊断标记物时，检测的准确性为80.5%(灵敏度为79%，特异度为82%，阈值为0.639)；ZNF184与HIST1H4I联合作为诊断标记物时，检测的准确性为77.5%(灵敏度为75%，特异度为80%，阈值为0.324)；ZSCAN12与HIST1H4I联合作为诊断标记物时，检测的准确性为81.5%(灵敏度为77%，特异度为86%，阈值为0.226)。

将ZNF184，ZSCAN12与HIST1H4I三者联合作为诊断标记物时，检测的准确性为84%(灵敏度为85%，特异度为83%，阈值为0.166)。

因此，本发明的方法可以用来诊断精神分裂症，并且诊断结果具有令人满意的灵敏度和特异度。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

1.van Os,J.and S.Kapur,Schizophrenia.Lancet,2009.374(9690):p.635-45.

Claims (10)

1.选自下组中至少一种基因的用途，其特征在于，所述基因用于制备诊断精神分裂症的检测试剂或检测试剂盒：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因的核苷酸序列至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的基因。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

4.一种用于诊断精神分裂症的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)检测选自下组中至少一种基因的检测试剂；和

(2)描述利用(1)所述检测试剂检测选自下组中至少一种基因的使用方法的使用说明书；

所述基因是：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的核苷酸序列的基因。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

7.一种核酸芯片或阵列，其特征在于，所述芯片或阵列上具有检测选自下组中至少一种基因的探针：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的核苷酸序列的基因。

8.如权利要求7所述的芯片或阵列，其特征在于，所述基因是(a)或(b)中任意两种基因的组合。

9.如权利要求7所述的芯片或阵列，其特征在于，所述基因是(a)或(b)中三种基因的组合。

10.一种精神分裂症的诊断方法，其特征在于，所述方法包括检测选自下组中至少一种基因的表达量是否降低：

(a)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、2、3所示的基因；或

(b)含有与(a)所述基因至少有85%，优选90%，更优选95%，最优选99%序列相同性的核苷酸序列的基因。