TWI564009B - 治療骨質疏鬆症之方法 - Google Patents
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Description
本申請案主張2011年9月22日申請之美國臨時申請案第61/538,039號的優先權,該申請案之全部內容以引用方式併入本文。
本發明係有關使用N-(4-{[6,7-雙(甲氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺來治療骨質疏鬆症。
骨質疏鬆症為特徵在於骨骼質量較低並且骨骼組織微結構退化,導致骨骼脆性增強,從而使骨折風險增加之疾病。該疾病導致骨骼變脆易碎,並且男性及女性均可患此病。骨質疏鬆性骨骼增加了在最小程度外傷之後的骨折風險。在全世界,估計有三千五百萬女性以及一千四百萬男性患有骨質疏鬆症或骨骼質量較低。在美國,每四個50歲以上的成年人中就有一個可能患有骨質疏鬆性骨折。骨質疏鬆症及所導致之骨折造成巨大的公共衛生負擔,部分原因在於該疾病在不為人知之情況下侵害人體-截至患者經診斷患有骨質疏鬆性骨折之時,骨骼已經受到破壞。
骨骼不斷地經歷著稱為重塑的過程。在骨質疏鬆症中發生骨骼流失,原因在於重塑或者骨骼轉換之正常過程
所移除的骨骼超過其所置換的骨骼。骨骼重塑涉及兩個不同階段:骨骼再吸收(分解)及骨骼形成。鈣儲存於骨骼中。當身體中需要鈣時,稱為破骨細胞之骨骼細胞附著至骨骼表面並且將其分解,從而在骨骼中留下空洞。然後,稱為成骨細胞的骨骼形成細胞用稱為類骨質的有機基質填補該等空洞。然後,類骨質自發地藉由磷酸鈣來礦化,從而改造硬骨。保留包埋於基質的成骨細胞被稱為骨細胞。
在衰老期間以及由於可能導致骨骼質量損失風險增加的其他情況(例如在治療前列腺癌或乳癌期間)或由於營養不良,在兩種性別中的骨骼轉換速率均增加,並且在組織層面上,由於個別成骨細胞數量及活性降低而導致成骨細胞性骨骼形成比破骨細胞性骨骼再吸收慢(Marie及Kassem,2011)。骨骼再吸收所耗費之時間少於骨骼形成所耗費之時間。在特定骨骼位點處,骨骼再吸收耗時約兩週;形成耗時三個月或更長。因此,在稱為重塑空間之位置處存在著骨骼不足。通常,其產生的後果很小,但若重塑循環失去平衡,則骨骼轉換可能導致嚴重的骨骼損失。咸信,高度骨骼轉換可增加骨折風險。
因此,仍存在對於治療骨質疏鬆症之方法的需要。
本發明係有關一種治療骨質疏鬆症之方法,滿足了此等及其他需要。該方法包括將治療有效量之化合物投與需要該治療之患者。
在此態樣及其他態樣之一實施例中,該化合物為式I化合物
或其醫藥學上可接受之鹽,其中:R1為鹵基;R2為鹵基;R3為(C1-C6)烷基;R4為(C1-C6)烷基;且Q為CH或N。
在另一實施例中,式I化合物為式Ia化合物。
或其醫藥學上可接受之鹽,其中:R1為鹵基;R2為鹵基;且Q為CH或N。
在另一實施例中,式I化合物為化合物1:
或其醫藥學上可接受之鹽。化合物1係稱為N-(4-{[6,7-雙(甲氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺並且稱為卡波曾替(cabozantinib)。
在另一實施例中,式I、Ia化合物或化合物1以足以改善異常骨骼轉換的影響的劑量以包含醫藥學上可接受之添加劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物形式來投與。
在另一態樣中,本發明提供一種用於治療骨骼質量損失風險增加的患者的骨質疏鬆症之方法。骨骼質量損失風險增加之患者包括絕經後女性及衰老男性患者,或曾經或當前經歷諸如前列腺癌或乳癌之癌症之治療的患者或營養不良之患者。該方法包括將治療有效量之式I、Ia化合物或化合物1投與需要該治療之患者。
在另一態樣中,本發明提供一種用於預防骨質疏鬆症之方法,其包括將治療有效量之式I、Ia化合物或化合物1投與需要該治療之患者。
在另一態樣中,本發明提供一種用於增加骨質疏鬆症患者的骨骼礦物質密度之方法,其包括將治療有效量之式I、Ia化合物或化合物1投與需要該治療之患者。
在此等及其他態樣中,式I化合物治療、改善骨質疏鬆
症或降低其嚴重程度的能力可以使用各種循環或尿標記物或各種成像技術來定性及定量地測定。可適用於用抗再吸收劑治療之骨質疏鬆症患者的個體監測之標記物包括血清總鹼性磷酸酶、血清骨骼特異性鹼性磷酸酶、血清骨鈣素;第1型原膠原C1NP之血清C端原肽或第I型原膠原(P1NP)之血清N端原肽[用於監測骨骼形成];尿羥基脯胺酸、尿總吡啶啉(PYD)、尿游離去氧吡啶啉(DPD)、第1型膠原之尿交聯N端端肽(NTx)、第1型膠原之尿或血清交聯C端端肽(CTx)、骨骼唾液酸蛋白(BSP)及酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)[用於監測骨骼再吸收]。
可適用於評估式I、Ia化合物或化合物1治療、改善骨質疏鬆症或降低其嚴重程度之能力的成像技術包括磁共振成像、正電子發射斷層攝影術、電腦化斷層攝影術(CT)及X射線吸收量測術。
在另一態樣中,本發明提供一種針對個體之骨質疏鬆症的預後方法,其包括:(a)量測來自個體之樣本中的P1NP、CTx或TRACP 5b含量;(b)比較步驟(a)中量測之P1NP、CTx或TRACP 5b含量與P1NP、CTx或TRACP 5b標準含量以確定來自個體之樣本是否具有P1NP、CTx或TRACP 5b之異常含量;(c)基於P1NP、CTx或TRACP 5b異常含量選擇式I、Ia或1化合物之治療方案或根據該治療方案來投與式I、Ia或1化合物以便抑制個體之骨質疏鬆症。
在另一態樣中,本發明提供一種在需要該治療之患者中刺激成骨細胞分化及/或活性之方法,其包括投與患者有效量之式I、Ia化合物或化合物1。
在另一態樣中,本發明提供一種在需要該治療之患者中刺激骨骼形成之方法,其包括投與患者有效量之式I、Ia化合物或化合物1。
在另一態樣中,本發明提供一種在需要該治療之患者中抑制破骨細胞分化之方法,其包括投與患者有效量之式I、Ia化合物或化合物1。
在另一態樣中,本發明提供一種在需要該治療之患者中調整骨骼轉換朝向骨骼形成之方法,其包括投與患者有效量之式I、Ia化合物或化合物1。
在另一態樣中,本發明提供一種治療去卵巢患者的骨質疏鬆症之方法,其包括投與患者有效量之式I、Ia化合物或化合物1。
在另一態樣中,本發明提供一種在去卵巢患者中調整骨骼轉換朝向骨骼形成之方法,其包括投與患者有效量之式I、Ia化合物或化合物1。
縮寫及定義
以下縮寫及術語通篇具有所指示之含義:
符號「-」意謂單鍵,「=」意謂雙鍵。
當描繪或描述化學結構時,除非另外明確陳述,否則假定所有碳均具有氫取代以符合四價。舉例而言,在以下示意圖之左手側上之結構中,蘊涵存在九個氫。在右手結構中描繪出九個氫。有時,結構中之特定原子在文字式中被描述為具有一個或多個氫取代(明確定義之氫),例如-CH2CH2-。普通熟習此項技術者應瞭解上述描述性技術為化學技術中常見的,以便使在其他方面複雜之結構的描述變得簡潔易懂。
若基團「R」描繪為在環系統上「浮動」,如例如在下式中:
則除非另外定義,否則取代基「R」可駐留在環系統之任何原子上,假定置換來自一個環原子的所描繪、所蘊涵或明確定義之氫,只要形成穩定結構。
若基團「R」描繪為在稠環系統上浮動,如例如在以下各式中:
則除非另外定義,否則取代基「R」可駐留在稠環系統之任何原子上,假定置換來自一個環原子的所描繪之氫(例如上式中之-NH-)、所蘊涵之氫(例如在上式中,其中氫未展示但應理解為存在)或明確定義之氫(例如其中在上式中,「Z」等於=CH-),只要形成穩定結構。在所描繪之實例中,「R」基團可駐留在稠環系統之5員或6員環上。當基團「R」描繪為存在於含有飽和碳之環系統中時,如例如在下式中:
其中在此實例中,「y」可為大於一,假定每一R置換環上的當前描繪、所蘊涵或明確定義之氫;則除非另外定義,否則只要所得結構穩定,兩個「R」可駐留在同一碳上。簡單實例是當R為甲基時;在所描繪之環的碳(「環形」碳)上可存在偕位二甲基。在另一實例中,同一碳上的兩個R(包括該碳)可形成環,由此建立螺環(「螺環基」)結構,其中所描繪之環例如處於下式中:
「鹵素」或「鹵基」係指氟、氯、溴或碘。
本文所述之每個反應的「產率」均以理論產率之百分率來表示。
出於本發明目的之「患者」包括人類及其他動物(尤其哺乳動物)及其他生物體。因此,該等方法適用於人類療法及獸醫應用。在另一實施例中,患者為哺乳動物,並且在另一實施例中,患者為人類。
化合物之「醫藥學上可接收之鹽」意謂醫藥學上可接受並且具有母體化合物之所需藥理學活性的鹽。應理解醫藥學上可接受之鹽為無毒的。合適之醫藥學上可接受之鹽的額外資訊可發現於以引用方式併入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版(Mack Publishing Company,Easton,PA,1985)或S.M.Berge等人,「Pharmaceutical Salts」,J.Pharm.Sci.,1977;66:1-19中,兩者均以引用方式併入本文。
醫藥學上可接受之酸加成鹽之實例包括由以下形成之鹽:無機酸,諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、及其類似酸;以及有機酸,諸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、乙二酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡庚糖酸、4,4’-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、黏康酸、對甲苯磺酸、及水楊酸及其類似酸。
「前藥」係指例如通過在血液中水解而在活體內轉化(通常快速)產生以上各式之母體化合物的化合物。常見實例包括但不限於具有攜帶羧酸部分之活性形式的化合物之酯及醯胺形式。本發明化合物之醫藥學上可接受之酯的實例包括但不限於烷基酯(例如具有約一個與約六個之間的碳),烷基為直鏈或分支鏈。可接受之酯亦包括環烷基酯及芳基烷基酯,諸如但不限於苯甲基。本發明化合物之醫藥學上可接受之醯胺的實例包括但不限於一級醯胺及二級及三級烷基醯胺(例如具有約一個與約六個之間的碳)。本發明化合物之醯胺及酯可根據習知方法來製備。前藥之深入討論提供於T.Higuchi及V.Stella,「Pro-drugs as Novel Delivery Systems,」美國化學學會學術討論會叢刊(A.C.S.Symposium Series)第14卷以及Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche編(American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987)中,兩者出於所有目的以引用方式併入本文。
「治療有效量」係在投與患者時改善疾病症狀的本發明化合物之量。治療有效量意欲包括單獨或與有效治療、改善骨質疏鬆症或降低其嚴重程度之其他活性成分組合的化合物之量。構成「治療有效量」的本發明化合物之量將視該化合物、疾病狀況及其嚴重程度、待治療之患者之年齡及其類似因素而變化。治療有效量可由普通熟習此項技術者考慮到其知識及本揭示案來確定,但通常將在每天約0.1至1,000 mg之範圍內,並且更特定在每天1
至100 mg之範圍內。
如本文中所用,疾病、病症或症候群的「治療(treating)」或「治療(treatment)」包括(i)預防疾病、病症或症候群在人類中發生,亦即使疾病、病症或症候群之臨床症狀不在可暴露於或易患疾病、病症或症候群但尚未經歷或顯示疾病、病症或症候群之症狀的動物中發展;(ii)抑制疾病、病症或症候群,亦即阻止其發展;及(iii)減輕疾病、病症或症候群,亦即引起疾病、病症或症候群之消退。如此項技術中已知,針對全身對比局部遞送、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與時間、藥物相互作用及病狀之嚴重程度進行調整可能為必要的,並且該等調整將可藉由常規經驗來確定。
在一個實施例中,式I化合物為式Ia化合物:
或其醫藥學上可接受之鹽,其中:R1為鹵基;R2為鹵基;且Q為CH或N。
在另一實施例中,式I化合物為化合物1:
或其醫藥學上可接受之鹽。
如先前所指示,化合物1在本文中稱為N-(4-{[6,7-雙(甲氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺。WO 2005/030140揭示化合物1並且描述其製造方法(實例12、37、38及48)並且亦揭示此化合物抑制、調節及/或調整激酶之信號轉導的治療活性(分析,表4,條目289)。實例48在WO 2005/030140的段落[0353]中。
在其他實施例中,式I、Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽以醫藥組合物形式投與,其中醫藥組合物另外包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
如本文所述之式I、式Ia化合物及化合物I包括所列舉之化合物以及個別異構體及異構體之混合物。在每種情況下,式I化合物包括所列舉化合物及其任何個別異構體或異構體之混合物的醫藥學上可接受之鹽、水合物及/或溶劑合物。
在其他實施例中,式I、Ia化合物或化合物1可為(L)-蘋果酸鹽。式I化合物及化合物1之蘋果酸鹽揭示於PCT/US2010/021194及61/325095中。
在其他實施例中,式I化合物可為(D)-蘋果酸鹽。
在其他實施例中,式Ia化合物可為蘋果酸鹽。
在其他實施例中,式Ia化合物可為(L)-蘋果酸鹽。
在其他實施例中,化合物1可為(D)-蘋果酸鹽。
在其他實施例中,化合物1可為蘋果酸鹽。
在其他實施例中,化合物1可為(D)-蘋果酸鹽。
在另一實施例中,蘋果酸鹽為如美國專利申請案第61/325095號中所揭示之化合物1之(L)蘋果酸鹽及/或(D)蘋果酸鹽的結晶N-1形式。關於包括化合物1之蘋果酸鹽之N-1及/或N-2結晶形式在內的結晶對映異構體之性質,亦參見WO 2008/083319。製造及表徵該等形式之方法完全描述於全部以引用方式併入本文的PCT/US10/21194中。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括向需要該治療之患者投與治療有效量之本文揭示之任何實施例中之式I化合物。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於100 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。在此實施例及以下實施例中,劑量為大於0 mg之量。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於90 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於80 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於70 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於60 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於50 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於40 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於30 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於20 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於10 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以小於或等於5 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以0.01 mg至25 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以0.1 mg至15 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症之症狀的方法,其包括以1 mg至10 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。
在另一實施例中,本發明係有關一種用於降低已接受乳癌或前列腺癌治療或正在經歷這種治療之患者的骨質疏鬆症之嚴重程度的方法,其包括以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一些實施例中,癌症為乳癌、前列腺癌、骨癌及/或骨腫瘤。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在0.01與25 mg之間。
在另一實施例中,本發明係有關一種改善骨質疏鬆症的伴隨有骨骼骨折增加、脊髓壓迫及嚴重骨骼疼痛的非結構化骨骼異常沈積的方法,其包括以小於或等於1100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與治療有效量之本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在0.01與25 mg之間。
如先前所指示,式I化合物治療、改善骨質疏鬆症或降低其嚴重程度的能力可以使用各種循環或尿標記物來定性及定量地測定。在一些實施例中,適用於用抗再吸收劑治療之骨質疏鬆症患者的個體監測之標記物可選自血清總鹼性磷酸酶、血清骨骼特異性鹼性磷酸酶、血清骨鈣素;血清第1型原膠原(C端/N端):C1NP或P1NP[用於監
測骨骼形成];尿羥基脯胺酸、尿總吡啶啉(PYD)、尿游離去氧吡啶啉(DPD)、第1型膠原之尿交聯N端端肽(NTx)、第1型膠原之尿或血清交聯C端端肽(CTx)、骨骼唾液酸蛋白(BSP)及酒石酸抗性酸性磷酸酶5b[用於監測骨骼再吸收]。
在特定實施例中,標記物為CTx。CTx係在骨骼再吸收期間由破骨細胞裂解的第1型膠原之一部分,並且因此,其血清含量被認為與抽取血液樣本時的破骨細胞活性成比例。因此,血清CTx廣泛地用於監測雙膦酸鹽對於骨骼之效應(Marx等人,2007)。每6個月地諾單抗(Denosumab)在骨質疏鬆症中之骨折減少評估(FREEDOM)試驗的骨骼轉換子研究包括經隨機化為每6個月進行皮下地諾單抗(60 mg)或安慰劑注射歷時3年的160個女性。注射之後一個月,所有經地諾單抗治療之個體中之血清CTx含量均降低至低於絕經前參考區間的水準。此外,在經地諾單抗治療之個體中,在CTx減少與骨骼礦物質密度增加之間有顯著相關性(Eastell等人,2011)。除了對於CTx之此等效應以外,另外在第1階段研究中,一次皮下注射之地諾單抗在停經後的女性中以劑量依賴性方式抑制尿NTx多達81%歷時長達6個月(Bekker等人,2004)。
在另一實施例中,標記物為TRACP-5b。
在患有轉移性閹割抗性前列腺癌之患者中,投與化合物1會導致血漿CTx降低,不論個體以前是否用雙膦酸鹽治療過(Hussain等人,2011)。在已知未患有骨骼轉移之患
者中觀察到使用化合物1之相似效應(Gordon等人,2011),其中先前使用雙膦酸鹽據推測用於治療骨質疏鬆症患者。不論是否先前用雙膦酸鹽治療過並且不論是否存在轉移性骨骼病變,化合物1均減少患者中之血漿CTx含量的能力暗示阻斷異常骨骼轉換之強大療效。
因此,在另一實施例中,本發明係有關一種降低患有骨質疏鬆症之患者中之血漿CTx的方法,其包括每日一次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、或5 mg之每日劑量向需要該治療之患者投與本文揭示之任何實施例中之式I化合物。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在0.01與25 mg之間。
在另一態樣中,本發明提供一種針對個體之骨質疏鬆症的預後方法,其包括:(a)量測來自個體之樣本中的P1NP、CTx或TRACP 5b含量;(b)比較步驟(a)中量測之P1NP、CTx或TRACP 5b含量與P1NP、CTx或TRACP 5b b標準含量以確定來自個體之樣本是否具有P1NP、CTx或TRACP 5b之異常含量;(c)基於P1NP、CTx或TRACP 5b異常含量選擇式I、Ia或1化合物之治療方案或根據該治療方案來投與式I、Ia或1化合物以便抑制個體之骨質疏鬆症。
在另一實施例中,本發明提供一種在需要該治療之患者中刺激成骨細胞分化及/或活性的方法,其包括每日一
次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量投與患者有效量的本文揭示之任何實施例中之式I、Ia化合物或化合物1。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在每日一次0.01與25 mg之間。
在另一態樣中,本發明提供一種在需要該治療之患者中刺激骨骼形成的方法,其包括每日一次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量投與患者有效量的本文揭示之任何實施例中之式I、Ia化合物或化合物1。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在每日一次0.01與25 mg之間。
在另一態樣中,本發明提供一種在需要該治療之患者中抑制破骨細胞分化的方法,其包括每日一次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量投與患者有效量的本文揭示之任何實施例中之式I、Ia化合物或化合物1。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在每日一次0.01與25 mg之間。
在另一態樣中,本發明提供一種在需要該治療之患者中調整骨骼轉換朝向骨骼形成的方法,其包括每日一次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量投與患者有效量的本文揭示之任何實施例中之式
I、Ia化合物或化合物1。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在每日一次0.01與25 mg之間。
在另一態樣中,本發明提供一種治療去卵巢患者之骨質疏鬆症的方法,其包括每日一次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量投與患者有效量的本文揭示之任何實施例中之式I、Ia化合物或化合物1。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在每日一次0.01與25 mg之間。
在另一態樣中,本發明提供一種在去卵巢患者中調整骨骼轉換朝向骨骼形成的方法,其包括每日一次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量投與患者有效量的本文揭示之任何實施例中之式I、Ia化合物或化合物1。在一特定實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在每日一次0.01與25 mg之間。
在另一實施例中,本發明提供一種治療患者之骨質疏鬆症的方法,其包括每日一次以小於或等於100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg之每日劑量投與患者有效量的本文揭示之任何實施例中之式I、Ia化合物或化合物1。在一實施例中,該治療會刺激成骨細胞分化。在另一實施例中,該治療會刺激骨骼形成。在另一實施例中,該治療會抑制破骨細胞分化及/或活性。在另一實施例中,該治
療引起朝向骨骼形成來調整轉換。在此等及其他實施例中,式I化合物為化合物1並且劑量在每日一次0.01與25 mg之間。
投與
以純形式或以合適醫藥組合物形式投與式I、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽可經由任何公認投與模式或達到類似效用之藥劑來執行。因此,投藥可例如經口、經鼻、非經腸(靜脈內、肌肉內或皮下)、局部、經皮、陰道內、膀胱內、腦池內或經直腸,呈固體、半固體、凍乾散劑或液體劑型形式,例如錠劑、栓劑、丸劑、軟質彈性及硬質明膠劑量(可呈膠囊或錠劑形式)、散劑、溶液、懸浮液或氣溶膠或其類似劑型,特定言之呈適合於簡單投與精確劑量之單位劑型。
組合物將包括習知醫藥載劑或賦形劑及作為活性劑之式I化合物,並且另外可包括載劑及佐劑等。
佐劑包括防腐劑、潤濕劑、懸浮劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、乳化劑及分散劑。防止微生物作用可藉由各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸及其類似試劑)來確保。亦可能需要包括等滲劑,例如糖、氯化鈉及其類似試劑。可注射醫藥形式之延長吸收可藉由使用延緩吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。
若需要,則式I化合物之醫藥組合物亦可含有少量輔助物質,例如潤濕或乳化劑、pH緩衝劑、抗氧化劑及其類
似試劑,例如檸檬酸、山梨醇酐單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯等。
組合物之選擇視各種因素而定,例如藥物投與模式(例如,對於經口投與而言,呈錠劑、丸劑或膠囊形式之組合物)及原料藥之生物利用率。最近,已經基於可以通過增加表面積(亦即減小粒徑)來增加生物利用率的原理,尤其針對顯示不良生物利用率之藥物來開發出醫藥組合物。舉例而言,美國專利第4,107,288號描述具有在10至1,000 nm之尺寸範圍內之顆粒的醫藥組合物,其中活性物質支撐於大分子之交聯基質上。美國專利第5,145,684號描述了生產一種醫藥組合物,其中在表面改質劑之存在下,原料藥被磨碎成奈米顆粒(平均粒徑為400 nm),然後分散在液態介質中以給出表現非常高的生物利用率之醫藥組合物。
適合於非經腸注射之組合物可包含生理學上可接受之無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液,及用於重構成無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。合適水性及非水性載劑、稀釋劑、溶劑或媒劑之實例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油及其類似物質)、其合適混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射之有機酯,例如油酸乙酯。適當流動性可例如藉由使用例如卵磷脂之塗層,藉由在分散液之情況下維持所需粒徑以及藉由使用界面活性劑來維持。
一種特定投與途徑為經口,使用可根據待治療之疾病
狀況之嚴重程度來調整的便利的每日給藥方案。
用於經口投與之固體劑型包括膠囊、錠劑、丸劑、散劑及顆粒劑。在該等固體劑型中,活性化合物與以下物質摻合:至少一種惰性習用賦形劑(或載劑),例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣;或(a)填充劑或增量劑,如例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇及矽酸,(b)黏合劑,如例如纖維素衍生物、澱粉、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及阿拉伯膠,(c)保濕劑,如例如甘油,(d)崩解劑,如例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、褐藻酸、交聯羧甲基纖維素鈉、複合物矽酸鹽及碳酸鈉,(e)溶解阻滯劑,如例如石蠟,(f)吸收加速劑,如例如四級銨化合物,(g)潤濕劑,如例如鯨蠟醇及單硬脂酸甘油酯、硬脂酸鎂及其類似試劑,(h)吸附劑,如例如高嶺土及膨潤土,及(i)潤滑劑,如例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉或其混合物。在膠囊、錠劑及丸劑之情況下,劑型亦可包含緩衝劑。
如上所述之固體劑型可製備成具有包衣及外殼,例如腸溶包衣及在此項技術中熟知之其他包衣。其可含有安撫劑,並且亦可具有使其在腸道之某一部分中以延遲方式釋放一或多種活性化合物的組成。可使用之包埋組合物之實例為聚合物質及蠟。活性化合物亦可呈微囊封化形式,適當時具有一或多種上述賦形劑。
用於經口投與之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。該等劑型例如藉由以
下方法來製備:將式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及任選之醫藥佐劑溶解、分散等於載劑(例如水、生理食鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇及其類似物);溶解劑及乳化劑(如例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺);油(尤其棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、及山梨醇酐之脂肪酸酯);或此等物質之混合物,及其類似物中,從而形成溶液或懸浮液。
除了活性化合物以外,懸浮液亦可含有懸浮劑,如例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及山梨醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃蓍膠或此等物質之混合物,及其類似物。
用於直腸投與之組合物例如為栓劑,其可藉由將式I化合物與例如合適之非刺激性賦形劑或載劑(例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟)混合來製備,該等賦形劑或載劑在常溫下為固態但在體溫下為液態,並且因此在處於合適體腔中時融化並且將活性組分釋放於其中。
用於式I化合物之局部投與之劑型包括軟膏、散劑、噴霧劑及吸入劑。活性組分在無菌條件下與生理學上可接受之載劑及可能需要之任何防腐劑、緩衝劑或推進劑摻合。亦涵蓋在本揭示案範圍內之眼科組合物、眼用軟膏、散劑及溶液。
壓縮氣體可用於散佈呈氣溶膠形式之式I化合物。適合
於此用途之惰性氣體為氮氣、二氧化碳等。
通常,視預定投與模式而定,醫藥學上可接受之組合物將含有約1重量%至約99重量%之式I化合物,或其醫藥學上可接受之鹽,及99重量%至1重量%之合適醫藥賦形劑。在一個實例中,組合物將為介於約重量5%與約75重量%之間之式I、式Ia化合物或化合物1,或其醫藥學上可接受之鹽,並且其餘部分為合適醫藥賦形劑。
製備該等劑型之實際方法為熟習此項技術者已知的或顯而易見的;例如,參見Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,(Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990)。在任何情況下,待投與之組合物均將含有根據本揭示案之教示用於治療疾病狀況的治療有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本揭示案之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物以治療有效量投與,該量將視各種因素而變化,該等因素包括所使用之特定化合物之活性、化合物之代謝穩定性及作用時間長度、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與模式及時間、排泄速率、藥物組合、特定疾病狀態之嚴重程度及經歷療法之宿主。式I、式Ia化合物或化合物1可以每天約0.1至約1,000 mg,以及每天約1至約150 mg範圍內之劑量水準投與患者。對於具有約70公斤體重之正常成人,每天每公斤體重約0.01至約100 mg範圍內之劑量為一實例。然而,所使用之特定劑量可變化。舉例而言,劑量可視許多因素而定,該等因素包
括患者之需求、所治療之病狀之嚴重程度,及所使用之化合物之藥理學活性。特定患者之最佳劑量之測定為普通熟習此項技術者所熟知。
在其他實施例中,式I、式Ia化合物或化合物1可與其他癌症治療並行投與患者。該等治療尤其包括其他癌症化學治療劑、荷爾蒙補充療法、放射療法或免疫療法。其他療法之選擇視許多因素而定,該等因素包括化合物之代謝穩定性及作用時間長度、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與模式及時間、排泄速率、藥物組合、特定疾病狀態之嚴重程度及經歷療法之宿主。
在一實施例中,式I、式Ia化合物或化合物1以膠囊形式經口投與。在另一實施例中,化合物1以膠囊形式經口投與。膠囊可含有100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg或更少之化合物1。在一實施例中,劑量在0.01與25 mg之間。
在另一實施例中,式I、式Ia化合物或化合物1以錠劑形式經口投與。
在另一實施例中,化合物1或化合物1之醫藥學上可接受之鹽以在下表中提供之錠劑形式經口投與。
在另一實施例中,化合物1或化合物1之醫藥學上可接受之鹽以在下表中提供之錠劑形式經口投與。
在另一實施例中,化合物1或化合物1之醫藥學上可接受之鹽以在下表中提供之錠劑形式經口投與。
上述錠劑調配物可適於提供95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5 mg或更少化合物1或化合物1之醫藥學上可接受之鹽之經口劑量。在一實施例中,劑量在0.01與25 mg之間。
製備N-(4-{[6,7-雙(甲氧基)喹啉-4-基]氧基}苯
基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺及其(L)-蘋果酸鹽。
用於製備N-(4-[6,7-雙(甲氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺及其(L)-蘋果酸鹽之合成途徑描繪於流程1中:
將6,7-二甲氧基-喹啉-4-醇(10.0 kg)及乙腈(64.0 L)依序饋入反應器。將所得混合物加熱至約65℃並且添加三氯氧磷(POCl3,50.0 kg)。添加POCl3之後,將反應混合物之溫度提高至約80℃。在留下小於2%之起始材料時(過程中之高效液相層析[HPLC]分析),反應被視為完成(約9.0小時)。將反應混合物冷卻至約10℃,然後在二氯甲烷(DCM,
238.0 kg)、30% NH4OH(135.0 kg)及冰(440.0 kg)之已冷卻溶液中驟冷。將所得混合物溫至約14℃,並且分離各相。將有機相用水(40.0 kg)清洗並且藉由真空蒸餾來濃縮以移除溶劑(約190.0 kg)。將甲基第三丁基醚(MTBE,50.0 kg)添加至批料,並且將混合物冷卻至約10℃,在該時間期間,產物結晶出來。將固體藉由離心來回收,用正庚烷(20.0 kg)清洗,並且在約40℃下乾燥以提供標題化合物(8.0 kg)。
將4-氯-6,7-二甲氧基-喹啉(8.0 kg)、4硝基苯酚(7.0 kg)、4二甲胺基吡啶(0.9 kg)及2,6二甲吡啶(40.0 kg)依序饋入反應器。將反應器內容物加熱至約147℃。當反應完成時(如過程中之HPLC分析所測定,留下小於5%之起始材料,約20小時),使反應器內容物冷卻至約25℃。添加甲醇(26.0 kg),隨後添加溶解水(50.0 kg)中之碳酸鉀(3.0 kg)。將反應器內容物攪拌約2小時。將所得固體沈澱物過濾,用水(67.0 kg)清洗,並且在25℃下乾燥約12小時以提供標題化合物(4.0 kg)。
將含有甲酸鉀(5.0 kg)、甲酸(3.0 kg)及水(16.0 kg)之溶液添加至已加熱至約60℃的6,7-二甲氧基-4-(4-硝基-苯氧基)-喹啉(4.0 kg)、10%鈀/碳(50%用水濕潤,0.4 kg)於四氫呋喃(THF,40.0 kg)中之混合物中。執行添加以使得反應混合物之溫度保持於約60℃。當如使用過程中之
HPLC分析所測定,反應被視為完成時(留下小於2%之起始材料,通常15小時),將反應器內容物過濾。在約35℃下藉由真空蒸餾將濾液濃縮至其原始體積之一半,導致產物沈澱。將產物藉由過濾來回收,用水(12.0 kg)清洗,並且在約50℃下真空乾燥以提供標題化合物(3.0 kg;97%之曲線下面積(AUC))。
以使得批料溫度不超過10℃之速率將三乙基胺(8.0 kg)添加至可購得之環丙烷-1,1-二甲酸(2 1,10.0 kg)於THF(63.0 kg)中之冷卻(約4℃)溶液中。將溶液攪拌約30分鐘,然後在保持批料溫度低於10℃下,添加亞硫醯氯(9.0 kg)。當添加完成時,以使得批料溫度不超過10℃之速率添加4-氟苯胺(9.0 kg)於THF(25.0 kg)中之溶液。將混合物攪拌約4小時,然後用乙酸異丙酯(87.0 kg)稀釋。將此溶液用氫氧化鈉水溶液(溶解於50.0 L水中之2.0 kg)、水(40.0 L)及氯化鈉水溶液(溶解於40.0 L水中之10.0 kg)依序清洗。將有機溶液藉由真空蒸餾來濃縮,隨後添加庚烷,導致固體沈澱。將固體藉由離心來回收,然後在約35℃下真空乾燥以提供標題化合物(10.0 kg)。
以使得批料溫度不超過30℃之速率將乙二醯氯(1.0 kg)添加至1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(2.0 kg)於THF(11 kg)與N,N-二甲基甲醯胺(DMF;0.02 kg)之混合物中之溶液中。此溶液在無進一步處理的情況下用於下一
步驟中。
以使得批料溫度不超過30℃之速率將來自先前步驟的含有1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲醯氯之溶液添加至4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(3.0 kg)及碳酸鉀(4.0 kg)於THF(27.0 kg)及水(13.0 kg)中之混合物中。當反應完成時(通常在10分鐘內),添加水(74.0 kg)。將混合物在15-30℃下攪拌約10小時,導致產物沈澱。將產物藉由過濾來回收,用THF(11.0 kg)與水(24.0 kg)之預製溶液清洗,並且在約65℃下真空乾燥約12小時以提供標題化合物(游離鹼,5.0 kg)。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO):δ 10.2(s,1H),10.05(s,1H),8.4(s,1H),7.8(m,2H),7.65(m,2H),7.5(s,1H),7.35(s,1H),7.25(m,2H),7.15(m,2H),6.4(s,1H),4.0(d,6H),1.5(s,4H).LC/MS:M+H=502。
在維持約25℃之批料溫度下,將L-蘋果酸(2.0 kg)於水(2.0 kg)中之溶液添加至環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺游離鹼(1 5,5.0 kg)於乙醇中之溶液中。然後添加碳(0.5 kg)及硫醇二氧化矽(0.1 kg),且將所得混合物加熱至約78℃,此時添加水(6.0 kg)。然後過濾反應混合物,隨後添加異丙醇(38.0 kg),並且使其冷卻至約25℃。將產物藉由過濾
來回收並且用異丙醇(20.0 kg)清洗,並且在約65℃下乾燥以提供標題化合物(5.0 kg)。
可用於製備N-(4-[6,7-雙(甲氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺及其(L)-蘋果酸鹽之替代性合成途徑描繪於流程2中。
將6,7-二甲氧基-喹啉-4-醇(47.0 kg)及乙腈(318.8 kg)依序饋入反應器。將所得混合物加熱至約60℃並且添加三氯氧磷(POCl3,130.6 kg)。添加POCl3之後,將反應混合物之溫度提高至約77℃。在留下小於3%之起始材料時(過
程中之高效液相層析[HPLC]分析),反應被視為完成(約13小時)。將反應混合物冷卻至約2-7℃,然後在二氯甲烷(DCM,482.8 kg)、26%之NH4OH(251.3 kg)及水(900 L)之已冷卻溶液中驟冷。將所得混合物溫至約20-25℃,並且分離各相。有機相經由AW hyflo super-cel NF(矽藻土;5.4 kg)床過濾並且過濾床用DCM(118.9 kg)清洗。將組合之有機相用鹽水(282.9 kg)清洗並且與水(120 L)混合。分離各相並且藉由真空蒸餾來濃縮有機相,並移除溶劑(約95 L殘留體積)。將DCM(686.5 kg)饋入含有有機相之反應器並且藉由真空蒸餾來濃縮,並移除溶劑(約90 L殘留體積)。然後饋入甲基第三丁基醚(MTBE,226.0 kg),並且將混合物之溫度調整至-20至-25℃並且保持2.5小時,產生固體沈澱物,然後將其過濾並用正庚烷(92.0 kg)清洗,並且在約25℃下在氮氣下在過濾器上乾燥以提供標題化合物(35.6 kg)。
在20-25℃下將溶解於N,N-二甲基乙醯胺(DMA,184.3 kg)中之4-胺苯酚(24.4 kg)饋入含有4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(35.3 kg)、第三丁醇鈉(21.4 kg)及DMA(167.2 kg)之反應器中。然後將此混合物加熱至100-105℃並保持約13小時。在如使用過程中之HPLC分析所測定,反應被視為完成(留下小於2%之起始材料)之後,在15-20℃下冷卻反應器內容物並且以維持15-30℃溫度之速率饋入水(預冷卻,2-7℃,587 L)。將所得固體沈澱物過濾,用水(47 L)與
DMA(89.1 kg)之混合物清洗並且最後用水(214 L)清洗。然後將濾餅在約25℃下在過濾器上乾燥以產生粗4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(基於LOD計算,59.4 kg濕重,41.6 kg乾重)。將粗4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺在四氫呋喃(THF,211.4 kg)與DMA(108.8 kg)之混合物中回流(約75℃)約1小時,然後冷卻至0-5℃並且老化約1小時,在該時間之後,將固體過濾,用THF(147.6 kg)清洗並且在過濾器上在真空下在約25℃下乾燥以產生4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(34.0 kg)。
將4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(34.8 kg)及4-胺基苯酚(30.8 kg)及第三戊醇鈉(1.8當量)88.7 kg,於THF中之35重量%)饋入反應器,隨後饋入N,N-二甲基乙醯胺(DMA,293.3 kg)。然後將此混合物加熱至105-115℃並保持約9小時。在如使用過程中之HPLC分析所測定,反應被視為完成(留下小於2%之起始材料)之後,在15-25℃下冷卻反應器內容物並且在將溫度維持在20-30℃之間的同時在兩小時時間內添加水(315 kg)。然後在20-25℃下將反應混合物再攪拌一小時。將粗產物藉由過濾來收集並且用88 kg水與82.1 kg DMA之混合物清洗,隨後用175 kg水清洗。將產物在過濾乾燥器上乾燥53小時。LOD顯示小於1% w/w。
在替代程序中,使用1.6當量第三戊醇鈉並且反應溫度自110℃增加至120℃。另外,冷卻溫度增加至35-40℃並且添加水之起始溫度調整至35-40℃,並且允許溫升至
45℃。
以使得批料溫度不超過5℃之速率將三乙基胺(19.5 kg)添加至環丙烷-1,1-二甲酸(24.7 kg)於THF(89.6 kg)中之冷卻(約5℃)溶液中。將溶液攪拌約1.3小時,然後在保持批料溫度低於10℃下,添加亞硫醯氯(23.1 kg)。當添加完成時,在保持溫度低於10℃下,將溶液攪拌約4小時。然後以使得批料溫度不超過10℃之速率添加4-氟苯胺(18.0 kg)於THF(33.1 kg)中之溶液。將混合物攪拌約10小時,之後反應被視為完成。然後,用乙酸異丙酯(218.1 kg)稀釋反應混合物。此溶液依序用氫氧化鈉水溶液(10.4 kg,溶解於119 L水中之50%)清洗,進一步用水(415 L)稀釋,然後用水(100 L)以及最後用氯化鈉水溶液(溶解於100 L水中之20.0 kg)清洗。在低於40℃下藉由真空蒸餾來濃縮有機溶液(100 L殘留體積),隨後添加正庚烷(171.4 kg),導致固體沈澱。將固體藉由過濾來回收並且用正庚烷(102.4 kg)清洗,產生濕潤的粗1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(29.0 kg)。在約25ºC下將粗的1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸溶解於甲醇(139.7 kg)中,隨後添加水(320 L),產生漿液,其藉由過濾來回收,依序用水(20 L)及正庚烷(103.1 kg)清洗,然後在過濾器上在約25℃下在氮氣下乾燥以提供標題化合物(25.4 kg)。
以使得批料溫度不超過25℃之速率將乙二醯氯(12.6
kg)添加至1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(22.8 kg)於THF(96.1 kg)與N,N-二甲基甲醯胺(DMF;0.23 kg)之混合物中之溶液中。此溶液在無進一步處理的情況下用於下一步驟中。
將1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(35 kg)、344 gDMF及175 kg THF饋入反應器。將反應混合物調整至12-17℃,然後將19.9 kg乙二醯氯在1小時時間內饋入反應混合物。反應混合物保持在12-17℃下攪拌3至8小時。此溶液在無進一步處理的情況下用於下一步驟中。
以使得批料溫度不超過30℃之速率將來自先前步驟的含有1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲醯氯之溶液添加至化合物4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(23.5 kg)及碳酸鉀(31.9 kg)於THF(245.7 kg)及水(116 L)中之混合物中。當反應完成時(在約20分鐘內),添加水(653 L)。將混合物在20-25℃下攪拌約10小時,導致產物沈澱。將產物藉由過濾來回收,用THF(68.6 kg)與水(256 L)之預製溶液清洗,並且首先在過濾器上在氮氣下在約25℃下乾燥,然後在約45℃下在真空下乾燥以提供標題化合物(41.0 kg,38.1 kg,基於LOD計算)。
將4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(35.7 kg,1當量)饋入反應器,隨後饋入412.9 kg THF。將48.3 K2CO3於169 kg水中之溶液饋入反應混合物。在最少兩個小時內,在將溫度保持在20-30℃之間的同時,將以上在替代性製備1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲醯氯中描述之酸性氯化物溶液轉移至含有4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺之反應器中。將反應混合物在20-25℃下攪拌最少三小時。然後將反應溫度調整至30-25℃並且攪拌混合物。停止攪拌並且使混合物之各相分離。移出並丟棄下部水相。向其餘上部有機相中添加804 kg水。反應在15-25℃下保持攪拌最少16小時。
產物沈澱。過濾產物並且用179 kg水及157.9 kg THF之混合物分兩部分來清洗。將粗產物在真空下乾燥至少兩小時。然後將乾燥之產物溶解於285.1 kg THF中。將所得懸浮液轉移至反應容器並且攪拌直至懸浮液變為透明(溶解)溶液為止,該過程需要加熱至30-35℃並保持約30分鐘。然後在兩小時內將456 kg水以及20 kg SDAG-1乙醇(藉由甲醇變性之乙醇)添加至溶液。將混合物在15-25℃下攪拌至少16小時。過濾產物並且用143 kg水及126.7 THF之混合物分兩部分來清洗。將產物在40℃之最大溫度設定點下乾燥。
在替代程序中,將酸性氯化物形成期間之反應溫度調整至10-15℃。將再結晶溫度自15-25℃改變至45-50℃並保持1小時,然後經2小時冷卻至15-25℃。
將環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺(1-5;13.3 kg)、L-蘋果酸(4.96 kg)、甲基乙基酮(MEK;188.6 kg)及水(37.3 kg)饋入反應器並且將混合物加熱至回流(約74℃)並保持約2小時。將反應器溫度降低至50至55℃並且過濾反應器內容物。以類似量之起始材料(13.3 kg)、L-蘋果酸(4.96 kg)、MEK(198.6 kg)及水(37.2 kg)開始,將上述此等依序步驟再重複兩次。在約74℃下使用MEK(1133.2 kg)(近似殘留體積711 L;KF0.5% w/w)將組合之濾液在大氣壓下共沸乾燥。將反應器內容物之溫度降低至20至25℃並且保持約4小時,產生固體沈澱物,將其過濾、用MEK(448 kg)清洗並且在真空下在50℃下乾燥以提供標題化合物(45.5 kg)。
將環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺(47.9 kg)、L-蘋果酸(17.2)、658.2 kg甲基乙基酮及129.1 kg水(37.3 kg)饋入反應器並且將混合物加熱至50-55℃並保持約1-3小時,然後在55-60℃下再加熱4-5小時。藉由經由1 μm濾筒過濾來澄清混合物。將反應器溫度調整至20-25℃並且在150-200 mm Hg之真空下在55℃之最大夾套溫度下真空蒸餾至
558-731 L之體積範圍內。
在分別饋入380 kg及380.2 kg甲基乙基酮的情況下再執行真空蒸餾兩次。在第三次蒸鎦之後,藉由饋入159.9 kg甲基乙基酮以給出880 L之總體積,將批料體積調整至18 v/w之環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺。藉由調整245.7甲基乙基酮來執行額外真空蒸餾。反應混合物在20-25℃下保持適度攪拌至少24小時。過濾產物並且用415.1 kg甲基乙基酮分三部分清洗。在45℃之夾套溫度設定點下在真空下乾燥產物。
在替代程序中,改變添加順序以使得將溶解於129.9 kg水中之17.7 kg L-蘋果酸溶液添加至甲基乙基酮(673.3 kg)中之環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺(48.7 kg)中。
此研究之目的為調查7種濃度之化合物1對於活體外人類破骨細胞及小鼠成骨細胞之分化及活性的效應。測試以下濃度:0.004、0.012、0.037、0.11、0.33、1.0及3.0 μM。使用在牛骨骼切片上培養的人類骨髓衍生之CD34+破骨細胞前驅細胞及經誘導以分化成骨骼形成性成骨細胞之KS483小鼠骨前驅細胞來執行研究。
研究分四部分執行。在第一部分中,人類骨髓衍生之
CD34+破骨細胞前驅細胞在牛骨骼切片上培養7天,之後藉由量測培養基中之酒石酸抗性酸性磷酸酶5b活性(TRACP 5b)來定量形成之破骨細胞定量。此分析證明化合物1對於破骨細胞分化之效應。將作為破骨細胞分化之參考抑制劑之骨保護素(OPG)包括在內以證明培養系統如預期起作用。
在第二部分中,在第7天將人類破骨細胞之培養基置換成新的培養基,並且將形成之成熟破骨細胞再培養3天,使其再吸收骨骼。在第7天將化合物1添加至培養基中。此分析證明化合物1對於成熟破骨細胞之骨骼再吸收活性的效應。在第10天收集之培養基中量測第I型膠原之C端交聯端肽(CTX)以定量第7-10天期間之骨骼再吸收。在第7天量測TRACP 5b以定量添加化合物1之前的破骨細胞數量。將CTX值除以TRACP 5b值,產生指示平均破骨細胞活性之再吸收指數。將作為破骨細胞活性之參考抑制劑的半胱胺酸蛋白酶抑制劑E64包括在內以證明培養系統如預期起作用。
在第三部分中,將KS483小鼠骨前驅細胞培養8天,之後藉由量測細胞內鹼性磷酸酶(ALP)活性量來定量形成之成熟成骨細胞定量。此分析證明化合物1對於成骨細胞分化之效應。將17ß-雌二醇作為刺激成骨細胞分化之參考化合物包括在研究中以證明培養系統如預期起作用。
在研究之第四部分中,將KS483小鼠骨前驅細胞培養13天,在此期間在第11天測定分泌至培養基中之第I型原膠
原之N端原肽(PlNP)以證明對於有機骨基質形成之效應,並且在第13天測定沈積於所形成之骨基質中之鈣的量以證明對於無機骨基質形成之效應。此成骨細胞活性分析證明化合物1對於成骨細胞之骨骼形成活性的效應。將17ß-雌二醇作為刺激成骨細胞分化及活性之參考化合物包括在研究中以證明培養系統如預期起作用。
化合物1顯示對破骨細胞分化之劑量依賴性抑制,該抑制對於0.11、0.33、1.0及3.0 μM濃度為顯著的。顯微分析顯示0.11及0.33 μM濃度不影響Hoechst及TRACP陽性單核細胞之數量,表明對於破骨細胞分化之特異性抑制作用。然而,1.0及3.0 μM濃度降低Hoechst及TRACP陽性單核細胞之數量,表明對於此等濃度所觀察到的抑制效應至少部分地具有細胞毒性。在破骨細胞活性分析中未觀察到任何效應。
化合物1顯示對成骨細胞分化及活性的劑量依賴性刺激。在成骨細胞分化分析中,化合物1的0.012、0.037、0.11、0.33及1.0 μM濃度增加ALP值,並且3.0 μM之濃度降低ALP值。在成骨細胞活性分析中,0.012及0.037 μM之濃度增加PlNP值,並且0.004、0.012、0.037及0.11 μM之濃度增加鈣值。0.33、1.0及3.0 μM之濃度降低PlNP及鈣值。此等結果證明化合物1之0.004、0.012、0.037及0.11 μM濃度對於骨骼細胞具有有利效應,活化成骨細胞骨骼形成並且對於骨骼再吸收性破骨細胞之形成不具有效應或起抑制作用。
此研究之目的為調查由主持者所選擇之化合物1對於活體外人類破骨細胞及小鼠成骨細胞之分化及活性的效應。使用模型來研究對於破骨細胞之效應,在該模型中骨髓衍生之人類破骨細胞前驅細胞在有利於破骨細胞分化之條件下在牛骨骼切片上培養7天,並且使其分化成骨骼再吸收性破骨細胞。在第7天破骨細胞分化完成之後,將培養基移出並且將有利於破骨細胞活性之新的培養基添加至孔中。然後將成熟破骨細胞再培養3天,使其再吸收骨骼。在破骨細胞分化分析中,在第0天將測試化合物及參考抑制劑骨保護素(OPG)添加至培養物中。在破骨細胞活性分析中,在第7天將測試化合物及參考抑制劑E64添加至培養物中。在兩種分析中測試重複8次之七種濃度。在第7天收集之培養基中量測酒石酸抗性酸性磷酸酶5b活性(TRACP 5b),作為在分化期期間每個孔中形成之破骨細胞數量之指數。在第10天收集之培養基中量測第I型膠原之C端交聯端肽(CTX)以定量第7-10天期間之骨骼再吸收。
使用可經誘導以分化成骨骼形成性成骨細胞的KS483小鼠骨前驅細胞來研究對於成骨細胞之效應。將17ß-雌二醇(E2)作為刺激成骨細胞分化及活性之參考化合物包括在研究中,以便證明培養系統可偵測成骨細胞分化及活性之刺激。在成骨細胞分化分析中,將細胞培養8天,之後藉由量測細胞內鹼性磷酸酶(ALP)活性量來定量形
成之成熟成骨細胞。在成骨細胞活性分析中,將骨前驅細胞培養13天,在此期間在第11天測定分泌至培養基中之第I型原膠原之N端原肽(PlNP)以證明對於有機骨基質形成之效應,並且在第13天測定沈積於所形成之骨基質中之鈣的量以證明對於無機骨基質形成之效應。
在含有包括媒劑之基準組、包括參考化合物之對照組及包括測試化合物之組的96孔板中執行測試。將參考化合物包括在內以證明測試系統如預期起作用。在破骨細胞培養物中,若對照組之結果顯著低於基準組之結果,則批准該研究。在成骨細胞培養物中,若對照組之結果顯著高於基準組之結果,則批准該研究。
化合物1以固體化合物形式自主持者獲得。將化合物以10 mM濃度懸浮於DMSO以獲得儲備溶液。在測試之前製成新鮮的儲備溶液,將其在室溫下在乾燥狀態下儲存於黑暗處。對於長期儲存(大於5天),將儲備溶液儲存於-70℃下。自儲備溶液製備適當稀釋液以獲得所需測試濃度;0.004 μM、0.012 μM、0.037 μM、0.11 μM、0.33 μM、1 μM及3 μM。
骨保護素(OPG,5 nM,目錄號450-14,獲自PeproTech EC Ltd,London,UK)用作破骨細胞分化之參考抑制劑並且半胱胺酸蛋白酶抑制劑E64(1_M,目錄號E-3132,獲自Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)用作破骨細胞再吸收活
性之參考抑制劑。
17ß-雌二醇(E2;10 nM,目錄號E1024,獲自Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)用作成骨細胞分化及活性之參考刺激劑。
骨骼切片上之破骨細胞培養方法最初由Boyde及合作者(1984)以及Chambers及合作者(1984)描述。最初,藉由在顯微鏡下計算酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP)陽性多核細胞之數量來測定破骨細胞之數量。後來,證明所分泌之TRACP 5b活性反映小鼠破骨細胞培養物中之破骨細胞的數量(Alatalo等人,2000)。雖然所分泌之TRACP 5b活性與破骨細胞之數量強烈相關,但在TRACP陽性單核破骨細胞前驅細胞分化成成熟多核破骨細胞之前,其並不分泌TRACP 5b。因此,所分泌之TRACP5b為成熟多核破骨細胞之數量的可靠標記物。
培養物中之骨骼再吸收速率最初藉由使用具有相差物鏡之顯微鏡來計數每個骨骼或牙質切片上之再吸收坑的數量而測定。後來,使用顯微鏡及電腦輔助影像分析系統,利用與骨骼中之再吸收區域特異性結合的小麥胚芽凝集素植物凝集素來對坑進行目測,從而可定量總的再吸收區域定量。此等方法具有兩個缺點:其為耗時的並且其不能偵測再吸收坑之深度的差異,從而可造成虛假的結果。後來,證明第I型膠原之C端交聯端肽(CTX)將定
量釋放至培養基中之骨骼膠原降解產物(Bagger等人,1999)。此方法為快速並且靈敏的,並且其為總的再吸收體積(包括坑深度)之可靠參數。
人類破骨細胞培養系統經開發用於此項研究中,其中源自人類骨髓之CD34+破骨細胞前驅細胞(Poietics®人類破骨細胞前驅體,Lonza,Walkersville,USA)在牛骨骼切片上在包括M-CSF及RANK-配體之合適生長因子的存在下培養(Rissanen等人2009)。首先使細胞分化成成熟骨骼再吸收性破骨細胞,然後使所形成之破骨細胞再吸收骨骼。在分化及/或再吸收時期開始時,將測試及參考化合物添加至細胞培養物中,並且測定其對於破骨細胞分化及/或再吸收活性的效應。
在分化期之後,使用可購得之方法(BoneTRAPÒ,IDS Ltd,Boldon,UK)測定培養基中分泌之TRACP 5b。分泌之TRACP 5b精確地描述在分化期期間每個孔中形成之破骨細胞之數量。再吸收期之後,使用可購得之方法(針對培養物之CrossLapsÒ,IDS Ltd,Boldon,UK)來測定培養基中之CTX。CTX精確地描述在再吸收期期間釋放至每個孔中之培養基中的骨骼膠原降解產物之量。說明平均破骨細胞活性之再吸收指數(Rissanen等人2009)藉由將所獲得之再吸收體積(CrossLapsÒ值)除以破骨細胞之數量(BoneTRAPÒ值)來計算。
成骨細胞為來自間質乾細胞之骨骼形成細胞。在成骨
細胞發育期間,已定義三個不同時期:1)細胞外基質(ECM)之細胞增殖及分泌;2)ECM成熟;3)ECM礦化。在此等時期期間,成骨細胞表型標記物之依序表現已得到表徵。鹼性磷酸酶(ALP)與骨細胞表型相關並且在成骨細胞成熟期間活躍地表現。第I型原膠原之N端原肽(PlNP)為第I型膠原合成及ECM產生之標記物並且在臨床前研究中為用於評估新骨質疏鬆症藥物候選物的相關量度(Rissanen等人2008)。在礦化開始時,大量鈣及羥磷灰石沈積於成熟有機基質中以形成骨骼樣結節。遵循此等標記物,可研究培養系統中之成骨細胞分化及活性之所有階段。
建立若干模型系統以研究成骨細胞。自顱蓋分離具有成骨細胞表型之細胞為第一個嘗試。然而,此等細胞僅代表成熟階段之成骨細胞,因為僅一小部分顱骨細胞為成骨細胞前驅體(Bellows等人1989)。或者,可刺激間質骨髓細胞或祖細胞之細胞株以分化成骨細胞。自小鼠顱蓋選殖之KS483細胞為雌激素反應性成骨細胞前驅體,其能夠在活體外分化成骨骼形成性成骨細胞並且形成礦化骨骼結節(Dang等人2002)。
建立一種培養系統,其可用作活體外研究合成代謝及雌激素樣化合物對於成骨細胞分化及活性之效應的模型。在此培養系統中,小鼠KS483細胞首先增殖,然後分化成能夠在抗壞血酸及ß-甘油磷酸酯存在下形成礦化骨骼結節之成骨細胞(Fagerlund等人2009)。伴隨著培養基
更換,將測試及參考化合物添加至細胞培養物中,並且測定其對於成骨細胞分化及活性之效應。如先前所描述(Lowry等人1954),測定細胞裂解物中作為成骨細胞分化標記物之細胞ALP。使用可購得之方法(大鼠/小鼠PlNP EIA,IDS Ltd,Boldon,UK)來測定培養基中作為有機骨基質形成標記物之分泌PlNP。使用可購得之鈣分析(Roche Diagnostics)來量測作為無機骨基質形成之指數的鈣沈積。
在此項研究中,人類骨髓衍生之CD34+幹細胞(10000個細胞/孔)懸浮於培養基中並且使其附著至96孔組織培養板中之牛骨骼切片。將培養基(含有10% FBS,OCP BulletKit® Lonza,Walkersville,USA)用200 μl培養基中之適量的有利於破骨細胞分化及活性之重要生長因子來補充,該等因子包括M-CSF(33 ng/ml,OCP BulletKit® Lonza,Walkersville,USA)及RANK-配體(66 ng/ml,OCPBulletKit® Lonza,Walkersville,USA)。在37℃下將細胞在CO2恆溫箱中在95%空氣與5%二氧化碳之加濕氛圍中培育7天。在第0天添加測試化合物及參考化合物OPG。將在第7天收集之上清液在-70℃下儲存直至分析TRACP 5b為止。使用VICTOR2TM多標記計數器(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)來量測培養基(20微升/樣本)中之TRACP 5b。將細胞用3%多聚甲醛固定並且針對TRACP活
性(白細胞酸性磷酸酶套組;Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)及Hoechst 33258(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)來染色。
以下各組包括在內(每個組含有8次重複):板1:
1)具有媒劑(DMSO)之基準組
2)具有5 nM OPG之對照組
3)0.004 μM化合物1
4)0.012 μM化合物1
5)0.037 μM化合物1
6)0.11 μM化合物1
7)0.33 μM化合物1
8)1.0 μM化合物1
9)3.0 μM化合物1
在此項研究中,人類骨髓衍生之CD34+幹細胞(10000個細胞/孔)懸浮於培養基中並且使其附著至96孔組織培養板中之牛骨骼切片。將培養基(含有10% FBS,OCP BulletKit® Lonza,Walkersville,USA)用200 μl培養基中之適量的有利於破骨細胞分化及活性之重要生長因子來補充,該等因子包括M-CSF(33 ng/ml,OCP BulletKit® Lonza,Walkersville,USA)及RANK-配體(66 ng/ml,OCP BulletKit® Lonza,Walkersville,USA)。在37℃下在CO2恆溫箱中在95%空氣與5%二氧化碳之加濕氛圍中培育細
胞。在第7天破骨細胞分化結束之後,將所有培養基移出並且將有利於破骨細胞活性之新的200 μl培養基添加至孔中。
將成熟破骨細胞再培養3天,使其再吸收骨骼。破骨細胞分化期完成之後,在第7天添加測試化合物及參考化合物E64。將第7天及第10天收集之上清液在-70℃下儲存直至分析TRACP 5b及CTX為止。使用VICTOR2TM多標記計數器(PerkinElmer,Waltham,MA,USA),量測第7天收集之培養基(20微升/樣本)中之TRACP 5b並且量測第10天收集之培養基(50微升/樣本)中之CTX。
以下各組包括在內(每個組含有8次重複):板1:
1)具有媒劑(DMSO)之基準組
2)具有1_M E64之對照組
3)0.004 μM化合物1
4)0.012 μM化合物1
5)0.037 μM化合物1
6)0.11 μM化合物1
7)0.33 μM化合物1
8)1.0 μM化合物1
9)3.0 μM化合物1
小鼠KS483細胞在T-75組織培養燒瓶中在補充有10%木炭吸附之胎牛血清的aMEM中培養直至80-90%匯合為止。
在37℃下在CO2恆溫箱中在95%空氣與5%二氧化碳之加濕氛圍中培育細胞。在達到80-90%匯合之後,製備次培養物。在胰蛋白酶處理的情況下將細胞自燒瓶中移出並且計數。為了誘導成骨細胞成熟及骨骼形成,將未成熟之成骨細胞細胞塗覆於第I型膠原塗佈之96孔板中。在補充抗壞血酸(50_g/ml)的情況下將細胞培養8天,並且每3-4天更換一半培養基。在培養期開始時並且在更換培養基時,添加測試化合物及對照物質(E2)。在第8天藉由自孔中移出培養基來停止培養物,並且製備細胞裂解物。使用VICTOR2TM多標記計數器(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)定量細胞ALP活性及總蛋白質含量(蛋白質分析(Protein Assay),Bio-Rad Laboratories Inc,CA,USA)。
以下各組包括在內(每個組含有8次重複):板1:
1)具有媒劑(DMSO)之基準組
2)具有10 nM E2之對照組
3)0.004 μM化合物1
4)0.012 μM化合物1
5)0.037 μM化合物1
6)0.11 μM化合物1
7)0.33 μM化合物1
8)1.0 μM化合物1
9)3.0 μM化合物1
小鼠KS483細胞在T-75組織培養燒瓶中在補充有10%木炭吸附之胎牛血清的αMEM中培養直至80-90%匯合為止。在37℃下在CO2恆溫箱中在95%空氣與5%二氧化碳之加濕氛圍中培育細胞。在達到80-90%匯合之後,製備次培養物。在胰蛋白酶處理的情況下將細胞自燒瓶中移出並且計數。為了誘導成骨細胞成熟及骨骼形成,將未成熟之成骨細胞細胞塗覆於第I型膠原塗佈之96孔板中。在補充抗壞血酸(50 μg/ml)及ß-甘油磷酸酯(5 mM)的情況下將細胞培養13天,並且每3-4天更換一半培養基。在培養期開始時並且在更換培養基時,添加測試化合物及對照物質(E2)。在第11天量測培養基中作為有機骨基質形成之標記物的分泌PlNP。在第13天藉由自孔中移出培養基並且添加鹽酸來停止培養物。沈積於所形成之骨基質中之鈣使用VICTOR2TM多標記計數器(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)來定量。
以下各組包括在內(每個組含有8次重複):板1:
1)具有媒劑(DMSO)之基準組
2)具有10 nM E2之對照組
3)0.004 μM化合物1
4)0.012 μM化合物1
5)0.037 μM化合物1
6)0.11 μM化合物1
7)0.33 μM化合物1
8)1.0 μM化合物1
9)3.0 μM化合物1
所有相關資料均以具有單位之圖及/或表[平均值、標準偏差(SD)及統計學顯著性]形式來呈現。統計分析用Origin統計軟體(OriginLab公司,Northampton,MA,USA)來執行。單向方差分析(ANOVA)用於研究不同組(基準相比於參考抑制劑及測試化合物)之間獲得的值是否在統計上不同(其中p<0.05)。若單向ANOVA揭示統計上顯著之差異,則t-測試用於各組之間之統計比較。
在第7天如第1圖中描繪來量測化合物1對於破骨細胞分化之效應。結果以分泌至培養基中之TRACP 5b活性(U/L)來展示。在此圖及其他圖中,BL意謂基準(未添加化合物);C意謂對照(5.0 nM OPG)。使用單向ANOVA將結果與BL相比(在所有組之間p小於0.001)。三個星號(***)指示統計上顯著之抑制效應,其中p值小於0.001。兩個星號(**)指示統計上顯著之效應,其中p值小於0.01。一個星號(*)指示p值小於0.05。圖中具有圓括號之星號([***])指示相對於基準水準之顯著差異。
結果進一步概述於表1中。如圖中,三個星號(***)指示統計上顯著之抑制效應,其中p值小於0.001。如圖中,在此圖及其他表中,三個星號(***)指示統計上顯著之抑制效應,其中p值小於0.001;兩個星號(**)指示統計上顯
著之效應,其中p值小於0.01;一個星號(*)指示p值小於0.05。圖中具有圓括號之星號([***])指示相對於基準水準之顯著差異。
第2圖中描繪化合物1對於人類破骨細胞之再吸收活性的效應。結果以CTX/TRACP 5b值來展示。CTX值在第10天再吸收期結束時測定,並且TRACP值在第7天再吸收期開始時測定。結果進一步概述於表2中。
第8天化合物1對於成骨細胞分化之效應描繪於第3圖中。結果以細胞ALP活性/mg蛋白質來展示。結果進一步概述於表3中。
化合物1對於小鼠成骨細胞之骨骼形成活性的效應描繪於第4圖中。結果以第11天分泌至培養基中之PlNP來展示。結果進一步概述於表4中。
化合物1對於小鼠成骨細胞之骨骼形成活性的效應描繪於第5圖中。結果以第13天之鈣沈積來展示。結果以第11天分泌至培養基中之PlNP來展示。結果進一步概述於表4中。
參考抑制劑OPG及E64分別顯著抑制破骨細胞分化及活性,並且參考刺激劑17β-雌二醇顯著刺激成骨細胞分化及活性,說明分析得以成功地執行並且獲得之結果為可靠的。化合物1顯示對破骨細胞分化之劑量依賴性抑制,該抑制對於0.11、0.33、1.0及3.0 μM濃度為顯著的。顯微分析顯示0.11及0.33 μM濃度之化合物1不影響Hoechst及TRACP陽性單核細胞之數量,表明對於破骨細
胞分化之特異性抑制。然而,1.0及3.0 μM濃度降低Hoechst及TRACP陽性單核細胞之數量,表明對於此等濃度所觀察到的抑制效應至少部分地具有細胞毒性。
化合物1在所測試之濃度下對於破骨細胞再吸收活性不具有效應。化合物1在0.012、0.037、0.11、0.33及1.0 μM濃度下顯示對成骨細胞分化之劑量依賴性刺激並且在3.0 μM濃度下顯示抑制效應。化合物1在0.004、0.0120、0.037及0.11 μM濃度下顯示對成骨細胞之骨骼形成活性的劑量依賴性刺激,並且在0.33、1.0及3.0 μM濃度下顯示抑制效應。總之,化合物1之0.004、0.012、0.037及0.11 μM濃度對於骨骼細胞顯示有利效應,活化成骨細胞骨骼形成並且對於骨骼再吸收性破骨細胞之形成不具有效應或起抑制作用。
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此研究之目的係在預防研究中調查化合物1對於停經後骨質疏鬆症之大鼠卵巢切除術(OVX)模型中之骨骼代謝之生化血清標記物的短期效應。17β-雌二醇(E2)用作參考化合物。以下五個實驗組包括於研究中:
1)接受媒劑(5 ml/kg/d p.o.)之假手術對照大鼠
2)接受媒劑(5 ml/kg/d p.o.)之OVX大鼠
3)接受17β-雌二醇(4 μg/kg/d s.c.)之OVX對照大鼠
4)接受測試化合物化合物1(1 mg/kg/d p.o.)之OVX大鼠
5)接受測試化合物化合物1(3 mg/kg/d p.o.)之OVX大鼠
每個組含有在研究之存活生長期開始時為三月齡之八隻雌性大鼠(Sprague-Dawley)。在存活生長期開始之前,將動物稱重,採集其血液樣本,並且藉由根據體重及前膠原第I型N端原肽(PIMP)之血清含量分層而將動物隨機
分至各研究組。在存活生長期開始時,將動物稱重並且作手術。在手術之後一天開始治療並且每天一次持續兩週。無菌水用作第1組及第2組中之媒劑。在治療一週之後測定體重並且相應地調整治療劑量。治療兩週之後,將動物稱重,採集其血液樣本,將動物處死,並且測定其相對子宮重量。為了分析治療之短期效應,在存活生長期開始之前及結束時採集之血清樣本中測定四種骨骼代謝生物標記物之含量。此等生物標記物包括作為骨骼形成標記物之PlNP、作為骨骼轉換一般標記物的骨鈣素(OC)之N端中間片段、作為骨骼再吸收標記物的第I型膠原之C端交聯端肽(CTX),及作為破骨細胞數量標記物的酒石酸抗性酸性磷酸酶同功異型物5b(TRACP 5b)。第-7天之血清含量用作基準含量並且第14天之血清含量作為受手術及治療影響之含量。
外科卵巢切除術在手術後兩週之後在雌性大鼠中增加體重,降低相對子宮重量,增加CTX、OC及PlNP之血清含量,並且降低血清TRACP 5b活性。此等骨骼代謝生物標記物結果指示卵巢切除術增強骨骼再吸收、增加骨骼轉換及骨骼形成,並且降低破骨細胞之總數。此等結論暗示外科卵巢切除術加速雌性大鼠中之骨骼轉換速率。
藉由將用4 μg/kg/d皮下劑量之17β-雌二醇治療之OVX動物與用媒劑治療之OVX動物比較來研究17β-雌二醇之短期效應。17β-雌二醇治療對於OVX大鼠之體重、相對子宮重量及骨骼代謝生物標記物具有以下效應:
. 用17β-雌二醇治療會防止OVX誘導的體重增加及OVX誘導的相對子宮重量減少。
. 用17β-雌二醇治療會防止OVX誘導的血清CTX、OC及PlNP含量增加。
. 用17β-雌二醇治療不影響OVX誘導的血清TRACP 5b活性減少。
骨骼代謝生物標記物結果指示用4 μg/kg/d皮下劑量之17β-雌二醇治療在治療兩週之後在OVX大鼠中防止OVX誘導的骨骼再吸收增強及OVX誘導的骨骼轉換及骨骼形成的增加,但不影響OVX誘導的破骨細胞總數的減少。此等結論暗示用4 μg/kg/d皮下劑量之17β-雌二醇治療在雌性大鼠中防止OVX誘導的骨骼轉換速率加速。
藉由將用1及3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療之OVX動物與用媒劑治療之OVX動物比較來研究化合物1之短期效應。化合物1治療對於OVX大鼠之體重、相對子宮重量及骨骼代謝生物標記物具有以下效應:. 用1 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療部分地防止OVX誘導的體重增加。
. 用1及3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療不影響OVX誘導的相對子宮重量減少。
. 用3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療會增強OVX誘導的血清PlNP含量增加及OVX誘導的血清TRACP5b活性減少。
. 用1及3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療不影響OVX
誘導的血清CTX及OC增加。
骨骼代謝生物標記物結果指示用3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療在治療兩週之後在OVX大鼠中增強OVX誘導的骨骼形成的增加及OVX誘導的破骨細胞總數的減少,但不影響OVX誘導的骨骼再吸收及骨骼轉換的增加。與破骨細胞總數減少及骨骼再吸收水準不變相聯繫的骨骼形成增強暗示了用3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療在雌性大鼠中使OVX刺激之骨骼轉換朝向骨骼形成變動。
人類骨質疏鬆症為特徵在於骨骼質量較低及骨骼微結構退化,導致骨骼脆性及骨折風險增加的全身骨骼疾病(Raisz等人2008)。骨質疏鬆症之長期性質使其對於社會日益變得代價昂貴。隨著預期壽命預計增加,骨質疏鬆症之出現率亦預計會增加,從而給健康護理造成額外的負擔。雖然有效之療法已經可用於治療骨質疏鬆症,但需要具有改良之治療窗,亦即改良之療效/安全比的療法。使用骨質疏鬆症之動物模型的臨床前療效研究在新的潛在療法投入臨床試驗之前提供了有關其效應的第一手資訊(Rissanen及Halleen 2010)。藥物投與之監管當局已經批准患有骨質減少症之切除性腺之大鼠在測試用於治療骨質疏鬆症之新的潛在療法之臨床前療效中用作預測性小動物模型。
此研究之目的為在預防研究中調查化合物1對於停經後骨質疏鬆症之大鼠卵巢切除術(OVX)模型中之骨骼代
謝之生化血清標記物的短期效應。17β-雌二醇(E2)用作參考化合物(Lindsay及Cosman 2008)。以下五個實驗組包括於研究中:
1)接受媒劑(5 ml/kg/d p.o.)之假手術對照大鼠
2)接受媒劑(5 ml/kg/d p.o.)之OVX大鼠
3)接受17β-雌二醇(4 μg/kg/d s.c.)之OVX對照大鼠
4)接受化合物1(1 mg/kg/d p.o.)之OVX大鼠
5)接受化合物1(3 mg/kg/d p.o.)之OVX大鼠
每個組含有在研究之存活生長期開始時為三月齡之八隻雌性大鼠(Sprague-Dawley)。研究之實驗設計呈現於第1圖中。藉由根據動物在存活生長期開始之前一週(第-7天)量測之體重及前膠原第I型N端原肽(PlNP)之血清含量分層而將動物隨機分至各研究組。在存活生長期開始時(第0天),將動物稱重,第2-5組中之動物切除卵巢,並且第1組中之動物接受假手術。在手術之後一天開始治療並且每天一次持續兩週(直至第13天)。無菌水用作第1組及第2組中之媒劑。在存活生長期開始時(第0天)、存活生長期開始之後一週(第7天),及存活生長期結束時(第14天)測定體重。根據獲得之最新體重來調整治療劑量。治療兩週之後(第14天),將動物稱重,採集其血液樣本,將動物處死,並且測定其相對子宮重量。為了分析治療之短期效應,在存活生長期開始之前(第-7天)及存活生長期結束時(第14天)採集之血清樣本中量測四種骨骼代謝生物標記物之含量。此等生化血清標記物包括PlNP、骨
鈣素(OC)之N端中間片段、第I型膠原之C端交聯端肽(CTX),及酒石酸抗性酸性磷酸酶同功異型物5b(TRACP 5b)。第-7天獲得之血清含量用作基準含量並且第14天獲得之血清含量作為受手術及治療影響之含量。
在整個研究期間將固體化合物1在室溫下儲存在乾燥環境中。每天製備化合物1之新鮮給藥懸浮液。每日等分試樣之固體化合物如下在包含少量氯化氫(HCl;Merck KGaA,Darmstadt,Germany)之無菌水(Baxter,Deerfield,IL,USA)中調配。
對於實驗組4。將4.5-5.8 mg化合物1分散於22.5-29.0 ml無菌水中,產生含有0.2 mg/ml化合物1之給藥懸浮液。調配物之特性藉由在給藥懸浮液中添加7.5-9.7 μl之1N HCl來改良。
對於實驗組5。將10.4-17.4 mg化合物1分散於17.333-29.0 ml無菌水中,產生含有0.6 mg/ml化合物1之給藥懸浮液。調配物之特性藉由在給藥懸浮液中添加17.3-29.0 μl之1N HCl來改良。
固體化合物之各每日等分試樣藉由暫時地渦動而與無菌水混合。化合物之分散藉由在水浴(FinnSonic超音波清洗器mO3型;FinnSonic,Lahti,Finland)中音波處理一分鐘,隨後渦動五秒來促進。此音波處理及渦動程序重複多達3-5次。調配物之特性藉由在每個給藥懸浮液中添加
少量1N HCl來改良。化合物之分散藉由進一步重複音波處理及渦動程序多達1-2次來促進。
在化合物調配之後一小時,將精細的均質給藥懸浮液用於治療實驗組4及5中之動物。動物之治療在其外科OVX手術之後一天(第1天)開始並且每天一次持續兩週(直至第13天)。
以5 ml/kg之體積經口投與給藥懸浮液,引起實驗組4中1 mg/kg/d之經口化合物1劑量及實驗組5中3 mg/kg/d之經口化合物1劑量。在投藥期間頻繁地混合給藥懸浮液以便用盡可能均質的給藥懸浮液來治療動物。每日給藥懸浮液之殘留物在每個投藥日之後妥善地處置並且固體化合物1之剩餘部分在存活生長期之後儲備起來。
17β-雌二醇(E2;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)在研究中用作參考化合物。參考化合物根據供應商提供之詳細說明書來操作。在玻璃瓶中,在苯甲酸苄酯(Sigma-Aldrich)中製備17β-雌二醇之儲備溶液,注意
如下使17β-雌二醇完全溶解:對於實驗組3。將1.6 mg之17β-雌二醇溶解於80.0 ml苯甲酸苄酯中,產生含有20 μg/ml之17β-雌二醇的儲備溶液。將儲備溶液在+4℃下在黑暗中儲存在其玻璃瓶中直至每日一次使用歷時兩週。如下每日用儲備溶液來製備新鮮的給藥溶液:對於實驗組3。將1 ml儲備溶液在4 ml蓖麻油(castor
oil)(蓖麻油(ricinus oil);批號319108624;目錄4702.1;Carl Roth,Karlsruhe,Germany)中稀釋、充分地混合,並且保持於黑暗中。新鮮的給藥溶液含有4 μg/ml之17β-雌二醇並且顯示20%苯甲酸苄酯及80%蓖麻油作為其媒劑組成。該溶液用於治療實驗組3中之動物。其治療在其外科OVX手術之後一天(第1天)開始並且每天一次持續兩週(直至第13天)。給藥溶液以1 ml/kg體積皮下投與,產生4 μg/kg/d之皮下17β-雌二醇劑量。每日給藥溶液之殘留物在每個每日投藥之後妥善地處置並且儲備溶液之剩餘部分在存活生長期之後保存起來。
在研究中包括接受測試化合物媒劑之兩個組,即實驗組1及2。媒劑溶液為無菌水並且將其儲存在+4℃下直至每日一次使用歷時兩週。第1及2組中之動物之治療在其外科OVX手術之後一天(第1天)開始並且每天一次持續兩週(直至第13天)。以5 ml/kg體積經口投與媒劑溶液,產生5 ml/kg/d之經口媒劑劑量。在存活生長期之後妥善地處置媒劑之殘留物。
骨骼代謝之生化標記物為適用於監測骨質疏鬆症療法及預測骨折風險及骨骼礦物質密度之長期變化的工具(Cremers等人2008)。在此項研究中,血清樣本用於量測骨骼代謝之四種生化標記物之含量(Rissanen等人2008a,Rissanen等人2008b);即用作骨骼形成標記物之
PlNP(大鼠/小鼠PlNP EIA;Immunodiagnostic Systems Ltd,Boldon,UK),用作骨骼轉換一般標記物之OC(Rat-MID Osteocalcin EIA;Immunodiagnostic Systems Ltd),用作骨骼再吸收標記物之CTX(RatLaps [CTX-I]EIA;Immunodiagnostic Systems Ltd),及用作破骨細胞數量標記物之TRACP 5b(RatTRAP [TRACP 5b]ELISA;Immunodiagnostic Systems Ltd)。OC用作骨骼轉換之一般標記物,這是因為其在骨骼形成及骨骼再吸收期間分泌於循環中(Cremers等人2008)。在研究之存活生長期開始之前(第7天)及存活生長期結束時(第14天)採集之樣本中測定此四種生化標記物之血清含量。第7天獲得之含量用作基準含量並且第14天獲得之含量作為受外科手術及治療影響之含量。分析根據供應商提供之說明書來執行並且其結果使用VICTOR2TM多標記計數器(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)來定量。血清樣本之血液在隔夜禁食之後自側部尾靜脈收集以避免晝夜差異性。分別在以1:5及1:4比率稀釋之血清樣本中量測PlNP及TRACP 5b之含量,並且在未進行任何樣本稀釋的情況下測定血清中之OC及CTX之含量。結果低於或高於分析之偵測極限的樣本之量測將予以重複,但此等結果未在此項研究中獲得。所得值實質上不同於實驗組之平均值的樣本的量測亦將予以重複,包括差異達到該組之標準偏差(SD)的2.5倍以上的值。然而,此等種類之值未在此項研究中獲得。
存活生長期包括動物豢養及操作、外科OVX及假手術、給藥、測定身體及相對子宮重量、處死,及採集血液樣本。外科OVX及假手術在麻醉及痛覺缺失下使用背側方法來執行(Peng等人1994,Wronski等人1986)。在OVX手術中,卵巢與輸卵管及一小部分子宮一起移除。麻醉使用美托咪定(medetomidine)(0.6 mg/kg s.c.;CP-Pharma Handelsgesellschaft,Burhdorf,Germany)、氯胺酮(ketamine)(30 mg/kg s.c.;Ketaminol;Intervetn International,Boxmeer,The Netherlands)及阿替美唑(atipamezole)(2 mg/kg s.c.;Revertor;CP-Pharma Handelsgesellschaft)注射來執行。手術後的痛覺缺失使用在外科手術之前及次日早晨投與之丁丙諾啡(buprenorphine)(25-37.5 μg/kg s.c.;Temgesic;Schering-Plough,Kenilworth,NJ,USA)來執行。卡洛芬(carprofen)(5 mg/kg s.c.)在需要時在研究期間用作止痛藥,但非所需的。在存活生長期結束時(第14天),動物藉由在麻醉下使用CO2-O2混合物窒息並且隨後藉由頸部脫位來處死。以下五個實驗組包括於研究中:
1)接受媒劑(5 ml/kg/d p.o.)之假手術對照大鼠
2)接受媒劑(5 ml/kg/d p.o.)之OVX大鼠
3)接受17β-雌二醇(4 μg/kg/d s.c.)之OVX對照大鼠
4)接受測試化合物卡波曾替(1 mg/kg/d p.o.)之OVX大鼠
5)接受測試化合物卡波曾替(3 mg/kg/d p.o.)之OVX大鼠
每個組含有在存活生長期開始時為三月齡之八隻雌性Sprague-Dawley大鼠。研究之實驗設計呈現於第1圖中。在整個存活生長期內,動物的健康狀況在工作日期間每天監測兩次並且在週末期間每天監測一次。使動物在存活生長期開始之前適應動物設施環境十一天。在存活生長期開始之前一週(第-7天),將動物稱重並且自側部尾靜脈採集其血液樣本。藉由根據動物體重及血清PlNP含量分層而將動物隨機分至各研究組。
健康狀況不佳之動物未被指派至各組,但該等動物在該項研究中不予觀察。動物藉由尾部標誌來識別並且來自同一實驗組之兩隻動物在每個籠中豢養於受控溫度及光照條件下並且無限制地取用飲用水及標準大鼠飼料(Teklad Global Diet 2016;Harlan Laboratories,Madison,WI,USA)。在存活生長期開始時(第0天),將動物稱重,第2-5組中之動物切除卵巢,並且第1組中之動物接受假手術。外科手術在麻醉及痛覺缺失下執行。在手術之後一天開始治療並且每天一次持續兩週(直至第13天)。無菌水用作第1組及第2組中之媒劑。在存活生長期開始時(第0天)、存活生長期開始之後一週(第7天),及存活生長期結束時(第14天)測定體重。根據獲得之最新體重來調整治療劑量。治療兩週之後(第14天),將動物稱重,採集其血液樣本,將動物處死,並且測定其相對子宮重量。
如下所述來採集、處理及儲存研究樣本。在整個研究中監測可能影響樣本完整性及/或使用樣本所獲得之原始資料完整性的所有條件。所有樣本所貼的標簽至少含有以下資訊:研究編號、治療組編號、動物編號及樣本名稱。
在研究之存活生長期開始之前(第-7天)及存活生長期結束時(第14天),採集0.6 ml體積之血液用於血清樣本。在隔夜禁食之後自側部尾靜脈執行血液採集,並且在血液採集及血清處理期間避免溶血。將血液採集至包括鋁二氧化矽作為凝結活化劑之血清凝膠管(Multivette 600;Sarstedt Ag & Co,Nümbrecht,Germany)中。在收集每個樣本之後,將其試管輕輕地混合並且使血液凝結30-60分鐘。在凝結之後,將樣本在2500 g下離心10分鐘。將所產生的血清分離並且轉移至清潔樣本試管中。自每個樣本獲得30、50、50及60 μl體積的等分試樣,分別用於量測血清PlNP、OC、CTX及TRACP 5b含量。將此等等分試樣及剩餘血清冷凍並且儲存於-70℃下。
研究之實驗設計描繪於第6圖中。在研究中執行之實驗骨骼分析包括量測骨骼代謝生物標記物之血清含量。此等分析藉由Pharmatest來執行。
在研究中執行之骨骼分析包括跟蹤骨骼代謝生物標記物之血清含量。骨骼代謝之此等生化標記物包括用作骨骼形成標記物之PlNP、用作骨骼轉換一般標記物之OC、用作骨骼再吸收標記物之CTX,及用作破骨細胞數量標記物之TRACP 5b。在研究之存活生長期開始之前(第-7天)及存活生長期結束時(第14天)採集之血清樣本中測定其含量。第7天獲得之含量用作基準含量並且第14天獲得之含量作為受外科手術及治療影響之含量。來自實驗分析之研究材料殘留物來自實驗分析之所有研究材料殘留物可用於額外分析及/或可在主持者要求下交送給主持者供進一步分析。此材料包括在研究期間採集並且在-70℃下儲存的血清樣本的剩餘部分。
所有相關資料均以具有單位之圖及表形式(平均值、SD及統計顯著性)及附錄形式(個別資料)來呈現。一個組中顯示與該組之平均值的SD具有兩倍以上差異並且具有該偏差之程序性原因的值將被視為異常值並且自分析中移除。該等值未在此項研究中獲得。
統計分析用針對視窗之統計軟體SPSS版本19(SPSS;Chicago,IL,USA)藉由雙側測試來執行。低於0.05之p值被視為統計上顯著的。在檢查統計模型的假設之後決定使用轉換及非參數測試,亦即藉由夏皮羅-威爾克(Shapiro-Wilk)測試來分析數據分配之正規性並且藉由列文測試(Levene's test)來分析方差均質性。在違反此等假
設的情況下,採用對數或其他合適轉換(亦即平方根及倒數)。若本身或在轉換之後滿足統計模型之假設,則使用參數單向方差分析(ANOVA)來評估各組之中的差異。若單向ANOVA揭示統計上顯著之差異,則鄧尼特測試(Dunnett's test)用於各組之間之統計比較。若甚至在轉換之後亦不滿足統計模型之假設,則非參數克魯斯卡爾-沃利斯(Kruskal-Wallis)測試用於評估各組之中的差異。若克魯斯卡爾-沃利斯測試顯示統計上顯著差異,則曼-惠特尼(Mann-Whitney)u測試用於各組之間的統計比較。
在研究中執行之跟蹤量測包含測定體重及量測骨骼代謝生物標記物之血清含量。使用每個動物之相對變化來執行其資料之統計分析。為了計算研究之存活生長期之第一週期間的相對變化,將存活生長期開始之後一週(第7天)獲得之值除以在存活生長期開始時(第0天)獲得之值。為了計算存活生長期期間之相對變化,將存活生長期結束時(第14天)獲得之值除以在存活生長期開始時(第0天)或在存活生長期開始之前(第-7天)獲得之值。
在研究中執行之終點量測包括測定相對子宮重量及測定體重及量測血清PlNP含量以用於將動物隨機分至各研究組。其資料之統計分析使用研究之存活生長期結束時(第14天)及存活生長期開始之前一週(第-7天)獲得之值本身來執行。
執行各組之間的以下統計比較:
. 藉由將用媒劑治療之OVX對照動物(第2組)與用媒劑治療之假手術對照動物(第1組)比較來研究卵巢切除術之短期效應。
. 藉由將用測試及參考化合物治療之OVX動物(第3-5組)與用媒劑治療之OVX對照動物(第2組)比較來研究治療之短期效應。
在此項研究中,使三月齡之雌性Spague-Dawley大鼠接受卵巢切除術及假手術。其治療在外科手術之後一天開始,並且將治療效應跟蹤兩週(存活生長期)。化合物1(1-3 mg/kg/d p.o.)用作測試化合物,17β-雌二醇(E2;4 μg/kg/d s.c.)用作參考化合物並且無菌水用作媒劑(5 ml/kg/d p.o.)。藉由將用媒劑治療之OVX對照動物(第2組)與用媒劑治療之假手術對照動物(第1組)比較來研究卵巢切除術之效應。藉由將用E2治療之OVX對照動物(第3組)與用媒劑治療之OVX對照動物(第2組)比較來研究E2之效應。藉由將用卡波曾替治療之OVX動物(第4-5組)與用媒劑治療之OVX對照動物(第2組)比較來研究化合物1治療之效應。
表5a及5b概述該等結果。向上箭頭(↑)指示統計上顯著之增加並且向下箭頭(↓)指示統計上顯著之減少。一個星號(*)指示p值<0.05之統計學顯著性,兩個星號(**)指示p
值<0.01,並且三個星號(***)指示p值<0.001。NS=非顯著。
根據表5b,結果證明外科卵巢切除術在卵巢切除術之後兩週在雌性大鼠中增加體重,降低相對子宮重量,增加血清CTX、OC及PlNP含量,並且降低血清TRACP 5b活性。
生物標記物結果指示外科卵巢切除術增強骨骼再吸收、增加骨骼轉換及骨骼形成,並且降低破骨細胞之總數。該等結論暗示卵巢切除術加速雌性大鼠中之骨骼轉換速率。描述卵巢切除術短期效應之結果與文獻中公開的證明本研究可用於評估療法在OVX大鼠中之臨床前療效的結果一致(Rissanen等人2008a,Rissanen等人2008b)。
如所指示,骨骼代謝生物標記物結果指示用3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療在治療兩週之後在OVX大鼠中增強OVX誘導之骨骼形成的增加及OVX誘導之破骨細胞總數的減少,但不影響OVX誘導之骨骼再吸收及骨骼轉換的增加。與破骨細胞總數減少及骨骼再吸收水準不變相聯繫的骨骼形成增強暗示了用3 mg/kg/d經口劑量之化合物1治療在雌性大鼠中使OVX刺激之骨骼轉換朝向骨骼形
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前述揭示案為了清晰及理解之目的已經藉由說明及實例在某種程度上較詳細地進行了描述。本發明參照各種特定及較佳實施例及技術來描述。然而,應理解可以在保持於本發明精神及範圍內的同時做出許多變化及修改。熟習此項技術者顯而易知可在隨附申請專利範圍之範疇內實施變化及修改。因此,應理解以上描述意欲為說明性而非限制性的。
因此,本發明範圍不應參照以上描述來確定,而應參照以下隨附申請專利範圍,以及該等申請專利範圍有資格享有之同等物的完全範圍來確定。
第1圖描繪在第7天藉由培養基中分泌之TRACP 5b活性(U/L)所量測的化合物1對於破骨細胞分化之效應。
第2圖描繪在第7天以CTX/TRACP 5b值表示的化合物1對於人類破骨細胞之再吸收活性的效應。
第3圖描繪在第8天以細胞ALP活性/mg蛋白質表示的化合物1對於成骨細胞分化之效應。
第4圖描繪在第11天以分泌至培養基中之PlNP表示的化合物1對於小鼠成骨細胞之骨骼形成活性的效應。
第5圖描繪在第13天以第13天之鈣沈積表示之化合物1對於小鼠成骨細胞之骨骼形成活性的效應。
第6圖描繪在大鼠卵巢切除術(OVX模型)中設計的化合物1對於骨骼轉換標記物之短期效應的研究。
Claims (13)
- 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的用途,其係用於製備治療骨質疏鬆症的藥劑,
- 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的用途,其係用於製備治療曾經或當前經歷癌症治療之患者之骨質疏鬆症的藥劑,
- 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的用途,其係用於製備改善骨質疏鬆症之伴隨有骨骼骨折增加、脊髓壓迫及嚴重骨骼疼痛的非結構化骨骼異常沈積的藥劑,
- 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的用途,其係用於製備藉由刺激成骨細胞分化或活性以治療骨質疏鬆症的藥劑,
- 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的用途,其係用於製備藉由刺激骨骼形成以治療骨質疏鬆症的藥劑,
- 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的用途,其係用於製備藉由抑制破骨細胞分化以治療骨質疏鬆症的藥劑,
- 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的用途,其係用於製備藉由調節骨骼轉換朝向骨骼形成以治療骨質疏鬆症的藥劑,
- 如請求項1至7中任一項之用途,其中化合物1為(L)-蘋果酸鹽或(D)-蘋果酸鹽。
- 如請求項8之用途,其中化合物1為(L)蘋果酸鹽。
- 如請求項8之用途,其中化合物1為(D)-蘋果酸鹽。
- 如請求項8之用途,其中化合物1呈該(L)蘋果酸鹽及/或該 (D)蘋果酸鹽之結晶N-1形式。
- 如請求項8之用途,其中化合物1呈該(L)蘋果酸鹽及/或該(D)蘋果酸鹽之結晶N-2形式。
- 如請求項1至7中任一項之用途,其中化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係以醫藥組合物投與,該醫藥組合物另外包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
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