CN104024397A - 细胞分离容器 - Google Patents

Abstract

本发明的细胞分离容器（10）被过滤器（40）区分成收集室（20）和组织保持室（30）。该细胞分离容器（10）具备对收集室（20）的气体的流入流出进行调节的第1气圧调节部（60），和对组织保持室（30）的气体的流入流出进行调节的第2气圧调节部（70），构成为能够通过这些气压调节部的操作而对收集室（20）和组织保持室（30）的气体的流入流出进行调节。在细胞分离容器（10）中，通过收集室（20）的气体的流入流出的调节，能够将处理液切换成保持在组织保持室（30）中或者向收集室（20）排出。

Description

细胞分离容器

技术领域

本发明涉及一种细胞分离容器。

背景技术

近年来，在生物体外(in vitro)培养细胞，为了治疗而将培养出的细胞植入到患者身上，或者利用于医药品等的毒性试验的细胞培养技术在各种领域得到利用。这种细胞培养技术自古以来一直进行，但其工序几乎都是人工进行的手动操作，作业者的负担大，希望使操作简单化或者自动化。尤其是在作为细胞培养的初期工序的从生物体组织中分离出细胞的工序中，需要对从患者或者供体采取的生物体组织进行清洗、消毒，或者用含有酶的液体进行处理而从生物体组织中分离出细胞这多种操作，给作业者带来极大的负担。

为此，例如在专利文献1中提出了如下的细胞分散装置，其具备：组织保持部，至少在一部分具有大小为细胞能够通过的多个细胞通过孔并能够保持生物体组织；液体貯留部，构成为包围组织保持部并能够貯留浸渍由组织保持部保持的生物体组织的分散剂含有液；以及水流发生部，使分散剂含有液发生水流，在貯留在液体貯留部的分散剂含有液的作用下，使从生物体组织分离出的细胞从组织保持部的细胞通过孔向组织保持部的外侧通过。在该细胞分散装置中，由于代办了在使细胞从生物体组织中分离、分散之际的手动操作，所以能够通过分散剂简单地进行从生物体组织中分离、分散细胞的处理。

专利文献1：日本国专利第4520855号公报。

但是，在上述的装置中，由于分散剂含有液不仅需要貯留在进行细胞分散处理的组织保持部，还需要将充分量的分散剂含有液貯留到貯留液体貯留部进行处理，因此存在液量必须要多等不经济的一面。

发明内容

本发明是为了解决这种问题而提出的，其主要目的在于提供一种用处理液对组织片进行处理，能够简便而高效地进行分离细胞的一系列的操作的细胞分离容器。而且，其目的还在于为即使是手动操作也能够容易地进行细胞分离处理的构造。

为了实现上述的主要目的，本发明的细胞分离容器采用了以下的手段。

即、本发明的细胞分离容器使用处理液将细胞从组织片中分离，其中具备：

收集室，收集前述处理液以及前述细胞中的至少一种；

组织保持室，设在前述收集室的上方，具备用于投入前述处理液的投入口；

过滤器，作为区分出前述收集室和前述组织保持室的结构的全部或者一部分地设置，能够保持前述组织片，并且前述细胞能够通过；

气压调节机构，通过对前述收集室和前述组织保持室的各气体的流入流出进行调节，能够将投入到前述组织保持室中的处理液切换成不通过前述过滤器而保持在前述组织保持室中，或者通过前述过滤器而向前述收集室排出。

在该细胞分离容器中，通过对收集室和组织保持室的各气体的流入流出进行调节，不仅能够在组织保持室内对组织片进行处理时，控制成处理液保持在组织保持室中，也能够在处理液的处理结束后，以组织保持室中保持着组织片及残渣的状态将处理液以及细胞容易地向收集室排出。这样，能够简便地以必要的最小限度的液量高效率地用处理液对组织片进行处理、排出处理后的处理液这一系列的操作。

在此，作为组织片，优选是从能够从生物体组织中采取的上皮组织、结合组织、筋组织、神经组织等，具体地说，列举出皮肤（表皮、真皮）、软骨、角膜、网膜、骨膜、骨、神经、肌肉、粘膜、牙周组织、血管、脂肪，或者心脏、肝脏、胰脏、肾脏或膀胱等组织或脏器的一部分。而且，培养细胞得到的细胞片或细胞块（球形体）或者在支架（Scaffold）中播种了细胞的培养组织等单种或者多种的细胞构成的细胞集团也能够用作本发明的组织片。

而且，作为处理液，除了用于输送组织片的输送液、用于对组织片进行消毒的消毒液、用于对组织片进行清洗的清洗液、用于从组织片中分离出细胞的酶溶液之外，列举出培养基等。作为输送液，列举出磷酸缓冲液（PBS）、林格氏液、培养基等。作为清洗液，列举出磷酸缓冲液（PBS）、林格氏液、生理食盐液等。作为消毒液，列举出酒精、聚乙烯吡咯酮碘溶液等。作为酶溶液，列举出结晶胰蛋白酶或分散酶、胶原酶、白明胶酶等各种蛋白酶、各种肽酶、各种糖分解酶等。作为培养基，列举出DMEM（含各种氨基酸和葡萄糖的培养基）、α－MEM、无血清培养基等各种液体培养基，也可以添加有FBS（胎牛血清）等血清、青霉素或链霉素等抗生剂、成長因子、抗坏血酸等各种添加物质。

在本发明的细胞分离容器中，也可以是前述气圧调节机构具备第1气圧调节部，设在前述收集室上，对前述收集室内的气体的流入流出进行调节；第2气圧调节部，设在前述组织保持室上，对前述组织保持室内的气体的流入流出进行调节。若这样，则由于能够分别对收集室内的气圧和组织保持室内的气圧进行调节，所以气圧的调节容易。

在这样的细胞分离容器中，也可以是前述第1气圧调节部构成为能够使前述收集室内的气体与外气流通、阻断，前述第2气圧调节部构成为平时能够使前述组织保持室内的气体与外气流通。就是这样，也能够控制收集室与组织保持室中的处理液的保持以及排出。具体地说，如果通过第1气圧调节部将收集室内的气体与外气阻断，则投入到组织保持室中的处理液成为盖，收集室成为密闭状态，收集室的气体不会伴随体积变化地维持在收集室内。此时，在处理液中，重力与组织保持室内的气体的气圧产生的朝下的力平衡那样的表面张力和收集室内的气体的气圧产生的朝上的力（以下也称为来自下方的支撑力）起作用。由于这种气圧平衡的作用，能够将处理液保持在组织保持室内。另外，为了处理液起到盖的作用，只要将处理液的表面张力与过滤器的孔隙尺寸（孔径）的关系设定成在收集室内的气体的气圧下气体不能够经由过滤器孔容易地移动即可，但若是能够保持组织片并且细胞能够通过的孔隙尺寸，则能够期待充分的效果。如果处于这种状态，则无论组织保持室的气体是与外气流通还是密闭的，由于收集室内的气体不会向组织保持室侧移动，所以维持了来自下方的支撑力，能够将处理液保持在组织保持部中。然后，如果通过第1气圧调节部使收集室内的气体与外气流通，则由于收集室内的气体能够向外部流出，所以来自下方的支撑力弱，处理液随着重力而向收集室排出。这样，如果使第1气圧调节部为阻断状态，则能够通过收集室的气圧产生的力将处理液保持在组织保持室中，如果使第1气圧调节部为流通状态，则能够容易地使处理液向收集室排出。另外，若通过第1气圧调节部主动地吸引收集室内的气体等，使收集室内的气圧低于组织保持部的气圧，则能够更有效地排出处理液。在这种情况下，孔隙尺寸小、处理液不易排出的状况更为有效。而且，即使与前述的构成相反，将前述第1气圧调节部构成为平时能够使前述收集室内的气体与外气流通，将前述第2气圧调节部构成为能够使前述组织保持室内的气体与外气流通、阻断，也期待同样的效果。

本发明的细胞分离容器也可以具备：下容器，上部具有开口；上容器，上部具有开口，底部具备前述过滤器，下方与前述下容器相连；以及盖体，能够安装在前述上容器的开口上；被前述下容器和前述上容器的前述底部包围的区域为前述收集室，被前述上容器和前述盖体包围的区域为前述组织保持室。在这样的细胞分离容器中，前述上容器既可以具备：外框体，上部以及下部具有开口，下方与前述下容器相连；和组装体，能够装卸地组装在前述外框体的内侧，具备前述过滤器，也可以作为一体形成。如果具备外框体和组装体，则通过改变外框体与组装体的组合能够适于所希望的操作，若作为一体形成，则由于零件个数少，处理容易。而且，在这样的细胞分离容器中，也可以是前述下容器具有能够安装前述盖体的构造。若这样，则在细胞的分离结束后拆下上容器，将盖体直接安装在下容器上，能够紧凑地进行之后的操作及保管。而且，下容器、上容器、过滤器也可以一体地形成。

而且，在具备下容器，上容器和盖体的方式的细胞分离容器中，也可以是前述第1气圧调节部具备：设在前述盖体上的密封部，和与该密封部相连并沿上下方向贯通前述上容器的筒状部。若这样，则由于能够通过设在盖体上的密封部进行气圧的调节操作，所以操作容易。在这种方式的细胞分离容器中，也可以是前述第1气圧调节部具备从前述筒状部连续到前述下容器的底部的吸引管。若这样，则由于在将收集在收集室中的处理液及细胞排出之际，能够省略将吸引件插入到下容器的底部的操作等，所以操作容易，而且还能够适于自动化。

而且，在具备下容器，上容器和盖体的方式的细胞分离容器中，也可以是前述盖体具备：能够通过螺纹在前述上容器上安装、拆下的盖体主体，和装配在该盖体主体的内侧的橡皮层，该橡皮层的与前述盖体主体的接触面的橡胶硬度比与前述上容器的接触面的橡胶硬度高。在这样的细胞分离容器中，不容易在橡皮层与盖体主体之间产生摩擦，橡皮层与上容器容易紧密贴合。因此，由于在将盖体安装在上容器上之际橡皮层不易扭转，所以盖不易反扭转，能够进一步提高外容器的气密性。

或者，本发明的细胞分离容器也可以具备：外容器，上部具有开口；内容器，组装在前述外容器的内部上方，上部具有开口，底部具备前述过滤器；以及盖体，能够安装在组装了前述内容器的状态的前述外容器上，被前述外容器与前述盖体包围，前述内容器的外侧的区域为前述收集室，被前述内容器与前述盖体包围的区域为前述组织保持室。在这样的细胞分离容器中，由于外容器及盖体容易适用市售的离心管等，所以通用性高。

而且，在具备外容器，内容器和盖体的方式的细胞分离容器中，也可以是前述第1气圧调节部具备设在前述盖体上的密封部，和与该密封部相连并沿上下方向贯通前述内容器的筒状部。若这样，则由于能够通过设在盖体上的密封部进行气圧的调节操作，所以操作容易。在这种方式的细胞分离容器中，也可以是前述第1气圧调节部具备从前述筒状部连续到前述外容器的底部的吸引管。若这样，则由于在将收集在收集室中的处理液及细胞排出之际能够省略将吸引件插入到外容器的底部的操作等，所以操作容易，而且，也能够适于自动化。

而且，在具备外容器，内容器和盖体的方式的细胞分离容器中，也可以是前述盖体具备：能够通过螺纹在前述外容器上安装、拆下的盖体主体，和装配在该盖体主体的内侧的橡皮层，该橡皮层的与前述盖体主体的接触面的橡胶硬度比与前述外容器和/或前述内容器的接触面的橡胶硬度高。在这样的细胞分离容器中，不容易在橡皮层与盖体主体之间产生摩擦，橡皮层与外容器及内容器容易紧密贴合。因此，由于在将盖体安装在外容器上之际橡皮层不易扭转，所以盖不易反扭转，能够进一步提高外容器及内容器的气密性。

附图说明

图1是第1实施方式的细胞分离容器10的立体图；

图2是表示装配前的细胞分离容器10的立体图；

图3是图2中A－A截面的示意图；

图4是表示细胞分离悬浊处理中的操作内容的流程图；

图5是表示组织片与输送液的样子的示意图；

图6是表示对组织片进行消毒的样子的示意图；

图7是表示酶处理的样子的示意图；

图8是表示细胞悬浊处理的样子的示意图；

图9是第2实施方式的细胞分离容器310的立体图；

图10是表示装配前的细胞分离容器310的立体图；

图11是细胞分离容器的变形例；

图12是细胞分离容器的变形例；

图13是细胞分离容器的变形例。

具体实施方式

以下，使用附图对本发明的优选实施方式进行说明。

［第1实施方式］

图1是第1实施方式的细胞分离容器10的立体图，图2是装配前的细胞分离容器10的立体图，图3是图2中A－A截面的示意图。

细胞分离容器10如图1所示，由过滤器40区分成收集室20和组织保持室30。该细胞分离容器10具备对收集室20的气体的流入流出进行调节的第1气圧调节部60，和对组织保持室30的气体的流入流出进行调节的第2气圧调节部70，通过这些调节部，能够对收集室20以及组织保持室30的外气与气体的流入流出进行调节。该细胞分离容器10如图2所示，具备下容器22，具备过滤器40的上容器32，以及能够安装在上容器32的开口34上的盖体50，被下容器22与上容器32的底部38包围的区域为收集室20，被上容器32与盖体50包围的区域为组织保持室30。

下容器22为有底筒状，底部28成为了与侧壁顺滑地相连的曲面。另外，底部28也可以是以圆锥形状与侧壁顺滑地相连。这样一来，在细胞分离后将细胞分离容器10放置在离心分离器上的情况下，细胞容易聚集在底部28（容易形成细胞颗粒）。而且，下容器22在上部具有开口24，在开口的外周侧设有凸螺纹部26。

上容器32为筒状，在底部38上内周侧设有凹螺纹部39。通过该凹螺纹部39与下容器22的凸螺纹部26旋合，上容器32与下容器22连接在一起。而且，上容器32在上部具有开口34，在开口的外周侧设有凸螺纹部36。

过滤器40热熔接在上容器32的底部38中凹螺纹部39的上方。该过滤器40具备滤材42和用于将滤材42固定在上容器32上的框部44。框部44由设在中央部的圆盘状的部分，沿着上容器32的内周设置的轮状的部分，以及连结两者的8根梁构成，滤材42满铺在该框部44上。另外，框部44的形状或形态既可以适当设计，也可以由滤材42构成整面，但通过为前述那样的结构则能够得到强度。滤材42只要是能够保持组织片并且细胞能够通过即可，但优选为膜滤器。作为膜滤器的材质，列举出尼龙（注册商标）、聚四氟乙烯（PTFE）、纤维素等。滤材42的孔隙尺寸如前所述，只要适当设定成按照处理液的表面张力（粘性）等，在规定的气圧条件下，收集室的气体不能够容易地经由过滤器孔向组织保持室移动即可。例如优选为30μm以上且100μm以下，更优选为40μm以上且70μm以下。

盖体50如图3所示，在内周侧具有凹螺纹部54。并且通过该凹螺纹部54与上容器32的凸螺纹部36旋合，盖体50与上容器32连接在一起。该凹螺纹部54构成为也能够与下容器22的凸螺纹部26旋合。因此，盖体50既可以安装在上容器32的开口34上，也可以安装在下容器22的开口24上。

盖体50具备盖体主体51和用于确保必要的气密性以及液密性的橡皮层56，设有用于投入处理液的投入口52、密封橡皮62、第2气圧调节部70。在此，投入口52由填埋在贯通盖体主体51以及橡皮层56的圆形的孔中的弹性体构成，并能够通过未图示的针管投入处理液。密封橡皮62与设成沿上下方向贯通上容器32地设置的筒状部64气密且液密地连接，构成了第1气圧调节部60。密封橡皮62安装成填埋在贯通盖体主体51以及橡皮层56的圆形的孔中。并且通过使针状部材66（参照图5（c）等）而使收集室20内的气体与外气流通，通过拔出该针状部材66，能够借助弹性体的复原力阻断收集室20内的气体与外气。另外，密封橡皮62不仅通过针状部材66的插拔而能够流通、阻断，也能够通过与针状部材66相连的阀68的开闭等而流通、阻断。第2气圧调节部70是用具有气体透过性和液体不透过性的材料封住贯通盖体主体51以及橡皮层56的圆形的孔中的气压调节部，平时气体能够流通。这样一来，由于平时组织保持室30内的气体与外气能够流通，所以组织保持室30内的气圧平时与外气相同。在此，作为气体透过性且液体不透过性的材料没有特别限制，但列举出聚四氟乙烯等氟树脂或硅树脂等，这些既可以是实心体，也可以形成有微细孔（例如直径为数μm～数十μm的孔）。

接着，对使用第1实施方式的细胞分离容器，从组织片中分离出细胞，制作出细胞悬浊液的具体的方法进行说明。图4是表示细胞分离悬浊处理中的操作内容的流程图。另外，该处理以将下容器22与上容器32一体化，未安装盖体50的状态开始的。

在细胞分离悬浊处理中，首先从开口34向细胞分离容器10的组织保持室30投入组织片（步骤S100）。另外，通过在组织片投入后向组织保持室30投入输送液，本细胞分离容器也能够作为输送容器使用。在这种情况下，由于通过在安装了盖体50后从投入口52投入输送液，输送液成为盖而收集室20成为密闭状态，所以借助上述的来自下方的支撑力，输送液与组织片一同保持在组织保持室30中。如果在该状态下进行输送，则能够将组织片以浸渍在输送液中的状态向组织保持部30输送。这样，在作为输送容器利用的情况下，能够在输送后原封不动地使用本细胞分离容器进行细胞分离悬浊处理。作为输送液，根据成为输送对象的组织片适当决定即可，但例如列举出磷酸缓冲液（PBS）、林格氏液、培养基等。

图5是表示投入组织片和输送液并排出输送液的样子的示意图。图5（a）表示投入了组织片的样子，图5（b）表示排出输送液前的样子。在图5（b）中，第1气圧调节部60为阻断状态，第2气圧调节部70为流通状态。因此，连接了第1气圧调节部60的收集室20因输送液成为盖而成为密闭状态，因此借助上述的来自下方的支撑力，投入的组织片和输送液不会向收集室20侧排出而保持在组织保持室30中。

然后，如图5（c）所示，由于若使针状部材66贯通第1气圧调节部60的密封橡皮62，则收集室20内与外气流通，所以收集室20内的气体能够向外部流出。这样一来，上述来自下方的支撑力弱，保持在组织保持室30中的输送液因重力而向收集室20侧排出。另外，由于此时组织片比过滤器40的孔隙尺寸大，所以不会通过滤器40而是保持在组织保持室30中。然后，将未图示的抽吸器连接在针状部材66上，吸引收集室20内的输送液并排出（参照图5（d））。另外，各操作既可以是一边将细胞分离容器10适当倾斜一边进行，也可以如图5（c）及图5（d）所示，各操作是用固定器80将细胞分离容器10固定后进行。这一点在以下的操作中也同样。

接着，对保持在组织保持室30中的组织片进行消毒（步骤S110）。图6是表示对组织片进行消毒的样子的示意图。另外，在用别的容器进行组织片的输送的情况下，能够在组织片投入（步骤S100、图5（a））后立即实施本工序。作为消毒液，只要是鉴于相对于组织片的消毒效果或对细胞的影响等决定即可，但例如列举出酒精、聚乙烯吡咯酮碘溶液等。在进行消毒之际，首先关闭与针状部材66相连的阀68，然后使放入了消毒液的针管90A的针头贯通投入口52，向组织保持室30内投入消毒液（参照图6（a））。此时，第1气圧调节部60因与针状部材66相连的阀68是关闭的而成为阻断状态，第2气圧调节部70为流通状态。因此，连接了第1气圧调节部60的收集室20内因消毒液成为盖而成为密闭状态，借助上述来自下方的支撑力，消毒液不会向收集室20侧排出，而是保持在组织保持室30中。然后，由于若打开与针状部材66相连的阀68，则收集室20内的气体与外气流通，所以收集室20内的气体能够向外部流出。这样一来，上述来自下方的支撑力弱，如图6（b）所示，保持在组织保持室30中的消毒液向收集室20侧排出。另外，此时由于组织片比过滤器40的孔隙尺寸大，所以不会通过过滤器40而是保持在组织保持室30中。然后，将未图示的抽吸器连接在针状部材66上，吸引收集室20内的消毒液并排出（参照图6（c））。

接着，对保持在组织保持室30中的组织片进行清洗（步骤S120）。作为清洗液，只要是鉴于清洗效果或对细胞的影响等决定即可，但例如列举出磷酸缓冲液（PBS）、林格氏液、生理食盐液等。清洗次数可任意设定，但例如优选进行两次左右。另外，关于取代消毒液而使用清洗液这一点以外的具体的操作，由于与步骤S110同样而省略其说明，在进行多此的情况下，只要同样地重复进行即可。

接着，为了将细胞从保持在组织保持室30中的组织片中分离，使用酶溶液进行酶处理（步骤S130）。图7是表示酶处理的样子的示意图。作为酶溶液，只要是与成为对象的组织片相对应地决定即可。例如，只要组织片为皮肤组织，则能够列举出结晶胰蛋白酶溶液，如果组织片为软骨组织，则能够列举出胶原酶溶液等。在进行酶处理之际，关闭与针状部材66相连的阀68，然后使加入了酶溶液的针管90B的针头贯通投入口52，向组织保持室30内投入酶溶液（参照图7（a））。即使在这种情况下，也与消毒液时同样，酶溶液不会向收集室20侧排出而是保持在组织保持室30中。

通过以该状态静置规定时间（例如1小时或3小时等），在组织保持室30中进行酶反应，能够将细胞从组织片中分离。另外，也可以将针状部材66从第1气圧调节部60上拔下，将细胞分离容器10从固定器80上拆除，如图7（b）所示，通过旋回振荡促进酶溶液进行的酶反应。该旋回振荡只要是与组织片或酶溶液相对应地适当设定即可，但例如使用恒温振荡机，在180rpm、1小时，60rpm、3小时等的条件下进行。此时，由于第1气圧调节部60因针状部材66被拔出而成为阻断状态，第2气圧调节部70为流通状态，所以连接了第1气圧调节部60的收集室20的气体为密闭状态。由于只要是至少过滤器面不暴露在组织保持室30的气体中，则即使振荡也维持收集室20的密闭状态，所以酶溶液不会向收集室20侧排出而是保持在组织保持室30中。而且，根据处理液的表面张力与过滤器的孔隙尺寸的关系，即使过滤器面瞬间暴露在组织保持室30的气体中，也能够维持效果，在更剧烈的振荡条件下也能够使用。

然后，如图7（c）所示，在将细胞分离容器10固定在固定器80上，使针状部材66贯通第1气圧调节部60的密封橡皮62（在通过静置进行了酶处理的情况下打开与针状部材66相连的阀68）。即使在这种情况下，也与消毒液时同样，保持在组织保持室30中的酶溶液向收集室20侧排出。在该排出的酶溶液中含有通过酶处理而从组织片中分离出的小于过滤器40的孔隙尺寸的细胞，大于过滤器40的孔隙尺寸的组织片的残渣等不会通过过滤器40而是原样保持在组织保持室30中。

酶处理只要是变更酶溶液或者重复进行等与细胞从组织片中分离的状况相对应地设定即可。

接着，进行向排出到收集室20侧的细胞中添加培养基而制作出细胞悬浊液的悬浊处理（步骤S140）。图8是表示细胞悬浊处理的样子的示意图。在进行细胞悬浊处理之际，首先保持关闭了与针状部材66相连的阀68的状态，使加入了培养基的针管90C的针头贯通投入口52，向组织保持室30内投入培养基（参照图8（a））。在此使用的培养基的种类可根据分离出的细胞的种类或有无酶反应的停止等适当设定即可，但例如优选是含有FBS的DMEM等。在这种情况下，也与消毒液时同样，培养基不会向收集室20侧排出而是保持在组织保持室30中。然后，若打开与针状部材66相连的阀68，则收集室20内的气体能够向外部流出。这样一来，上述来自下方的支撑力弱，随之如图8（b）所示，保持在组织保持室30中的培养基向收集室20侧排出。另外，此时由于组织片的残渣比过滤器40的孔隙尺寸大，所以不会通过过滤器40而是保持在组织保持室30中，残留在残渣中等的细胞与培养基一同向收集室20侧排出。然后，在将针状部材66从第1气圧调节部60上拔出，将细胞分离容器10从固定器80上拆下，将下容器22和上容器32与盖体50分离后，如图8（c）所示，将盖体50安装在下容器22的开口24上。并且将减小了的细胞分离容器10放置在离心分离器上，使细胞颗粒凝集在下容器22下部，与处理液（在这种情况下是酶溶液与培养基的混合液）分离。该离心分离例如以1500rpm进行大约5分钟。另外，也可以不使下容器22与上容器32分离地进行离心分离。然后，如图8（d）所示，将细胞分离容器10固定在固定器80上，使针状部材66贯通密封橡皮62，将针状部材66连接在未图示的抽吸器上，注意不吸引细胞颗粒而吸引处理液。然后，使加入了培养基的针管90C的针头贯通投入口52，向收集室20内投入培养基（参照图8（e））。之后，通过振荡容器，经由针状部材66进行吸排而进行移液操作等，制作出细胞悬浊液。而且，在制作出细胞悬浊后，也可以根据需要重复进行图8（c）～图8（e）的处理。另外，在制作出细胞悬浊液之际，也可以包含对细胞数进行计数，将规定量的细胞包含在规定量的悬浊液中的工序。另外，在用于说明的图5～图8中，容器内的针状部材66、各种处理液、组织片、组织片的残渣以及细胞应以虚线表示，但为了方便而用实线表示。

根据以上所说明的第1实施方式的细胞分离容器10，由于在用处理液对组织片进行处理时，通过阻断收集室20的气体与外气，防止气体的流入流出，维持了上述来自下方的支撑力，处理液保持在组织保持室30中，所以能够在组织保持室30内进行处理。另一方面，由于在处理液的处理结束后，通过使收集室20的气体与外部连通，使气体能够流入流出，上述来自下方的支撑力弱，处理液向收集室排出，所以能够将处理液从保持在组织保持室30中的组织片上分离而排出。这样，能够简便且高效率地进行用处理液对组织片进行处理、从组织片中分离出细胞这一系列的操作。而且，由于在组织保持室30内完成处理液进行的处理，所以无需用处理液充满细胞分离容器10的整体，能够减少处理使用的处理液的量。而且，由于具备能够将收集室20内的气体与外气流通、阻断地构成的第1气圧调节部60，和平时使组织保持室30内的气体与外气能够流通地构成的第2气圧调节部70，所以能够以简易的结构容易地对收集室20与组织保持室30的气体的流入流出进行调节。而且，由于第1气圧调节部60也具有作为排出收集室20内的处理液及细胞的排出口的功能，所以能够为无需另外设置排出口的简单的构造。而且，细胞分离容器10具备上部具有开口24的下容器22，上部具有开口34、底部具备过滤器40、下方与下容器22相连的上容器32，以及能够安装在上容器32的开口34上的盖体50，下容器22具有能够安装盖体50的构造。因此，在细胞的分离结束后，通过拆下上容器32，将盖体20直接安装在下容器22上，能够在从分离出的细胞制作出悬浊液或者进行保管之际紧凑。

［第2实施方式］

图9是第2实施方式的细胞分离容器310的立体图，图10是装配前的细胞分离容器310的立体图。

细胞分离容器310如图9所示，由过滤器340区分成收集室320和组织保持室330。该细胞分离容器310具备对收集室320的气体的流入流出进行调节的第1气圧调节部360，和对组织保持室330的气体的流入流出进行调节的第2气圧调节部370，这样一来，能够对收集室320以及组织保持室330的外气与气体的流入流出进行调节。该细胞分离容器310如图10所示，具备外容器322，组装在外容器322的内部上方的内容器33，以及能够安装在组装了内容器332的状态的外容器322上的盖体350。在这种情况下，被外容器322和盖体350包围，内容器332的外侧的区域为收集室320，被内容器332和盖体350包围的区域为组织保持室330。

由于能够使外容器322为与上述的下容器22同样的容器，所以在此省略其说明。

内容器332为筒状，具备筒状部364，该筒状部364设成上部具有开口334，上端设有凸缘335，底部338设有过滤器340，进而沿上下方向贯通内容器332。另外，由于能够使过滤器340为与上述的过滤器40同样的过滤器，所以在此省略其说明。若内容器332装入外容器322，则凸缘335卡止在外容器322的上端面325上。这样一来，内容器332以与外容器322的底部328保持了一定的距离的状态组装在外容器322的内部上方。在此，在外容器322的上端面325与内容器332的凸缘335之间夹有O型环380，能够防止液体或气体从该部分漏出。该O型环380例如优选橡胶硬度为40～50的程度。作为O型环380的材质，例如列举出硅橡胶等。

盖体350具备盖体主体351和橡皮层356。该盖体主体351在内周侧具有未图示的凹螺纹部。通过该凹螺纹部与外容器322的凸螺纹部326旋合，盖体350与外容器322连接在一起。在盖体主体351上设有贯通孔354、362、372。而且，盖体主体351与橡皮层356紧密贴合。并且贯通孔354和橡皮层356构成投入口352，贯通孔362和橡皮层356与筒状部364构成第1气圧调节部360，贯通孔372和橡皮层356构成第2气圧调节部370。此时，作为投入口352的一部分的橡皮层356能够通过未图示的针管投入处理液。而且，作为第1气圧调节部360的一部分的橡皮层356通过使针状部材贯通而使收集室320内的气体与外气流通，通过拔出该针状部材，能够借助橡皮的复原力进行阻断。而且，作为第2气圧调节部370的一部分的橡皮层356通过使针状部材贯通而使组织保持室330内的气体与外气流通，通过拔出该针状部材，能够借助橡皮的复原力进行阻断。在此，橡皮层356与盖体主体351的接触面为橡胶硬度（以JIS K 6253的A型硬度计硬度为基准，以下也相同）高的材料（例如橡胶硬度为70～90），橡皮层356与外容器322和/或内容器332的接触面为橡胶硬度低的材料（例如橡胶硬度为20～50）。另外，橡皮层356的材质优选能够容易地使针状部材或针管的针头等贯通的材质，例如以硅橡胶等为宜。

由于使用第2实施方式的细胞分离容器从组织片中分离出细胞而制作出细胞悬浊液的方法能够以第1实施方式为基准进行，所以在此省略其记载。

根据以上所说明的第2实施方式的细胞分离容器310，由于在用处理液对组织片进行处理时，阻断收集室320的气体与外气，防止气体的流入流出，维持了上述来自下方的支撑力，处理液保持在组织保持室330中，所以能够在组织保持室330内进行处理。另一方面，由于在处理液的处理结束后，将针状部件等刺入第2气圧调节部370，使组织保持室330的气体的流入流出自由，同时使收集室320的气体与外部连通，使气体能够流入流出，上述来自下方的支撑力弱，处理液向收集室320排出，所以能够将处理液从保持在组织保持室330中的组织片上分离并排出。这样，能够简便、高效率地进行用处理液对组织片进行处理，从组织片中分离细胞这一系列的操作。而且，由于在组织保持室330内完成处理液进行的处理，所以无需用处理液充满细胞分离容器310的整体，能够减少处理使用的处理液的量。而且，由于具备能够使收集室320内的气体与外气流通、阻断地构成的第1气圧调节部360，和能够使组织保持室330内的气体与外气流通、阻断地构成的第2气圧调节部370，所以能够以简单的结构容易地对收集室320和组织保持室330的气体的流入流出进行调节。而且，由于第1气圧调节部360也具有作为排出收集室320内的处理液及细胞的排出口的功能，所以能够为无需另外设置排出口的简单的构造。而且，在该细胞分离容器310中，外容器322及盖体350容易适用市售的离心管等，通用性高。而且，橡皮层356作为投入口352或第1、第2气圧调节部360、370的一部分发挥功能。因此，无需分别准备第1实施方式中使用的投入口52的弹性体、第1气圧调节部60的密封橡皮62、具有第2气圧调节部70的气体透过性和液体不透过性的材料等。而且，橡皮层356的与盖体主体351的接触面的橡胶硬度比与外容器322和／或内容器332的接触面的橡胶硬度高。这样，在橡皮层356与盖体主体351之间不容易产生摩擦，橡皮层356与外容器322及内容器332容易紧密贴合。因此，在将盖体350安装在外容器322上之际，由于橡皮层356不容易扭转，所以盖不容易反扭转，能够进一步提高外容器322或内容器332的气密性。

［其它实施方式］

另外，本发明并不仅限于上述的实施方式，毋庸置疑，只要属于本发明的技术范围，也能够以各种方式实施。

例如，在上述的第1实施方式中，第1气圧调节部60是由设在盖体50上的密封橡皮62和贯通上容器32地设置的筒状部64构成的，但也可以设在下容器22的侧壁等上。将这种方式（变形例）示于图11。另外，由于图11所示的细胞分离容器110除了第1气圧调节部160设在下容器22的侧壁上之外与图1所示的细胞分离容器10相同，所以赋予相同的附图标记而省略详细的说明。

在上述的第1实施方式中，作为第1气圧调节部60的一部分的密封橡皮62由弹性体构成，能够通过使针状部材66贯通而使收集室20内的气体与外气流通，通过拔出该针状部材66而借助弹性体的复原力进行阻断，但并不仅限于此，例如既可以设有能够开闭的盖，也可以设有能够开闭的阀，还可以由鲁尔锁定方式的连接器形状或管接头形状构成。第2实施方式也同样。另外，除了第1实施方式的密封橡皮62及第2实施方式的橡皮层356之外，在此所示的能够开闭的盖或能够开闭的阀相当于本发明的密封部。

在上述的第1实施方式中，第2气圧调节部70由具有气体透过性和液体不透过性的材料构成，平时气体能够流通，但并不仅限于此，例如，为了在输送时等阻断气体的流通，既可以由密封橡皮62那样的弹性体构成，也可以设有能够开闭的盖，还可以设有能够开闭的阀，以鲁尔锁定方式的连接器形状或管接头形状构成也可以。第2实施方式也同样。

在上述的第1以及第2实施方式中，在收集室20、320以及组织保持室30、330的双方设有气圧调节部，也也可以仅设在某一方。例如，如果在收集室20、320上作为气压调节部设置真空泵等减圧装置，则在不起动减圧装置的情况下，处理液保持在组织保持室30、330内，若起动减圧装置，使收集室20、320的气圧低于组织保持室30、330，则处理液能够从组织保持室30、330向收集室20、320排出。这样一来，则无需在组织保持室30、330上设置气圧调节部。而且，如果例如在组织保持室30、330上作为气压调节部设置加圧储气瓶等加圧装置，则在不起动加圧装置的情况下，处理液保持在组织保持室30、330内，若起动加圧装置，使组织保持室30、330的气圧高于收集室20、320的气圧，则处理液从组织保持室30、330向收集室20、320排出。这样一来，无需在收集室20、320上设置气圧调节部。另外，即使将气圧调节部设在收集室20、320以及组织保持室30、330双方上的情况下，也可以适当地采用减圧装置或加圧装置作为气圧调节部。

在上述的第1实施方式中，上容器32是筒状的部分与过滤器40一体形成，但并不仅限于此，例如是上容器32具备上部以及下部具有开口，下方与下容器相连的外框体，和能够装卸地组装在外框体的内侧、具备过滤器的组装体的结构。这样一来，通过改变外框体与组装体的组合，能够适于所希望的操作。在这种情况下，例如可构成为具备筒状的外框体，和有底筒状、底部热熔敷有过滤器的组装体，外框体的内周与组装体的外周气密且液密地紧密贴合。而且，也可以构成为具备在下端侧具备能够固定过滤器的衬垫的筒状体的外框体，和过滤器本身的组装体，通过使组装体与外框体衬垫紧密贴合地组装，两者气密且液密地紧密贴合。而且，在第2实施方式中，内容器332是筒状的部分与过滤器340一体形成，但并不仅限于此。例如，内容器332可构成为具备在下端侧具备能够固定过滤器的衬垫的筒状的外框体，和过滤器本身的组装体，通过使组装体与外框体的衬垫紧密贴合地组装。

在上述的第1实施方式中，投入口52为了能够通过未图示的针管投入处理液而由填埋在贯通盖体主体51以及贯通橡皮层56的圆形的孔中的弹性体构成，但并不仅限于此。例如，既可以具备能够开闭的盖，也可以由鲁尔锁定方式的连接器形状或管接头形状构成。第2实施方式也同样。

在上述的第1实施方式中，细胞分离容器10具备下容器22，上容器32和盖体50，但并不仅限于此。例如也可以如图12所示，具备上部具有开口的外容器222，设在外容器222的内部上方、上部具有开口、下方具备过滤器40的内容器232，以及能够安装在外容器222和内容器232双方上的盖体250，被外容器222的盖体250包围、内容器232的外侧的区域为收集室220，被内容器232和盖体250包围的区域为组织保持室230。在这种情况下，能够在盖体250和内容器232上设有能够旋合的螺纹部。另外，关于过滤器40、投入口52、第2气圧调节部70，由于与图1所示的细胞分离容器10同样，所以省略其说明。在该细胞分离容器210中，设在盖体250上的第1气圧调节部260由弹性体构成，能够通过使针状部材66贯通而使收集室220内的气体与外气流通，通过拔出该针状部材66而借助弹性体的复原力进行阻断。另外，该第1气圧调节部260也可以设在外容器222的侧壁部等上。

在上述的第1实施方式中，贯通第1气圧调节部60的密封橡皮62的针状部材66与抽吸器相连，吸引收集室20的处理液及细胞并排出，但并不仅限于此。例如，也可以在收集室20上另外设置能够开闭的排出口。而且，还可以如图13所示，设置从筒状部64连续到下容器22的底部28吸引管65，将抽吸器等直接与第1气圧调节部60相连，吸引收集室20的处理液及细胞并排出。这样一来，由于能够省略将针状部材66插入到下容器22的底部28的操作等，所以能够适于自动化等。第2实施方式也同样，既可以在收集室320上另外设置用于吸引收集室320的处理液及细胞并排出的排出口，也可以设置从筒状部364连续到外容器322的底部328的吸引管。

在上述的第1实施方式中使用了盖体50，但也可以取代该盖体而使用第2实施方式的盖体350那样构成的盖体。另一方面，在上述的第2实施方式中使用了盖体350，但可以取代该盖体而使用第1实施方式的盖体50那样构成的盖体。

在上述的第2实施方式中使用的O型环380，但只要是能够确保必要的气密性以及液密性，则也可以不使用这样的O型环。而且，在上述的第2实施方式中，内容器332具备沿上下方向贯通内容器332地设置的筒状部364，但并不仅限于此。例如，内容器332也可以在内容器332的侧壁具备上下方向延伸的槽状部。

本申请将2012年1月4日提出的日本国专利申请第2012－000138号作为要求优先权的基础，通过引用，其全部内容包含在本说明书中。

本发明能够利用于在生物体外（in vitro）培养细胞的细胞培养技术中。

Claims (13)

1.一种细胞分离容器，使用处理液将细胞从组织片中分离，其特征在于，具备：

收集室，收集前述处理液以及前述细胞中的至少一种；

组织保持室，设在前述收集室的上方，具备用于投入前述处理液的投入口；

过滤器，作为区分出前述收集室和前述组织保持室的结构的全部或者一部分地设置，能够保持前述组织片，并且前述细胞能够通过；

气压调节机构，通过对前述收集室和前述组织保持室的各气体的流入流出进行调节，能够将投入到前述组织保持室中的处理液切换成不通过前述过滤器而保持在前述组织保持室中，或者通过前述过滤器而向前述收集室排出。

2.如权利要求1所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述气圧调节机构具备：第1气圧调节部，设在前述收集室上，对前述收集室内的气体的流入流出进行调节；第2气圧调节部，设在前述组织保持室上，对前述组织保持室内的气体的流入流出进行调节。

3.如权利要求2所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述第1气圧调节部构成为能够使前述收集室内的气体与外气流通、阻断，前述第2气圧调节部构成为平时能够使前述组织保持室内的气体与外气流通。

4.如权利要求1～3中任一项所述的细胞分离容器，其特征在于，

具备：下容器，上部具有开口；上容器，上部具有开口，底部具备前述过滤器，下方与前述下容器相连；以及盖体，能够安装在前述上容器的开口上；

被前述下容器和前述上容器的前述底部包围的区域为前述收集室，被前述上容器和前述盖体包围的区域为前述组织保持室。

5.如权利要求4所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述上容器具备：外框体，上部以及下部具有开口，下方与前述下容器相连；组装体，能够装卸地组装在前述外框体的内侧，具备前述过滤器。

6.如权利要求4或5所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述下容器具有能够安装前述盖体的构造。

7.如权利要求4～6中任一项所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述第1气圧调节部具备：设在前述盖体上的密封部，和与该密封部相连并沿上下方向贯通前述上容器的筒状部。

8.如权利要求7所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述第1气圧调节部具备从前述筒状部连续到前述下容器的底部的吸引管。

9.如权利要求4～8中任一项所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述盖体具备：能够通过螺纹在前述上容器上安装、拆下的盖体主体，和装配在该盖体主体的内侧的橡皮层，该橡皮层的与前述盖体主体的接触面的橡胶硬度比与前述上容器的接触面的橡胶硬度高。

10.如权利要求1～3中任一项所述的细胞分离容器，其特征在于，

具备：外容器，上部具有开口；内容器，组装在前述外容器的内部上方，上部具有开口，底部具备前述过滤器；以及盖体，能够安装在组装了前述内容器的状态的前述外容器上；

被前述外容器和前述盖体包围，前述内容器的外侧的区域为前述收集室，被前述内容器和前述盖体包围的区域为前述组织保持室。

11.如权利要求10所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述第1气圧调节部具备：设在前述盖体上的密封部，和与该密封部相连并沿上下方向贯通前述内容器的筒状部。

12.如权利要求11所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述第1气圧调节部具备从前述筒状部连续到前述外容器的底部的吸引管。

13.如权利要求10～12中任一项所述的细胞分离容器，其特征在于，

前述盖体具备：能够通过螺纹在前述外容器上安装、拆下的盖体主体，和装配在该盖体主体的内侧的橡皮层，该橡皮层的与前述盖体主体的接触面的橡胶硬度比与前述外容器和/或前述内容器的接触面的橡胶硬度高。