JP6164612B2 - 細胞分離容器 - Google Patents

Description

本発明は、細胞分離容器に関する。

近年、生体外(in vitro)で細胞を培養し、培養した細胞を治療のために患者に投与したり、医薬品等の毒性試験に利用したり、と細胞培養技術が種々の領域で利用されるようになってきている。このような細胞培養技術は古くから行われているが、その工程のほとんどは人手によるマニュアル操作であって、作業者の負担が大きく、操作を簡素化したり自動化したりすることが望まれている。特に、細胞培養の初期工程である生体組織から細胞を分離する工程では、患者又はドナーから採取した生体組織を洗浄・消毒したり、酵素を含む液体で処理して生体組織から細胞を分離したり、といった多数の操作が必要であり、作業者に大きな負担を与えている。

そこで、例えば特許文献１では、少なくとも一部に細胞が通過可能な大きさの複数の細胞通過孔を有し生体組織を保持可能な組織保持部と、組織保持部を囲むように構成され組織保持部に保持された生体組織を浸漬する分散剤含有液を貯留可能な液体貯留部と、液体貯留部に貯留される分散剤含有液の作用により生体組織から分離した細胞を組織保持部の細胞通過孔から組織保持部の外側へ通過させるような水流を分散剤含有液に発生させる水流発生部とを備えた細胞分散装置が提案されている。この細胞分散装置では、生体組織から細胞を分離・分散させる際のマニュアル操作を代行してくれるため、分散剤によって生体組織から細胞を分離・分散する処理を簡易に行うことができる。

特許第４５２０８５５号公報

しかしながら、上述の装置では、細胞分散処理が行われる組織保持部だけでなく、液体貯留部までも十分な量の分散剤含有液を貯留して処理する必要があるために液量が多く必要であるなど、効率的でない面があった。

本発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、組織片を処理液で処理して細胞を分離する一連の操作を簡便に効率よく行うことができる細胞分離容器を提供することを主目的とする。また、マニュアル操作であっても容易に細胞分離処理ができる構造とすることを目的とする。

本発明の細胞分離容器は、上述の主目的を達成するために以下の手段を採った。

すなわち、本発明の細胞分離容器は、
処理液を用いて組織片から細胞を分離させる細胞分離容器において、
前記処理液及び前記細胞のうち少なくとも一方を収集する収集室と、
前記処理液を投入するための投入口を備え、前記収集室の上方に設けられた組織保持室と、
前記収集室と前記組織保持室とを区画する構成の全部又は一部として設けられ、前記組織片を保持可能かつ前記細胞が通過可能なフィルタと、
前記収集室と前記組織保持室の各気体の流入出を調節することで、前記組織保持室に投入した処理液を、前記フィルタを通過させることなく前記組織保持室に保持させるか、前記フィルタを通過させて前記収集室へ排出させるかを切替可能な気圧調節機構と、
を備えたものである。

この細胞分離容器では、収集室と組織保持室の各気体の流入出を調節することにより、組織保持室内で組織片を処理するときには組織保持室に処理液が保持されるように制御できるだけでなく、処理液での処理が終了したときには組織保持室に組織片や残渣を保持した状態で容易に処理液及び細胞を収集室に排出できる。このように、組織片を処理液で処理し、処理後の処理液を排出するという一連の操作を簡便に、必要最小限の液量で効率よく行うことができる。

ここで、組織片としては、生体組織から採取可能な上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などが好ましく、具体的には、皮膚（表皮、真皮）、軟骨、角膜、網膜、骨膜、骨、神経、筋肉、粘膜、歯周組織、血管、脂肪または心臓、肝臓、すい臓、腎臓もしくは膀胱などの組織や臓器の一部が挙げられる。また、細胞を培養して得られる細胞シートや細胞塊（スフェロイド）又は足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）に細胞を播種した培養組織などの単一種又は複数種の細胞で構成される細胞集団も、本発明の組織片として利用することができる。

また、処理液としては、組織片を輸送するのに用いられる輸送液や、組織片を消毒するのに用いられる消毒液、組織片を洗浄するのに用いられる洗浄液、組織片から細胞を分離するのに用いられる酵素溶液のほか、培地などが挙げられる。輸送液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、リンゲル液、培地などが挙げられる。洗浄液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、リンゲル液、生理食塩液などが挙げられる。消毒液としては、アルコール、ポビドンヨード溶液などが挙げられる。酵素溶液としては、トリプシンやディスパーゼ、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼなどの各種プロテアーゼ、各種ペプチダーゼ、各種糖分解酵素などが挙げられる。培地としては、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、α−ＭＥＭ、無血清培地などの各種液体培地が挙げられ、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）などの血清、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生剤、成長因子、アスコルビン酸などの各種添加物質が添加されていてもよい。

本発明の細胞分離容器において、前記気圧調節機構は、前記収集室に設けられ前記収集室内の気体の流入出を調節する第１気圧調節部と、前記組織保持室に設けられ前記組織保持室内の気体の流入出を調節する第２気圧調節部と、を備えているものとしてもよい。こうすれば、収集室内の気圧と組織保持室内の気圧とを個別に調節できるため、気圧の調節が容易である。

こうした細胞分離容器において、前記第１気圧調節部は、前記収集室内の気体と外気とを流通・遮断可能に構成されており、前記第２気圧調節部は、常時前記組織保持室内の気体と外気とを流通可能に構成されているものとしてもよい。このようにしても、収集室と組織保持室における処理液の保持および排出を制御することができる。具体的には、第１気圧調節部によって収集室内の気体と外気とを遮断すれば、組織保持室に投入された処理液が蓋となって収集室は密閉状態となり、収集室の気体は体積変化を伴うことなく収集室内に維持される。このとき、処理液には、重力と組織保持室内の気体の気圧による下向きの力と釣り合うような、表面張力と収集室内の気体の気圧による上向きの力（以下では下方からの支持力とも称する）が働く。このような気圧平衡の作用により、処理液を組織保持室内に保持することができる。なお、処理液が蓋の役割を果たすためには、処理液の表面張力とフィルタのポアサイズ（孔径）の関係が、収集室内の気体の気圧下においてフィルタ孔を介して気体が容易に移動できないような設定にすればよいが、組織片を保持可能かつ細胞が通過可能なポアサイズであれば十分な効果が期待できる。このような状態にあれば、組織保持室の気体が外気と流通していても密閉されていても収集室内の気体が組織保持室側に移動することがないため、下方からの支持力は維持され、処理液を組織保持部に保持することができる。次いで、第１気圧調節部によって収集室内の気体と外気とを流通すれば、収集室内の気体は外部に流出することが可能となるため、下方からの支持力が弱まり、処理液は重力にしたがって収集室に排出される。このように、第１気圧調節部を遮断状態とすれば、収集室の気圧による力で処理液を組織保持室に保持することができ、第１気圧調節部を流通状態とすれば、処理液を容易に収集室に排出させることができる。なお、第１気圧調節部により積極的に収集室内の気体を吸引してやること等によって収集室内の気圧を組織保持部の気圧よりも低くしてやれば、さらに効率的に処理液を排出できる。この場合、ポアサイズが小さく、処理液が排出されにくいような状況では、より効果的である。また、前述の構成とは逆に、前記第１気圧調節部を常時前記収集室内の気体と外気とを流通可能にし、前記第２気圧調節部を前記組織保持室内の気体と外気とを流通・遮断可能に構成しても同様の効果が期待される。

本発明の細胞分離容器は、上部に開口を有する下容器と、上部に開口を有し底部に前記フィルタを備え下方で前記下容器と接続される上容器と、前記上容器の開口に取付け可能な蓋体と、を備え、前記下容器と前記上容器の前記底部とで囲まれた領域が前記収集室であり、前記上容器と前記蓋体とで囲まれた領域が前記組織保持室であるものとしてもよい。こうした細胞分離容器において、前記上容器は、上部及び下部に開口を有し下方で前記下容器と接続される外枠体と、前記外枠体の内側に着脱可能に組み込まれ前記フィルタを備えた組込体と、を備えているものとしてもよいし、一体として形成されているものとしてもよい。外枠体と組込体とを備えたものとすれば、外枠体と組込体との組み合わせを変えることによって所望の操作に適したものとすることができるし、一体として形成されているものとすれば、部品点数が少ないため取扱いが容易である。また、こうした細胞分離容器において、前記下容器は、前記蓋体を取付け可能な構造を有しているものとしてもよい。こうすれば、細胞の分離が終了したあと上容器を取り外して下容器に直接蓋体を取付けてその後の操作や保管をコンパクトに行うことができる。また、下容器、上容器、フィルタを一体的に形成してもよい。

また、下容器と上容器と蓋体とを備えた態様の細胞分離容器において、前記第１気圧調節部は、前記蓋体に設けられた封止部と、該封止部に接続し前記上容器を上下方向に貫通する筒状部とを備えているものとしてもよい。こうすれば、気圧の調節操作を蓋体に設けた封止部で行うことができるため、操作が容易となる。こうした態様の細胞分離容器において、前記第１気圧調節部は前記筒状部から連続し、前記下容器の底部に達する吸引管を備えていてもよい。こうすれば、収集室に収集された処理液や細胞を排出する際に吸引具を下容器の底部に達するまで挿入する操作などを省略できるため操作が容易となり、また、自動化に適したものとすることができる。

また、下容器と上容器と蓋体とを備えた態様の細胞分離容器において、前記蓋体は、前記上容器にねじによって取り付け・取り外しが可能な蓋体本体と、該蓋体本体の内側に配設されるラバー層とを備え、該ラバー層は前記蓋体本体との接触面のゴム硬度が前記上容器との接触面のゴム硬度よりも高くなっているものとしてもよい。こうしたものでは、ラバー層と蓋体本体との間には摩擦が生じにくく、ラバー層と上容器とは密着しやすい。このため、蓋体を上容器に取り付ける際にラバー層が捩れにくいので蓋が捩戻りしにくいし、外容器の気密性をより高めることができる。

あるいは、本発明の細胞分離容器は、上部に開口を有する外容器と、前記外容器の内部上方に組み込まれ上部に開口を有し底部に前記フィルタを備えた内容器と、前記内容器が組み込まれた状態の前記外容器に取付け可能な蓋体と、を備え、前記外容器と前記蓋体とで囲まれ前記内容器の外側の領域が前記収集室であり、前記内容器と前記蓋体とで囲まれた領域が前記組織保持室であるものとしてもよい。こうした細胞分離容器では、外容器や蓋体に市販の遠沈管などを適用しやすいため、汎用性が高い。

また、外容器と内容器と蓋体とを備えた態様の細胞分離容器において、前記第１気圧調節部は、前記蓋体に設けられた封止部と、該封止部に接続し前記内容器を上下方向に貫通する筒状部とを備えているものとしてもよい。こうすれば、気圧の調節操作を蓋体に設けた封止部で行うことができるため、操作が容易となる。こうした態様の細胞分離容器において、前記第１気圧調節部は前記筒状部から連続し、前記外容器の底部に達する吸引管を備えていてもよい。こうすれば、収集室に収集された処理液や細胞を排出する際に吸引具を外容器の底部に達するまで挿入する操作などを省略できるため操作が容易となり、また、自動化に適したものとすることができる。

また、外容器と内容器と蓋体とを備えた態様の細胞分離容器において、前記蓋体は、前記外容器にねじによって取り付け・取り外しが可能な蓋体本体と、該蓋体本体の内側に配設されるラバー層とを備え、該ラバー層は前記蓋体本体との接触面のゴム硬度が前記外容器及び／又は前記内容器との接触面のゴム硬度よりも高くなっているものとしてもよい。こうしたものでは、ラバー層と蓋体本体との間には摩擦が生じにくく、ラバー層と外容器や内容器とは密着しやすい。このため、蓋体を外容器に取り付ける際にラバー層が捩れにくいので蓋が捩戻りしにくいし、外容器や内容器の気密性をより高めることができる。

第１実施形態の細胞分離容器１０の斜視図である。 組立前の細胞分離容器１０を示す斜視図である。 図２のＡ−Ａ断面の模式図である。 細胞分離懸濁処理における操作内容を示すフローチャートである。 組織片と輸送液の様子を示す模式図である。 組織片を消毒する様子を示す模式図である。 酵素処理の様子を示す模式図である。 細胞懸濁処理の様子を示す模式図である。 第２実施形態の細胞分離容器３１０の斜視図である。 組立前の細胞分離容器３１０を示す斜視図である。 細胞分離容器の変形例である。 細胞分離容器の変形例である。 細胞分離容器の変形例である。

次に、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて説明する。

［第１実施形態］
図１は、第１実施形態の細胞分離容器１０の斜視図、図２は組立前の細胞分離容器１０の斜視図、図３は図２のＡ−Ａ断面の模式図である。

細胞分離容器１０は、図１に示すように、収集室２０と組織保持室３０とがフィルタ４０によって区画されている。この細胞分離容器１０は、収集室２０の気体の流入出を調節する第１気圧調節部６０と、組織保持室３０の気体の流入出を調節する第２気圧調節部７０とを備えており、これらによって収集室２０及び組織保持室３０の外気との気体の流入出を調節することができるように構成されている。この細胞分離容器１０は、図２に示すように、下容器２２と、フィルタ４０を備えた上容器３２と、上容器３２の開口３４に取付け可能な蓋体５０とを備えており、下容器２２と上容器３２の底部３８とで囲まれた領域が収集室２０、上容器３２と蓋体５０とで囲まれた領域が組織保持室３０となる。

下容器２２は、有底筒状であり、底部２８は側壁から滑らかに続く曲面になっている。なお、底部２８は、円錐形状で側壁から滑らかに続いているものとしてもよい。こうすれば、細胞分離容器１０を細胞分離後に遠心分離器にかけた場合に底部２８に細胞が集積しやすい（細胞ペレットを形成しやすい）。また、下容器２２は、上部に開口２４を有しており、開口の外周側には雄ねじ部２６が設けられている。

上容器３２は、筒状であり、底部３８には内周側に雌ねじ部３９が設けられている。この雌ねじ部３９と下容器２２の雄ねじ部２６とが螺合されることによって、上容器３２と下容器２２とが接続される。また、上容器３２は、上部に開口３４を有しており、開口の外周側には雄ねじ部３６が設けられている。

フィルタ４０は、上容器３２の底部３８のうち雌ねじ部３９の上方に熱融接されている。このフィルタ４０は、フィルタ材４２とフィルタ材４２を上容器３２に固定するための枠部４４とを備えている。枠部４４は、中央部に設けられた円盤状の部分と、上容器３２の内周に沿って設けられた輪状の部分と、両者を結ぶ８本の梁とによって構成されており、この枠部４４にフィルタ材４２が張り渡されている。なお、枠部４４の形状や形態については適宜設計すればよく、全面をフィルタ材４２で構成してもよいが、前述のような構成とすることで強度を得ることができる。フィルタ材４２は、組織片を保持可能かつ細胞が通過可能であればよいが、メンブランフィルタであることが好ましい。メンブランフィルタの材質としてはナイロン（登録商標）や、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロースなどが挙げられる。フィルタ材４２のポアサイズは、前述したとおり、処理液の表面張力（粘性）などを踏まえて所定の気圧条件下で収集室の気体がフィルタ孔を介して組織保持室に容易に移動できないように適宜設定すればよい。例えば３０μｍ以上１００μｍ以下が望ましく、４０μｍ以上７０μｍ以下が更に好ましい。

蓋体５０は、図３に示すように、内周側に雌ねじ部５４を有している。そして、この雌ねじ部５４と上容器３２の雄ねじ部３６とが螺合されることによって、蓋体５０と上容器３２とが接続される。この雌ねじ部５４は、さらに、下容器２２の雄ねじ部２６とも螺合可能に構成されている。このため、蓋体５０は、上容器３２の開口３４にも下容器２２の開口２４にも取付け可能である。

蓋体５０は、蓋体本体５１と、必要な気密性及び液密性を確保するためのラバー層５６とを備えており、処理液を投入するための投入口５２や、封止ラバー６２、第２気圧調節部７０が設けられている。ここで、投入口５２は、図示しないニードルボトルによって処理液を投入できるように、蓋体本体５１及びラバー層５６を貫通する円形の穴を埋めるエラストマーで構成されている。封止ラバー６２は、上容器３２を上下方向に貫通するように設けられた筒状部６４と気密かつ液密に接続されて、第１気圧調節部６０を構成している。封止ラバー６２は、蓋体本体５１及びラバー層５６を貫通する円形の穴を埋めるように取り付けられている。そして、針状部材６６（図５（ｃ）などを参照）を貫通させることで収集室２０内の気体と外気とを流通させ、この針状部材６６を抜くことでエラストマーの復元力によって収集室２０内の気体と外気とを遮断することができるようになっている。なお、封止ラバー６２は、針状部材６６の抜き差しだけでなく、針状部材６６に接続されたバルブ６８の開閉などによっても流通・遮断することができる。第２気圧調節部７０は、蓋体本体５１及びラバー層５６を貫通する円形の穴を気体透過性と液体不透過性を有する材料で塞いだものであり、常時気体の流通が可能となっている。これにより、組織保持室３０内の気体と外気とが常時流通可能となっているため、組織保持室３０内の気圧は常に外気と同じになる。ここで、気体透過性かつ液体不透過性の材料としては、特に限定されるものではないが、ポリテトラフルオロエチレンなどのフッ素樹脂やシリコン樹脂などが挙げられ、これらは充実体であってもよいが微細孔（例えば数〜数十μｍの径の孔）が形成されていてもよい。

次に、第１実施形態の細胞分離容器を用いて組織片から細胞を分離し細胞懸濁液を作製する具体的な方法について説明する。図４は、細胞分離懸濁処理における操作内容を示すフローチャートである。なお、この処理は、下容器２２と上容器３２とを一体化し、蓋体５０は取付けていない状態で開始するものとする。

細胞分離懸濁処理では、まず、細胞分離容器１０の組織保持室３０に開口３４から組織片を投入する（ステップＳ１００）。なお、組織片投入後に組織保持室３０に輸送液を投入することで本細胞分離容器は輸送容器としても使用できる。この場合、蓋体５０を取付けた後に投入口５２から輸送液を投入することで、輸送液が蓋となって収集室２０は密閉状態となるため、上述した下方からの支持力により、輸送液は組織片とともに組織保持室３０に保持される。この状態で輸送すれば、組織保持部３０に、組織片を輸送液に浸漬した状態で輸送することが可能である。このように輸送容器として利用した場合は、輸送後に本細胞分離容器をそのまま使用して細胞分離懸濁処理を行うことができる。輸送液としては、輸送対象となる組織片によって適宜決定すればよいが、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、リンゲル液、培地などが挙げられる。

図５は組織片と輸送液とを投入し輸送液を排出する様子を示す模式図である。図５（ａ）は組織片を投入した様子を、図５（ｂ）は輸送液を排出する前の様子を示している。図５（ｂ）では、第１気圧調節部６０は遮断状態であり第２気圧調節部７０は流通状態である。このため、第１気圧調節部６０が接続された収集室２０は輸送液が蓋となって密閉状態となるため、上述した下方からの支持力により、投入した組織片と輸送液は、収集室２０側に排出されることなく組織保持室３０に保持される。

続いて、図５（ｃ）に示すように、第１気圧調節部６０の封止ラバー６２に針状部材６６を貫通させると、収集室２０内が外気と流通するため、収集室２０内の気体は外部に流出することが可能となる。これによって、上述した下方からの支持力が弱まり、組織保持室３０に保持されていた輸送液が重力にしたがって収集室２０側に排出される。なお、このとき、組織片はフィルタ４０のポアサイズより大きいため、フィルタ４０を通過することなく組織保持室３０に保持される。続いて、針状部材６６に図示しないアスピレーターを接続して、収集室２０内の輸送液を吸引して排出する（図５（ｄ）参照）。なお、各操作は、細胞分離容器１０を適宜傾けながら行ってもよいし、図５（ｃ）や図５（ｄ）に示すように、各操作は、ホルダ８０で細胞分離容器１０を固定して行ってもよい。この点は、以下の操作でも同様である。

次に、組織保持室３０に保持された組織片を消毒する（ステップＳ１１０）。図６は、組織片を消毒する様子を示す模式図である。なお、組織片の輸送を別容器で行った場合は、組織片の投入（ステップＳ１００、図５（ａ））後、すぐに本工程を実施できる。消毒液としては、組織片に対する消毒効果や細胞への影響等を鑑みて決定すればよいが、例えば、アルコール、ポビドンヨード溶液などが挙げられる。消毒に際しては、まず、針状部材６６に接続されたバルブ６８を閉じて、続いて、消毒液が入ったニードルボトル９０Ａのニードルを投入口５２に貫通させて組織保持室３０内に消毒液を投入する（図６（ａ）参照）。このとき、第１気圧調節部６０は針状部材６６に接続されたバルブ６８が閉じられていることによって遮断状態となっており、第２気圧調節部７０は流通状態となっている。このため、第１気圧調節部６０が接続された収集室２０内は消毒液が蓋となって密閉状態となり、上述した下方からの支持力によって、消毒液が収集室２０側に排出されることなく、組織保持室３０に保持されている。続いて、針状部材６６に接続されたバルブ６８を開くと、収集室２０内の気体が外気と流通するため、収集室２０内の気体は外部に流出することが可能となる。これによって、上述した下方からの支持力が弱まり、図６（ｂ）に示すように、組織保持室３０に保持されていた消毒液が収集室２０側に排出される。なお、このとき、組織片はフィルタ４０のポアサイズより大きいため、フィルタ４０を通過することなく組織保持室３０に保持される。続いて、針状部材６６に図示しないアスピレーターを接続して、収集室２０内の消毒液を吸引して排出する（図６（ｃ）参照）。

次に、組織保持室３０に保持された組織片を洗浄する（ステップＳ１２０）。洗浄液としては、洗浄効果や細胞への影響等を鑑みて決定すればよいが、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、リンゲル液、生理食塩液などが挙げられる。洗浄回数は任意に設定すればよいが、例えば２回程度行うことが望ましい。なお、消毒液の代わりに洗浄液を用いる点以外の具体的な操作については、ステップＳ１１０と同様のため、説明を省略する。複数回行う場合には、同様に繰返して行えばよい。

次に、組織保持室３０に保持された組織片から細胞を分離するため、酵素溶液を用いて酵素処理を行う（ステップＳ１３０）。図７は、酵素処理の様子を示す模式図である。酵素溶液としては、対象となる組織片に応じて決定すればよい。例えば、組織片が皮膚組織であればトリプシン溶液、組織片が軟骨組織であればコラゲナーゼ溶液などを挙げることができる。酵素処理に際して、針状部材６６に接続されたバルブ６８を閉じ、続いて、酵素溶液が入ったニードルボトル９０Ｂのニードルを投入口５２に貫通させて組織保持室３０内に酵素溶液を投入する（図７（ａ）参照）。この場合も、消毒液のときと同様、酵素溶液は収集室２０側に排出されることなく組織保持室３０に保持される。

この状態で所定時間（例えば、１時間や３時間など）静置することで、組織保持室３０において酵素反応を進行させ、組織片から細胞を分離することができる。なお、針状部材６６を第１気圧調節部６０から抜き、細胞分離容器１０をホルダ８０から取り外して、図７（ｂ）に示すように、旋回振盪により酵素溶液による酵素反応を促進させてもよい。この旋回振盪は組織片や酵素溶液に応じて適宜設定すればよいが、例えば恒温振盪機を使用して１８０ｒｐｍで１時間、６０ｒｐｍで３時間などの条件で行う。このとき、第１気圧調節部６０は、針状部材６６が抜かれていることによって遮断状態となっており、第２気圧調節部７０は流通状態となっているため、第１気圧調節部６０が接続された収集室２０の気体が密閉状態になっている。少なくともフィルタ面が組織保持室３０の気体に暴露されない限り、振盪しても収集室２０の密閉状態は維持されるため、酵素溶液が収集室２０側に排出されることなく、組織保持室３０に保持される。また、処理液の表面張力とフィルタのポアサイズの関係によっては、瞬間的にフィルタ面が組織保持室３０の気体に暴露されても効果を維持することが可能であり、より激しい振盪条件でも使用可能となる。

続いて、図７（ｃ）に示すように、細胞分離容器１０をホルダ８０に固定し、第１気圧調節部６０の封止ラバー６２に針状部材６６を貫通させる（静置により酵素処理を行った場合は、針状部材６６に接続されたバルブ６８を開ける）。この場合も、消毒液のときと同様、組織保持室３０に保持されていた酵素溶液が収集室２０側に排出される。この排出された酵素溶液には、酵素処理によって組織片から分離されたフィルタ４０のポアサイズより小さい細胞が含まれており、フィルタ４０のポアサイズより大きい組織片の残渣などは、フィルタ４０を通過することなく組織保持室３０に保持されたままとなる。

酵素処理は、酵素溶液を変更したり、繰返し行ったりするなど、組織片からの細胞分離の状況に応じて、適宜設定すればよい。

次に、収集室２０側に排出された細胞に培地を添加して細胞懸濁液を作製する懸濁処理を行う（ステップＳ１４０）。図８は、細胞懸濁処理の様子を示す模式図である。細胞懸濁処理に際しては、まず、針状部材６６に接続されたバルブ６８を閉じた状態のまま、培地が入ったニードルボトル９０Ｃのニードルを投入口５２に貫通させて組織保持室３０内に培地を投入する（図８（ａ）参照）。ここで使用する培地の種類は、分離された細胞の種類や酵素反応の停止の有無等から適宜設定すればよいが、例えばＦＢＳ含有ＤＭＥＭなどが望ましい。この場合も、消毒液のときと同様、培地が収集室２０側に排出されることなく、組織保持室３０に保持されている。続いて、針状部材６６に接続されたバルブ６８を開くと、収集室２０内の気体は外部に流出することが可能になる。これによって、上述した下方からの支持力が弱まり、それに伴い、図８（ｂ）に示すように、組織保持室３０に保持されていた培地が収集室２０側に排出される。なお、このとき、組織片の残渣はフィルタ４０のポアサイズより大きいため、フィルタ４０を通過することなく組織保持室３０に保持されたままであり、残渣の中などに残っていた細胞が培地とともに収集室２０側へ排出される。続いて、針状部材６６を第１気圧調節部６０から抜き、細胞分離容器１０をホルダ８０から取り外し、下容器２２と上容器３２と蓋体５０とを分離した後、図８（ｃ）に示すように、下容器２２の開口２４に蓋体５０を取付ける。そして、小さくなった細胞分離容器１０を遠心分離器にかけて下容器２２下部に細胞ペレットを凝集させ、処理液（この場合、酵素溶液と培地の混合液）から分離させる。この遠心分離は、例えば１５００ｒｐｍで約５分間行う。なお、下容器２２と上容器３２を分離せずに、遠心分離を行ってもよい。続いて、図８（ｄ）に示すように、細胞分離容器１０をホルダ８０に固定し、封止ラバー６２に針状部材６６を貫通させ、針状部材６６を図示しないアスピレーターに接続して、細胞ペレットを吸引しないように注意しながら処理液を吸引する。続いて、培地が入ったニードルボトル９０Ｃのニードルを投入口５２に貫通させて収集室２０内に培地を投入する（図８（ｅ）参照）。この後、容器を振盪したり、針状部材６６を介して吸排出を行うことでピペッティングを行うなどして細胞懸濁液を作製する。また、細胞懸濁後も必要に応じて図８（ｃ）〜（ｅ）の処理を繰返してもよい。なお、細胞懸濁液を作製する際には、細胞数をカウントして、所定量の懸濁液中に所定量の細胞を含むものとする工程を含めてもよい。なお、説明に用いた図５〜図８において、容器内の、針状部材６６、各種処理液、組織片、組織片の残渣及び細胞は、破線で示すべきものであるが、便宜上、実線で示した。

以上説明した第１実施形態の細胞分離容器１０によれば、組織片を処理液で処理するときには、収集室２０の気体と外気とを遮断し、気体の流入出を防止することで上述した下方からの支持力が維持され、組織保持室３０に処理液が保持されるため、組織保持室３０内で処理を行うことができる。一方、処理液での処理が終了したときには、収集室２０の気体と外部とを連通させ、気体の流入出を可能とすることで上述した下方からの支持力が弱まり収集室に処理液が排出されるため、組織保持室３０に保持された組織片から処理液を分離し、排出することができる。このように、組織片を処理液で処理し組織片から細胞を分離する一連の操作を簡便に効率よく行うことができる。また、組織保持室３０内で処理液による処理が完了するため、細胞分離容器１０の全体を処理液で満たす必要がなく、処理に用いる処理液の量を少なくすることができる。また、収集室２０内の気体と外気とを流通・遮断可能に構成された第１気圧調節部６０と、常時組織保持室３０内の気体と外気とを流通可能に構成された第２気圧調節部７０とを備えているため、収集室２０と組織保持室３０の気体の流入出を簡易な構成で容易に調節することができる。また、第１気圧調節部６０は、収集室２０内の処理液や細胞を排出する排出口としての機能も有するため、別途排出口を設ける必要がなく簡単な構造とすることができる。また、細胞分離容器１０は、上部に開口２４を有する下容器２２と、上部に開口３４を有し底部にフィルタ４０を備え下方で下容器２２と接続される上容器３２と、上容器３２の開口３４に取付け可能な蓋体５０と、を備えており、下容器２２は、蓋体５０を取付け可能な構造を有している。このため、細胞の分離が終了したあと上容器３２を取り外して下容器２２に直接蓋体５０を取付けることで、分離した細胞から懸濁液を作製したり保管する際にはコンパクトにすることができる。

［第２実施形態］
図９は第２実施形態の細胞分離容器３１０の斜視図、図１０は組立前の細胞分離容器３１０の斜視図である。

細胞分離容器３１０は、図９に示すように、収集室３２０と組織保持室３３０とがフィルタ３４０によって区画されている。この細胞分離容器３１０は、収集室３２０の気体の流入出を調節する第１気圧調節部３６０と、組織保持室３３０の気体の流入出を調節する第２気圧調節部３７０とを備えており、これらによって収集室３２０及び組織保持室３３０の外気との気体の流入出を調節することができるように構成されている。この細胞分離容器３１０は、図１０に示すように、外容器３２２と、外容器３２２の内部上方に組み込まれる内容器３３２と、内容器３３２が組み込まれた状態の外容器３２２に取付け可能な蓋体３５０と、を備えている。この場合、外容器３２２と蓋体３５０とで囲まれ内容器３３２の外側の領域が収集室３２０となり、内容器３３２と蓋体３５０とで囲まれた領域が組織保持室３３０となる。

外容器３２２は、上述した下容器２２と同様のものとすることができるため、ここでは説明を省略する。

内容器３３２は、筒状であり、上部に開口３３４を有し、上端にフランジ３３５が設けられ、底部３３８にフィルタ３４０が設けられ、さらに、内容器３３２を上下方向に貫通するように設けられた筒状部３６４を備えている。なお、フィルタ３４０は、上述したフィルタ４０と同様のものとすることができるため、ここでは説明を省略する。内容器３３２は、外容器３２２に装入されると、フランジ３３５が外容器３２２の上端面３２５に掛止する。これにより、内容器３３２は、外容器３２２の底部３２８と一定の距離を保った状態で、外容器３２２の内部上方に組み込まれる。ここで、外容器３２２の上端面３２５と内容器３３２のフランジ３３５との間には、Ｏリング３８０が介在しており、この部分からの液体や気体の漏出を防ぐことができるようになっている。このＯリング３８０は、例えばゴム硬度が４０〜５０程度であることが好ましい。Ｏリング３８０の材質としては、例えば、シリコーンゴムなどが挙げられる。

蓋体３５０は、蓋体本体３５１と、ラバー層３５６とを備えている。この蓋体本体３５１は、内周側に図示しない雌ねじ部を有している。この雌ねじ部と外容器３２２の雄ねじ部３２６とが螺合されることによって、蓋体３５０と外容器３２２とが接続される。蓋体本体３５１には、貫通穴３５４，３６２，３７２が設けられている。また、蓋体本体３５１とラバー層３５６とは密着している。そして、貫通穴３５４とラバー層３５６とが投入口３５２を構成し、貫通穴３６２とラバー層３５６と筒状部３６４とが第１気圧調節部３６０を構成し、貫通穴３７２とラバー層３５６とが第２気圧調節部３７０を構成している。このとき、投入口３５２の一部であるラバー層３５６は、図示しないニードルボトルによって処理液を投入できる。また、第１気圧調節部３６０の一部であるラバー層３５６は、針状部材を貫通させることで収集室３２０内の気体と外気とを流通し、この針状部材を抜くことでラバーの復元力によって遮断することができる。また、第２気圧調節部３７０の一部であるラバー層３５６は、針状部材を貫通させることで組織保持室３３０内の気体と外気とを流通し、この針状部材を抜くことでラバーの復元力によって遮断することができる。ここで、ラバー層３５６は、蓋体本体３５１との接触面はゴム硬度（ＪＩＳ Ｋ ６２５３のタイプＡデュロメータ硬さに準拠、以下同じ）の高い材料（例えばゴム硬度７０〜９０）であり、外容器３２２及び／又は内容器３３２との接触面はゴム硬度の低い材料（例えばゴム硬度２０〜５０）である。なお、ラバー層３５６の材質は、針状部材やニードルボトルのニードルなどを容易に貫通させることができる材質が好ましく、例えば、シリコーンゴムなどが好適である。

第２実施形態の細胞分離容器を用いて組織片から細胞を分離し細胞懸濁液を作製する方法は、第１実施形態に準じて行うことができるため、ここでは記載を省略する。

以上説明した第２実施形態の細胞分離容器３１０によれば、組織片を処理液で処理するときには、収集室３２０の気体と外気とを遮断し、気体の流入出を防止することで上述した下方からの支持力が維持され、組織保持室３３０に処理液が保持されるため、組織保持室３３０内で処理を行うことができる。一方、処理液での処理が終了したときには、第２気圧調節部３７０に針状部材等を刺して組織保持室３３０の気体の流入出を自由にさせると共に、収集室３２０の気体と外部とを連通させ、気体の流入出を可能とすることで上述した下方からの支持力が弱まり収集室３２０に処理液が排出されるため、組織保持室３３０に保持された組織片から処理液を分離し、排出することができる。このように、組織片を処理液で処理し組織片から細胞を分離する一連の操作を簡便に効率よく行うことができる。また、組織保持室３３０内で処理液による処理が完了するため、細胞分離容器３１０の全体を処理液で満たす必要がなく、処理に用いる処理液の量を少なくすることができる。また、収集室３２０内の気体と外気とを流通・遮断可能に構成された第１気圧調節部３６０と、組織保持室３３０内の気体と外気とを流通・遮断可能に構成された第２気圧調節部３７０とを備えているため、収集室３２０と組織保持室３３０の気体の流入出を簡易な構成で容易に調節することができる。また、第１気圧調節部３６０は、収集室３２０内の処理液や細胞を排出する排出口としての機能も有するため、別途排出口を設ける必要がなく簡単な構造とすることができる。また、この細胞分離容器３１０では、外容器３２２や蓋体３５０に市販の遠沈管などを適用しやすく、汎用性が高い。また、ラバー層３５６は、投入口３５２や第１，２気圧調節部３６０，３７０の一部として機能する。このため、第１実施形態で用いた投入口５２のエラストマーや、第１気圧調節部６０の封止ラバー６２や、第２気圧調節部７０の気体透過性と液体不透過性を有する材料などを個別に用意する必要がない。また、ラバー層３５６は、蓋体本体３５１との接触面のゴム硬度が外容器３２２及び／又は内容器３３２との接触面のゴム硬度よりも高い。こうしたものでは、ラバー層３５６と蓋体本体３５１との間には摩擦が生じにくく、ラバー層３５６と外容器３２２や内容器３３２とは密着しやすい。このため、蓋体３５０を外容器３２２に取り付ける際にラバー層３５６が捩れにくいので蓋が捩戻りしにくいし、外容器３２２や内容器３３２の気密性をより高めることができる。

［他の実施形態］
なお、本発明は上述した実施形態に何ら限定されることはなく、本発明の技術的範囲に属する限り種々の態様で実施し得ることはいうまでもない。

例えば、上述した第１実施形態では、第１気圧調節部６０は、蓋体５０に設けられた封止ラバー６２と上容器３２を貫通するように設けられた筒状部６４とによって構成されているものとしたが、下容器２２の側壁などに設けられていてもよい。このようなもの（変形例）を図１１に示す。なお、図１１に示す細胞分離容器１１０は、第１気圧調節部１６０が下容器２２の側壁に設けられている以外は図１に示す細胞分離容器１０と同じであるため、同一の番号を付して詳細な説明を省略する。

上述した第１実施形態では、第１気圧調節部６０の一部である封止ラバー６２は、エラストマーによって構成されており、針状部材６６を貫通させることで収集室２０内の気体と外気とを流通し、この針状部材６６を抜くことでエラストマーの復元力によって遮断することができるようになっているものとしたが、これに限定されない。例えば、開閉可能な蓋が設けられていてもよいし、開閉可能な弁が設けられていてもよいし、ルアーロック方式の継手形状やチューブコネクター形状で構成されていてもよい。第２実施形態でも同様である。なお、第１実施形態の封止ラバー６２や第２実施形態のラバー層３５６のほか、ここに示す開閉可能な蓋や開閉可能な弁が、本発明の封止部に相当する。

上述した第１実施形態では、第２気圧調節部７０は、気体透過性と液体不透過性を有する材料で構成されており、常時気体の流通が可能となっているものとしたが、これに限定されない。例えば、輸送時などには気体の流通を遮断するように、封止ラバー６２のようなエラストマーによって構成されていてもよいし、開閉可能な蓋が設けられていてもよいし、開閉可能な弁が設けられていてもよいし、ルアーロック方式の継手形状やチューブコネクター形状で構成されていてもよい。第２実施形態でも同様である。

上述した第１及び第２実施形態では、収集室２０，３２０及び組織保持室３０，３３０の両方に気圧調節部が設けられているものとしたが、どちらか一方のみに設けられていてもよい。例えば、収集室２０，３２０に真空ポンプなどの減圧装置を気圧調節部として設ければ、減圧装置を起動しない場合には組織保持室３０，３３０内に処理液が保持され、減圧装置を起動して収集室２０，３２０の気圧を組織保持室３０，３３０より低くすると組織保持室３０，３３０から収集室２０，３２０へ処理液が排出されるようにできる。こうすれば、組織保持室３０，３３０に気圧調節部を設ける必要がない。また例えば、組織保持室３０，３３０に加圧ボンベなどの加圧装置を気圧調節部として設ければ、加圧装置を起動しない場合には組織保持室３０，３３０内に処理液が保持され、加圧装置を起動して組織保持室３０，３３０の気圧を収集室２０，３２０の気圧より高くすると組織保持室３０，３３０から収集室２０，３２０へ処理液が排出されるようにできる。こうすれば、収集室２０，３２０に気圧調節部を設ける必要がない。なお、気圧調節部を収集室２０，３２０及び組織保持室３０，３３０の両方に設ける場合であっても、適宜気圧調節部として減圧装置や加圧装置を採用してもよい。

上述した第１実施形態では、上容器３２は筒状の部分とフィルタ４０とが一体として形成されたものとしたが、これに限定されない。例えば、上容器３２は、上部及び下部に開口を有し下方で下容器と接続される外枠体と、外枠体の内側に着脱可能に組み込まれフィルタを備えた組込体とを備えているものとしてもよい。こうすれば、外枠体と組込体との組み合わせを変えることによって所望の操作に適したものとすることができる。この場合、例えば、筒状の外枠体と、有底筒状で底部にフィルタが熱融着された組込体とを備え、外枠体の内周と組込体の外周とが気密且つ液密に密着するように構成されたものとしてもよい。また、下端側にフィルタを固定可能なパッキンを備えた筒状体の外枠体と、フィルタそのものである組込体とを備え、組込体を外枠体パッキンに密着させて組み込むことにより両者が気密且つ液密に密着するように構成されたものとしてもよい。また、第２実施形態では、内容器３３２は筒状の部分とフィルタ３４０とが一体として形成されたものとしたが、これに限定されない。例えば、内容器３３２は、下端側にフィルタを固定可能なパッキンを備えた筒状の外枠体と、フィルタそのものである組込体とを備え、組込体を外枠体のパッキンに密着させて組み込むことにより構成されたものとしてもよい。

上述した第１実施形態では、投入口５２は、図示しないニードルボトルによって処理液を投入できるように、蓋体本体５１及びラバー層５６を貫通する円形の穴を埋めるエラストマーで構成されているものとしたが、これに限定されない。例えば、開閉可能な蓋を備えているものとしてもよいし、ルアーロック方式の継手形状やチューブコネクター形状で構成されていてもよい。第２実施形態でも同様である。

上述した第１実施形態では、細胞分離容器１０は、下容器２２と上容器３２と蓋体５０とを備えたものとしたが、これに限定されない。例えば、図１２に示すように、上部に開口を有する外容器２２２と、外容器２２２の内部上方に設けられ上部に開口を有し下方にフィルタ４０を備えた内容器２３２と、外容器２２２及び内容器２３２の両方に取付け可能な蓋体２５０と、を備え、外容器２２２と蓋体２５０とで囲まれ内容器２３２の外側の領域が収集室２２０であり、内容器２３２と蓋体２５０とで囲まれた領域が組織保持室２３０であるものとしてもよい。この場合、蓋体２５０及び内容器２３２には、螺合可能にねじ部が設けられているものとすることができる。なお、フィルタ４０や、投入口５２や、第２気圧調節部７０については、図１に示した細胞分離容器１０と同様であるため、説明を省略する。この細胞分離容器２１０では、蓋体２５０に設けられた第１気圧調節部２６０は、エラストマーによって構成されており、針状部材６６を貫通させることで収集室２２０内の気体と外気とを流通し、この針状部材６６を抜くことでエラストマーの復元力によって遮断することができるようになっている。なお、この第１気圧調節部２６０は外容器２２２の側壁部などに設けられていてもよい。

上述した第１実施形態では、第１気圧調節部６０の封止ラバー６２に貫通させた針状部材６６アスピレーターに接続して、収集室２０の処理液や細胞を吸引して排出するものとしたが、これに限定されない。たとえば、収集室２０に別途開閉可能な排出口を設けてもよい。また、図１３に示すように、筒状部６４から連続し、下容器２２の底部２８まで達する吸引管６５を設けて、第１気圧調節部６０にアスピレーターなどを直接接続し、収集室２０の処理液や細胞を吸引して排出するものとしてもよい。こうすれば、針状部材６６を下容器２２の底部２８に達するまで挿入する操作などを省略できるため、自動化などに適したものとすることができる。第２実施形態においても同様であり、収集室３２０の処理液や細胞を吸引して排出するための排出口を収集室３２０に別途設けてもよいし、筒状部３６４から連続して外容器３２２の底部３２８まで達する吸引管を設けてもよい。

上述した第１実施形態では、蓋体５０を用いたが、これに代えて第２実施形態の蓋体３５０のような構成の蓋体を用いてもよい。一方、上述した第２実施形態では、蓋体３５０を用いたが、これに代えて第１実施形態の蓋体５０のような構成の蓋体を用いてもよい。

上述した第２実施形態では、Ｏリング３８０を用いたが、必要な気密性及び液密性を確保することができれば、こうしたものを用いなくてもよい。また、上述した第２実施形態では、内容器３３２は、内容器３３２を上下方向に貫通するように設けられた筒状部３６４を備えているものとしたが、これに限定されない。例えば、内容器３３２は、内容器３３２の側壁に上下方向に伸びる溝状部を備えているものとしてもよい。

本出願は、２０１２年１月４日に出願された日本国特許出願第２０１２−０００１３８号を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容の全てが本明細書に含まれる。

本発明は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養する細胞培養技術においてに利用可能である。

Claims (11)

1. 処理液を用いて組織片から細胞を分離させる細胞分離容器において、
   前記処理液及び前記細胞のうち少なくとも一方を収集する収集室と、
   前記処理液を投入するための投入口を備え、前記収集室の上方に設けられた組織保持室と、
   前記収集室と前記組織保持室とを区画する構成の全部又は一部として設けられ、前記組織片を保持可能かつ前記細胞が通過可能なフィルタと、
   前記収集室と前記組織保持室と各気体の流入出を調節することで、前記組織保持室に投入した処理液を、前記フィルタを通過させることなく前記組織保持室に保持させるか、前記フィルタを通過させて前記収集室へ排出させるかを切替可能な気圧調節機構と、
   を備え、
   前記気圧調節機構は、前記収集室に設けられ前記収集室内の気体の流入出を調節する第１気圧調節部と、前記組織保持室に設けられ前記組織保持室内の気体の流入出を調節する第２気圧調節部と、を備え、
   前記第１気圧調節部は、前記収集室内の気体と外気とを流通・遮断可能に構成されており、前記第２気圧調節部は、常時前記組織保持室内の気体と外気とを流通可能に構成されているか、又は、前記第１気圧調節部は、常時前記収集室内の気体と外気とを流通可能に構成されており、前記第２気圧調節部は、前記組織保持室内の気体と外気とを流通・遮断可能に構成されている、
   細胞分離容器。
2. 上部に開口を有する下容器と、
   上部に開口を有し底部に前記フィルタを備え下方で前記下容器と接続される上容器と、
   前記上容器の開口に取付け可能な蓋体と、
   を備え、
   前記下容器と前記上容器の前記底部とで囲まれた領域が前記収集室であり、前記上容器と前記蓋体とで囲まれた領域が前記組織保持室である、請求項１に記載の細胞分離容器。
3. 前記上容器は、上部及び下部に開口を有し下方で前記下容器と接続される外枠体と、前記外枠体の内側に着脱可能に組み込まれ前記フィルタを備えた組込体と、を備えている、請求項２に記載の細胞分離容器。
4. 前記下容器は、前記蓋体を取付け可能な構造である、請求項２又は３に記載の細胞分離容器。
5. 前記第１気圧調節部は、前記蓋体に設けられた封止部と、該封止部に接続し前記上容器を上下方向に貫通する筒状部とを備えている、請求項２〜４のいずれか１項に記載の細胞分離容器。
6. 前記第１気圧調節部は前記筒状部から連続し、前記下容器の底部に達する吸引管を備えている、請求項５に記載の細胞分離容器。
7. 前記蓋体は、前記上容器にねじによって取り付け・取り外しが可能な蓋体本体と、該蓋体本体の内側に配設されるラバー層とを備え、該ラバー層は前記蓋体本体との接触面のゴム硬度が前記上容器との接触面のゴム硬度よりも高くなっている、請求項２〜６のいずれか１項に記載の細胞分離容器。
8. 上部に開口を有する外容器と、
   前記外容器の内部上方に組み込まれ上部に開口を有し底部に前記フィルタを備えた内容器と、
   前記内容器が組み込まれた状態の前記外容器に取付け可能な蓋体と、
   を備え、
   前記外容器と前記蓋体とで囲まれ前記内容器の外側の領域が前記収集室であり、前記内容器と前記蓋体とで囲まれた領域が前記組織保持室である、
   請求項１に記載の細胞分離容器。
9. 前記第１気圧調節部は、前記蓋体に設けられた封止部と、該封止部に接続し前記内容器を上下方向に貫通する筒状部とを備えている、請求項８に記載の細胞分離容器。
10. 前記第１気圧調節部は前記筒状部から連続し、前記外容器の底部に達する吸引管を備えている、請求項９に記載の細胞分離容器。
11. 前記蓋体は、前記外容器にねじによって取り付け・取り外しが可能な蓋体本体と、該蓋体本体の内側に配設されるラバー層とを備え、該ラバー層は前記蓋体本体との接触面のゴム硬度が前記外容器及び／又は前記内容器との接触面のゴム硬度よりも高くなっている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の細胞分離容器。