CN103957915A - 治疗骨质疏松症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用N-(4-{[6，7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺治疗骨质疏松症。

Description

治疗骨质疏松症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年9月22日提交的第61/538,039号美国临时申请的优先权权益，该申请的全部内容以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及使用N-(4-{[6,7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺治疗骨质疏松症。
发明背景
骨质疏松症是一种疾病，其特征为骨量低并且骨组织发生微结构退化，导致骨骼脆性增大并且骨折危险也随之增加。该疾病使骨骼变脆并且易碎，男女均可受到影响。在极小的创伤后，骨质疏松的骨骼会增加骨折的危险。在全球范围内估计有3500万妇女和1400万男性可能患有骨质疏松症或骨量低。在美国，50岁以上年龄的成人每四名中有一名遭受骨质疏松性骨折之苦。骨质疏松症及随之而来的骨折造成了巨大的公共卫生负担，这部分是因为该疾病侵袭时征兆不多一当患者被诊断患有骨质疏松性骨折之时，对骨骼造成的伤害已成事实。
骨骼不断地经历所谓的重建过程。在骨质疏松症中发生骨质流失，因为正常的重建过程或骨转换移除的骨骼比其取代的多。骨重建涉及两个不同的阶段：骨再吸收(分解)和骨形成。钙储存于骨骼中。当身体需要它的时候，被称作破骨细胞的骨细胞附着于骨表面并将其分解，在骨中留下空腔。然后被称作成骨细胞的骨形成细胞用被称作类骨质的有机基质填充空腔。然后类骨质自发地与磷酸钙矿化以重新形成硬骨骼。保持嵌在基质中的成骨细胞被称为骨细胞。
在衰老期间以及由于可导致骨量流失危险增加的其它病状，如在治疗前列腺癌或乳腺癌期间或由于营养不良，骨转换速率在两种性别中均增加，并且在组织水平上，由于单独的成骨细胞性细胞的数量减少和活性降低，成骨细胞性骨形成比破骨细胞性骨再吸收慢(Marie和Kassem，2011)。骨再吸收花费的时间比骨形成短。特定骨骼部位的骨再吸收需要约两周；形成则需要三个月或更长的时间。因此，在所谓的重建间隔期存在着骨骼不足。通常情况下，这是无关紧要的，但如果重建周期失衡，则骨转换可导致较多的骨质流失。据信高骨转换增加骨折的危险。
因此，仍然需要治疗骨质疏松症的方法。
发明概要
涉及治疗骨质疏松症方法的本发明可满足这些及其它需求。该方法包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的化合物。
在这个及其它方面的一个实施方案中，该化合物是式I的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；
R3是(C1-C6)烷基；
R4是(C1-C6)烷基；且
Q是CH或N。
在另一实施方案中，式I的化合物是式Ia的化合物。
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；且
Q是CH或N。
在另一实施方案中，式I的化合物是化合物1：
或其药学上可接受的盐。已知化合物1为N-(4-{[6,7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺，并且被称为卡博替尼(cabozantinib)。
在另一实施方案中，以药物组合物的形式施用式I、Ia的化合物或化合物1，所述药物组合物包含药学上可接受的添加剂、稀释剂或赋形剂，施用剂量足以改善异常骨转换的影响。
在另一方面，本发明提供治疗骨质流失危险增加的患者的骨质疏松症的方法。骨质流失危险增加的患者包括绝经后妇女和老年男性患者，或已经或目前正经历癌症(如前列腺癌或乳腺癌)治疗的患者，或患有营养不良的患者。该方法包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在另一方面，本发明提供预防骨质疏松症的方法，包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在另一方面，本发明提供提高患有骨质疏松症的患者的骨矿物质密度的方法，包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在这些及其它方面中，可以采用多种循环或尿液标志物或多种成像技术来定性和定量地确定式I的化合物治疗、改善或减轻骨质疏松症的严重程度的能力。可用于个体监测用抗骨再吸收剂治疗的骨质疏松症患者的标志物包括血清总碱性磷酸酶、血清骨特异性碱性磷酸酶、血清骨钙素、1型前胶原的血清C-末端前肽C1NP或I型前胶原的血清N-末端前肽(P1NP)[监测骨形成]、尿羟脯氨酸、尿总吡啶啉(pyridinoline)(PYD)、尿游离脱氧吡啶啉(DPD)、1型胶原的尿交联N-末端端肽(NTx)、1型胶原的尿或血清交联C-末端端肽(CTx)、骨唾液酸蛋白(BSP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)[监测骨再吸收]。
可用于评估式I、Ia的化合物或化合物1治疗、改善或减轻骨质疏松症严重程度的能力的成像技术包括磁共振成像、正电子发射断层摄影、计算机断层摄影(CT)和X-射线吸光光度法。
在另一方面，本发明提供受试者骨质疏松症的预后方法，包括：
(a)测量来自受试者的样本中的P1NP、CTx或TRACP5b的水平；
(b)将在步骤(a)中测得的P1NP、CTx或TRACP5b的水平与P1NP、CTx或TRACP5b的标准水平进行比较以确定来自受试者的样本是否具有异常的P1NP、CTx或TRACP5b水平；
(c)基于P1NP、CTx或TRACP5b的异常水平选择采用式I、Ia或1的化合物的治疗方案或者根据治疗方案施用式I、Ia或1的化合物，使得受试者的骨质疏松症受到抑制。
在另一方面，本发明提供在需要这种治疗的患者中刺激成骨细胞分化和/或活性的方法，包括对患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在另一方面，本发明提供在需要这种治疗的患者中刺激骨形成的方法，包括对患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在另一方面，本发明提供在需要这种治疗的患者中抑制破骨细胞分化的方法，包括对患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在另一方面，本发明提供在需要这种治疗的患者中调节向着骨形成的骨转换的方法，包括对患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在另一方面，本发明提供在切除卵巢的患者中治疗骨质疏松症的方法，包括对患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
在另一方面，本发明提供在切除卵巢的患者中调节向着骨形成的骨转换的方法，包括对患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
附图概述
图1描述化合物1对破骨细胞分化的影响，其是在第7天测量的在培养基中分泌的TRACP5b活性(U/L)。
图2描述化合物1对人破骨细胞的再吸收活性的影响，为第7天的CTX/TRACP5b值。
图3描述化合物1对成骨细胞分化的影响，为第8天的细胞ALP活性/mg蛋白。
图4描述化合物1对小鼠成骨细胞的骨形成活性的影响，为第11天分泌到培养基里的PINP。
图5描述在第13天化合物1对小鼠成骨细胞的骨形成活性的影响，为第13天的钙沉积。
图6描述在大鼠卵巢切除(OVX模型)中化合物1对骨转换标志物的短期影响的研究设计。
发明详述
缩写和定义
贯穿说明书的以下缩写和术语具有指定的含义：
缩写 含义
Ac 乙酰基
Br 宽
℃ 摄氏度
c- 环
CBZ CarboBenZoxy=苄氧羰基
d 双重峰
dd 双双峰
dt 双三峰
DCM 二氯甲烷
DME 1，2-二甲氧基乙烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
Dppf 1，1’-双(二苯基膦)二茂铁
EI 电子轰击电离
G 克
h或hr 小时
HPLC 高压液相色谱
L 升
M 摩尔或摩尔浓度
m 多重峰
Mg 毫克
MHz 兆赫(频率)
Min 分钟
mL 毫升
μL 微升
μM 微摩尔或微摩尔的
mM 毫摩尔的
Mmol 毫摩尔
Mol 摩尔
MS 质谱分析
N 当量或当量浓度
nM 纳摩尔的
NMR 核磁共振光谱
q 四重峰
RT 室温
s 单重峰
t或tr 三重峰
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
符号“-”表示单键，“=”表示双键。
当描绘或描述化学结构时，除另有明确说明外，假定所有的碳均具有氢取代以符合四价态。例如，在下面示意图中左手侧的结构中意指有九个氢。所述九个氢描绘在右手结构中。有时按具有一个或多个氢取代(明确限定为氢)的文字式描述结构中的特定原子，例如-CH2CH2-。本领域普通技术人员要理解的是，前述描述技术是化学领域中常见的，用以对否则很复杂的结构提供简短和简单性描述。
如果基团“R”被描绘成“浮”在环系统上，例如在下式中：
则除另有限定外，取代基“R”可位于环系统的任何原子上，假定的是从环原子中的一个上置换所描述的、暗指的或明确定义的氢，只要形成的结构稳定即可。
如果基团“R”被描绘成浮在稠环系统上，例如在下式中：
则除另有限定外，取代基“R”可位于稠环系统的任何原子上，假定的是从环原子中的一个上置换所描述的氢(例如，上式中的-NH-)、暗指的氢(例如上式中，其中氢未示出，但应被理解为存在)或明确定义的氢(例如其中在上式中，“Z”等于=CH-)，只要形成的结构稳定即可。在所描述的例子中，“R”基团可位于稠环系统的5元或6元环上。当基团“R”被描述成存在于含饱和碳的环系统上时，例如在下式中：
其中，在此例中，“y”可大于一，假定的是每个置换目前所描述的、暗指的或明确定义的环上的氢；则除另有说明外，在所得到的结构是稳定的情况下，两个“R”可位于同一个碳上。一个简单的例子是当R为甲基时；在所描述的环的碳(“环状”碳)上可存在偕二甲基。在另一个例子中，同一个碳上的两个R(包括该碳)可形成环，从而产生螺环(“螺环基”基团)结构，所描述的环例如下式：
“卤素”或“卤基”是指氟、氯、溴或碘。
本文所描述的每一反应的“产率”表示为理论产量的百分比。
用于本发明目的的“患者”包括人及其它动物，特别是哺乳动物，以及其它生物体。因此，所述方法适用于人的治疗和兽医应用。在另一实施方案中，患者是哺乳动物，而在另一实施方案中，患者是人。
化合物的“药学上可接受的盐”表示药学上可接受的并且具有母体化合物的所需药理活性的盐。要理解的是，药学上可接受的盐是无毒的。关于合适的药学上可接受的盐的其它资料可见于Remington’sPharmaceutical Sciences,第17版，Mack Publishing Company,Easton，PA，1985(以引用的方式并入本文)或S.M.Berge,等，“PharmaceuticalSalts,”J.Pharm.Sci.，1977；66：1-19(两者均以引用的方式并入本文)。
药学上可接受的酸加成盐的例子包括与以下酸形成的盐：无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；以及有机酸，如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸、对甲苯磺酸和水杨酸等。
“前药”是指例如通过在血液中水解而在体内(通常迅速地)转化以产生上式的母体化合物的化合物。常见的例子包括但不限于化合物的酯和酰胺形式，它们具有带羧酸部分的活性形式。本发明化合物的药学上可接受的酯的例子包括但不限于烷基酯(例如具有介于约一个与约六个之间的碳)，烷基基团为直链或支链。可接受的酯还包括环烷基酯和芳基烷基酯，如但不限于苄基酯。本发明化合物的药学上可接受的酰胺的例子包括但不限于伯酰胺以及仲和叔烷基酰胺(例如具有介于约一个与约六个之间的碳)。可以根据常规的方法制备本发明化合物的酰胺和酯。在A.C.S.Symposium Series的T.Higuchi和V.Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”第14卷和BioreversibleCarriers in Drug Design，Edward B.Roche编辑，AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press，1987中提供了有关前药的深入讨论，这两篇文献出于所有的目的以引用的方式并入本文。
“治疗有效量”是当对患者施用时会改善疾病的症状的本发明化合物的量。治疗有效量旨在包括能有效治疗、改善或减轻骨质疏松症的严重程度的单独的化合物或化合物与其它活性成分组合的量。构成“治疗有效量”的本发明化合物的量将取决于化合物、疾病状态及其严重程度、待治疗的患者的年龄等而有所不同。治疗有效量可由本领域的普通技术人员考虑到他们的知识范围和本说明书的公开内容而予以确定，但通常范围为每天约0.1至1,000mg，并且更具体地说，范围为每天1至100mg。
如本文所用的疾病、病状或综合征的“治疗(Treating，treatment)”包括(i)预防疾病、病状或综合征在人中发生，即，使疾病、病状或综合征的临床症状不在可能会暴露于或易患疾病、病状或综合征但还没有经历或表现出疾病、病状或综合征的症状的动物中产生；(ii)抑制疾病、病状或综合征，即，阻止其发展；和(iii)缓解疾病、病状或综合征，即，使疾病、病状或综合征消退。如本领域中已知的那样，针对全身与局部递送、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症的严重程度进行调节可能是必要的，并且可通过日常经验予以确定。
实施方案
在一个实施方案中，式I的化合物是式Ia的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；且
Q是CH或N。
在另一实施方案中，式I的化合物是化合物1：
或其药学上可接受的盐。
如前面所指出的那样，化合物1在本文中是指N-(4-{[6,7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺。WO2005/030140公开了化合物1并描述了其制备方法(实施例12、37、38和48)，并且还公开了此化合物抑制、调控和/或调节激酶的信号转导的治疗活性(测定法、表4、条目289)。实施例48在WO2005/030140中的第[0353]段。
在其它实施方案中，以药物组合物的形式施用式I、Ia的化合物或化合物1或其药学上可接受的盐，其中药物组合物另外包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
如本文所述，式I、式Ia的化合物和化合物I包括所列举的化合物以及单独的异构体及异构体的混合物。在每种情况下，式I的化合物包括所列举的化合物的药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂化物及其任何单独的异构体或异构体的混合物。
在其它实施方案中，式I、Ia的化合物或化合物1可以是(L)-苹果酸盐。PCT/US2010/021194和61/325095中公开了式I的化合物和化合物1的苹果酸盐。
在其它实施方案中，式I的化合物可以是(D)-苹果酸盐。
在其它实施方案中，式Ia的化合物可以是苹果酸盐。
在其它实施方案中，式Ia的化合物可以是(L)-苹果酸盐。
在其它实施方案中，化合物1可以是(D)-苹果酸盐。
在其它实施方案中，化合物1可以是苹果酸盐。
在其它实施方案中，化合物1可以是(D)-苹果酸盐。
在另一实施方案中，苹果酸盐为化合物1的(L)苹果酸盐和/或(D)苹果酸盐的结晶N-1形式，如系列号为61/325095的美国专利申请中所公开的那样。关于包括化合物1的苹果酸盐的N-1和/或N-2结晶形式在内的结晶对映体的性质，还可参见WO2008/083319。制备和表征这种形式的方法在PCT/US10/21194中有充分的描述，其以全文引用的方式并入本文。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于100mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。在这个及以下的实施方案中，该剂量是大于0mg的量。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于90mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于80mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于70mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于60mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于50mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于40mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于30mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于20mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于10mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以小于或等于5mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以0.01mg至25mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以0.1mg至15mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及改善骨质疏松症的症状的方法，包括以1mg至10mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。
在另一实施方案中，本发明涉及在已治疗或正在经受乳腺癌或前列腺癌治疗的患者中减轻骨质疏松症的严重程度的方法，所述方法包括以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在一些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、骨癌和/或骨肿瘤。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于0.01mg与25mg之间。
在另一实施方案中，本发明涉及改善伴随骨质疏松症的骨折增加、脊髓压迫和严重骨痛的非结构化骨骼的异常沉积的方法，包括以小于或等于1100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于0.01mg与25mg之间。
如先前所指出的那样，可以使用多种循环或尿液标志物来定性和定量地确定式I的化合物治疗、改善或减轻骨质疏松症的严重程度的能力。在一些实施方案中，用于个体监测用抗骨再吸收剂治疗的骨质疏松症患者的标志物可选自血清总碱性磷酸酶、血清骨特异性碱性磷酸酶、血清骨钙素、血清1型前胶原(C-末端/N-末端)：C1NP或P1NP[监测骨形成]、尿羟脯氨酸、尿总吡啶啉(PYD)、尿游离脱氧吡啶啉(DPD)、1型胶原的尿交联N-末端端肽(NTx)、1型胶原的尿或血清交联C-末端端肽(CTx)、骨唾液酸涎蛋白(BSP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b[监测骨再吸收1。
在特定的实施方案中，标志物是CTx。CTx是1型胶原在骨再吸收期间由破骨细胞裂解的部分，且因此认为在取血样之时其血清水平与破骨细胞活性成比例。因此，血清CTx被广泛用于监测双膦酸盐对骨骼的影响(Marx等，2007)。地诺单抗在骨质疏松症中的骨折复位评价每6个月(FREEDOM)的试验的骨转换子研究包括160名妇女，她们在3年中每6个月随机接受地诺单抗(60mg)或安慰剂注射。注射后一个月时，所有用地诺单抗治疗的受试者中的血清CTx水平降到绝经前参考区间以下的水平。此外，在用地诺单抗治疗的受试者中，CTx的减少与增加的骨矿物质密度之间存在着显著的相关性(Eastell等，2011)。除了对CTx的这些影响外，在第1阶段研究中，在绝经后妇女中地诺单抗的一次皮下注射以剂量依赖性方式抑制尿NTx多达81％，并且长达6个月(Bekker等，2004)。
在另一实施方案中，标志物是TRACP-5b。
在患有转移性去势难治性前列腺癌的患者中，化合物1的施用与血浆CTx的减少相关联，无论受试者是否以前用双膦酸盐治疗过(Hussain等，2011)。在没有已知的骨转移的患者中用化合物1观察到类似的效果(Gordon等，2011)，其中之前使用双膦酸盐大概是用于治疗患有骨质疏松症的患者。化合物1降低患者中的血浆CTx水平的能力(无论之前是否有双膦酸盐治疗且无论是否存在转移性骨病损)表明对阻断异常骨转换有强力的影响。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及减少患有骨质疏松症的患者中的血浆CTx的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对需要这种治疗的患者施用本文公开的任意实施方案中的式I的化合物。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于0.01mg与25mg之间。
在另一方面，本发明提供受试者骨质疏松症的预后方法，包括：
(a)测量来自受试者的样本中的P1NP、CTx或TRACP5b的水平；
(b)将在步骤(a)中测得的P1NP、CTx或TRACP5b的水平与P1NP、CTx或TRACP5b的标准水平进行比较以确定来自受试者的样本是否具有异常的P1NP、CTx或TRACP5b水平；
(c)基于P1NP、CTx或TRACP5b的异常水平选择采用式I、Ia或1的化合物的治疗方案或者根据治疗方案施用式I、Ia或1的化合物，使得受试者的骨质疏松症受到抑制。
在另一实施方案中，本发明提供在需要这种治疗的患者中刺激成骨细胞分化和/或活性的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对患者施用有效量的本文公开的任意实施方案中的式I、Ia的化合物或化合物1。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于每日一次的0.01mg与25mg之间。
在另一方面，本发明提供在需要这种治疗的患者中刺激骨形成的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对患者施用有效量的本文公开的任意实施方案中的式I、Ia的化合物或化合物1。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于每日一次的0.01mg与25mg之间。
在另一方面，本发明提供在需要这种治疗的患者中抑制破骨细胞分化的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对患者施用有效量的本文公开的任意实施方案中的式I、Ia的化合物或化合物1。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于每日一次的0.01mg与25mg之间。
在另一方面，本发明提供在需要这种治疗的患者中调节向着骨形成的骨转换的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对患者施用有效量的本文公开的任意实施方案中的式I、Ia的化合物或化合物1。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于每日一次的0.01mg与25mg之间。
在另一方面，本发明提供在切除卵巢的患者中治疗骨质疏松症的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对患者施用有效量的本文公开的任意实施方案中的式I、Ia的化合物或化合物1。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于每日一次的0.01mg与25mg之间。
在另一方面，本发明提供在切除卵巢的患者中调节向着骨形成的骨转换的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对患者施用有效量的本文公开的任意实施方案中的式I、Ia的化合物或化合物1。在具体的实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于每日一次的0.01mg与25mg之间。
在另一实施方案中，本发明提供治疗患者的骨质疏松症的方法，包括每日一次以小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg的日剂量对患者施用有效量的本文公开的任意实施方案中的式I、Ia的化合物或化合物1。在一个实施方案中，治疗导致刺激成骨细胞分化。在另一实施方案中，治疗导致刺激骨形成。在另一实施方案中，治疗导致抑制破骨细胞分化和/或活性。在另一实施方案中，治疗导致调节向着骨形成的转换。在这些及其它实施方案中，式I的化合物是化合物1并且剂量介于每日一次的0.01mg与25mg之间。
施用
可通过任何接受的施用模式或起到类似功效的试剂实施式I、式Ia的化合物或化合物1或其药学上可接受的盐以纯的形式或以适当药物组合物进行的施用。因此，施用可以是例如口服施用、鼻部施用、肠胃外(静脉内、肌内或皮下)施用、局部施用、透皮施用、阴道内施用、膀胱内施用、脑池内施用(intracistemally)或直肠施用，以固体、半固体、冻干粉末的形式或液体剂型施用，例如像片剂、栓剂、丸剂、软弹性和硬明胶剂(可以在胶囊或片剂中)、粉剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂等，特别是适合简单施用精确剂量的单位剂型。
组合物将包含常规的药物载体或赋形剂和作为所述/一种活性剂的式I的化合物，以及另外可包含载体和佐剂等。
佐剂包括防腐剂、润湿剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可取的是包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)引起可注射的药物形式的吸收延长。
如果需要的话，则式I的化合物的药物组合物还可含有少量的辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如像柠檬酸、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、丁基化羟基甲苯等。
组成的选择取决于多种因素，如药物施用的模式(例如，对于口服施用，组合物的形式为片剂、丸剂或胶囊形式)和药物物质的生物利用度。最近，已经特别针对显示出较差生物利用度的药物开发了药物组合物，所根据的原理是可通过增大表面积(即，减小粒度)来提高生物利用度。例如，美国专利No.4,107,288描述了粒度范围在10至1,000nm的药物组合物，其中活性物质负载在大分子交联基质上。美国专利No.5,145,684描述了药物组合物的生产，其中药物物质在表面改性剂的存在下被粉碎成纳米颗粒(平均粒度400nm)，然后分散在液体介质中以得到显示出显著高的生物利用度的药物组合物。
适合肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散液、混悬液或乳液以及用于复溶成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水和非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的例子包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
一个具体的施用途径是采用适宜日剂量方案的口服施用，所述方案可根据待治疗的疾病状态的严重程度加以调整。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物与以下物质混合：至少一种惰性的常规赋形剂(或载体)，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(b)粘合剂，例如纤维素衍生物、淀粉、藻酸盐(alignates)、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶，(c)保湿剂，例如甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、交联羧甲基纤维素钠、复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如季铵化合物，(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯、硬脂酸镁等，(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，或它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可包含缓冲剂。
可用包衣和壳如肠溶包衣及本领域熟知的其它包衣制备如上所述的固体剂型，。它们可含有安抚剂(pacifying agents)，并且还可以是这样的组合物，即它们在肠道的某一部分中以延迟的方式释放一种或多种活性化合物。可以使用的嵌入组合物的例子有聚合物质和蜡。活性化合物也可以是微囊化形式的，如果适当的话，则含有一种或多种上述的赋形剂。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。通过例如将式I的化合物或其药学上可接受的盐和任选的药物佐剂溶解、分散在以下物质中等：载体，例如像水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯；或这些物质的混合物等，从而形成溶液或混悬液，由此制备此类剂型。
混悬液除了活性化合物外还可含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或这些物质的混合物等。
用于直肠施用的组合物例如有栓剂，其可通过将式I的化合物与例如合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，它们在常温下为固体，但在体温下为液体，并因此在处于合适的体腔中时融化并释放其中的活性组分。
式I化合物的用于局部施用的剂型包括软膏剂、粉剂、喷雾剂和吸入剂。在无菌条件下将活性组分与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂或可能需要的推进剂混合。眼用组合物、眼膏剂、粉剂和溶液剂也涵盖在本公开的范围内。
压缩气体可用于以气溶胶的形式分散式I的化合物。适用于此目的的惰性气体有氮、二氧化碳等。
一般而言，取决于预期的施用模式，药学上可接受的组合物将含有约1重量％至约99重量％的式I化合物或其药学上可接受的盐和99重量％至1重量％的合适的药物赋形剂。在一个实施例中，组合物将是介于约5重量％与约75重量％之间的式I、式Ia的化合物或化合物1或其药学上可接受的盐，以及剩余的合适的药物赋形剂。
制备此类剂型的实际方法是已知的，或者对于本领域技术人员来说是显而易见的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences,第18版，(Mack Publishing Company,Easton，Pa.，1990)。待施用的组合物在任何情况下都将含有根据本公开的教导用于治疗疾病状态的治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐。
以治疗有效量来施用本公开的化合物或它们的药学上可接受的盐或溶剂化物，该量将根据多种因素情况而有所不同，所述因素包括所使用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时间长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速率、药物组合、特定疾病状态的严重程度以及接受治疗的主体。可以按每天约0.1至约1,000mg和每天约1至约150mg范围的剂量水平对患者施用式I、式Ia的化合物或化合物1。对于体重约70公斤的正常成年人，每天每公斤体重约0.01至约100mg范围的剂量就是一个例子。然而，所使用的具体剂量可有所不同。例如，剂量可取决于多种因素，包括患者的要求、被治疗的病症的严重程度以及所使用的化合物的药理活性。为特定的患者确定最佳剂量是本领域普通技术人员所熟知的。
在其它实施方案中，可以与其它癌症治疗同时对患者施用式I、式Ia的化合物或化合物1。此类治疗包括其它的癌症化疗、激素替代疗法、放射疗法或免疫疗法等等。其它疗法的选择将取决于多种因素，包括化合物的代谢稳定性和作用时间长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速率、药物组合、特定疾病状态的严重程度以及接受治疗的主体。
在一个实施方案中，口服施用作为胶囊的式I、式Ia的化合物或化合物1。在另一实施方案中，口服施用作为胶囊的化合物1。胶囊可含有100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg或更少的化合物1。在一个实施方案中，剂量介于0.01mg与25mg之间。
在另一实施方案中，口服施用作为片剂的式I、式Ia的化合物或化合物1。
在另一实施方案中，口服施用如下表所提供的作为片剂的化合物1或化合物1的药学上可接受的盐。
成分 (％w/w)
化合物1 31.68
微晶纤维素 38.85
无水乳糖 19.42
羟丙基纤维素 3.00
交联羧甲基纤维素钠 3.00
颗粒内总计 95.95
二氧化硅，胶态 0.30
交联羧甲基纤维素钠 3.00
硬脂酸镁 0.75
合计 100.00
在另一实施方案中，口服施用如下表所提供的作为片剂的化合物1或化合物1的药学上可4k-受的盐。
成分 (％w/w)
化合物1 25.0-33.3
微晶纤维素 q.s
羟丙基纤维素 3
泊洛沙姆 0-3
交联羧甲基纤维素钠 6.0
胶态二氧化硅 0.5
硬脂酸镁 0.5-1.0
合计 100
在另一实施方案中，口服施用如下表所提供的作为片剂的化合物1或化合物1的药学上可接受的盐。
成分 理论量(mg/单位剂量)
化合物1 100.0
微晶纤维素PH-102 155.4
无水乳糖60M 77.7
羟丙基纤维素，EXF 12.0
交联羧甲基纤维素钠 24
胶态二氧化硅 1.2
硬脂酸镁(非牛) 3.0
欧巴代黄 16.0
合计 416
可使上述片剂配方适于提供95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5mg或更少的化合物1或化合物1的药学上可接受的盐的口服剂量。在一个实施方案中，剂量介于0.01mg与25mg之间。
化合物1的制备
N一(4一{[6，7一双(甲基氧基)喹啉_4一基]氧基}苯基)一N′一(4一氟苯基)环丙烷一1，1一二甲酰胺及其(L)一苹果酸盐的制备。
用于制备N-(4-[6，7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N’-(4一氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺及其(L)-苹果酸盐的合成路线描述于方案1：
方案1
4-氯-6，7-二甲氧基-喹啉的制备
向反应器中依次装入6,7-二甲氧基-喹啉-4-醇(10.0kg)和乙腈(64.0L)。将所得到的混合物加热到大约65℃并添加磷酰氯(POCl3，50.0kg)。添加POCl3后，将反应混合物的温度升到大约80℃。当起始材料剩不到2％(在线高效液相色谱[HPLC]分析)时认为反应完全(大约9.0小时)。将反应混合物冷却到大约10℃，然后骤冷到二氯甲烷(DCM，238.0kg)、30％NH4OH(135.0kg)和冰(440.0kg)的冷溶液里。将所得到的混合物温热到大约14℃并进行相分离。用水(40.0kg)洗涤有机相并通过真空蒸馏进行浓缩以除去溶剂(大约190.0kg)。向批料中添加甲基叔丁基醚(MTBE，50.0kg)并将混合物冷却到大约10℃，在此期间产物结晶出来。通过离心回收固体，用正庚烷(20.0kg)洗涤并在大约40℃下干燥，得到标题化合物(8.0kg)。
6,7-二甲基-4-(4-硝基-苯氧基)-喹啉的制备
向反应器中依次装入4-氯-6,7-二甲氧基-喹啉(8.0kg)、4硝基苯酚(7.0kg)、4二甲基氨基吡啶(0.9kg)和2,6-甲基吡啶(40.0kg)。将反应器内容物加热到大约147℃。当反应完全时(通过在线HPLC分析确定起始材料剩不到5％，大约20小时)，使反应器内容物冷却到大约25℃。添加甲醇(26.0kg)，接着添加溶解在水(50.0kg)中的碳酸钾(3.0kg)。将反应器内容物搅拌大约2小时。将所得到的固体沉淀过滤，用水(67.0kg)洗涤并在25℃下干燥大约12小时，得到标题化合物(4.0kg)。
4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的制备
将含有甲酸钾(5.0kg)、甲酸(3.0kg)和水(16.0kg)的溶液加入到已被加热到大约60℃的6,7-二甲氧基-4-(4-硝基-苯氧基)-喹啉(4.0kg)、10％碳载钯(50％水湿(water wet)，0.4kg)在四氢呋喃(THF，40.0kg)中的混合物中。添加进行的方式使得反应混合物的温度保持在大约60℃。当采用在线HPLC分析确定认为反应完全时(起始材料剩不到2％，通常为15小时)，将反应器内容物过滤。通过在大约35℃下真空蒸馏将滤液浓缩到其初始体积的一半，这导致产物的沉淀。通过过滤回收产物，用水(12.0kg)洗涤并在大约50℃下真空干燥，得到标题化合物(3.0kg；97％曲线下面积(AUC))。
1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷羧酸的制备
将三乙胺(8.0kg)添加到市售的环丙烷-1，1-二羧酸(21，10.0kg)在THF(63.0kg)中的冷却(大约4℃)溶液中，添加速率为使得批料温度不超过10℃。将溶液搅拌大约30分钟，然后添加亚硫酰氯(9.0kg)，保持批料温度低于10℃。当添加完成时，添加4-氟苯胺(9.0kg)在THF(25.0kg)中的溶液，添加的速率使得批料温度不超过10℃。将混合物搅拌大约4小时，然后用乙酸异丙酯(87.0kg)稀释。将此溶液依次用氢氧化钠水溶液(2.0kg溶于50.0L水)、水(40.0L)和氯化钠水溶液(10.0kg溶于40.0L水)洗涤。通过真空蒸馏浓缩有机溶液，接着添加庚烷，这导致固体沉淀。通过离心回收固体，然后在大约35℃下真空干燥，得到标题化合物(10.0kg)。
1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷碳酰氯的制备
将草酰氯(1.0kg)添加到1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷羧酸(2.0kg)在THF(11kg)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF；0.02kg)的混合物中的溶液中，添加速率使得批料温度不超过30℃。不用进一步处理将此溶液用于下一步。
N-(4-{[6,7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺的制备
将来自前一步的含1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷碳酰氯的溶液添加到4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(3.0kg)和碳酸钾(4.0kg)在THF(27.0kg)和水(13.0kg)中的混合物中，添加速率使得批料温度不超过30℃。当反应完全时(通常用10分钟)，添加水(74.0kg)。将混合物在15-30℃下搅拌大约10小时，这导致产物沉淀。通过过滤回收产物，用THF(11.0kg)和水(24.0kg)的预制溶液洗涤，并在大约65℃下真空干燥大约12小时，得到标题化合物(游离碱，5.0kg)。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：δ10.2(s，1H)，10.05(s，1H)，8.4(s，1H)，7.8(m，2H)，7.65(m，2H)，7.5(s，1H)，7.35(s，1H)，7.25(m，2H)，7.15(m，2H)，6.4(s，1H)，4.0(d，6H)，1.5(s，4H)。LC/MS：M+H=502。
N-(4-{[6,7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺，(L)苹果酸盐的制备
将L-苹果酸(2.0kg)在水(2.0kg)中的溶液添加到环丙烷-1，1-二羧酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺游离碱(15，5.0kg)在乙醇中的溶液中，保持大约25℃的批料温度。然后添加碳(0.5kg)和巯基二氧化硅(thiol silica)(0.1kg)，并将所得到的混合物加热到大约78℃，此时添加水(6.0kg)。然后将反应混合物过滤，接着添加异丙醇(38.0kg)，并使之冷却到大约25℃。通过过滤回收产物并用异丙醇(20.0kg)洗涤，并在大约65℃下干燥，得到标题化合物(5.0kg)。
N-(4-{[6，7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺及其(L)-苹果酸盐的替代性制备
可用于制备N-(4-{[6，7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N’-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺及其(L)-苹果酸盐的替代性合成路线描述于方案2。
方案2
4-氯-6，7-二甲氧基-喹啉的制备
向反应器中依次装入6，7-二甲氧基-喹啉-4-醇(47.0kg)和乙腈(318.8kg)。将所得到的混合物加热到大约60℃并添加磷酰氯(POCl3，130.6kg)。添加POCl3后，将反应混合物的温度升高到大约77℃。当起始材料剩不到3％(在线高效液相色谱[HILC]分析)时认为反应完全(大约13小时)。将反应混合物冷却到大约2-7℃并骤冷到二氯甲烷(DCM，482.8kg)、26％NH4OH(251.3kg)和水(900L)的冷溶液里。将所得到的混合物温热到大约20-25℃并进行相分离。通过AW hyflosuper-cel NF床(Celite；5.4kg)过滤有机相，并用DCM(118.9kg)洗涤滤床。将合并的有机相用盐水(282.9kg)洗涤并与水(120L)混合。进行相分离，并将有机相通过真空蒸馏浓缩除去溶剂(大约95L残留体积)。将DCM(686.5kg)装到含有机相的反应器中，并通过真空蒸馏浓缩除去溶剂(大约90L残留体积)。然后装入甲基叔丁基醚(MTBE，226.0kg)，将混合物的温度调节到-20至-25℃并保持2.5小时，产生固体沉淀，然后将固体沉淀过滤并用正庚烷(92.0kg)洗涤，并且在大约25℃和氮气氛下在过滤器上进行干燥，得到标题化合物(35.6kg)。
4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的制备
在20-25℃下将溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMA，184.3kg)的4-氨基苯酚(24.4kg)装入含4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(35.3kg)、叔丁醇钠(21.4kg)和DMA(167.2kg)的反应器中。然后将此混合物加热到100-105℃达大约13小时。在通过采用在线HPLC分析确定认为反应完全(起始材料剩不到2％)后，在15-20℃下冷却反应器内容物并以保持15-30℃温度的速率装水(预冷的，2-7℃，587L)。将所得到的固体沉淀过滤，用水(47L)和DMA(89.1kg)的混合物并最后用水(214L)洗涤。然后在大约25℃下在过滤器上干燥滤饼，得到粗的4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(59.4kg湿，41.6kg干，基于LOD计算)。将粗的4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺在四氢呋喃(THF，211.4kg)和DMA(108.8kg)的混合物中回流(大约75℃)大约1小时，然后冷却到0-5℃并老化大约1小时，此后将固体过滤，用THF(147.6kg)洗涤并在大约25℃下在过滤器上真空干燥，得到4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(34.0kg)。
4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的替代性制备
将4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(34.8kg)和4-氨基苯酚(30.8kg)以及叔戊醇钠(1.8当量)88.7kg，在THF中35重量％)装入反应器中，接着装入N,N-二甲基乙酰胺(DMA，293.3kg)。然后将此混合物加热到105-115℃达大约9小时。在采用在线HPLC分析确定认为反应完全(起始材料剩不到2％)后，在15-25℃下冷却反应器内容物并经两个小时的时间添加水(315kg)，同时保持温度在20-30℃之间。然后在20-25℃下将反应混合物再搅拌一小时。通过过滤收集粗产物，并用88kg水和82.1kg DMA的混合物、接着用175kg水洗涤。将产物在过滤器上干燥53小时。LOD显示不到1％w/w。
在替代性程序中，使用1.6当量的叔戊醇钠并从110-120℃升高反应温度。另外，将冷却温度升高到35-40℃并将添加水的起始温度调节到35-40℃，允许放热到45℃。
1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷羧酸的制备
将三乙胺(19.5kg)添加到环丙烷-1，1-二羧酸(24.7kg)在THF(89.6kg)中的冷却(大约5℃)溶液中，添加速率使得批料温度不超过5℃。将溶液搅拌大约1.3小时，然后添加亚硫酰氯(23.1kg)，保持批料温度低于10℃。当添加完成时，将溶液搅拌大约4小时，保持温度低于10℃。然后添加4-氟苯胺(18.0kg)在THF(33.1kg)中的溶液，添加速率使得批料温度不超过10℃。将混合物搅拌大约10小时，此后认为反应完全。然后用乙酸异丙酯(218.1kg)稀释反应混合物。将此溶液用进一步以水(415L)稀释的氢氧化钠水溶液(10.4kg，溶解在119L水中50％)、然后用水(100L)并且最后用氯化钠水溶液(20.0kg溶解在100L水中)依次洗涤。在低于40℃的条件下通过真空蒸馏浓缩有机溶液(100L残留体积)，接着添加正庚烷(171.4kg)，这导致固体沉淀。通过过滤回收固体，并用正庚烷(102.4kg)洗涤，得到湿的粗1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷羧酸(29.0kg)。在大约25℃下将粗的1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷羧酸溶于甲醇(139.7kg)，接着添加水(320L)，得到浆料，通过过滤将所述浆料回收，依次用水(20L)和正庚烷(103.1kg)洗涤，然后在大约25℃和氮气氛下在过滤器上干燥，得到标题化合物(25.4kg)。
1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷碳酰氯的制备
将草酰氯(12.6kg)添加到1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷羧酸(22.8kg)在THF(96.1kg)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF；0.23kg)的混合物中的溶液中，添加速率使得批料温度不超过25℃。不经进一步处理将此溶液用于下一步。
1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷碳酰氯的替代性制备
向反应器中装入1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷羧酸(35kg)、344g DMF和175kg THF。将反应混合物调节到12-17℃，然后经1小时的时间向反应混合物装入19.9kg草酰氯。将反应混合物放置在12-17℃下搅拌3至8小时。不经进一步处理将此溶液用于下一步。
环丙烷-1，1-二羧酸[4-(6，7-甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺的制备
将来自前一步的含1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)-环丙烷碳酰氯的溶液添加到化合物4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(23.5kg)和碳酸钾(31.9kg)在THF(245.7kg)和水(116L)中的混合物中，添加速率使得批料温度不超过30℃。当反应完全时(经大约20分钟)，添加水(653L)。将混合物在20-25℃下搅拌大约10小时，这导致产物沉淀。通过过滤回收产物，用THF(68.6kg)和水(256L)的预制溶液洗涤，并首先在氮气氛和大约25℃下在过滤器上干燥，然后在大约45℃下真空干燥，得到标题化合物(41.0kg，38.1kg，基于LOD计算)。
环丙烷-1，1-二羧酸[4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺的替代性制备
向反应器中装入4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(35.7kg，1当量)，接着装入412.9kg THF。向反应混合物中装入48.3K2C03在169kg水中的溶液。经最少两小时将上面在1-(4-氟-苯基氨基甲酰基)- 环丙烷碳酰氯的替代性制备中所述的酰氯溶液转移到含4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺的反应器中，同时保持温度在20-30℃之间。将反应混合物在20-25℃下搅拌最少三小时。然后将反应温度调节到30-25℃并搅动混合物。停止搅动并将混合物各相分离。除去下层水相并弃去。向剩下上层有机相中添加804kg水。在15-25℃下搅拌反应物最少16小时。
产物沉淀。将产物过滤并用179kg水和157.9kg THF的混合物分两次洗涤。将粗产物真空干燥至少两小时。然后将干燥的产物吸收在285.1kg THF中。将所得到的悬浮液转移到反应容器中并搅动，直到悬浮液变为澄清(溶解的)溶液，这需要加热到30-35℃达大约30分钟。然后经两小时向溶液中添加456kg水以及20kgSDAG-1乙醇(用甲醇变性的乙醇。将混合物在15-25℃下搅动至少16小时。将产物过滤并用143kg水和126.7THF的混合物分两次洗涤。将产物在40℃的最高温度设定点下干燥。
在替代性程序中，将酰氯形成期间的反应温度调节到10-15℃。再结晶温度从15-25℃变化到45-50℃达1小时，然后经2小时冷却到15-25℃。
环丙烷-1，1--二羧酸[4-(6,7--二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺，苹果酸盐的制备
将环丙烷-1，1-二羧酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺(1-5；13.3kg)、L-苹果酸(4.96kg)、甲基乙基酮(MEK；188.6kg)和水(37.3kg)装入反应器中并将混合物加热到回流(大约74℃)达大约2小时。将反应器温度降到50至55℃并过滤反应器内容物。以相似量的起始材料(13.3kg)、L-苹果酸(4.96kg)、MEK(198.6kg)和水(37.2kg)开始，将上述这些连续步骤再重复两次。在大气压力下使用MEK(1133.2kg)于大约74℃将合并的滤液共沸干燥(近似残留体积711L；KF≤0.5％w/w)。将反应器内容物的温度降到20至25℃并保持大约4小时，得到固体沉淀，将所述固体过滤，用MEK(448kg)洗涤并在50℃下真空干燥，得到标题化合物(45.5kg)。
环丙烷-1，1--二羧酸[4-(6，7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺，(L)苹果酸盐的替代性制备
将环丙烷-1，1-二羧酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺(47.9kg)、L-苹果酸(17.2)、658.2kg甲基乙基酮和129.1kg水(37.3kg)装到反应器中并将混合物加热50-55℃达大约1-3小时，然后在55-60℃下再加热4-5小时。通过经由1μm滤筒的过滤使混合物澄清。将反应器温度调节到20-25℃并真空蒸馏，真空度为150-200mm Hg，最高夹套温度为55℃，蒸馏到558-731L的体积范围。
分别装入380kg和380.2kg甲基乙基酮再进行两次真空蒸馏。在第三次蒸馏后，通过装入159.9kg甲基乙基酮以得到880L的总体积将批料的体积调节到18v/w的环丙烷-1，1-二羧酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺。通过调节245.7甲基乙基酮进行另外的真空蒸馏。将反应混合物置于20-25℃下适度搅动至少24小时。将产物过滤并用415.1kg甲基乙基酮分三次洗涤。将产物真空干燥，夹套温度设定点在45℃。
在替代性程序中，改变添加顺序，使得将17.7kg L-苹果酸溶于129.9kg水的溶液添加到在甲基乙基酮(673.3kg)中的环丙烷-1，1-二羧酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-酰胺(4-氟-苯基)-酰胺(48.7kg)中。
实施例1
化合物1在体外破骨细胞和成骨细胞分化和活性测定中的测试
本研究的目的是探讨7种浓度的化合物1对体外人破骨细胞和小鼠成骨细胞分化和活性的影响。对以下浓度进行了测试：0.004、0.012、0.037、0.11、0.33、1.0和3.0μM。使用在牛骨切片上培养的由人骨髓得到的CD34+破骨细胞前体细胞和被诱导分化为骨形成成骨细胞的KS483小鼠骨原细胞进行研究。
按四个部分进行研究。在第一部分中，将由人骨髓得到的CD34+破骨细胞前体细胞在牛骨切片上培养7天，此后通过在培养基中测量抗酒石酸酸性磷酸酶5b活性(TRACP5b)对所形成的破骨细胞进行定量。此测定显示化合物1对破骨细胞分化的影响。包括骨保护素(OPG)作为破骨细胞分化的参考抑制剂以表明培养系统如预期发挥作用。
在第二部分中，在第7天将人破骨细胞的培养基更换为新的培养基，并且将所形成的成熟破骨细胞再培养3天，使它们再吸收骨骼。在第7天将化合物1加到培养基里。此测定显示化合物1对成熟破骨细胞的骨再吸收活性的影响。在于第10天收集的培养基中测量I型胶原的C-末端交联端肽(CTX)以定量第7-10天期间的骨再吸收。在第7天测量TRACP5b以定量加化合物1前的破骨细胞数。用CTX值除以TRACP5b值，得到指示平均破骨细胞活性的再吸收指数。包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64作为破骨细胞活性的参考抑制剂以表明培养系统如预期发挥作用。
在第三部分中，将KS483小鼠骨原细胞培养8天，此后通过测量细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性量对所形成的成熟成骨细胞进行定量。此测定显示化合物1对成骨细胞分化的影响。在研究中包括17β-雌二醇作为刺激成骨细胞分化的参考化合物以表明培养系统如预期发挥作用。
在研究的第四部分中，将KS483小鼠骨原细胞培养13天，在此期间在第11天测定分泌到培养基里的I型前胶原的N-末端前肽(PINP)以显示对有机骨基质形成的影响，并且在第13天测定沉积到所形成的骨基质里的钙量以显示对无机骨基质形成的影响。此成骨细胞活性测定显示化合物1对成骨细胞的骨形成活性的影响。在研究中包括17β-雌二醇作为刺激成骨细胞分化和活性的参考化合物以表明培养系统如预期发挥作用。
化合物1显示出破骨细胞分化的剂量依赖性抑制，这在0.11、0.33、1.0和3.0μM的浓度时是显著的。显微分析显示0.11和0.33μM浓度不影响Hoechst和TRACP阳性单核细胞的数目，表明了破骨细胞分化的特异性抑制。然而，1.0和3.0μM浓度减少了Hoechst和TRACP阳性单核细胞的数目，表明用这些浓度观察到的抑制效果至少部分是细胞毒性的。在破骨细胞活性测定中没有观察到影响。
化合物1显示出成骨细胞分化和活性的剂量依赖性刺激。化合物1浓度0.012、0.037、0.11、0.33和1.0μM增加成骨细胞分化测定中的ALP值，而浓度3.0μM减少该值。在成骨细胞活性测定中，浓度0.012和0.037μM增加PINP值，而浓度0.004、0.012、0.037和0.11μM增加钙值。浓度0.33、1.0和3.0μM减少PINP和钙值两者。这些结果表明，化合物1的0.004、0.012、0.037和0.11μM浓度对骨细胞具有有益的影响，活化成骨细胞性骨形成，并且不影响或抑制骨再吸收破骨细胞的形成。
研究描述
本研究的目的是探讨由发起人选定的化合物1对人破骨细胞和小鼠成骨细胞体外分化和活性的影响。使用模型研究对破骨细胞的影响，其中在有利于破骨细胞分化的条件下将由骨髓得到的人破骨细胞前体细胞在牛骨切片上培养7天，并使之分化为骨再吸收破骨细胞。在第7天破骨细胞分化完成后，移除培养基并将有利于破骨细胞活性的新培养基加到各孔里。然后将成熟破骨细胞再培养3天，使它们再吸收骨骼。在破骨细胞分化测定中，在第0天将测试化合物和参考抑制剂骨保护素(OPG)加到培养物里。在破骨细胞活性测定中，在第7天将测试化合物和参考抑制剂E64加到培养物里。在两项测定中重复实验8次测试七个浓度。由在第7天收集的培养基测量抗酒石酸酸性磷酸酶5b活性(TRACP5b)作为分化期间在各孔中形成的破骨细胞数的指标。由在第10天收集的培养基测量I型胶原的C-末端交联端肽(CTX)以定量第7-10天期间的骨再吸收。
使用可被诱导以分化为骨形成成骨细胞的KS483小鼠骨原细胞研究对成骨细胞的影响。在研究中包括17β-雌二醇(E2)作为刺激成骨细胞分化和活性的参考化合物，以表明培养系统可检测成骨细胞分化和活性的刺激。在成骨细胞分化测定中，将细胞培养8天，此后通过测量细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性的量对所形成的成熟成骨细胞进行定量。在成骨细胞活性测定中，将骨原细胞培养13天，在此期间在第11天测定分泌到培养基里的I型前胶原的N-末端前肽(PINP)以显示对有机骨基质形成的影响，并且在第13天测定沉积到所形成的骨基质里的钙量以显示对无机骨基质形成的影响。
在含有包括媒介物的基线组、包括参考化合物的对照组和包括测试化合物的组的96孔板中进行测试。包括参考化合物以表明测试系统如预期发挥作用。在破骨细胞培养物中，如果对照组的结果显著低于基线组的结果，则研究被认可。在成骨细胞培养物中，如果对照组的结果显著高于基线组的结果，则研究被认可。
化合物1
由发起人处得到作为固体化合物的化合物1。将该化合物以10mM的浓度悬浮于DMSO中以得到原液。在进行测试之前制出新鲜的原液，将其在室温下干燥保存在黑暗中。对于长期(超过5天)的情况，将原液保存于-70℃。由原液制备适当的稀释液以获得所需的测试浓度；0.004μM、0.012μM、0.037μM、0.11μM、0.33μM、1μM和3μM。
参考化合物
使用骨保护素(OPG，5nM，目录号450-14，得自PeproTech EC Ltd，London，UK)作为破骨细胞分化的参考抑制剂，并且使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64(1_M，目录号E-3132，得自Sigma-A1drich，St Louis，MO，USA)作为破骨细胞的再吸收活性的参考抑制剂。
使用17β-雌二醇(E2；10nM，目录号E1024，得自Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)作为成骨细胞分化和活性的参考刺激剂。
方法
破骨细胞培养物
骨切片上的破骨细胞培养方法最初由Boyde和合作者(1984)以及由Chambers及合作者描述(1984)。最初，通过计算在显微镜下的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)-阳性多核细胞的数目来确定破骨细胞数。后来证明分泌的TRACP5b活性反映了小鼠破骨细胞培养物中的破骨细胞数(Alatalo等2000)。虽然分泌的TRACP5b活性与破骨细胞数密切相关，但TRACP5b不是由TRACP-阳性单核破骨细胞前体细胞在它们已分化为成熟多核破骨细胞前分泌的。因此，分泌的TRACP5b是成熟多核破骨细胞的可靠标志物。最初是使用带有相衬物镜的显微镜通过对每个骨或牙质切片上的再吸收陷窝的数目进行计数来确定培养物中的骨再吸收的速率。后来使用特异性结合于再吸收区域骨腔(inbone)的凝集素(小麦胚芽凝集素)(Wheat GermAgglutinin lectin)显现陷窝，使得有可能使用显微镜和计算机辅助图像分析系统来定量总再吸收区域。这些方法有两个缺点：它们费时并且它们不能检测到再吸收陷窝的深度差异，这可能会导致结果错误。后来证明I型胶原的C-末端交联端肽(CTX)定量释放到培养基里的骨胶原降解产物(Bagger等1999)。这种方法快速且灵敏，并且它是总再吸收体积(包括陷窝的深度)的可靠参数。
开发用在这项研究中的人破骨细胞培养系统，其中在包括M-CSF和RANK-配体(Rissanen等2009)在内的适当生长因子的存在下在牛骨切片上培养由人骨髓得到的CD34+破骨细胞前体细胞(Human Osteoclast Precursors，Lonza，Walkersville，USA)。首先使细胞分化为成熟骨再吸收破骨细胞，并且然后使所形成的破骨细胞再吸收骨骼。
在分化期和/或再吸收期的的开始将测试和参考化合物加到细胞培养物里，并确定它们对破骨细胞的分化和/或再吸收活性的影响。采用商业上可行的方法(IDS Ltd，Boldon，UK)在分化期后由培养基测定分泌的TRACP5b。分泌的TRACP5b准确地描述分化期间在各孔中形成的破骨细胞数。采用商业上可行的方法(用于培养物的IDS Ltd，Boldon，UK)在再吸收期后由培养基测定CTX。CTX准确地描述再吸收期间在各孔中释放到培养基里的骨胶原降解产物的量。通过用所获得的再吸收体积(值)除以破骨细胞数(值)来计算表示平均破骨细胞活性的再吸收指数(Rissanen等2009)。
成骨细胞培养物
成骨细胞是由间充质干细胞产生的骨形成细胞。在成骨细胞的发育期间，已经定义了三个不同的时期：1)细胞增殖和胞外基质的分泌(ECM)；2)ECM成熟；3)ECM矿化。在这些期间，成骨细胞表型标志物的连续表达已被表征。碱性磷酸酶(ALP)与骨细胞表型相关联，并且在成骨细胞的成熟期间被积极地表达。I型前胶原的N-末端前肽(PINP)是I型胶原合成和ECM产生的标志物以及用于评估临床前研究中的新骨质疏松症候选药物的相关量度(Rissanen等2008)。随着矿化开始发生，大量的钙和羟基磷灰石沉积到成熟的有机基质里，形成骨样结节。根据这些标志物，有可能研究培养系统中的成骨细胞分化和活性的所有阶段。
建立了若干模型系统以研究成骨细胞。从颅盖中分离具有成骨细胞表型的细胞是第一次尝试。然而，这些细胞仅代表成骨细胞的成熟阶段，因为只有一小部分颅盖细胞是成骨细胞前体(Bellows等1989)。作为另外的选择，可以刺激间充质骨髓细胞或祖细胞系分化为成骨细胞。克隆自小鼠颅盖的KS483细胞是雌激素响应性成骨细胞前体，其能够体外分化为骨形成成骨细胞并形成矿化骨结节(Dang等2002)。
建立可用作研究促合成及雌激素样化合物对成骨细胞分化和活性的影响的体外模型的培养系统。在此种培养系统中，小鼠KS483细胞首先增殖，然后分化为能够在抗坏血酸和β-甘油磷酸盐的存在下形成矿化骨结节的成骨细胞(Fagerlund等2009)。将测试和参考化合物加到细胞培养物里并与此同时改变培养基，并且确定它们对成骨细胞的分化和活性的影响。如先前的描述由细胞裂解物测定细胞ALP(成骨细胞分化的标志物)(Lowry等1954)。采用商业上可行的方法(Rat/Mouse PINP EIA，IDS Ltd，Boldon，UK)由培养基测定分泌的PINP(有机骨基质形成的标志物)。采用商业上可行的钙测定法(RocheDiagnostics)测量钙沉积(无机骨基质形成的指数)。
程序
破骨细胞分化测定
在此项研究中，将由人骨髓得到的CD34+干细胞(10000个细胞/孔)悬浮在培养基中，并使其附着于96孔组织培养板中的牛骨切片。培养基(含10％FBS，OCPLonza，Walkersville，USA)补充有适当量的有利于破骨细胞分化和活性的重要生长因子，包括在200μl培养基中的M-CSF(33ng/ml，OCPLonza，Walkersville，USA)和RANK-配体(66ng/ml，OCPLonza，Walkersville，USA)。在37℃下将细胞在95％空气和5％二氧化碳潮湿气氛条件下的CO2温育箱中温育7天。在第0天加入测试化合物和参考化合物OPG。将第7天收集的上清液保存在-70℃下，直到分析TRACP5b时。使用VICTOR2TM多标记计数器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)由培养基(20μl/样本)测量TRACP5b。用3％低聚甲醛固定细胞并针对TRACP活性(白细胞酸性磷酸酶试剂盒；Sigma Aldrich，St Louis，MO，USA)和Hoechst33258(Sigma Aldrich，St Louis，MO，USA)进行染色。
包括了以下组(每组包括8次重复实验)：
板1：
1)具有媒介物(DMSO)的基线组
2)具有5nM OPG的对照组
3)0.004μM化合物1
4)0.012μM化合物1
5)0.037μM化合物1
6)0.11μM化合物1
7)0.33μM化合物1
8)1.0μM化合物1
9)3.0μM化合物1
破骨细胞活性测定
在此项研究中，将由人骨髓得到的CD34+干细胞(10000个细胞/孔)悬浮在培养基中，并使其附着于96孔组织培养板中的牛骨切片。培养基(含10％FBS，OCPLonza，Walkersville，USA)补充有适当量的有利于破骨细胞分化和活性的重要生长因子，包括在200μl培养基中的M-CSF(33ng/ml，OCPLonza，Walkersville，USA)和RANK-配体(66ng/ml，OCPLonza，Walkersville，USA)。在37℃下将细胞在95％空气和5％二氧化碳潮湿气氛条件下的CO2温育箱中温育。在第7天破骨细胞分化完成后，移除所有的培养基并将新的200μl有利于破骨细胞活性的培养基加到孔里。
将成熟破骨细胞再培养3天，使它们再吸收骨骼。在破骨细胞分化期完成后在第7天加入测试化合物和参考化合物E64。将第7天和第10天收集的上清液保存在-70℃下，直到分析TRACP5b和CTX。使用VICTOR2TM多标记计数器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)由在第7天收集的培养基(20μl/样本)测量TRACP5b，并且由在第10天收集的培养基(50μl/样本)测量CTX。
包括了以下组(每组包括8次重复实验)：板1：
1)具有媒介物(DMSO)的基线组
2)具有1_M E64的对照组
3)0.004μM化合物1
4)0.012μM化合物1
5)0.037μM化合物1
6)0.11μM化合物1
7)0.33μM化合物1
8)1.0μM化合物1
9)3.0μM化合物1
成骨细胞分化测定
将小鼠KS483细胞在T-75组织培养瓶中于补充有10％活性炭解吸的胎牛血清的aMEM中培养，直到80-90％融合。在37℃下将细胞在95％空气和5％二氧化碳潮湿气氛条件下的CO2温育箱中温育。在达到80-90％融合后，制备继代培养物。从烧瓶中取出细胞并进行胰蛋白酶处理和计数。为诱导成骨细胞的成熟和骨形成，将未成熟的成骨细胞接种在涂布I型胶原的96孔板中。补充抗坏血酸(50_g/ml)将细胞培养8天，并且每3-4天更换一半的培养基。在培养期开始和更换培养基时加入测试化合物和对照物(E2)。在第8天通过从孔中移除培养基而停止培养，并且制备细胞裂解物。通过使用VICTOR2TM多标记计数器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)定量细胞ALP活性和总蛋白质含量(Protein Assay,Bio-Rad Laboratories Inc，CA，USA)。
包括了以下组(每组包括8次重复实验)：板1：
1)具有媒介物(DMSO)的基线组
2)具有10nM E2的对照组
3)0.004μM化合物1
4)0.012μM化合物1
5)0.037μM化合物1
6)0.11μM化合物1
7)0.33μM化合物1
8)1.0μM化合物1
9)3.0μM化合物1
成骨细胞活性测定
将小鼠KS483细胞在T-75组织培养瓶中于补充有10％活性炭解吸的胎牛血清的αMEM中培养，直到80-90％融合。在37℃下将细胞在95％空气和5％二氧化碳潮湿气氛条件下的CO2温育箱中温育。在达到80-90％融合后，制备继代培养物。从烧瓶中取出细胞并进行胰蛋白酶处理和计数。为诱导成骨细胞的成熟和骨形成，将未成熟的成骨细胞接种在涂布I型胶原的96孔板中。补充抗坏血酸(50μg/ml)和β-甘油磷酸盐(5mM)将细胞培养13天，并且每3-4天更换一半的培养基。在培养期开始和更换培养基时加入测试化合物和对照物(E2)。在第11天由培养基测量作为有机骨基质形成的标志物的分泌的PINP。在第13天通过从孔中移除培养基而停止培养并添加盐酸。通过使用VICTOR2TM多标记计数器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)定量沉积到所形成的骨基质里的钙。包括了以下组(每组包括8次重复实验)：
板1：
1)具有媒介物(DMSO)的基线组
2)具有10nM E2的对照组
3)0.004μM化合物1
4)0.012μM化合物1
5)0.037μM化合物1
6)0.11μM化合物1
7)0.33μM化合物1
8)1.0μM化合物1
9)3.0μM化合物1
统计分析
所有的相关数据以带有单位的图形和/或表格[平均值、标准偏差(SD)和统计显著性]形式给出。用Origin统计软件(OriginLabCorporation，Northampton，MA，USA)进行统计分析。采用单向方差分析(ANOVA)来研究在不同组之间获得的值(基线对比参考抑制剂和测试化合物)是否具有统计学差异(p<0.05)。如果单向ANOVA显示有显著统计学差异，则将··检验用于各组之间的统计比较。
结果
如图1中所示在第7天测量化合物1对破骨细胞分化的影响。结果显示为在培养基中分泌的TRACP5b活性(U/L)。在此图及其它图中，BL表示基线(没有添加的化合物)；C表示对照(5.0nM OPG)。采用单向ANOVA将结果与BL进行比较(在所有组之间p小于0.001)。三个星号(***)表示小于0.001的p值的统计学显著抑制效果。两个星号(**)表示小于0.01的p值的统计学显著效果。一个星号(*)表示小于0.05的p值。
图中带括弧的星号([***])表示与基线水平相反的显著差异。结果进一步归纳于表1。如在图中，三个星号([***])表示小于0.001的p值的统计学显著抑制效果。如在图中以及在此表和其它表中，三个星号(***)表示小于0.001的p值的统计学显著抑制效果；两个星号(**)表示小于0.01的p值的统计学显著效果；一个星号(*)表示小于0.05的p值。图中带括弧的星号([***])表示与基线水平相反的显著差异。
表1.
破骨细胞分化测定。在第7天的TRACP5b活性。
化合物1对人破骨细胞的再吸收活性的影响示于图2。结果显示为CTX/TRACP5b值。在第10天在再吸收期结束时测定CTX值，并且在第7天在再吸收期开始时测定TRACP值。结果进一步归纳于表2。
表2.
破骨细胞分化测定。第10天的CTX和第7天的TRACP5b活性。
在第8天化合物1对成骨细胞分化的影响示于图3。结果显示为细胞ALP活性/mg蛋白质。结果进一步归纳于表3。
表3.
成骨细胞分化测定。在第8天的ALP活性。
化合物1对小鼠成骨细胞的骨形成活性的影响示于图4。结果显示为在第11天分泌到培养基里的PINP。结果进一步归纳于表4。
表4.
成骨细胞分化测定。在第天11的PINP活性。
化合物1对小鼠成骨细胞的骨形成活性的影响示于图5。结果显示为在第13天的钙沉积。结果显示为在第11天分泌到培养基里的PINP。结果进一步归纳于表4。
表5.
成骨细胞分化测定。在第13天的钙沉积。
结论
参考抑制剂OPG和E64分别显著地抑制破骨细胞分化和活性，并且参考刺激剂17β-雌二醇显著地刺激成骨细胞分化和活性，说明成功地进行了测定，并且所得到的结果是可靠的。化合物1显示出破骨细胞分化的剂量依赖性抑制，这在0.11、0.33、1.0和3.0μM浓度时是显著的。显微分析显示0.11和0.33μM浓度的化合物1不影响Hoechst和TRACP阳性单核细胞的数目，表明了破骨细胞分化的特异性抑制。然而，1.0和3.0μM浓度减少了Hoechst和TRACP阳性单核细胞两者的数目，表明用这些浓度观察到的抑制效果至少部分是细胞毒性的。
在测试浓度下，化合物1不影响破骨细胞再吸收活性。化合物1在0.012、0.037、0.11、0.33和1.0μM浓度下显示出成骨细胞分化的剂量依赖性刺激，并且在3.0μM浓度下显示出抑制效果。化合物1在0.004、0.0120.037和0.11μM浓度下显示出成骨细胞的骨形成活性的剂量依赖性刺激，并且在0.33、1.0和3.0μM浓度下显示出抑制效果。作为结论，0.004、0.012、0.037和0.11μM浓度的化合物1对骨细胞显示出有益的影响，活化成骨细胞性骨形成，并且不影响或抑制骨再吸收破骨细胞的形成。
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实施例2
在大鼠卵巢切除(OVX)模型中化合物1对骨转换标志物的短期影响
本研究的目的是探讨在用于绝经后骨质疏松症的大鼠卵巢切除(OVX)模型的预防研究中化合物1对骨代谢的生化血清标志物的短期影响。使用17β一雌二醇(E2)作为参考化合物。研究中包括以下5-个实验组：
1)接受媒介物(5ml/kg/d p.o.)的假(SHAM)手术对照大鼠
2)接受媒介物(5ml/kg/d p.o.)的OVX对照大鼠
3)接受17β-雌二醇(4μg/kg/d s.c)的OVX对照大鼠
4)接受测试化合物化合物1(1mg/kg/d p.o.)的OVX大鼠
5)接受测试化合物化合物1(3mg/kg/d p.o.)的OVX大鼠
每组包括八只在研究的存活阶段(in-life phase)开始时为三个月龄的雌性大鼠(Sprague-Dawley)。在存活阶段开始之前，将动物称重，收获它们的血样，并且根据体重和I型前胶原N-末端前肽(PINP)的血清水平通过分层法将动物随机分入若干研究组。在存活阶段开始时，对动物称重并进行手术。在手术后一天开始进行处理并每天一次继续进行达两周。在第1组和第2组中使用无菌水作为媒介物。在一周的处理后测定体重并相应地调整处理剂量。在两周的处理后，将动物称重，收获它们的血样，将动物处死并测定它们的相对子宫重量。为分析处理的短期影响，在收获于存活阶段的开始前和存活阶段结束时的血清样本中测定四种骨代谢生物标志物的水平。这些生物标志物包括PINP(作为骨形成的标志物)、骨钙素(OC)的N-末端中间片段(作为骨转换的一般性标志物)、I型胶原的C末端交联端肽(CTX)(作为骨再吸收的标志物)和抗酒石酸酸性磷酸酶亚型5b(TRACP5b)(作为破骨细胞数的标志物)。使用第-7天的血清水平为基线水平，第14天的血清水平为受手术和处理影响的水平。
手术切除卵巢在手术后两周过后的雌性大鼠中增加体重，减少相对子宫重量，升高CTX、OC和PINP的血清水平并降低血清TRACP5b活性。这些骨代谢生物标志物结果表明，卵巢切除增强骨再吸收，增加骨转换和骨形成并减少破骨细胞的总数。这些结论意味着手术切除卵巢加速雌性大鼠中的骨转换的速率。
通过比较以4μg/kg/d的皮下剂量用17β-雌二醇处理的OVX动物与用媒介物处理的OVX动物来研究17β-雌二醇的短期影响。在OVX大鼠中，17β-雌二醇处理对体重、相对子宫重量和骨代谢生物标志物的影响如下：
●用17β-雌二醇处理防止OVX诱导的体重增加和OVX诱导的相对子宫重量的减少。
●用17β-雌二醇处理防止OVX诱导的血清CTX、OC和PINP水平的升高。
●用17β-雌二醇处理不影响OVX诱导的血清TRACP5b活性的降低。
骨代谢生物标志物结果表明，在两周处理后的OVX大鼠中，以4μg/kg/d的皮下剂量用17β-雌二醇处理防止OVX诱导的骨再吸收的增强和OVX诱导的骨转换及骨形成的增加，但不影响OVX诱导的破骨细胞总数的减少。这些结论意味着在雌性大鼠中，以4μg/kg/d的皮下剂量用17β-雌二醇处理防止OVX诱导的骨转换速率的加快。
通过比较以1和3mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理的OVX动物与用媒介物处理的OVX动物来研究化合物1的短期影响。在OVX大鼠中，化合物1处理对体重、相对子宫重量和骨代谢生物标志物的影响如下：
●以1mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理部分地防止OVX诱导的体重增加。
●以1和3mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理不影响OVX诱导的相对子宫重量的减少。
●以3mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理增强OVX诱导的血清PINP水平的升高和OVX诱导的血清TRACP5b活性的降低。
●以1和3mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理不影响OVX诱导的血清CTX和OC水平的升高。
骨代谢生物标志物结果表明，在两周处理后的OVX大鼠中，以3mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理增强OVX诱导的骨形成的增加和OVX诱导的破骨细胞总数的减少，但不影响OVX诱导的骨再吸收和骨转换的增加。与减少的破骨细胞总数和未改变的骨再吸收水平相关联的增强的骨形成意味着，在雌性大鼠中，以3mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理使OVX刺激的骨转换向着骨形成转换。
描述
人骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，其特征为骨量低并且骨微结构恶化，其导致骨骼脆性并且发生骨折的危险增加(Raisz等2008)。骨质疏松症的慢性性质使其越来越成为社会的负担。由于估计到预期寿命的增加，因此也估计到骨质疏松症频率的增加，这对我们的卫生保健造成额外的负担。虽然对骨质疏松症的治疗已经有有效的疗法，但还需要具有改进的治疗窗口(即，提高了的药效/安全性比)的新疗法。使用骨质疏松症的动物模型的临床前药效研究提供了在进行临床试验之前与新的潜在疗法效果有关的第一手资料(Rissanen和Halleen2010)。药物施用监管部门已经批准在骨质疏松症治疗的新潜在疗法的临床前药效测试中将患有骨质减少的性腺切除大鼠用作预测性小动物模型。
本研究的目的是探讨在用于绝经后骨质疏松症的大鼠卵巢切除(OVX)模型的预防研究中化合物1对骨代谢的生化血清标志物的短期影响。使用17β-雌二醇(E2)作为参考化合物(Lindsay和Cosman2008)。在研究中包括以下五个实验组：
1)接受媒介物(5ml/kg/d p.o.)的假手术对照大鼠
2)接受媒介物(5ml/kg/d p.o.)的OVX对照大鼠
3)接受17β-雌二醇(4μg/kg/d s.c)的OVX对照大鼠
4)接受化合物1(1mg/kg/d p.o.)的OVX大鼠
5)接受化合物1(3mg/kg/d p.o.)的OVX大鼠
每组包括八只在研究的存活阶段开始时为三个月龄的雌性大鼠(Sprague-Dawley)。图1中给出研究的实验设计。根据在存活阶段开始前一周(在第-7天)测量的动物体重和I型前胶原N-末端前肽(PINP)的血清水平通过分层法将动物随机分入若干研究组。在存活阶段开始(在第天0)时，将动物称重，将第2-5组中的动物切除卵巢，并对第1组中的动物进行假手术。在手术后一天开始进行处理并每天一次继续进行达两周(直到第13天)。在第1和第2组中使用无菌水作为媒介物。在存活阶段的开始时(在第0天)、存活阶段开始后一周(在第7天)和在存活阶段结束时(在第14天)测定体重。根据最晚获得的体重调整处理剂量。在两周的处理后(在第14天)，将动物称重，收获它们的血样，将动物处死，并测定它们的相对子宫重量。为分析处理的短期影响，在收获于存活阶段的开始前(在第-7天)和存活阶段结束时(在第14天)的血清样本中测定四种骨代谢生物标志物的水平。这些生化血清标志物包括PINP、骨钙素(OC)的N-末端中间片段、I型胶原的C-末端交联端肽(CTX)和抗酒石酸酸性磷酸酶亚型5b(TRACP5b)。使用在第-7天获得的血清水平为基线水平，并且使用在第14天获得的血清水平为受外科手术和处理影响的水平。
材料和设备
化合物1
在整个研究期间将固体化合物1在室温下保存于干燥环境中。每天制备化合物1的新鲜给药悬浮液。如下所示在包括少量氯化氢(HCl；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)的无菌水(Baxter，Deerfield，IL，USA)中配制固体化合物的每日等分试样。
对于实验组4。将4.5-5.8mg化合物1分散在22.5-29.0ml无菌水中，得到含0.2mg/ml化合物1的给药悬浮液。通过在给药悬浮液中添加7.5-9.7μl的1N HCl来改进制剂的特性。
对于实验组5。将10.4-17.4mg化合物1分散在17.333-29.0ml无菌水中，得到含0.6mg/ml化合物1的给药悬浮液。通过在给药悬浮液中添加17.3-29.0μl的1N HCl来改进制剂的特性。
通过短暂涡旋将固体化合物的各每日等分试样与无菌水混合。通过在水浴(FinnSonic Ultrasonic Cleaner Model m03；FinnSonic，Lahti，Finland)中超声处理一分钟并接着涡旋五秒钟来促进化合物的分散。将此超声处理和涡旋程序重复多达3-5次。通过在各给药悬浮液中添加少量的1N HCl来改进制剂的特性。进一步通过将超声处理和涡旋程序重复多达1-2次来促进化合物的分散。
在化合物配制后一小时内，在第4和5实验组中使用微细均匀的给药悬浮液处理动物。在外科OVX手术后一天(在第l天)开始动物的处理并且每天一次继续进行达两周(直到第13天)。
以5ml/kg的量口服施用给药悬浮液，在实验组4中得到1mg/kg/d的口服化合物1剂量和在实验组5中得到3mg/kg/d的口服化合物1剂量。在施用期间频繁地混合给药悬浮液以便用尽可能均匀的给药悬浮液处理动物。在每日施用后妥善处置每天的给药悬浮液的残留物和存活阶段后剩下的固体化合物1储料。
参考化合物17β-雌二醇
在研究中使用17β-雌二醇(E2；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)作为参考化合物。根据供应商提供的详细说明处理参考化合物。如下所述，在玻璃小瓶中的苯甲酸苄酯(Sigma-Aldrich)中制备17β-雌二醇的原液，注意将17β-雌二醇完全溶解：
对于实验组3。将1.6mg的17β-雌二醇溶于80.0ml苯甲酸苄酯，得到含20μg/ml的17β-雌二醇的原液。在+4℃和黑暗条件下将原液在其玻璃小瓶中保存，直到每天使用达两周。由原液每天制备新鲜的给药溶液，如下所述：
对于实验组3。在4ml蓖麻油(蓖麻油(ricinus oil)；批号#319108624；目录号4702.1；Carl Roth，Karlsruhe，Germany)中稀释1ml原液，彻底混合并保存在黑暗中。新鲜的给药溶液含有4μg/ml的17β-雌二醇并显示有20％苯甲酸苄酯和80％蓖麻油作为其媒介物组成。在实验组3中使用该溶液处理动物。在它们进行外科OVX手术后一天(在第1天)开始它们的处理并每天一次继续进行达两周(直到第13天)。以1ml/kg的量皮下施用给药溶液，得到4μg/kg/d的皮下17β-雌二醇剂量。在每日施用后妥善处置每天的给药溶液的残留物和存活阶段后剩下的原液。
媒介物
在研究中包括两个接受测试化合物媒介物的组，即实验组1和2。媒介物溶液是无菌水，并且将其在+4℃下保存，直到每天使用达两周。在动物的外科手术后一天(在第天1)开始组1和2中的动物的处理并每天一次继续进行达两周(直到第13天)。以5ml/kg的量口服施用媒介物溶液，得到5ml/kg/d的口服媒介物剂量。在存活阶段后妥善处置媒介物的残留物。
所用方法的描述
骨代谢的生化标志物是用于监测骨质疏松症治疗以及用于预测骨折危险和骨矿物质密度的长期变化的有用工具(Cremers等2008)。在这项研究中，将血清样本用于测量骨代谢的四种生化标志物的水平(Rissanen等2008a，Rissanen等2008b)；即用作骨形成的标志物的PINP(Rat/Mouse PINP EIA；Immunodiagnostic Systems Ltd，Boldon，UK)、用作骨转换的一般性标志物的OC(Rat-MID Osteocalcin EIA；Immunodiagnostic Systems Ltd)、用作骨再吸收的标志物的CTX(RatLaps[CTX-I]EIA；Immunodiagnostic Systems Ltd)和用作破骨细胞数的标志物的TRACP5b(RatTRAP[TRACP5b]ELISA；Immunodiagnostic Systems Ltd)。OC用作骨转换的一般性标志物，因为其在骨形成和骨再吸收期间均在循环中分泌(Cremers等2008)。在收获于研究的存活阶段开始前(在第7天)和存活阶段结束时(在第天14)的样本中测定这四种生化标志物的血清水平。使用第7天获得的水平作为基线水平，并将在第14天获得的水平作为受外科手术和处理影响的水平。根据由供应商提供的说明进行测定，并使用VICTOR2TM多标记计数器(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)对其结果进行定量。在过夜禁食后由侧尾静脉收集用于血清样本的血液，以便避免昼夜变化性。在分别以1∶5和1∶4的比例稀释的血清样本中测量PINP和TRACP5b的水平，并且在没有任何样本稀释的血清中测定OC和CTX的水平。将重复结果低于或高于测定检测限的样本的测量，但在本研究中未获得这样的结果。也将重复其值与其实验组的平均值显著不同的样本的测量，包括与该组的标准偏差(SD)相差超过2.5倍的值。然而，在本研究中没有获得这些类型的值。
程序
研究的存活阶段
存活阶段包括动物安置和处理、外科OVX和假手术、给药、身体和相对子宫重量的测定、处死和收获血样。采用背侧入路在麻醉和无痛条件下进行外科OVX和假手术(Peng等1994，Wronski等1986)。在OVX手术中，将卵巢连同输卵管和一小部分子宫一并移除。采用美托咪啶(0.6mg/kg s.c；CP-Pharma Handelsgesellschaft，Burhdorf，Germany)、氯胺酮(30mg/kg s.c.；Ketaminol；Intervetn International，Boxmeer，The Netherlands)和阿替美唑(2mg/kg s.c；Revertor；CP-Pharma Handelsgesellschaft)注射剂进行麻醉。使用在外科手术前和次日早晨施用的丁丙诺啡(25-37.5μg/kg s.c；Temgesic；Schering-Plough，Kenilworth，NJ，USA)进行术后止痛。必要时在研究期间使用卡洛芬(5mg/kg s.c)作为止痛剂，但不是必需的。在存活阶段结束时(在第14天)，通过在麻醉条件下使用CO2-O2混合物窒息并通过随后的颈脱位处死动物。在研究中包括以下五个实验组：
1)接受媒介物(5ml/kg/d p.o.)的假手术对照大鼠
2)接受媒介物(5ml/kg/d p.o.)的OVX对照大鼠
3)接受17β-雌二醇(4μg/kg/d s.c)的OVX对照大鼠
4)接受测试化合物卡博替尼(1mg/kg/d p.o.)的OVX大鼠
5)接受测试化合物卡博替尼(3mg/kg/d p.o.)的OVX大鼠
每组包括八只在存活阶段开始时为三个月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠。图1中给出研究的实验设计。在整个存活阶段，平日期间每天监测动物的健康状况两次，并且周末期间每天监测动物的健康状况一次。在存活阶段开始前使动物适应动物设施环境达十一天。在存活阶段开始前一周(在第-7天)将动物称重并由侧尾静脉收获它们的血样。根据动物的体重和血清PINP水平通过分层法将它们随机分入若干研究组。
不将健康状况不佳的动物分配到各组中，但在本研究中没有观察到此类动物。通过尾部标记识别动物，并且在受控的温度和光照条件下将来自同一个实验组的两只动物安置在每个笼子中，它们可随意接触到自来水和标准大鼠饲料(Teklad Global Diet2016；HarlanLaboratories，Madison，WI，USA)。在存活阶段开始(在第0天)时，将动物称重，将第2-5组中的动物卵巢切除，并且对第1组中的动物进行假手术。在麻醉和无痛条件下进行外科手术。在手术后一天开始处理并每天一次继续进行达两周(直到第13天)。在第1和2组中使用无菌水作为媒介物。在存活阶段开始时(在第0天)、存活阶段开始后一周(在第7天)和存活阶段结束时(在第14天)测定体重。根据最晚获得的体重调整处理剂量。在两个处理周后(在第14天)，将动物称重，收获它们的血样，将动物处死，并测定它们的相对子宫重量。
研究样本的收获和处理
如下所述收获、处理和保存研究样本。在整个研究中监测所有可能影响样本完整性和/或使用样本获得的原始数据的完整性的条件。对所有样本进行包括以下信息的标记：研究编号、处理组编号、动物编号和样本名称。
血样
在研究的存活阶段开始时(在第-7天)和在存活阶段结束时(在第14天)收获用于血清样本的0.6ml体积的血液。在过夜禁食后由侧尾静脉进行采血，并且在采血和血清处理期间避免溶血。将血液收获到包含铝二氧化硅作为凝血激活剂的血清凝胶管里(Multivette600；Sarstedt Ag&Co，Nümbrecht，Germany)。在收集每个样本后，将其管轻轻地混合，并且使血液凝结30-60分钟。凝血后，在2500g下将样本离心10分钟。将所得到的血清分离并转移到干净的样本管中。由各样本得到30、50、50和60μl体积的等分试样分别用于测量血清PINP、OC、CTX和TRACP5b水平。将这些等分试样和剩余的血清冷冻并保存于-70℃。
实验分析
研究的实验设计示于图6。在研究中进行的实验骨分析包括骨代谢生物标志物的血清水平的测量。这些分析由Pharmatest进行。
骨分析
在研究中进行的骨分析包括骨代谢生物标志物的血清水平的随访。骨代谢的这些生化标志物包括用作骨形成的标志物的PINP、用作骨转换的一般性标志物的OC、用作骨再吸收的标志物的CTX和用作破骨细胞数的标志物的TRACP5b。在研究的存活阶段开始前(在第-7天)和在存活阶段结束时(在第14天)收获的血清样本中测定它们的水平。使用在第-7天获得的水平为基线水平，并且使用在第14天获得的水平为受外科手术和处理影响的水平。来自实验分析的研究材料残留物来自实验分析的所有研究材料残留物可供进行另外的分析和/或可应发起人的要求递送给发起人进行进一步的分析。这种材料已包括了在研究期间收获的剩余血清样本并保存于-70℃。
统计分析
所有的相关数据以具有单位的图形和表格(平均值、SD和统计显著性)以及附录(单独的数据)的形式给出。组内显示出与该组的平均值差异超过SD两倍并具有该偏差的程序性原因的值将被视为异常值，并从分析中剔除。在本研究中没有得到此类值。
以用于Windows的第19版统计软件SPSS(SPSS；Chicago，IL，USA)为双侧检验进行统计分析。低于0.05的p值被视为是统计学显著的。在检查统计模型的假设后，即通过夏皮洛-威尔克检验(Shapiro-Wilk test)检查数据分布的正态性和通过莱文检验(Levene’stest)检查方差齐性，决定使用转换和非参数检验。在违反这些假设的情况下，应用对数或其它适当的转换(即，平方根和倒数)。如果统计模型的假设如此或转换后得到满足，则采用方差的参数单向分析(ANOVA)评价组间差异。如果单向ANOVA显示出统计学显著差异，则将杜奈特检验(Dunnett’s test)用于组间统计比较。如果即使在转换情况下统计模型的假设也得不到满足，则采用非参数克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)来评价各组间差异。如果克鲁斯凯-沃利斯检验显示出统计学显著差异，则将曼-惠特尼u-检验(Mann-Whitneyu-test)用于组间的统计比较。
随访测量
在研究中进行的后续测量包括体重的测定和骨代谢生物标志物的血清水平的测量。使用每只动物中的相对变化对它们的数据进行统计分析。为计算研究的存活阶段的第一周期间的相对变化，用在存活阶段开始后一周(在第7天)获得的值除以在存活阶段开始时(在第0天)获得的值。为计算存活阶段期间的相对变化，用在存活阶段结束时(在第14天)获得的值除以在存活阶段开始时(在第0天)或在存活阶段开始前(在第-7天)获得的值。
终点测量
在研究中进行的终点测量包括用于将动物随机分入研究组的相对子宫重量的测定和体重测定以及血清PINP水平的测量。使用如此在研究的存活阶段结束时(在第14天)和在存活阶段开始前一周(在第-7天)获得的值对它们的数据进行统计分析。
组间比较
进行以下的组间统计比较：
●通过比较用媒介物处理的OVX对照动物(第2组)与用媒介物处理的假手术对照动物(第1组)来研究卵巢切除的短期影响。
●通过比较用测试和参考化合物处理的OVX动物(第3-5组)与用媒介物处理的OVX对照动物(第2组)来研究处理的短期影响。
结果
在本研究中，在三个月龄时将雌性Spague-Dawley大鼠卵巢切除并进行假手术。在外科手术后一天开始它们的处理，并跟踪处理效果两周(存活阶段)。使用化合物1(1-3mg/kg/d p.o.)作为测试化合物，17β-雌二醇(E2；4μg/kg/d s.c)作为参考化合物，并且无菌水作为媒介物(5ml/kg/d p.o.)。通过比较用媒介物处理的OVX对照动物(第2组)与用媒介物处理的假手术对照动物(第1组)来研究卵巢切除的影响。通过比较用E2处理的OVX对照动物(第3组)与用媒介物处理的OVX对照动物(第2组)来研究E2的影响。通过比较用卡博替尼处理的OVX动物(第4-5组)与用媒介物处理的OVX对照动物(第2组)来研究化合物1处理的影响。
表5a和5b总结了结果。向上箭头(个)表示统计学显著增加，而向下箭头(↓)表示统计学显著减少。一个星号(*)表示p值<0.05的统计显著性，两个星号(**)表示p值<0.01的统计显著性，三个星号(***)表示p值<0.001的统计显著性。NS=不显著。
根据表5b，结果表明，在卵巢切除后两周的雌性大鼠中，外科卵巢切除增加体重，减少相对子宫重量，提高血清CTX、OC和PINP水平，并且降低血清TRACP5b活性。
表5a.
在大鼠OVX模型中化合物1对体重的短期影响
表5a.
在大鼠OVX模型中化合物1对骨代谢生物标志物的短期影响
生物标记物结果表明，外科卵巢切除增强骨再吸收，增加骨转换和骨形成，并且减少破骨细胞总数。这些结论意味着卵巢切除在雌性大鼠中加快骨转换的速率。描述卵巢切除的短期影响的结果与文献中发表的结果一致，表明本研究可用于评价OVX大鼠中治疗的临床前药效(Rissanen等2008a，Rissanen等2008b)。
如所指出的那样，骨代谢生物标志物结果表明，在处理两周后的OVX大鼠中，用化合物1以3mg/kg/d的口服剂量处理增强了OVX诱导的骨形成增加和OVX诱导的破骨细胞总数的减少，但不影响OVX诱导的骨再吸收和骨转换的增加。与减少的破骨细胞总数和未改变的骨再吸收水平相关联的增强的骨形成意味着，在雌性大鼠中，以3mg/kg/d的口服剂量用化合物1处理使OVX刺激的骨转换向着骨形成转化。
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其它实施方案
为了清楚和理解的目的，已经借助于图示和实施例相当详细地对前述的公开内容进行了描述。已经参考了多种特定及优选的实施方案和技术对本发明进行了描述。然而要理解的是，在本发明的实质和范围内可以做出许多变化和修改。对本领域技术人员将显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内实施变化和修改。因此要理解的是，上面的描述旨在为示例而非限制性的。
因此，不应参考上面的说明书而是应该参考以下所附的权利要求连同这些权利要求具有的等价形式的全范围来确定本发明的范围。

Claims (15)

1.一种治疗骨质疏松症的方法，包括对需要这种治疗的患者施用式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；
R3是(C1-C6)烷基；
R4是(C1-C6)烷基；且
Q是CH或N。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述式I的化合物是式Ia的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是卤基；
R2是卤基；且
Q是CH或N。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其中所述式I的化合物是化合物1：
或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的化合物，其是N-(4-{[6，7-双(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺。
5.根据权利要求1-4所述的方法，其中所述式(I)、式I(a)的化合物和化合物1是(L)-或(D)-苹果酸盐。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述式(I)的化合物是所述(L)苹果酸盐和/或所述(D)苹果酸盐的结晶N-1形式。
7.根据权利要求1-6所述的方法其中以药物组合物的形式施用所述式I、I(a)的化合物或化合物1或其药学上可接受的盐，所述药物组合物另外包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
8.一种治疗患有癌症或目前正经受癌症治疗的患者的骨质疏松症的方法，包括施用包含式I的化合物或所述式I化合物的苹果酸盐或式I化合物的另一种药学上可接受的盐的药物组合物。
9.一种改善伴随骨质疏松症的骨折增加、脊髓压迫和严重骨痛的非结构化骨骼的异常沉积的方法，包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本文公开的任意实施方案中的式I化合物。
10.一种用于受试者骨质疏松症的预后方法，包括：
(a)测量来自所述受试者的样本中的P1NP、CTx或TRACP5b的水平；
(b)将在步骤(a)中测得的P1NP、CTx或TRACP5b的水平与P1NP、CTx或TRACP5b的标准水平进行比较以确定来自所述受试者的样本是否具有异常的P1NP、CTx或TRACP5b水平；
(c)基于P1NP、CTx或TRACP5b的异常水平选择采用式I、Ia或1的化合物的治疗方案或者根据所述治疗方案施用所述式I、Ia或1的化合物使得所述受试者的骨质疏松症受到抑制。
11.一种在需要这种治疗的患者中刺激成骨细胞分化和/或活性的方法，包括对所述患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
12.一种在需要这种治疗的患者中刺激骨形成的方法，包括对所述患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
13.一种在需要这种治疗的患者中抑制破骨细胞分化和/或活性的方法，包括对所述患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
14.一种在需要这种治疗的患者中调节向着骨形成的骨转换的方法，包括对所述患者施用有效量的式I、Ia的化合物或化合物1。
15.根据权利要求11-14所述的方法其中所述式I的化合物是以介于0.01mg与25mg之间的量每天施用一次的化合物1。
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