CN103980358A - 一种制备利拉鲁肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种合成利拉鲁肽的技术，解决了现有技术存在的合成周期长、成本高、收率低、杂质多的问题。本发明的具体步骤为：A）通过液相合成片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；B）在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；C）通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；D）裂解，纯化，冻干后得到利拉鲁肽。本发明提供了一种合成周期短、成本低、收率较高、适合规模化生产的利拉鲁肽的合成工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，是一种合成的具有胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂的长效II型糖尿病的治疗特效药-利拉鲁肽的制备方法。
背景技术
利拉鲁肽，英名为：Liraglutide，结构式如下：
肽序列为：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司开发的第一个也是目前唯一一个长效GLP-1类似物，具有GLP-1受体激动剂作用，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-1相似。利拉鲁肽的分子结构与GLP-1(7-37) 的同源性达97％，结构差异表现在Lys34 被Arg 替代，Lys26 经由谷氨酸介导发生棕榈酰化，脂肪酸侧链可以使利拉鲁肽在血夜中与白蛋白可逆性地结合，使利拉鲁肽的作用时间延长，且增强对DPP-4酶降解的抵抗，脂肪酸侧链还可以使利拉鲁肽分子在注射部位自交联成七聚体，从而延缓其自皮下吸引，使其作用时间可长达接近24小时，每天注射一次并且可在任意时间注射，且低血糖发生风险小。此外，本品还能够以血糖依赖性方式降低胰高血糖素的分泌，并延迟胃排空。
诺和诺德的利拉鲁肽通过基因工程等生物学方法进行制备，技术难度大，生产成本高，不利于利拉鲁肽的大规模生产。US6268343B1和US6458924B2报道了利拉鲁肽的固液合成法，中间体GLP-1(7-37)-OH均需要反相HPLC纯化，再在液相条件下与Nα-Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu反应，此方法需两次纯化，合成周期长，废液多，成本昂贵，不利于大规模生产的缺点。
WO2013037266A1公开了一种利拉鲁肽的制备方法，具体步骤为：通过Fmoc固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys (Alloc）-OH，脱去Alloc，通过固相合成法在赖氨酸侧链氨基上偶联Palmitoyl-Glu-Offiu，裂解后得到产品。此方法由于使用四（三苯基膦）钯脱去Alloc，不仅使成本偏高，不利于大规模生产，还会使金属残留导致重金属含量超标，导致产品质量和含量不高。
综上所述，现有利拉鲁肽的固相合成过程中，由于合成周期长，成本高，收率低，杂质多，不适用于工业化生产。
本发明人用现有的合成方法，制备利拉鲁肽，发现合成步骤较多，合成周期长，纯度和收率不高，不适于工业化规模生产。为此，本发明人对利拉鲁肽的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种利拉鲁肽的固相合成方法。本发明需要解决的技术问题是：合成周期长，成本高，收率低，杂质多，不适用于工业化生产。
本发明的合成路线如图1所示：首先通过液相方法合成赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH，其次在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂，然后通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH，最后裂解，纯化，冻干，得到利拉鲁肽。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc ：芴甲氧羰基
Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸
DIC ：N，N′-二异丙基碳化二亚胺
DCC ：N，N′-二环己基碳二亚胺
PyBOP : 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU : 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt ：1- 羟基苯骈三唑
HOSu ： N-羟基琥珀酰亚胺
tBu ：叔丁基
Trt ：三苯甲基
Boc : 叔丁氧羰基
Palmitoyl ： 棕榈酰基
Pbf ： 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Tyr ：酪氨酸
Ile ：异亮氨酸
Gln ：谷氨酰胺
Asn ：天冬酰胺
Cys ：半胱氨酸
Pro ：脯氨酸
Leu ：亮氨酸
Gly ：甘氨酸
Arg ：精氨酸
Val ：缬氨酸
Trp ：色氨酸
Ala : 丙氨酸
Phe ： 苯丙氨酸
Glu ：谷氨酸
Lys ： 赖氨酸
Ser ：丝氨酸
Asp ：天冬氨酸
Thr ：苏氨酸
His ：组氨酸
DMF ：N，N′-二甲基甲酰胺
MeOH ：甲醇
DCM：二氯甲烷
NMP : N-甲基吡咯烷酮
DMSO ：二甲基亚砜
TFA ：三氟醋酸
EDT ：乙二硫醇
Piperidine ：六氢吡啶
DMAP：4-二甲氨基吡啶
DIEA : N，N′-二异丙基乙胺
TMP ： 2,4,6-三甲基吡啶。
为此本发明提供一种利拉鲁肽的合成方法，其步骤如下：
步骤1，通过液相方法合成赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；
步骤2，在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
步骤3，通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；
步骤4，裂解，纯化，冻干，得到利拉鲁肽。
其中，步骤1所述的固相合成方法，所述片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的液相合成为：正十六烷酸、HOSu、DCC偶联得到Palmitoyl-OSu活化脂，然后和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段Palmitoyl-Glu-OtBu；Palmitoyl-Glu-OtBu、HOSu、DCC偶联得到Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化脂，然后和Fmoc-Lys-OH反应得到赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH。
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固体载体采用2-CTC树脂，所述活化剂系统选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-树脂为0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-CTC树脂。
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固体载体采用王树脂，所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Gly-王树脂为0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-王树脂。
其中，步骤3所述的固相合成方法，
1）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Gly-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂；
2）在偶联剂系统的存在下，H-Gly-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
3）重复步骤1）、2），按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH, 偶联氨基酸顺序为：
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc- Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala -OH、Boc-His(Trt)-OH；
所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1）摩尔比的选择：H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂:Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH:HATU:HOBt:DIEA的摩尔比为：1:3:3:3:3和1:5:5:5:5；
2）反应温度的选择：
25oC和35oC
3）反应时间的选择：
反应时间为: 2小时和3小时。
为此提出了8种实验条件：
实验条件1：取3.43g (1.0mmol) H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂、2.16g (3.0 mmol) Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、0.41g (3.0 mmol) HOBt和1.14g (3.0 mmol) HATU加入20ml DMF中搅拌溶解，冷却到0oC，将0.5ml(3.0 mmol) DIEA加入上述溶液中，在25oC反应2小时，然后依次偶联剩下的氨基酸，偶联氨基酸顺序为：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala -OH、Boc-His(Trt)-OH，裂解，纯化，冻干，得到利拉鲁肽精肽；
实验条件2―8，实验操作如实验条件1所示，不同的实验条件及其实验结果如下：
| 实验条件 | 摩尔比 | 温度 | 时间 | 总收率 | 纯度 |
| 实验条件1 | 1:3:3:3 | 25℃ | 2小时 | 23% | 99.10% |
| 实验条件2 | 1:5:5:5 | 25℃ | 2小时 | 27% | 99.11% |
| 实验条件3 | 1:3:3:3 | 35℃ | 2小时 | 27% | 99.23% |
| 实验条件4 | 1:5:5:5 | 35℃ | 2小时 | 31% | 99.75% |
| 实验条件5 | 1:3:3:3 | 25℃ | 3小时 | 28% | 99.54% |
| 实验条件6 | 1:5:5:5 | 25℃ | 3小时 | 29% | 99.64% |
| 实验条件7 | 1:3:3:3 | 35℃ | 3小时 | 28% | 99.13% |
| 实验条件8 | 1:5:5:5 | 35℃ | 3小时 | 26% | 99.26% |
以上结果表明，实验条件4的纯化效果最优。
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下：
| 专利 | 总收率 | 纯度 |
| 本发明技术 | 31% | 99.75% |
| WO2013037266A1 | 15.87% | 99.17% |
| US6458924B2 | 22% | NA |
本发明的有益效果是：选用片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH直接固相合成利拉鲁肽，解决了现有技术存在的合成周期长，成本高，纯度低，杂质多，不适用于工业化生产的问题；本发明提供了一种合成周期短、成本低、收率较高，适合规模化生产的利拉鲁肽的合成工艺。
附图说明
图1本发明的合成路线；
图2 赖氨酸三肽片段的HPLC谱图；
图3利拉鲁肽粗肽的HPLC谱图；
图4利拉鲁肽精肽的HPLC谱图；
图5实施例十二利拉鲁肽精肽质谱谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例一：Palmitoyl- OSu活化脂的合成
称取256.42g正十六烷酸（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000ml THF中，冰水浴下加入247.56g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，0-5℃冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到314.62g Palmitoyl-OSu活化脂，收率89%。
实施例二：Palmitoyl-Glu-OtBu的合成
称取101.62g H-Glu-OtBu（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，称取176.75g Palmitoyl-OSu（0.5mol）加入到500ml THF，溶解后滴加上述混合溶液中，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用0-5℃冰乙醇重结晶。固体油泵拉干得到192.11g Palmitoyl-Glu-OtBu，收率87%。
实施例三： Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu的合成
称取88.33g Palmitoyl-Glu-OtBu（0.2mol），27.62g HOSu（0.24mol）加入1000ml THF中，冰水浴下加入49.51g DCC（0.24mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，0-5℃冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到94.81g Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化脂，收率88%。
实施例四：Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的合成
称取36.74g Fmoc-Lys-OH（0.1mol）和15.90g Na2CO3（0.15mol）加入到100ml水和100ml THF的混合溶液中溶解，称取53.87g Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu（0.1mol）加入到100ml THF，溶解后滴加上述混合溶液中，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用0-5℃冰乙醇重结晶。固体油泵拉干得到67.24g Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH，HPLC纯度为97.40%，收率85%。
实施例五：取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为0.4mmol/g的2-CTC树脂20g，加入到固相反应柱中，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取13.37g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入7.5ml DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入100ml无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到22.34g Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.10mmol/g。
实施例六：取代度为0.25mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为0.95mmol/g的2-CTC树脂10g，加入到固相反应柱中，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取14.11g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入8.0ml DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入100ml无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.25mmol/g。
实施例七：取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取取代度为0.45mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取13.37g Fmoc-Gly-OH、6.01g HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入6.0ml DIC活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入2.75g DMAP，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用100ml醋酸酐/吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.10mmol/g。
实施例八：取代度为0.25mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取取代度为0.75mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取22.28g Fmoc-Gly-OH、10.13g HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入8.0ml DIC活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入4.5g DMAP，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用100ml醋酸酐/吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到22.54g Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.25mmol/g。
实施例九：利拉鲁肽CTC树脂的制备
称取4.46g(1mmol)取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取3.24g Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5mmol）、0.68g HOBt（5mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入0.8ml DIC（10mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc- Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala -OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。其中Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA，偶联完毕，将利拉鲁肽CTC树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到9.67g 利拉鲁肽CTC树脂。
实施例十：利拉鲁肽王树脂的制备
称取4.57g（1mmol）取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取3.24g Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5mmol）、0.68g HOBt（5mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入0.8ml DIC（10mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc- Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala -OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。
其中Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA，偶联完毕，将利拉鲁肽CTC树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到9.78g 利拉鲁肽王树脂。
实施例十一：利拉鲁肽王树脂的规模化制备
称取4570g（1mol）取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取3240g Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5mol）、682g HOBt（5mol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入800ml DIC（5mol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc- Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala -OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。其中Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA，偶联完毕，将利拉鲁肽CTC树脂用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到9795g 利拉鲁肽王树脂。
实施例十二：利拉鲁肽粗肽的制备
称取100g 全保护的利拉鲁肽CTC树脂或者利拉鲁肽王树脂，加入到1000mL的三口圆底烧瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90: 5: 3:2的体积比配置裂解液10L，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到利拉鲁肽粗肽34.13g，HPLC纯度83.03%，粗肽收率78%。
实施例十三：利拉鲁肽精肽醋酸盐的制备
称取3413g 利拉鲁肽粗肽用50%乙腈+50%水的混合溶液30L溶解后，通过C18或C8柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一次纯化条件：流动相为：A相： 0.1%TFA；B相：乙腈，检测波长220nm，收集目的峰馏分。第二次纯化条件：流动相为：A相： 0.3%乙酸；B相：乙腈。检测波长220nm，收集目的峰馏分。转盐条件：流 动 相：A相：20mM乙酸铵-水溶液；B相：乙腈；检测波长220nm。收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到利拉鲁肽醋酸盐精肽11.24g，HPLC纯度99.75%，纯化总收率40%，总收率31%。
以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保户范围。
Claims (6)
1.一种利拉鲁肽的合成方法，所述方法步骤如下：
步骤1，通过液相方法合成赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；
步骤2，在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
步骤3，通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；
步骤4，裂解，纯化，冻干，得到利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤1所述的固相合成方法，所述片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的液相合成为：正十六烷酸、HOSu和DCC偶联得到Palmitoyl-OSu，然后Palmitoyl-OSu和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段Palmitoyl-Glu-OtBu；Palmitoyl-Glu-OtBu、HOSu和DCC偶联得到Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu，然后Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu和Fmoc-Lys-OH反应得到赖氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固体载体采用2-CTC树脂，所述活化剂系统选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-树脂为0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-CTC树脂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤2所述的固相合成方法，所述树脂固体载体采用王树脂，所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Gly-王树脂为0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-王树脂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：
其中，步骤3所述的固相合成方法，1）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Gly-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂；
2）在偶联剂系统的存在下，H-Gly-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
3）重复步骤1）、2），按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：
所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。
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