CN104109657A - 南极磷虾谷氨酰胺转移酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南极磷虾谷氨酰胺转移酶及其应用，所述的南极磷虾谷氨酰胺转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明的南极磷虾谷氨酰胺转移酶可以用于蛋白类食品的进一步开发。用于粘合南极磷虾肉，粘合后的南极磷虾肉质地紧实，将来可以做成大块的虾饼、虾丸等南极磷虾食品，促进南极磷虾的食品开发利用。

Description

南极磷虾谷氨酰胺转移酶及其应用

技术领域

本发明属于食品和分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种南极磷虾谷氨酰胺转移酶及其应用。

背景技术

南极磷虾是解决人类粮食危机的重要蛋白源，但是由于加工不过关，目前开发出来的食品种类还很少。由于南极磷虾个体小、脱壳后品相不佳以及虾肉粘合困难，这成为了限制南极磷虾食品开发的一个关键因素。常规的粘合剂如a-淀粉、海藻酸钠、氯化钙、以及细菌来源商品话的谷氨酰胺转移酶均不能很好地使南极磷虾虾肉发生很好粘合。因此，如何使得南极磷虾虾肉发生很好粘合是本领域技术人员亟待解决的技术问题之一。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种南极磷虾谷氨酰胺转移酶及其在促进南极磷虾虾肉发生很好粘合中的应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明涉及一种南极磷虾谷氨酰胺转移酶，其特征在于所述的南极磷虾谷氨酰胺转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明另一方面还涉及所述的南极磷虾谷氨酰胺转移酶在制备粘合南极磷虾肉中的应用，优选的，所述的粘合南极磷虾肉进一步制成虾饼或虾丸。

本发明另一方面还涉及南极磷虾谷氨酰胺转移酶基因，其特征在于所述的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明另一方面还涉及含有上述南极磷虾谷氨酰胺转移酶基因的可表达载体。

本发明的南极磷虾谷氨酰胺转移酶可以用于制备粘合南极磷虾肉，粘合后的南极磷虾肉质地紧实，将来可以做成大块的的虾饼、虾丸等南极磷虾食品，促进南极磷虾的食品开发利用。

附图说明

图1：粘合后的南极磷虾肉照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：

(1)从新鲜南极磷虾中提取RNA，反转录。(2)用引物F5’-GGATCCTCTAGAGATTGATATCATGGCCTTCTTCTCCGATGT-3’和R5’-CTGCAGGTCGACGATTGTCGACGTCAAACATCTTGCTCAACAAC-3’对进行PCR扩增，获得了CDS区全长。PCR反应体系为：反转录产物1μL，5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10μL，dNTP Mixture(2.5mMeach)4μL，CTG324F(20uM)1μL，CTG324R(20uM)1μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，Total Up to50μL。反应条件为：98℃10sec；55℃15sec；72℃2min；72℃10min，共30个循环。

凝胶电泳分离，电泳条带割胶回收，得到南极磷虾谷氨酰胺转移酶基因序列，其基因序列为SEQ ID NO.1。

利用PET-30质粒构建了包含南极磷虾谷氨酰胺转移酶基因序列的表达载体。具体方法如下：PET-30质粒小量制备后进行纯化，按照以下体系进行酶切，酶切体系组成如表1所示。将上面体系混匀，离心去气泡；37℃水浴4h；70℃水浴20min；-20℃保存。

表1酶切体系

组成	体积
		EcoRV	0.5μL
SalI	0.5μL
		Pet-30质粒	17.5μL
Buffer	1.5μL

选取PET-30酶切质粒、DNA酶切片段，按照以下体系进行连接，连接体系组成如表2所示，质粒与DNA片段比为1：5。连接转化步骤：1)连接体系22℃水浴10min；2)取5μL连接体系与50μL DH-5α感受态细胞至于1.5mL离心管中，冰水浴30min；3)42℃，90s；4)冰水浴2min；5)加入900μL LB液体培养基，37℃，150rpm,60min；6)4000rpm，室温离心3min；7)取100μL上清，弃去多余上清，用100μL上清与沉淀轻轻混匀；8)将混合物全部移入含卡那霉素的固体平板上，涂布，放置10min；9)于37℃恒温培养箱中倒置培养16h。

表2连接体系

挑取DH-5α阳性克隆的质粒，按照以下体系进行PCR反应，PCR体系组成如表3所示。反应条件：94℃，5min；94℃40s，57℃40s，72℃3min，32个循环；72℃10min；4℃终止反应。

表3PCR反应体系

BL-21的转化、质粒提取及目的片段检测。BL-21的转化步骤：1)取5uLDH-5α已转质粒与50μL BL-21感受态细胞至于1.5mL离心管中，冰水浴30min；2)42℃，90s；3)冰水浴2min；4)加入900μL LB液体培养基，37℃，150rpm,60min；5)4000rpm，室温离心3min；6)取100μL上清，弃去多余上清，用100μL上清与沉淀轻轻混匀；7)将混合物全部移入含卡那霉素的固体平板上，涂布，放置10min；8)于37℃恒温培养箱中倒置培养16h。

1)挑取阳性克隆菌落于5mL加卡那霉素液体培养基的试管中，37℃，170rpm,1h摇菌，至OD为0.6左右；2)将菌液8000rpm，4℃，离心7min收菌，弃上清；3)加200μL SolutionⅠ，用枪头或振荡器充分悬浮细菌；4)加200μL Solution Ⅱ，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液，时间不宜超过5min；5)加350μL SolutionⅢ，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5min，12000rpm，离心5-10min；6)将步骤5)中上清液转移到套放于2mL收集管内的Genclean column中，室温6000rpm，离心1min，取Genclean column，倒掉收集管中废液；7)将Genclean column重新放回收集管中，加500μL washing Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液；8)重复步骤7)一次；9)12000rpm，室温离心1min，彻底去除washing Solution；10)将Genclean column放入干净的1.5mL离心管中，加30μL Elution Buffer，37℃，放置2min；11)12000rpm，室温离心1min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液，-20℃保存；

选BL-21阳性克隆质粒，按照以下体系进行PCR反应，PCR体系组成如表4所示。反应条件：94℃，5min；94℃40s，57℃40s，72℃3min，32个循环；72℃10min；4℃终止反应。

表4PCR反应体系

BL-21阳性克隆菌扩大培养步骤：1)挑菌，加入5mL已加卡那霉素的液体培养基的试管中，37℃，170rpm，培养1h；2)各吸取2mL分别置于2个500mL锥形瓶内，倒入200mL已加入卡那霉素的液体培养基，37℃，170rpm，培养1h。

其中一瓶加入400μL IPTG，为实验组，另一瓶不加，标记空白对照组，分别于16℃，170rpm，培养24h后于10000rpm，4℃，15min离心，弃上清。BL-21阳性克隆菌的破碎步骤：1)加入少量0.06mol/LPBS充分悬浮沉淀，对沉淀进行清洗，洗去多余的液体培养基；2)10000rpm，4℃，15min，离心，弃上清；3)加入5mL PBS，充分悬菌，液氮和25℃水浴，反复冻融15次；4)10000rpm，4℃，15min，离心，取上清于新的离心管中标记为实验组上清，沉淀加入10mL PBS过夜清洗离心弃上清；沉淀标记为实验组沉淀；5)对照组操作步骤同上并标记为对照组上清、对照组沉淀；

SDS-PAGE证明了南极磷虾谷氨酰胺转移酶的表达。经过镍柱分离纯化，得到了纯化的蛋白(其氨基酸序列为SEQ ID NO.2)，其分子量为86kD。

以z-Gln-Gly及羟胺为底物,用L一谷氨酸一γ一单羟胺酸做标准曲线。酶活的定义：在37℃时生成1umol的L一谷氨酸一γ一单羟胺酸所需酶量定义为1个酶活单位。经过酶活测定，酶的活力在30万U/g。

和南极磷虾肉50：1重量比混合后，4摄氏度放置36h，虾肉明显粘合为一个整体，(如图1所示)。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种南极磷虾谷氨酰胺转移酶，其特征在于所述的南极磷虾谷氨酰胺转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.权利要求1所述的南极磷虾谷氨酰胺转移酶，可用于南极磷虾或其它蛋白类食品的加工和开发。

3.南极磷虾谷氨酰胺转移酶基因，其特征在于所述的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

4.含有权利要求3所述的南极磷虾谷氨酰胺转移酶基因的可表达载体。