CN103917636A - 藻类脂质组合物和制备及利用所述组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含高脂质含量藻类的组合物和制备及利用所述组合物的方法。具体地，本发明涉及高脂质含量藻类生物质和衍生自所述藻类生物质的藻类脂质材料、制备所述藻类生物质的方法以及包含所述藻类生物质或由所述藻类生物质制备的生物燃料(例如，生物柴油)和膳食组合物(例如，动物饲料)。发现本发明的组合物和方法用于多种应用，包括生物燃料、膳食(例如，人和动物营养)、治疗应用以及研究应用。

Description

藻类脂质组合物和制备及利用所述组合物的方法
本申请要求2011年7月13日提交的美国临时专利申请序列号61/507,390的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及包含高脂质含量藻类的组合物和制备及利用所述组合物的方法。具体地，本发明涉及高脂质含量藻类生物质和衍生自所述藻类生物质的藻类脂质材料、制备所述藻类生物质的方法以及包含所述藻类生物质或由所述藻类生物质制备的生物燃料(例如，生物柴油)和膳食组合物(例如，动物饲料)。发现本发明的组合物和方法用于多种应用，包括生物燃料、膳食(例如，人和动物营养)、治疗应用以及研究应用。
发明背景
在最近几年，由藻类生产生物燃料(例如，生物柴油)已成为热门的领域。这部分是由于高品质农业土地不需要生长藻类(藻类生物质)。然而，由藻类工业生产生物燃料(例如，生物柴油)仍存在挑战。
此外，在最近的50年间，提供动物营养的方法已改变。不再喂养动物任何草料或可利用的其它材料。而是，密切监测动物饮食的总营养值和成本。通常监测特定饮食的动物的品质和性能特性，调节饲料的营养组分，以使得饲料的营养值最大化和动物性能特性最优化。
然而，成本为关键因素。持续研究成本-有效的动物饲料，其不仅维持动物，而且在许多情况下引起提高的生长和价值。
发明概述
本发明涉及包含高脂质含量藻类的组合物和制备及利用所述组合物的方法。具体地，本发明涉及高脂质含量藻类生物质和衍生自所述藻类生物质的藻类脂质材料、制备所述藻类生物质的方法以及包含所述藻类生物质或由所述藻类生物质制备的生物燃料(例如，生物柴油)和膳食组合物(例如，动物饲料)。发现本发明的组合物和方法用于多种应用，包括生物燃料、膳食(例如，人和动物营养)、治疗应用以及研究应用。
因此，本发明提供了一种制备包含期望的高脂肪含量(例如，至少67%总脂肪)的藻类生物质的方法，所述方法包括在足以提供包含期望的高脂肪含量的藻类生物质的培养条件下培养藻类。本发明已鉴定可能得到包含期望水平的总脂肪(例如，至少67%总脂肪)的藻类生物质的培养条件。本发明不局限于根据本发明产生的藻类生物质的总脂肪含量(例如，按重量计)。在一个优选的实施方案中，根据本发明产生和/或使用的藻类生物质包含按重量计至少67%的脂肪含量。然而，本发明还提供产生藻类生物质的组合物和方法，所述藻类生物质含有更大(例如，大于68%、大于69%、大于70%、大于71%、大于72%、大于73%、大于74%、大于75%、大于76%、大于77%、大于78%、大于79%、大于80%、大于81%、大于82%、大于85%或更多)或更少(例如，约66%、约65%、约64%、约63%、约62%、约61%、约60%、约59%、约58%、约57%、约56%、约55%、约54%或更少)量的总脂肪。实际上，本文描述的方法和组合物可用于产生含有任何期望水平的总脂肪含量的藻类生物质。在一些实施方案中，藻类生物质以序贯的方式在两种或更多种类型的培养基中培养。例如，在一些实施方案中，所述两种或更多种培养基中的一种培养基含有50 g/L的碳源、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和0.15 g/L氯化镁。本发明不局限于所述碳源。实际上，可使用多种碳源，包括但不限于碳水化合物(例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖或可溶性淀粉)以及油酸、脂肪(例如大豆油)、糖蜜、甘油、甘露醇和乙酸钠、棉籽粉、甘油、糖蜜和玉米浸渍液。在一些实施方案中，所述两种或更多种培养基中的另一种培养基含有50 g/L的碳源、约7.5 g/L酵母提取物、约4.0 g/L硫酸镁、约1 g/L尿素、约2 g/L氯化钙、约2 g/L氯化镁和约0.25 g/L磷酸一钾。在一些实施方案中，所述两种或更多种培养基中的一种培养基含有碳源、酵母提取物和海盐。在一些实施方案中，并且如本文所述，藻类在第一培养基(例如，含有葡萄糖、酵母提取物和海盐)中培养；转移至第二培养基(例如，含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸镁、氯化钙和氯化镁)并且在其中孵育；和转移至第三培养基(例如，含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸镁、尿素、氯化钙、氯化镁和磷酸一钾)并且在其中孵育。在一些实施方案中，所述培养基中的一种补充有分批进给的进料。在一个优选的实施方案中，第三培养基补充有分批进给的进料。本发明不局限于所利用的分批进给的进料的类型或持续时间。在一些实施方案中，分批进给的进料包含尿素和磷酸一钾。本发明不局限于用于培养物的培养基组分的量和/或比率。本文详述可用作各种培养基(例如，第一培养基、第二培养基、分批培养基和分批进料的培养基)中的每一种的组分的实例。在一些实施方案中，在停止分批进料的过程后12-24小时，从培养物(例如，从第三培养基)收获藻类生物质。在一些实施方案中，在所有的营养物已从第三培养基除去/消耗后，从所述培养基收获藻类生物质。本发明不局限收获藻类生物质的方式。实际上，可使用多种方式收获生物质，包括但不限于本文描述的方法。在一些实施方案中，经由离心收获藻类生物质。在一些实施方案中，在收获藻类生物质之前，将包含藻类生物质的培养基冷却。本发明不局限在收获之前将包含藻类生物质的培养基冷却的温度。实际上，可使用多种温度，包括但不限于本文描述的那些。在一些实施方案中，将包含藻类生物质的培养基冷却至约5-25℃。本发明不局限用于本发明的藻类的类型。实际上，可使用多种藻类(例如，单独或组合)，包括但不限于本文描述的那些。在一些实施方案中，藻类为来自小球藻(Chlorella)属、裂壶藻(Schizochytrium)属或隐甲藻(Crypthecodinium)属的藻株或种类。在一个优选的实施方案中，藻类为Schizochytrium limacinum。在一些实施方案中，第一培养基含有约50 g/L葡萄糖、约10 g/L酵母提取物和约4 g/L海盐。在一些实施方案中，第二培养基含有约50 g/L葡萄糖、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和0.15 g/L氯化镁。在一些实施方案中，第三培养基含有约50 g/L葡萄糖、约7.5 g/L酵母提取物、约4.0 g/L硫酸镁、约1 g/L尿素、约2 g/L氯化钙、约2 g/L氯化镁和约0.25 g/L磷酸一钾。在一些实施方案中，培养条件包括在空气流和搅动条件下于30℃进行藻类培养，以保持溶解的氧在约10%。在一些实施方案中，第三培养基(例如，在接种主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、256,000 L容器)时存在的培养基)含有氮(N):磷(P):钾(K)的初始比率为46:13:8.5的培养基。在一个优选的实施方案中，在分批培养模式和分批进料培养模式中，N:P:K比率相同。在一些实施方案中，在用于分批模式和分批进料模式二者的培养基中，镁(Mg):钙(Ca)的比率为3:1，但是可使用更高(例如，4:1、4.5:1或更高)和更低(例如，2.5:1、2:1、1.5:1或更低)比率。在另一实施方案中，在用于分批模式和分批进料模式二者的培养基中，使用1:1比率的氯(Cl2):硫酸根(SO4)，但是可使用更高(例如，2:1、3:1、4:1、5:1或更多)和更低(例如，1:2、1:3、1:4、1:5或更低)比率。在一些实施方案中，在接种主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、256,000 L容器)时，在培养基中硫酸根(SO4):磷酸根(PO4)的比率为16:1，但是可使用更高(例如，20:1、25:1、30:1、32:1或更高)和更低(例如，10:1、8:1、5:1、3:1或更低)比率。在一些实施方案中，在产生含有期望的脂肪含量(例如，大于67%脂肪)的藻类生物质的全部培养物(例如，包括接种体、第一接种阶段、第二接种阶段和主发酵罐培养物)结束时已分批和进料的硫酸根(SO4):磷酸根(PO4)的总比率为5.3:1，但是可使用更高(例如，5.5:1、5.7:1、6:1、7:1、8:1或更高)和更低(例如，5:1、4.5:1、4:1、3:1或更低)比率。在一些实施方案中，在接种主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、256,000 L容器)时，在培养基中氯(Cl2):磷酸根(PO4)的比率为16:1，但是可使用更高(例如，20:1、25:1、30:1、32:1或更高)和更低(例如，10:1、8:1、5:1、3:1或更低)比率。在一些实施方案中，在产生含有期望的脂肪含量(例如，大于67%脂肪)的藻类生物质的全部培养物(例如，包括接种体、第一接种阶段、第二接种阶段和主发酵罐培养物)结束时已分批和进料的氯(Cl2):磷酸根(PO4)的总比率为5.3:1，但是可使用更高(例如，5.5:1、5.7:1、6:1、7:1、8:1或更高)和更低(例如，5:1、4.5:1、4:1、3:1或更低)比率。
本发明还提供具有期望的高脂肪含量(例如，按重量计至少67%的总脂肪含量)的藻类生物质。在一些实施方案中，生物质包含约170-250 mg/g二十二碳六烯酸(DHA)和/或约150-400 mg/g棕榈酸。在一些实施方案中，本发明提供了一种包含藻类生物质(例如，干燥的藻类生物质)或其组分(例如，其脂肪酸组分)的脂质组合物、食品或其它材料。在一些实施方案中，藻类生物质(例如，干燥的藻类生物质(例如，根据本文描述的方法产生的))含有期望量的总脂肪和/或其它组分(例如，大于约68%总脂肪、大于约69%总脂肪、大于约70%总脂肪、大于约71%总脂肪、大于约72%总脂肪、大于约73%总脂肪、大于约74%总脂肪、大于约75%总脂肪、大于约76%总脂肪、大于约77%总脂肪或大于约78%总脂肪)。在一些实施方案中，将本发明的藻类生物质(例如，含有大于67%总脂肪)干燥，使得生物质含有少于5%水分(例如，少于4.5%水分、少于4%水分、少于3.5%水分、少于3%水分、少于2.5%水分、少于2%水分或少于1.5%水分)。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有约170-250 mg/g或更多的二十二碳六烯酸(DHA) (例如，约170-180 mg/g DHA、约180-190 mg/g DHA、约190-200 mg/g DHA、约200-210 mg/g DHA、约210-220 mg/g DHA、约220-230 mg/g DHA、约230-240 mg/g DHA、约240-250 mg/g DHA或多于250 mg/g DHA)。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有约150-400 mg/g或更多的棕榈酸(IUPAC名称：十六烷酸(例如，约150-200 mg/g、约200-225 mg/g、约225-250 mg/g、约250-275 mg/g、约275-300 mg/g、约300-325 mg/g、约325-350 mg/g、约350-375 mg/g、约375-400 mg/g或多于400 mg/g))。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有约300-600 mg/g或更多的总脂肪酸(例如，约300-350 mg/g、约350-400 mg/g、约400-450 mg/g、约450-500 mg/g、约500-550 mg/g、约550-600 mg/g或多于600 mg/g脂肪酸))。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有少于约15%蛋白质(例如，少于约14%蛋白质、少于约13%蛋白质、少于约12%蛋白质、少于约11%蛋白质、少于约10%蛋白质、少于约9%蛋白质或少于约8%蛋白质)。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质或其组分用于制备生物燃料(例如，生物柴油)。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质或其组分用于制备食品(例如，动物饲料或饲料组分)。
附图简述
图1描述根据本发明的各方面在大规模、异养藻类生物质生产期间产生的数据。
图2显示从若干独立的大规模藻类培养物中收获的藻类生物质的脂肪酸特征。
图3显示利用本文所述的材料和方法收获的生物质的综合脂肪酸特征。
定义
本文使用的“磷脂”是指具有以下通用结构的有机化合物：
其中R1为脂肪酸残基，R2为脂肪酸残基或-OH，和R3为-H或含氮化合物胆碱(HOCH2CH2N+(CH3)3OH-)、乙醇胺(HOCH2CH2NH2)、肌醇或丝氨酸。R1和R2不能同时为OH。当R3为-OH时，化合物为二酰基甘油磷酸酯，而当R3为含氮化合物时，化合物为磷脂，例如卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸或缩醛磷脂。
本文使用的“醚磷脂”是指在甘油骨架的1位具有醚键的磷脂。醚磷脂的实例包括但不限于烷基酰基磷脂酰胆碱(AAPC)、lyso-烷基酰基磷脂酰胆碱(LAAPC)和烷基酰基磷脂酰乙醇胺(AAPE)。“非醚磷脂”为在甘油骨架的1位不具有醚键的磷脂。
本文使用的术语“Ω-3脂肪酸”是指从分子的甲基端在第三和第四个碳原子之间在烃链中具有最终的双键的多不饱和脂肪酸。Ω-3脂肪酸的非限制性实例包括5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸(DPA)。
本文使用的术语“三酰基甘油酯”、“甘油三酯”和“三酰基甘油”和“TAG”是指为衍生自甘油和三个脂肪酸的酯，其中“脂肪酸”是指具有长的未支化的脂族末尾(链)的羧酸，其为饱和或不饱和的。棕榈酸为三酰基甘油酯的一个非限制性实例。
本文使用的术语“% w/w (重量/重量)”和“w/w %”和语法上的等价物是指在组合物中给定的物质的基于重量:重量的量(百分比)。例如，包含50% w/w磷脂的组合物是指磷脂的质量为组合物总质量的50% (即，50 g磷脂在100 g组合物例如油中)。
本文使用的术语“藻类”是指自养或异养的存在于淡水或咸水中的以前分类为植物的单细胞或多细胞生物体，但是缺乏真的茎、根和叶。本文使用的术语"异养"是指不能合成其自身食物并且依赖于有机物质(例如，复杂的和/或简单的有机物质)用于营养的生物体。因此，术语“异养藻类”是指不能合成其自身食物并且依赖于有机物质用于营养的藻类。本文使用的术语“自养”是指使用光能或化学能，能由无机物质合成其自身食物的生物体。使用术语“藻类的”还涉及微藻类，因此包括“微藻类的”的含义。术语“藻类组合物”是指包含藻类的任何组合物，例如水生组合物，并且不局限于水体或在其中培养藻类的培养物。藻类组合物可为藻类培养物、藻类生物质、浓缩的藻类培养物或藻类的脱水物质，并且可为液体、半固体或固体形式。非液体藻类组合物可以水分水平或固体的重量百分比的方式来描述。“藻类培养物”为包含活的藻类的藻类组合物。术语“藻类”包括大藻类(通常称为海藻)和微藻类。
本文使用的术语“藻类生物质”或“生物质”是指在给定的时间在给定的区域或生态系统中生长的藻类细胞的聚集体或块。所述区域或生态系统可为天然存在的环境(例如，水体)或人工环境(例如，在发酵罐或生物反应器中(例如，敞开的或封闭的))。
本文使用的术语“总脂肪”是指存在于材料中的甘油三酯、磷脂、蜡酯和甾醇的总和。例如，藻类生物质的“总脂肪”含量是指存在于生物质中的甘油三酯、磷脂、蜡酯和甾醇的总和。此外，总脂肪包括饱和和不饱和脂肪二者。
本文使用的术语“防腐剂”是指通过延迟或防止味道、气味、颜色、质地、外观、营养值或安全性劣化来延长食品和非食品的储存期限的试剂。防腐剂不需要提供导致部分或完全微生物细胞破坏或丧失能力的致命的、不可逆的作用。杀菌剂、卫生洗涤剂、消毒剂、杀芽孢剂、杀病毒剂和杀结核菌剂提供这样的不可逆的作用模式，有时称为“杀菌”作用。与此相反，防腐剂可提供可逆的抑制作用或抑菌作用，其中如果除去防腐剂，标靶微生物可恢复繁殖。防腐剂和卫生洗涤剂之间的主要差别主要涉及作用模式(防腐剂防止生长而不是杀灭微生物)和暴露时间(防腐剂要几天到几个月起作用，而卫生洗涤剂最多几分钟就起作用)。
本文使用的术语“酵母”和“酵母细胞”是指在真菌界中分类的真核微生物，具有细胞壁、细胞膜和细胞内组分。酵母不形成特定的分类学或系统发生分组。目前已知约1,500个种类；估计所有酵母种类中仅1%已被描述。术语“酵母”通常取作与酿酒酵母(S. cerevisiae)同义词，但是通过酵母在子囊菌(Ascomycota)门和担子菌(Basidiomycota)门两者中的位置显示酵母的系统发生多样性。芽殖酵母(“真酵母”)分类为酵母(Saccharomycetales)目。酵母的大多数种类通过发芽无性繁殖，但是一些通过二分裂繁殖。酵母为单细胞，但是通过形成一串称为假菌丝(pseudohyphae或false hyphae)的连接的发芽细胞，一些种类变为多细胞。酵母大小可根据种类变化很大，通常测量为3-4 μm直径，但是一些酵母可达到超过40 μm。
本文使用的术语“富硒酵母”和“硒化酵母”是指在含有无机硒盐的培养基中培养的任何酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。本发明不局限所用的硒盐。实际上，预期多种硒盐用于本发明，包括但不限于亚硒酸钠、硒酸钠、亚硒酸钴或硒酸钴。游离的硒代蛋氨酸(例如，不与细胞或酵母缔合)也可用作富硒酵母的硒源，因为酵母不结合这种形式的硒。在培养期间，由于硒和硫之间的化学类似性，酵母结合硒代替硫，在细胞内所述硫通常为含硫有机化合物。在这样的酵母制备物中含硒化合物为硒代蛋氨酸，其以结合到多肽/蛋白质的形式存在。在这样的制备物中以硒代蛋氨酸形式存在的总细胞硒的量可变化，但是可为10-100%、20-60%、50-75%和60-75%。在硒化酵母制备物中有机硒的其余部分主要由在硒代蛋氨酸生物合成的路径中的中间体组成。这些中间体包括但不限于硒代半胱氨酸、硒代胱硫醚、硒代高半胱氨酸和硒代-腺苷硒代蛋氨酸。在终产物中残余的无机硒盐的量通常相当低(< 2%)。然而，本发明不局限于该百分比，因为本发明还包括含有比该百分比更高(例如，2-70%)或更低(例如，0.1-2%)的制备物。
本文使用的术语“SEL-PLEX”是指在分批进料发酵中培养的干燥的、不能存活的富硒酵母(例如，登录号CNCM I-3060的酿酒酵母，Collection Nationale De Cultures De Microorganismes (CNCM)，Institut Pasteur，巴黎，法国)，所述发酵以以下方式提供增加量的甘蔗糖蜜和硒盐：使得硒盐对酵母的生长速率的不利作用最小化，并且允许无机硒最佳掺入到细胞有机材料中。残余的无机硒被消除(例如，使用严格的洗涤方法)并且不超过总硒含量的2%。
本文使用的术语“有机硒”是指其中硒代替硫的任何有机化合物。因此，有机硒可指通过酵母生物合成的任何这样的化合物，或者其可指化学合成的游离的有机硒代-化合物。后者的实例为游离的硒代蛋氨酸。
本文使用的术语“无机硒”通常是指任何硒盐(例如，亚硒酸钠、硒酸钠、亚硒酸钴和硒酸钴)。还存在多种其它无机硒来源(参见例如在Merck索引中列举的那些)。使用无机硒的来源，可产生硒化酵母，所述来源包括但不限于亚硒酸钠、硒酸钠、亚硒酸钴、硒酸钴、硒酸、亚硒酸、溴化硒、氯化硒、六氟化硒、氧化硒、溴氧化硒、氯氧化硒、氟氧化硒、硫化硒、四溴化硒、四氯化硒和四氟化硒。
本文使用的术语“酵母细胞壁”，其亦称为“YCW”，是指围绕酵母的原生质膜和细胞内组分的酵母生物体的细胞壁。酵母细胞壁包括酵母细胞壁的外层(主要为甘露聚糖)和内层(主要为葡聚糖和壳多糖)二者。细胞壁的功能是提供结构和保护代谢活性细胞质。在酵母细胞壁中发生信号和识别途径。酵母细胞壁的组成在菌株之间不同，并且取决于酵母的生长条件。
本文使用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样品除去组分。例如，通过除去非酵母细胞壁组分(例如，原生质膜和/或酵母细胞内组分)，纯化酵母细胞壁或酵母细胞壁提取物；它们还通过除去酵母细胞壁以外的污染物或其它试剂而纯化。除去非酵母细胞壁组分和/或非酵母细胞壁污染物导致提高样品中的酵母细胞壁或其组分的百分比。
本文使用的术语“体内”是指在生物机体内发生的在活的生物体内进行的研究和/或实验。
本文使用的术语"体外"是指在活的生物体外部的人工环境，和通常在生物体内发生但使其在人工环境中发生的生物过程或反应。体外环境可包括但不限于试管和细胞培养。
本文使用的术语“高效液相色谱”和术语“HPLC”是指用于分离化合物的液相色谱形式。将化合物溶解于溶液中。通过将一管塞样品混合物注射到柱上，分离化合物。HPLC仪器包含流动相的储器、泵、注射器、分离柱和检测器。通过定量检测折射指数、在设定的波长下的UV-VIS吸收、在用合适的波长激发后的荧光或电化学响应的变化，记录在柱流出物中分析物的存在。
本文使用的术语“扫描电子显微术”和术语“SEM”是指使用一种类型的电子显微镜，通过以光栅扫描式样使用高能量电子束扫描样品表面使其成像。电子与组成样品的原子相互作用，产生含有关于样品的表面形态学、组成和其它性质例如导电性的信息的信号。
本文使用的术语"固定剂"是指为了“固定”、稳定或以另外的方式保存当前形式的物质以防止物质降解或另外变化，能使一种物质固定到另一种物质上的化学物质。通常，固定剂用于扫描电子显微术(SEM)以制备样品。初级固定剂：本文使用的术语“初级固定剂”是指用于“固定”物质的第一固定剂。二级固定剂：本文使用的术语“二级固定剂”是指用于“固定”物质的第二固定剂。三级固定剂：本文使用的术语“三级固定剂”是指用于“固定”物质的第三固定剂。
本文使用的术语"分析物"是指原子、分子、一组原子和/或分子、物质或化学成分。不能测量分析物内部及其自身；而是，可使用分析程序(例如HPLC)测定分析物的各方面或性质(物理、化学、生物等)。例如，不能测量“椅子”(分析物-组分)内部及其自身，但是可测量椅子的高度、宽度等。同样，不能测量霉菌毒素，但是可测量与其浓度相关的霉菌毒素荧光。
本文使用的术语“信号”通常用于指示已发生反应(例如，抗体与抗原结合)的任何可检测的过程。信号可定性以及定量评价。“信号”的类型的实例包括但不限于放射性信号、荧光信号或比色产物/试剂信号。
本文使用的术语“生物利用度”是指可用于生物体或到达全身循环的分子或组分的分数。当分子或组分静脉内给予时，其生物利用度为100%。然而，当分子或组分经由其它途径(例如口服)给予时，其生物利用度降低(由于不完全吸收和第一遍代谢)。在营养设定中，生物利用度是指营养物质的吸收率和利用率。例如，不同形式的相同的营养物质可具有不同的生物利用度。
本文使用的术语“有效量”是指足以实现有益的或期望的结果的组合物的量。可在一次或多次给药、应用或剂量中给予有效量和/或与另一种材料组合，并且不意旨局限于具体的制剂或给予途径。
本文使用的术语“消化”是指将食品、饲料或其它有机化合物转化为可吸收的形式；是指通过热量和水分或化学作用软化、分解或破坏。
本文使用的“消化系统”是指其中可发生消化或确实发生消化的系统(包括肠胃系统)。
本文使用的术语“饲料”是指被哺乳动物(例如，人和动物)消耗和为哺乳动物饮食贡献能量和/或营养物质的材料。饲料的实例包括但不限于全混合日粮(TMR)、草料、粒料、浓缩物、预混副产品、谷物、酒糟、糖蜜、纤维、饲料、草、干草、谷粒、叶、粗粉、可溶性物质和添加物。
本文使用的术语“食品添加物”、“膳食添加物”、“膳食添加物组合物”等是指作为用作膳食的一部分的膳食添加物或营养添加物配制的食品。示例性膳食添加物组合物如本文所描述。
本文使用的术语“动物”是指动物界的那些动物。其包括但不限于牲畜、农畜、家畜、宠物动物、海洋和淡水动物以及野生动物。
本文使用的术语“给药”和术语“给予”是指给予受试者(例如，受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官)物质(包括药物、前药或其它试剂)或治疗性治疗的行为。给药的示例性途径可通过眼睛(眼用)、口(口服)、皮肤(局部或透皮)、鼻子(鼻用)、肺(吸入剂)、口腔粘膜(含服)、耳、直肠、阴道、通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。
本文使用的术语“共同给药”和术语“共同给予”是指对受试者和/或材料(例如，饲料)给予至少两种试剂或疗法。共同给予两种或更多种试剂或疗法可同时发生，或者可在第二试剂/疗法之前给予第一试剂/疗法。
本文使用的术语“治疗”是指采取的利于改进和/或逆转疾病症状的措施。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施二者。例如，可受益于使用本发明的组合物和方法治疗的受试者包括已患有疾病和/或病症的受试者以及其中要预防疾病和/或病症(例如，使用本发明的预防性治疗)的受试者。
本文使用的术语“在疾病风险中”是指倾向于经历特定疾病的受试者。该倾向可为遗传性的(例如，经历疾病例如可遗传病症的特定遗传性倾向)，或归因于其它因素(例如，年龄、体重、环境条件、暴露于环境中存在的不利化合物等)。
本文使用的术语“疾病”、术语“感染”和术语“病理条件或反应”是指与损害活的动物或其任何器官或组织的正常状态相关的状态、迹象和/或症状(所述损害中断或改变正常功能的性能)，并且可为对环境因素(例如营养不良、工业危害或气候，包括霉菌毒素中毒)、特定的感染物(例如蠕虫、细菌或病毒)、生物体的固有的缺陷(例如各种遗传性异常)或这些因素和其它因素的组合的反应。
本文使用的术语“遭受疾病”是指经历特定疾病的受试者(例如，动物或人受试者)，并且不局限于任何特定的迹象或症状或疾病。
本文使用的术语“有毒的”是指与在接触或给予毒素/毒物之前的相同细胞或组织相比，对受试者、细胞或组织的任何不利、有害的、有伤害的或另外负面的作用。
本文使用的术语“药物组合物”是指活性试剂与惰性或活性载体的组合，所述载体使得组合物尤其适用于体外、体内或离体的诊断或治疗应用。
本文使用的术语“药学上可接受的”和术语“药理学上可接受的”是指基本上不产生比已知的有益反应更多的已知不良反应的组合物。
本文使用的术语“接种”是指向培养基中引入微生物(例如，藻类、酵母、真菌、细菌等)或微生物的悬浮液的行为。接种为将某物引入某一环境中行为或过程，该物将在所述环境中生长或繁殖。
本文使用的术语“接种体”和术语“预接种体”是指用于接种的细胞，例如加入以开始培养的细胞。
本文使用的术语“离心”是指使用通过将物体放置在围绕固定轴旋转的自旋转子上施用与轴垂直的力产生的离心力，通过尺寸或密度分离分子。离心利用沉降原理起作用，其中利用向心加速将具有更大和更小密度的物质均匀分布成为不同的密度层。
本文使用的术语“浓度”是指每限定的空间的物质的量。浓度通常以质量/单位体积的方式来表达。为了稀释溶液，必须加入更多的溶剂，或者减少溶质的量(例如，通过选择性蒸发、喷雾干燥、冷冻干燥，例如，浓缩的酵母细胞壁提取物或浓缩的改性酵母细胞壁提取物)。与此相反，为了浓缩溶液，必须加入更多的溶质，或者减少溶剂的量。
本文使用的术语“层”是指由通过离心分离后得到的形成上覆部分或片的一层材料组成的通常水平的沉积物，其与材料的密度性质有关。
本文使用的术语“收获”是指收集或集合已生产的材料的行为(例如，集合在酵母生产期间生产的材料)。
本文使用的术语“干燥”是指喷雾干燥、冷冻干燥、空气干燥、真空干燥或减少或消除物质中的液体的任何其它种类的过程。
本文使用的术语“喷雾干燥”是指干燥含有液体的物质的常用方法，其使用热气体来蒸发液体，以减少或消除物质中的液体。换言之，通过在热的干燥空气的气流中喷雾或雾化的方式来干燥材料。
本文使用的术语“冷冻干燥”和术语“升华冻干”和术语“冻干”是指通过升华从冷冻状态的物质除去溶剂。这通过冷冻待干燥的材料低于其共晶点，随后提供升华的潜热来完成。精确控制热量输入允许从冷冻状态干燥，而没有产物熔回。在实际应用中，在减压条件下加速和精确控制该过程。
本文使用的术语“干燥的自由流动的粉末”是指自由流动的干燥粉末，例如，可从容器、袋子、器皿等倒出而没有大块妨碍的粉末。
本文使用的术语"研磨"是指通过冲击、剪切或摩擦来降低粒径。
本文使用的术语“样品”以宽泛含义使用，包括由任何来源得到的样品或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可自动物(包括人)得到，并且包括流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液产物，例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。
发明详述
本发明涉及包含高脂质含量藻类的组合物和制备及利用所述组合物的方法。具体地，本发明涉及高脂质含量藻类生物质和衍生自所述藻类生物质的藻类脂质材料、制备所述藻类生物质的方法以及包含所述藻类生物质或由所述藻类生物质制备的生物燃料(例如，生物柴油)和膳食组合物(例如，动物饲料)。发现本发明的组合物和方法用于多种应用，包括生物燃料、膳食(例如，人和动物营养)、治疗应用以及研究应用。
因此，在本发明的一方面，提供了一种用于制备含有升高量(例如，基于w/w)的总脂肪的藻类生物质的方法。例如，如本文所述，在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有期望的高水平的总脂肪含量(例如，大于60%总脂肪，与产生含有显著较低水平的总脂肪含量(例如，60%或更少的总脂肪)的藻类生物质的常规方法对比)的藻类生物质的方法。基于藻类的生物燃料(例如，生物柴油)的巨大挑战是，确保生物质不以比在最终的燃料产物中所得到的能量更多的能量为代价而生产。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有大于65%总脂肪的藻类生物质的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有大于66%总脂肪的藻类生物质的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有大于67%总脂肪的藻类生物质的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有大于68%总脂肪的藻类生物质的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有大于69%总脂肪的藻类生物质的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有大于70%总脂肪的藻类生物质的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种产生含有基于w/w大于70% (例如，大于71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90%或更多)总脂肪的藻类生物质的方法。在一些实施方案中，所述方法利用封闭的生物反应器系统(例如，发酵罐)，但是本发明不如此限制(例如，在一些实施方案中，可利用敞开的生物反应器)。在一个优选的实施方案中，在无菌条件下进行本发明的藻类生物质的生长。在另一个优选的实施方案中，藻类在分批进料过程中生长(例如，以产生含有高脂肪含量(例如，大于67%脂肪)的藻类生物质)。
在一些实施方案中，本发明提供了一种培养藻类的方法，以生产包含期望的高总脂肪含量(例如，67%或更多总脂肪)的藻类生物质，如在实施例1和2中所描述。例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种培养藻类的方法，所述方法包括以逐步方式培养藻类，以生产包含期望的高总脂肪含量(例如，67%或更多总脂肪)的藻类生物质。在一些实施方案中，用于培养藻类的逐步过程包括融化藻类的储存株，和将已融化的藻类加入(例如，无菌)到1L摇瓶，所述摇瓶含有包含碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、酵母提取物和海盐的培养基。在一些实施方案中，碳源以50 g/L的浓度存在，酵母提取物以10 g/L的浓度存在，和/或海盐以4 g/L的浓度存在。在一些实施方案中，将含有藻类和培养基的1L摇瓶保持在30℃，并且摇动(例如，以约100-400 RPM)，直到藻类已进入指数生长期但是还未完全耗尽碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))的时间。在开发本发明的实施方案期间进行的实验已确定，在72-144小时之间的时间段，藻类进入指数生长但是未完全耗尽碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))。因此，在一些实施方案中，在包含碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、酵母提取物和海盐的培养基中，在约100-400 RPM (例如，250 RPM)下，于30℃在1L摇瓶中培养72-144小时的藻类用于接种第一接种阶段培养物(例如，在较大的容器中(例如，40、27或18 L容器))。在一些实施方案中，用于第一接种阶段的培养基包含碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、酵母提取物、硫酸镁、氯化钙和/或氯化镁。在一个优选的实施方案中，用于第一接种阶段的培养基包含约50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和/或0.15 g/L氯化镁。在一些实施方案中，第一接种阶段培养物于30℃在空气流和搅动条件下进行，以保持溶解的氧在约7-15% (例如，8、9、10、11、12、13、14%)，但是可利用更低和更高的溶解的氧条件。在一个优选的实施方案中，第一接种阶段培养物于30℃在空气流和搅动条件下进行，以保持溶解的氧在约10%。在一些实施方案中，含有藻类和培养基的第一接种阶段培养物保持在30℃下，并且培养直至藻类已进入指数生长期并且至少20 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))已被消耗但是碳源还未完全耗尽的时间。在开发本发明的实施方案期间进行的实验确定，在接种第一接种阶段培养物后24-48小时之间的时间段，藻类进入指数生长，消耗至少20 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))但是未完全耗尽碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))。在一些实施方案中，在包含碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、酵母提取物、硫酸镁、氯化钙和氯化镁的培养基中于30℃在第一接种阶段培养物中培养24-48小时的藻类用于在仍然较大的容器(例如，2000 L容器)中接种第二接种阶段培养物。在一些实施方案中，用于第二接种阶段培养物的培养基包含碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、酵母提取物、硫酸镁、氯化钙和/或氯化镁。在一个优选的实施方案中，用于第二接种阶段培养物的培养基包含约50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和/或0.15 g/L氯化镁。在一些实施方案中，第二接种阶段培养物于30℃在空气流和搅动条件下进行，以保持溶解的氧在约7-15% (例如，8、9、10、11、12、13、14%)，但是可利用更低和更高的溶解的氧条件。在一个优选的实施方案中，第二接种阶段培养物于30℃在空气流和搅动条件下进行，以保持溶解的氧在约10%。在一些实施方案中，含有藻类和培养基的第二接种阶段培养物保持在30℃下，并且培养直至藻类已进入指数生长期并且至少20 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))已消耗但是碳源还未完全耗尽的时间。在开发本发明的实施方案期间进行的实验确定，在接种第二接种阶段培养物后24-48小时之间的时间段，藻类进入指数生长，消耗至少20 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))但是未完全耗尽碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))。在一些实施方案中，在包含碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、酵母提取物、硫酸镁、氯化钙和氯化镁的培养基中于30℃在第二接种阶段培养物中培养24-48小时的藻类用于接种含有用于进一步培养/发酵藻类的培养基的大规模容器(例如，70,000 L、120,000 L、220,000 L或更大的容器(例如，主发酵罐))。在一些实施方案中，在将第二接种阶段培养物转移至大规模容器(例如，主发酵罐)后，存在于大规模容器(例如，主发酵罐)中的培养基(例如，分批的培养基)包含碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、酵母提取物、硫酸镁、尿素、氯化钙、氯化镁和/或磷酸一钾。在一个优选的实施方案中，用于大规模(例如，70,000 L、120,000 L、220,000 L或更大的容器(例如，主发酵罐))培养物的培养基包含约50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约4.0 g/L硫酸镁、约1 g/L尿素、约2 g/L氯化钙、约2 g/L氯化镁和/或约0.25 g/L磷酸一钾。在一些实施方案中，大规模培养物于30℃在空气流和搅动条件下进行，以保持溶解的氧在约7-15% (例如，8、9、10、11、12、13、14%)，但是可利用更低和更高的溶解的氧条件。在一个优选的实施方案中，大规模培养物于30℃在空气流和搅动条件下进行，以保持溶解的氧在约10%。在一个优选的实施方案中，碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))保持在10 g/L下达一定的时间段(例如，1天或多天(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天(例如，使用分批进料过程))。例如，在一些实施方案中，在大规模容器中在期望量的葡萄糖已被藻类消耗之后(例如，在大规模容器中在约20-30 g/L的葡萄糖已被藻类消耗后(例如，在30 g/L的葡萄糖已被消耗后))，开始葡萄糖和分批进给进料。在开发本发明的实施方案期间进行的实验确定，加入分批进给进料约34小时，但是可使用更短(例如，约32、28、24、20小时或更少)和更长(例如，36、38、42、46、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168小时或更多)时间段。在其它优选的实施方案中，在完成分批进料过程后，继续在大规模容器中培养藻类，直至所有的营养物质从培养基除去/消耗。在开发本发明的实施方案期间进行的实验确定，在停止分批进料过程之后约12-24小时，营养物质从培养基耗尽。在一些实施方案中，从大规模培养基/发酵液(broth)收获藻类生物质，并且如本文所述利用。在一些实施方案中，将大规模培养物发酵液离心，以得到藻类生物质。在一些实施方案中，在离心前将大规模培养物发酵液冷却。尽管不必理解机理来实践本发明，并且本发明不局限于任何特定的作用机理，但在一些实施方案中，冷却培养物发酵液提高包含升高水平的总脂肪(例如，脂质/油)的藻类生物质的密度，并且允许比缺少冷却培养物发酵液的情况下所实现的生物质回收率更大的生物质回收率(参见，例如，实施例3)。本发明不局限离心前将大规模培养物冷却至的温度。在一些实施方案中，将大规模培养物冷却至0-50℃、5-40℃、5-25℃、5-15℃或5-10℃的温度。
因此，本发明利用分批模式和分批进料模式两者培养藻类(例如，单独和/或在第一和/或第二接种阶段之后)，以产生含有期望的脂肪含量(例如，脂肪含量大于67%)的藻类生物质。本发明不局限用于分批或分批进料模式的培养基中存在的单个组分。在一些实施方案中，在接种主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、220,000 L容器)时存在的培养基含有氮(N):磷(P):钾(K)的初始比率为46:13:8.5的培养基。在一个优选的实施方案中，在分批和分批进料培养模式中，N:P:K比率相同。在一些实施方案中，在用于分批和分批进料模式二者的培养基中，镁(Mg):钙(Ca)的比率为3:1。在另一实施方案中，在用于分批和分批给料模式二者的培养基中，氯(Cl2):硫酸根(SO4)的比率为1:1。在一些实施方案中，在接种主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、220,000 L容器)时，在培养基中硫酸根(SO4):磷酸根(PO4)的比率为16:1。在一些实施方案中，在产生含有期望的脂肪含量(例如，大于67%脂肪)的藻类生物质的全部培养物(例如，包括接种体、第一接种阶段、第二接种阶段和主发酵罐培养物)结束时已分批和进料的硫酸根(SO4):磷酸根(PO4)的总比率为5.3:1。在一些实施方案中，在接种主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、220,000 L容器)时，在培养基中氯(Cl2):磷酸根(PO4)的比率为16:1。在一些实施方案中，在产生含有期望的脂肪含量(例如，大于67%脂肪)的藻类生物质的全部培养物(例如，包括接种体、第一接种阶段、第二接种阶段和主发酵罐培养物)结束时已分批和进料的氯(Cl2):磷酸根(PO4)的总比率为5.3:1。
如在下文实施例2中所述，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含藻类生物质(例如，干燥的藻类生物质(例如，根据本文所述方法产生的))，所述藻类生物质含有期望量的总脂肪和/或其它组分。例如，在一些实施方案中，本发明提供藻类生物质(例如，干燥的生物质)，所述藻类生物质含有大于67%总脂肪(例如，大于约68%总脂肪、大于约69%总脂肪、大于约70%总脂肪、大于约71%总脂肪、大于约72%总脂肪、大于约73%总脂肪、大于约74%总脂肪、大于约75%总脂肪、大于约76%总脂肪、大于约77%总脂肪、大于约78%总脂肪或更大量的总脂肪)。在一些实施方案中，干燥藻类生物质(例如，含有大于67%总脂肪)，使得所述生物质含有少于5%水分(例如，少于4.5%水分、少于4%水分、少于3.5%水分、少于3%水分、少于2.5%水分、少于2%水分或少于1.5%水分)。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有约170-250 mg/g或更多的二十二碳六烯酸(DHA) (例如，约170-180 mg/g DHA、约180-190 mg/g DHA、约190-200 mg/g DHA、约200-210 mg/g DHA、约210-220 mg/g DHA、约220-230 mg/g DHA、约230-240 mg/g DHA、约240-250 mg/g DHA或多于250 mg/g DHA)。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有约150-400 mg/g或更多的棕榈酸(IUPAC名称：十六烷酸(例如，约150-200 mg/g、约200-225 mg/g、约225-250 mg/g、约250-275 mg/g、约275-300 mg/g、约300-325 mg/g、约325-350 mg/g、约350-375 mg/g、约375-400 mg/g或多于400 mg/g))。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有约300-600 mg/g或更多的总脂肪酸(例如，约300-350 mg/g、约350-400 mg/g、约400-450 mg/g、约450-500 mg/g、约500-550 mg/g、约550-600 mg/g或多于600 mg/g脂肪酸))。在一些实施方案中，本发明的藻类生物质(例如，含有少于5%水分的干燥的生物质)含有少于约15%蛋白质(例如，少于约14%蛋白质、少于约13%蛋白质、少于约12%蛋白质、少于约11%蛋白质、少于约10%蛋白质、少于约9%蛋白质或少于约8%蛋白质)。
本发明不局限用于本文所述的方法和组合物的藻类的藻株或种类。实际上，发现多种藻类用于本发明，包括但不限于一种或多种破囊壶菌(Thraustochytrium)属。在一些实施方案中，藻类为一种小球藻属。在一些实施方案中，藻类为一种裂壶藻属。在一些实施方案中，藻类为一种隐甲藻属。在一些实施方案中，藻类为纹状体破囊壶菌(Thraustochytrium Striatum)、Thraustochytrium roseum、Thraustochytrium aureum、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)和/或Aurantiochytrium sp。在一个优选的实施方案中，Schizochytrium limacinum用于本文所述的方法和组合物。本发明不局限于由产生本文公开的具有升高水平的脂质的藻类生物质的方法生产的脂质的类型。在一些实施方案中，通过本发明的方法产生的脂质包括但不限于豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和硬脂酸。这些脂质已用于动物和人两者的健康，用于预防各种疾病(例如心血管疾病和炎性疾病)，和在婴儿营养中用于儿童的适当脑发育和视网膜视力。
在另一实施方案中，本发明提供了一种由藻类物种(例如，Schizochytrium limacinum)生产含有升高水平(例如，大于67%)的总脂肪的藻类生物质的方法，其中所述方法包括在包含培养基(例如，包含约50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和/或0.15 g/L氯化镁)的第一分批进料容器中培养藻类，将第一分批进料培养物转移(例如，无菌地)至第二接种分批培养基(例如，包含约50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和/或0.15 g/L氯化镁)，将第二接种分批培养物转移(例如，无菌地)至含有培养基(例如，主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、220,000 L容器，含有例如包含约50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约4.0 g/L硫酸镁、约1 g/L尿素、约2 g/L氯化钙、约2 g/L氯化镁和/或约0.25 g/L磷酸一钾的培养基)的大规模培养容器，其中使用分批进料过程使大规模培养容器的葡萄糖水平保持在10 g/L，其中在停止分批进料过程后12-24小时，在所有的营养物质已从培养基除去/消耗后，从大规模培养物收获藻类细胞。
本发明的另一个实施方案提供了一种用于由藻类物种(例如，Schizochytrium limacinum)生产含有升高水平(例如，大于67%)的总脂肪的藻类生物质的方法，其中所述培养基(例如，在发酵的各个阶段(例如，第一接种阶段、第二接种阶段和/或分批培养(分批进料)培养阶段)期间)包含碳源(例如，糖)、酵母提取物、磷酸根源(例如，磷酸一钾、硫酸镁和/或硫酸锌)、氮源(例如，尿素)、氯化镁和/或氯化钙。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用于由藻类的藻株生产含有升高水平(例如，大于67%)的总脂肪的藻类生物质的方法，其中所述培养基(例如，在发酵的各个阶段(例如，第一接种阶段、第二接种阶段和/或分批培养(分批进料)培养阶段)期间)包含糖、酵母提取物、磷酸一钾、硫酸镁、硫酸锌)、尿素、氯化镁和/或氯化钙。然而，本发明不局限在其中生长藻类的培养基中所利用的营养物质的类型。在一些实施方案中，将一种或多种碳源加入到培养基中。碳源的实例包括但不限于碳水化合物(例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖或可溶性淀粉)以及油酸、脂肪(例如大豆油)、糖蜜、甘油、甘露醇和乙酸钠、棉籽粉、甘油、糖蜜和玉米浸渍液。在一些实施方案中，将一种或多种氮源加入到培养基中。氮源的实例包括但不限于天然氮源(例如蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、肉提取物、酪蛋白氨基酸和玉米浸渍液)、有机氮源(例如谷氨酸钠和尿素)或无机氮源(例如乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和硫酸钠)。在一些实施方案中，将一种或多种磷酸根源加入到培养基中。磷酸根源的实例包括但不限于磷酸钾和磷酸二氢钾、无机盐例如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锌和硫酸铜。在一些实施方案中，氯化镁、氯化钙和/或维生素包括在培养基中。
本发明不局限于培养基中的这些组分的每一种的量(例如，浓度)。在一些实施方案中，利用不会对藻类生长有害的量。在一个优选的实施方案中，例如在发酵的各个阶段(例如，第一接种阶段、第二接种阶段和/或分批培养(分批进料)培养阶段)期间，设定每一种培养基成分的量(例如，浓度和/或比率)在促进形成高脂肪含量藻类(例如，包含67%或更高脂肪含量的藻类生物质)的水平的。在一些实施方案中，碳源(例如，糖)以约20-120 g/L培养基存在于培养基中。在其它实施方案中，碳源(例如，糖)以约30-70 g/L培养基存在于培养基中。在又其它的实施方案中，碳源(例如，糖)以约40-60 g/L培养基存在于培养基中。在一个优选的实施方案中，碳源(例如，糖)以约50 g/L培养基存在于培养基中。在一些实施方案中，尿素与磷酸一钾的比率(尿素:KH2PO4)为约5:0.1 之间(例如，约4.5:0.1、4:0.25、3:0.25、4:0.3、5:0.3、5:0.5、4:0.5、3:0.5、2:0.5或1:0.5)；但是可使用更高和更低的比率(例如，1:1、1:2、1:3等)。在一个优选的实施方案中，在培养基中尿素与磷酸一钾的比率为4:1。在一些实施方案中，培养基不含氯化钠。在其它实施方案中，培养基含有氯化钠。在一些实施方案中，硫酸镁(MgSO4):氯化钙(CaCl2)的比率为1:1。在一些实施方案中，硫酸镁(MgSO4):氯化钙(CaCl2)的比率为1:2。实际上，可使用多种硫酸镁(MgSO4):氯化钙(CaCl2)比率，包括但不限于1:1、1:1.125、1:1.5、1:1.75、1:2、1:2.125、1:2.25、1:2.5、2.5:1、2.25:1、2.125:1、2:1、1.75:1、1.5:1、1.25:1或1.125:1。在一个优选的实施方案中，在第一接种培养基中，硫酸镁(MgSO4):氯化钙(CaCl2)的比率为1:1。在另一个优选的实施方案中，在第二接种培养基中，硫酸镁(MgSO4):氯化钙(CaCl2)的比率为1:1。在又一个优选的实施方案中，在大规模培养基(例如，主发酵罐(例如，70,000 L、120,000 L、220,000 L容器)，本文中也称为第三培养基)中，硫酸镁(MgSO4):氯化钙(CaCl2)的比率为1:2。
在其它优选的实施方案中，在制备培养基后，不必调节培养基的pH。例如，在本发明的逐步发酵过程期间，不必调节其中生长藻类的培养基的pH。尽管不必理解机理来实践本发明，并且本发明不局限于任何具体的作用机理，在一些实施方案中，本发明的逐步发酵过程的无菌(sterile)和/或无菌(aseptic)条件否定在发酵期间调节培养基的pH。在一些实施方案中，培养基的pH为4.0-6.5。在本发明的逐步发酵过程期间藻类的培养可在10-40℃温度下进行，优选17-35℃，最优选约30℃。可通过通气-搅动培养、振动培养、静止培养等进行培养。在一个优选的实施方案中，在使得溶解的氧保持在10%或稍高于10%的条件下培养藻类。
在一些实施方案中，本发明提供了包含所有或一部分藻类生物质(例如，本文描述的和/或根据本文描述的方法和组合物产生的干燥的藻类生物质)的食品、饲料、营养添加物或治疗添加物，所述在藻类生物质包含升高水平(例如，大于67%)的总脂肪。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含喷雾干燥的藻类生物质的食品、饲料、营养添加物或治疗添加物，所述藻类生物质包含升高水平(例如，大于67%)的总脂肪。在其它实施方案中，本发明提供了包含从藻类生物质提取和/或分离的脂质的食品、饲料、营养添加物或治疗添加物，所述藻类生物质包含升高水平(例如，大于67%)的总脂肪。本发明不局限于从包含升高水平(例如，大于67%)的总脂肪的藻类生物质提取和/或分离的脂质的类型。在一些实施方案中，脂质包括豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、鰶鱼酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十四碳五烯酸和/或二十四碳六烯酸。在一个优选的实施方案中，脂质包括DHA和/或棕榈酸。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于制备脂质(例如，本文公开的那些脂质(例如，二十二碳六烯酸))的方法，所述方法包括：在第一培养基(例如，含有50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、10 g/L酵母提取物和4 g/L海盐)中培养藻类藻株(例如，Schizochytrium limacinum)，并在25-35℃范围的温度下孵育培养物约72-144小时的时间段；将培养物转移至第二培养基(例如，含有50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和/或0.15 g/L氯化镁)，并在25-35℃范围的温度下孵育培养物约24-48小时的时间段；将培养物转移至第三培养基(例如，含有50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和/或0.15 g/L氯化镁)，并在25-35℃范围的温度下孵育培养物约24-48小时的时间段；将培养物转移至第四培养基(例如，含有50 g/L的碳源(例如，糖(例如，葡萄糖))、约7.5 g/L酵母提取物、约4.0 g/L硫酸镁、约1 g/L尿素、约2 g/L氯化钙、约2 g/L氯化镁和/或约0.25 g/L磷酸一钾)，并在25-35℃范围(例如，30℃)的温度下孵育培养物约24-192小时(例如，约36、约38、约42、约46、约60、约72、约84、约96、约108、约120、约132、约144、约156、约168、约180或约192小时)的时间段；从培养物分离细胞生物质；和从生物质提取脂质。
在一些实施方案中，使用如本文描述的各种营养物质培养基，在100 ml至几十万升范围的合适的体积和容器中，在烧瓶或大发酵罐中，生长藻类培养物(例如，生长以生产藻类生物质)。
在又一方面，使用离心、过滤和/或絮凝或类似的技术，得到含有脂质的细胞生物质的分离。在一个优选的实施方案中，使用离心，由培养物得到藻类生物质。在其它优选的实施方案中，在将细胞培养物冷却之后进行离心(例如，以允许回收含有升高水平的脂质的细胞)。在一些实施方案中，将得到的藻类生物质喷雾干燥和使用(例如，直接用于动物饲料或用于生物燃料生产)。
在一个实施方案中，藻类为不同的藻类物种(例如，一个或多个本文描述的藻类物种)的混合物。在一些实施方案中，含有升高水平的从含有升高水平的总脂肪的藻类生物质提取的总脂肪和/或脂质的藻类生物质添加有来自其它来源(包括但不限于植物来源)的脂质(例如，多不饱和脂肪酸)。
在一些实施方案中，含有升高水平的总脂肪的藻类生物质包含在约60-90% (例如，约65-90%、约66-89%、约67-88%、约68-87%、约68-86%、约69-85%，或约70-80%)范围内浓度(w/w)的脂质。因此，含有升高水平的脂质的藻类生物质可包含61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%等浓度的脂质。在一个实施方案中，含有升高水平的总脂肪的藻类生物质包含至少67%浓度的脂质。
在一些实施方案中，DHA以1%-75%的总脂质/脂肪酸的范围包含在本发明的藻类生物质组合物中。因此，DHA可以以下量的总脂肪酸在组合物中提供：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%等。在其它实施方案中，DHA可以以下范围的量的总脂肪酸包含在组合物中：1%-5%、1%-10%、1%-15%、1%-20%、1%-25%、1%-30%、5%-10%、5%-15%、5%-20%、5%-25%、5%-30%、10%-15%、10%-20%、10%-25%、10%-30%、15%-20%、15%-25%、15%-30%、20%-25%、20%-30%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%等。
在一些实施方案中，棕榈酸以1%-75%的总脂质/脂肪酸的范围包含在本发明的藻类生物质组合物中。因此，棕榈酸可以以下量的总脂肪酸在组合物中提供：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%等。在其它实施方案中，棕榈酸可以以下范围的量的总脂肪酸包含在组合物中：1%-5%、1%-10%、1%-15%、1%-20%、1%-25%、1%-30%、5%-10%、5%-15%、5%-20%、5%-25%、5%-30%、10%-15%、10%-20%、10%-25%、10%-30%、15%-20%、15%-25%、15%-30%、20%-25%、20%-30%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%等。
本发明的另外的实施方案包括制备动物饲料添加剂的方法。因此，本发明的一个方面为制备包含来自藻类(例如，藻类生物质)的脂质的动物饲料添加剂的方法，所述方法包括：培养藻类，以生产含有期望的升高水平的总脂肪(例如，大于67%总脂肪)的藻类生物质；和从藻类生物质提取藻类脂质，以生产藻油；和/或从藻类生物质除去水，以生产固体含量为约5%-100% (重量百分比)的藻类生物质；其中动物饲料添加剂包含来自藻类的脂质。在一些实施方案中，由藻类收集的脂肪酸为短链、中链或长链Ω-3脂肪酸。在其它实施方案中，将由藻类生物质提取的藻类脂质与固体含量为约5%-100% (重量百分比)的藻类生物质合并。
根据本发明的饲料添加剂可与其它食品组分合并，以生产加工的食品或饲料产品(例如，动物和/或人饲料产品)。所述的其它食品组分包括一种或多种酶添加物、维生素食品添加剂和矿物质食品添加剂。所得到的(合并的)饲料添加剂可以适当的量与其它食品组分(例如谷物和植物蛋白质)混合，以形成加工的食品。可使用任何常规使用的加工设备进行将这些组分加工成为加工的食品。本发明的饲料/食品添加剂还可与维生素、矿物质、其它饲料酶、农业副产物(例如，小麦中级品或玉米麸质粗粉)或与之的组合一起，用作食品/饲料本身的添加物。
在其它方面，本发明提供了一种生产具有提高的组织含量的Ω-3脂肪酸的动物和/或人的方法，所述方法包括喂养动物/人包含由藻类收集的脂质/脂肪酸的饲料添加剂，所述饲料添加剂还包含：(a)由培养的藻类生物质提取的藻类脂质和/或(b)来自培养的藻类的藻类生物质，其中将水从藻类生物质除去，以实现固体含量为约5-100% (重量百分比)，其中所述动物/人显示提高的组织含量的Ω-3脂肪酸。本发明不局限于可受益于本发明的组合物的任何具体的哺乳动物(例如，动物或人)。实际上，本发明的动物包括但不限于其蛋、肉、奶或其它产品被人或其它动物消耗的任何动物。因此，本发明的动物包括但不限于鱼、家禽(鸡、火鸡、鸭等)、猪、绵羊、山羊、兔、肉牛和奶牛。
在一些实施方案中，本发明提供了用于通过给予有需要的受试者治疗有效量的本发明的组合物治疗所述受试者的哺乳动物疾病的方法。在一些实施方案中，所治疗的哺乳动物疾病包括但不限于心血管疾病、炎性疾病和各种癌症疾病。在其它实施方案中，待治疗的心血管疾病包括但不限于高甘油三酯血症、冠心病、中风、急性心肌梗死和动脉粥样硬化。在其它实施方案中，待治疗的炎性疾病包括但不限于哮喘、关节炎、过敏性鼻炎、牛皮癣、特应性皮炎、炎性肠疾病、克罗恩氏病和过敏性鼻炎结膜炎(rhinoconjunctitis)。在其它实施方案中，待治疗的癌症疾病包括但不限于前列腺癌、乳腺癌和结肠癌。在另外的实施方案中，待治疗的哺乳动物疾病包括精神病病症。精神病病症包括但不限于抑郁症、双相性精神障碍、精神分裂症。此外，本发明的组合物可用于保持和/或增强认知功能。
在一些实施方案中，本发明提供了通过给予有需要的受试者治疗有效量的自含有升高水平的总脂肪(例如，大于67%总脂肪)的藻类生物质提供和/或得到的脂质组合物，治疗所述受试者的哺乳动物疾病的方法。可发现受益于治疗的受试者包括但不限于鸟类和哺乳动物受试者。本发明的哺乳动物包括但不限于犬科动物、猫科动物、牛科动物、山羊科动物、马科动物、绵羊科动物、猪科动物、啮齿类动物(例如，大鼠和小鼠)、兔形动物、灵长类动物(包括非人灵长类动物)、人类等和子宫内哺乳动物。需要根据本发明治疗的任何哺乳动物受试者都是合适的。本发明的哺乳动物包括但不限于犬科动物、猫科动物、牛科动物、山羊科动物、马科动物、绵羊科动物、猪科动物、啮齿类动物(例如，大鼠和小鼠)、兔形动物、灵长类动物(包括非人灵长类动物)、人类等和子宫内哺乳动物。根据本发明的一些实施方案，哺乳动物为非人哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物为人受试者。两种性别和在发育的任何阶段(例如，新生儿、婴儿、少年、青年、成人)的哺乳动物受试者可根据本发明治疗。根据本发明的例证性鸟类包括鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑、雉鸡、平胸鸟(例如，鸵鸟)、家养的鸟(例如，鹦鹉和金丝雀)和蛋中的鸟。
藻类
使用本文描述的方法，能产生升高水平的总脂肪的任何藻类或者含有升高水平的总脂肪的藻类生物质可用于本发明的方法、组合物、膳食添加物、生物燃料和/或生物燃料前体和/或饲料添加剂。因此，在一些实施方案中，本发明的藻类选自破囊壶菌、甲藻纲(Dinophyceae)、隐藻纲(Cryptophyceae)、共球藻纲(Trebouxiophyceae)、Pinguiophyceae和它们的组合。在其它实施方案中，本发明的藻类选自纹状体破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)、Thraustochytrium roseum、Thraustochytrium aureum、寇氏隐甲藻、Parietochloris spp.、Rhodomonas spp.、隐藻(Cryptomonas spp.)、Parietochloris spp.、Hemisebnis spp.、Porphyridium spp.、Glossomastix spp.和它们的组合。在其它实施方案中，本发明的藻类选自Parietochloris incise、Rhodomonas salina、Hemiselmis brunescens、紫球藻(Porphyridium cruentum)和Glossomastix chrysoplasta和它们的组合。在其它实施方案中，本发明的藻类为Schizochytrium limacinum。
在本发明的一些实施方案中，藻类为不同的藻类物种的混合物。在其它实施方案中，藻类为单一藻类物种。在本发明的一些实施方案中，藻类脂质/脂肪酸作为藻油提供。在其它实施方案中，藻类脂质/脂肪酸作为藻类生物质(例如，干燥的(例如，粉末状)生物质)提供。
此外，本发明的藻类包括但不限于野生型、突变的(天然或诱导)或遗传工程改造的藻类。在一个优选的实施方案中，用于本发明的方法、组合物、膳食添加物、生物燃料或生物燃料前体和/或饲料添加剂的藻类为非遗传修饰的生物体。本文使用的术语“遗传修饰的变体”和“遗传修饰的生物体”是指具有由其正常(例如，野生型，天然存在的)形式修饰(例如，突变、改变)以获得期望结果的基因组的藻类藻株。
此外，本发明的藻类包括含有具有降低厚度的细胞壁的细胞(与野生型藻类的细胞相比)的藻类，从而降低厚度的细胞壁改进藻类脂质级分的提取能力和/或生物利用度(例如，改进藻类消化能力的难易程度和从藻类生物质的细胞提取藻类脂质/脂肪酸的能力的难易程度)。含有具有降低厚度的细胞壁的细胞(与野生型藻类的细胞相比)的藻类可为天然存在的、突变的和/或遗传工程改造的，使得与野生型藻株相比具有降低厚度的细胞壁。因此，在本发明的一个实施方案中，所述藻类为具有降低厚度的细胞壁的藻类(与野生型藻类相比)，从而降低厚度的细胞壁改进藻类脂质级分的提取能力和/或生物利用度。产生具有减少的细胞壁的藻类的方法包括在WO 2006/107736 A1 (其通过引用以其整体结合到本文中)中得到的方法。因此，所述藻类可使用本领域技术人员已知的诱变剂诱变处理，所述诱变剂包括但不限于化学试剂或辐射。在具体的实施方案中，化学诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、三乙基三聚氰胺(TEM)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12 二甲基-苯并蒽(DMBA)、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、bisulfan、二环氧烷烃(二环氧辛烷(DEO)、二环氧丁烷(BEB)等)、2-甲氧基-6-氯-9(3-(乙基-2-氯-o-ethyp氨基丙基氨基)吖啶二盐酸盐(ICR-170)、甲醛等。辐射诱变的方法包括但不限于x-射线、γ-辐射、紫外线等。
可基于对洗涤剂提高的灵敏度或通过显微镜观察细胞壁厚的改变(参见例如WO 2006/107736 A1)或本领域已知的用于检测降低的细胞壁厚度或降低的细胞壁完整性的任何其它方法来选择细胞壁突变体。
本发明的藻类可根据在实施例1-3中描述的技术来培养。
因此，在一些实施方案中，藻类在10℃-35℃范围的温度下培养。因此，藻类可在以下温度下培养：10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃等。在其它实施方案中，藻类可在20℃-35℃范围下生长，但是可使用更冷(例如，低于20℃)和更温暖(例如，高于35℃)的温度。在一个优选的实施方案中，藻类在约30℃下生长。
在一些实施方案中，在培养后，收获藻类。在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的常规程序进行藻类的收获，包括但不限于离心、絮凝或过滤。在一个优选的实施方案中，在收获前，将藻类培养物冷却，从而允许成功地收获含有升高水平的总脂肪的藻类细胞。收获的藻类细胞或藻类生物质可随后直接用作脂质/脂肪酸源或进行提取以得到包含脂质/脂肪酸的藻油。在其中藻类生物质直接使用的一些实施方案中，从藻类生物质除去水以实现固体含量为约5-100重量%。在另外的实施方案中，待直接使用的藻类生物质由还包含细胞壁的藻类细胞组成，所述细胞壁至少部分分裂，以提高在细胞内藻油的提取能力和/或生物利用度。藻类细胞的分裂可根据已知的技术进行，包括但不限于用沸水或通过机械破坏例如研磨、粉碎、超声处理、French挤压或普通技术人员已知的任何其它方法处理细胞。
当藻类生物质直接使用时，从藻类生物质除去水以实现固体含量为约5-100%。因此，在一些实施方案中，从藻类生物质除去水以实现固体含量为约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%等。在另外的实施方案中，从藻类生物质除去水以实现固体含量在以下范围：约5%-50%、5%-60%、5%-70%、5%-80%、5%-90%、5%-95%、10%-30%、10%-40%、10%-50%、10%-60% 10%-65%、10%-70%、10%-75%、10%-80%、10%-85%、10%-90%、10%-95%、10%-100%、15%-40%、15%-50%、15%-60%、15%-65%、15%-70%、15%-75%、15%-80%、15%-85%、15%-90%、15%-95%、15%-100%、20%-50%、20%-60%、20%-65%、20%-70%、20%-75%、20%-80%、20%-85%、20%-90%、20%-95%、20%-100%、25%-50%、25%-60%、25%-70%、25%-75%、25%-80%、25%-85%、25%-90%、25%-95%、25%-100%、30%-50%、30%-60%、30%-70%、30%-75%、30%-80%、30%-85%、30%-90%、30%-95%、45%-100%、50%-70%、50%-75%、50%-80%、50%-85%、50%-90%、50%-95%、50%-100%、55%-75%、55%-80%、55%-85%、55%-90%、55%-95%、55%-100%、60%-75%、60%-80%、60%-85%、60%-90%、60%-95%、60%-100%、70%-80%、70%-85%、70%-90%、70%-95%、70%-100%、75%-85%、75%-90%、75%-95%、75%-100%、80%-85%、80%-90%、80%-95%、80%-100%、85%-90%、85%-95%、85%-100%、90%-95%、95%-100%等。
在一些实施方案中，将生物质的藻类细胞分裂或溶解，并且提取藻类脂质。根据常规的技术，藻类细胞可湿提取或干提取，以生产含有脂质/脂肪酸的组合物。藻类细胞的分裂或溶解可根据常规的技术进行，包括但不限于用沸水或通过机械破坏，例如研磨、粉碎、超声处理、French挤压或任何其它已知的方法处理细胞。从溶解的细胞提取脂质/脂肪酸采用用于藻类和已知的其它生物体的标准程序，包括但不限于在细胞溶解后将液相与固相分离，通过加入溶剂萃取液相中的脂质/脂肪酸，蒸发溶剂和回收得自溶解的细胞的液相的脂质/脂肪酸。
本发明不局限于用于萃取的任何具体溶剂。溶剂包括但不限于己烷、氯仿、乙醇、甲醇、异丙醇、乙醚、二噁烷、异丙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、石油醚和它们的组合。
在一些实施方案中，源自自本发明的藻类生物质的脂质/脂肪酸以以下形式提供：游离脂肪酸、胆固醇酯、盐酯、脂肪酸酯、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、二酰基甘油、单甘油、鞘磷脂、鞘糖脂或它们的任何组合(例如，用于本文描述的方法、组合物、生物燃料、食品、膳食添加物、饲料添加剂或其它组合物)。
用于制备藻类生物质的方法
在一些实施方案中，本发明提供了用于制备包含升高水平的总脂肪(例如，大于67%脂质)的藻类生物质的方法，所述方法包括：在足以提供包含升高水平的总脂肪(例如，大于67%脂质)的藻类生物质的培养条件下培养藻类，其中在藻类的对数生长期结束时收获藻类生物质(参见例如实施例1和2)。本文使用的术语“对数生长期”是指特征为以指数方式提高藻类细胞数量的培养阶段。通常，在培养体系中，在接种后存在特性性生长模式，其包括滞后期、指数或“对数生长期”、负生长加速期和停滞或“静止期”。例如，在对数生长期，随着藻类持续生长，细胞可达到它们的最大细胞分裂速率，并且细胞的数量以对数关系随时间增加。在对数期开始之后的时间内，细胞分裂速率可能开始下降，并且一些细胞可能开始死亡。这在生长曲线上反映为线逐步变平。最终细胞死亡速率基本上等于细胞分裂速率，并且总存活种群可在某一时间段内保持相同。这称为静止或停滞期，并且在生长曲线上表现为线变平，其中斜率接近零。在一个优选的实施方案中，在无菌条件下培养藻类生物质(例如，以防止在培养物中污染微生物(例如，酵母、细菌、病毒等)的污染和/或生长)。
在一些实施方案中，培养条件为对于藻类而言足以产生升高水平的总脂肪(例如，大于67%，基于w/w)。培养条件包括适于生长藻类以提供包含升高水平的总脂肪(例如，大于67% ，基于w/w)的藻类生物质的培养基。合适的培养基如本文所描述。培养基还可包含盐、维生素、矿物质、金属和其它营养物质。优选地，培养条件为足以为藻类提供合适量的营养物质和温度以在产生包含升高水平的总脂肪的藻类生物质的条件下生长。
在一些实施方案中，培养包括在合适的时间内限制营养物质(例如，氮、磷)以提高总脂肪量。例如，可使培养物缺乏某一营养物质或转移至缺乏特定的营养物质(例如，不含磷的或不含氮的培养基，或含有较低水平的营养物质的培养基)的单独的培养基中。在一些实施方案中，培养基含有初始含量的营养物质，使得营养物质在指数生长期间较后的时间但在耗尽其它营养物质之前被耗尽。在一些实施方案中，在培养期间，培养不包括限制营养物质(例如，氮、磷)。在一些实施方案中，单一藻类生物质的培养在两种或更多种类型的培养基中以序贯的方式发生。在一些实施方案中，单一藻类生物质的培养在三种或更多种类型的培养基中以序贯的方式发生。以类似的方式，单一藻类生物质的培养可在两个或更多个容器中发生，其中第一容器用于接种随后的容器，随后的容器用于接种又一个随后的容器，等等。尽管不需要理解机理来实践本发明，并且本发明不局限于任何具体的作用机理，但在一些实施方案中，在含有多种类型的培养基的多个容器中序贯培养单一藻类生物质允许藻类生物质以这样的方式生长，其中与在单一容器和/或生长培养基中生长的藻类生物质的(例如，相同的藻类物种的)生长相比，生物质的总脂肪含量升高。
可在适用于培养藻类的常规生物反应器中进行藻类的培养，以提供藻类生物质。例如，藻类可通过以下过程培养，包括但不限于分批、分批进料、细胞再循环和连续发酵。在一个优选的实施方案中，藻类在分批进料过程中培养。
本发明不局限于从培养基收获藻类的任何具体方式或方法。多种方法可用于从培养基收获藻类细胞。在一个实施方案中，收获包括通过分离，例如通过过滤(例如，带式过滤、转鼓过滤)和/或离心，从培养基回收藻类生物质。如果需要，收获的藻类细胞可随后洗涤，冷冻，冻干，喷雾干燥和/或在非氧化气氛的气体(例如，CO2、N2)下储存，以降低或消除O2的存在。任选，还可向所收获的细胞中加入合成的和/或天然抗氧化剂，包括但不限于丁基化的羟基甲苯(BHT)、丁基化的羟基苯甲醚(BHA)、叔丁基氢醌(TBHQ)、乙氧基喹、β-胡萝卜素、维生素E和维生素C。
在一些实施方案中，本发明提供了用于制备包含升高水平的总脂肪的藻类生物质的方法，所述方法包括：在足以提供包含升高水平的总脂肪的藻类生物质的培养条件下培养藻类，和收获藻类生物质。
微藻类生物质
在一些实施方案中，本发明提供藻类生物质和/或其级分和/或其提取物(例如，用于生物燃料生产和/或作为食品或饲料产品)。
在一些实施方案中，藻类生物质包含含量为生物质干重的至少10%的Ω-3脂肪酸，例证性地，生物质干重的约10%-约50%、约10%-约40%、约10%-约30%、约10%-约20%。在一个实施方案中，根据本发明的方法制备藻类生物质。例如，在一些实施方案中，通过包括以下的方法制备藻类生物质：在足以提供包含升高的总脂肪水平(例如，大于67% w/w)的藻类生物质的培养条件下培养藻类，其中在负生长加速期或静止期收获藻类生物质。在另一实施方案中，在指数、对数生长期期间，从培养物收获藻类生物质。
由藻类生物质制备的脂质组合物
在一些实施方案中，本发明提供了用于从在含有升高水平的总脂肪的条件下生长的藻类生物质制备脂质/脂肪酸提取物(例如，脂质/脂肪酸组合物)的方法，所述方法包括从在足以提供具有升高的总脂肪含量(例如，总脂肪含量大于生物质的67%)的藻类生物质的培养条件下培养的藻类生物质中获得脂质，其中在藻类的负生长加速期或静止期收获藻类生物质。在另一实施方案中，在藻类的对数生长期期间收获藻类生物质。
用于从本发明的藻类生物质获得脂质组合物的方法包括但不限于萃取、加热、挤压、皂化、超声处理、冷冻、研磨、离子交换、色谱法、膜分离、电渗析、反向渗透、蒸馏、化学衍生、结晶等。例如，藻类脂质可通过任何合适的方法从藻类细胞中提取，所述方法包括但不限于使用溶剂萃取，所述溶剂包括但不限于乙醇、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、甲醇、石油、氯仿等，或通过加压的液体烃例如丁烷、戊烷、丙烷或其它(含有或不含共溶剂)，或通过超临界流体萃取(含有或不含共溶剂)。任选，在减压下蒸发提取的脂质/脂肪酸油，以减少或除去溶剂和/或产生浓缩的脂质材料的样品。在其它实施方案中，将细胞破坏或溶解以得到脂质组合物，例如成为油形式(例如，用作生物燃料或生物燃料前体)。在一些实施方案中，将所提取的油经过精炼。本发明不局限精炼的类型。在一些实施方案中，将所提取的油经化学精炼。在一些实施方案中，将所提取的油经物理精炼。在一些实施方案中，将所提取的油经化学和物理两者精炼。所提取的油(例如，从在升高藻类细胞的总脂肪含量(例如，至超过67%)的条件下生长的藻类生物质)可使用任何常规的精炼方法来精炼。精炼过程可从所提取的脂质/脂肪酸/油中除去一些或所有杂质。在一些实施方案中，精炼过程包括一个或多个步骤以脱胶，漂白，过滤，除臭和/或抛光所提取的脂质/脂肪酸/油。
在一些实施方案中，通过采用例如尿素加合作用、分馏、柱色谱法和/或超临界流体分馏等方法，通过水解脂质以浓缩脂质级分，浓缩包含在所提取的脂质组合物中的脂质/脂肪酸/油。
因此，在一个实施方案中，从本发明的藻类生物质获得脂质组合物的步骤包括从生物质提取脂质组合物。在另一实施方案中，从本发明的藻类生物质获得脂质组合物的步骤包括使生物质与极性溶剂接触。
例如，在一些实施方案中，使用溶剂，在足以萃取脂质和/或脂肪酸但是不足以萃取不溶于所述溶剂的化合物的萃取条件下，从藻类生物质萃取脂质/脂肪酸/油，以提供脂质组合物。在一个实施方案中，从本发明的藻类生物质萃取脂质/脂肪酸组合物，其中细胞碎片和/或沉淀的不溶性化合物与含有脂质/脂肪酸和溶剂的级分分离。在另一实施方案中，所述方法还包括使用分离方法(例如过滤、离心和/或它们的组合)分离细胞碎片和沉淀的化合物。在一些实施方案中，将细胞碎片和/或沉淀的不溶性化合物(例如，不溶于溶剂的藻类生物质部分(例如，蛋白质、纤维等)回收和利用(例如，在食品或饲料产品中)。
在一些实施方案中，溶剂为极性溶剂。极性溶剂的实例包括但不限于乙醇、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇、乙酸乙酯和它们的混合物。在一个实施方案中，极性溶剂为乙醇。可采用多种方式进行使用溶剂萃取脂质组合物。例如，萃取可为分批过程、连续过程或连续的逆流过程。在连续的逆流过程中，溶剂与微藻类接触使油沥滤进入溶剂，提供提高的更多溶剂-油级分。在萃取后，可使用本领域已知的方法除去溶剂。例如，可使用蒸馏、旋转蒸发或升膜式蒸发器和汽提器或任何合适的脱溶剂器以除去溶剂。
在一个实施方案中，将所提取的脂质/脂肪酸暴露于吸附过程(例如，漂白)，以除去一个或多个不需要的化合物，例如可能存在的有色体和/或磷脂。在一些实施方案中，吸附过程为漂白过程，包括使脂质/脂肪酸提取物与漂白材料(例如，中性土(例如，天然粘土或漂白土)、酸-活性土、活性炭、活性粘土、硅酸盐和/或它们的组合)接触。本发明不局限所利用的漂白材料的量。
在一个实施方案中，将所提取的脂质/脂肪酸暴露于脱胶步骤。脱胶方法为本领域已知的，并且包括例如，水脱胶、酸脱胶、酶脱胶和膜脱胶。在一些实施方案中，将脂质/脂肪酸提取物经历脱胶(例如，在吸附过程之后)，其中脱胶包括使脂质/脂肪酸提取物与水性酸的混合物接触，所述水性酸的量为有效沉淀可能存在于脂质/脂肪酸提取物组合物中的胶质和/或叶绿素类型化合物。本发明不局限所利用的水性酸的类型或量。在一个实施方案中，水性酸的混合物包含硫酸和/或磷酸。在另一实施方案中，将等量的水性酸与脂质组合物混合。在一个优选的实施方案中，当与油共混时，水性酸的量足以提供酸性pH。可例如使用离心和/或过滤(例如，膜过滤)从脂质组合物除去在酸混合后形成的沉淀物。在一些实施方案中，将脱胶的脂质/脂肪酸提取物组合物经历干燥(例如，以降低组合物的水分含量)。本发明不局限干燥条件(例如，时间、温度和/或真空条件)。如本文所述，在一些实施方案中，干燥的脂质/脂肪酸组合物的水分含量少于约10% w/w (例如，少于约9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01% w/w)。
脂质组合物
在一些实施方案中，本发明提供了由本发明的藻类生物质制备的脂质组合物。在一些实施方案中，脂质组合物根据本发明的方法制备。例如，在一些实施方案中，脂质组合物为来自破囊壶菌属的藻类的藻类生物质或其一部分/级分。在一些实施方案中，藻类生物质包括选自甲藻纲、隐藻纲、共球藻纲、Pinguiophyceae和/或它们的组合的藻类。在其它实施方案中，藻类生物质包括选自以下的藻类：纹状体破囊壶菌、Thraustochytrium roseum、Thraustochytrium aureum、寇氏隐甲藻、Parietochlorois spp.、Rhodomonas spp.、隐藻、Parietochlorois spp.、Hemisebnis spp.、Porphyridium spp.、Glossomastix spp.和/或它们的组合。在其它实施方案中，藻类生物质包括选自以下的藻类：Parietochlorois incise、Rhodomonas salina、Hemiselmis brunescens、紫球藻和Glossomastix chrysoplasta和它们的组合。在一个优选的实施方案中，藻类生物质包括Schizochytrium limacinum。
食品和动物饲料添加剂
在一些实施方案中，将全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物用于消耗(例如，被哺乳动物(例如，人或动物消耗))或作为食品添加剂(例如，以提高食品的脂质含量和/或营养组分)。例如，在一些实施方案中，当用作动物饲料(例如，牲畜饲料、乳牛饲料、水产养殖饲料、家禽饲料等)时，将通过本发明的藻类生物质生产的脂质/脂肪酸掺入到食品(例如，动物饲料)中。在一些实施方案中，将全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物用于药物或营养目的和/或工业应用。
全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物可以适于具体的应用或用途的多种形式/组合物中的任一种提供。在一些实施方案中，提供全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物。在另一实施方案中，以粉末形式或作为液体形式的游离油(例如，脂质组合物或其级分或其浓缩物)提供全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物。全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物可用于人和/或动物消耗。例如，在一些实施方案中，提供全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物作为或掺入到饲料、膳食添加物、食品、药物制剂、乳制品和/或婴儿乳粉中。
例如，在一个实施方案中，将全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物干燥(例如，喷雾干燥、通道干燥、真空干燥)并用作其肉和/或产物被人或动物(例如，宠物、家畜)消耗的任何动物或水产养殖生物体(例如，鱼、虾、蟹、龙虾等)的饲料或食品添加物。在另一实施方案中，将全部细胞藻类生物质、其级分和/或其提取物与干的水分-减少剂(例如，磨碎的谷物例如磨碎的玉米)混合。
本文所述的组合物可用作完整的食品、作为食品的组分、作为膳食添加物或作为膳食添加物的一部分、作为饲料添加剂，并且可呈液体、半固体或固体形式。此外，本发明的组合物可为药物组合物形式。在用于促进个体健康的方法中，可利用本发明的组合物、膳食添加物、食品、婴儿食品、饲料添加剂和/或药物组合物。组合物可呈液体、半固体或固体形式。例如，组合物可作为片剂、凝胶包、胶囊、明胶胶囊、调味饮料、可复溶成所述饮料的粉末、烹调油、色拉油或调料、酱油、糖浆、蛋黄酱、人造黄油等给予。此外，本发明的食品、膳食添加物等可包括但不限于乳制品、婴儿食品、婴儿乳粉、饮料、棒(bar)、粉末(powder)、食品装饰配料、饮料、谷类食物、冰淇淋、糖、混合点心、烘烤食品和油炸食品。本发明的饮料包括但不限于能量饮料、保健饮料、冰沙(smoothie)、运动饮料、橙汁和其它果汁饮料。本发明的棒包括但不限于粗粉替代物、营养棒、点心棒和能量棒、挤出的棒等。本发明的乳制品包括但不限于乳酪、乳酪饮料、干酪和牛奶。意图口服给予的组合物可根据用于制造膳食添加物或药物制剂的任何已知的方法来制备，并且所述组合物可包括至少一种选自改进味道的物质(例如甜味剂或矫味剂)、稳定剂、乳化剂、着色剂和防腐剂的添加剂，以提供在膳食上或药学上可口的制备物。来自任何生理上可接受的来源的维生素、矿物质和微量元素也可包含在本发明的组合物中。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括治疗有效量的本发明的组合物。本发明的组合物可根据已知的制药技术配制用于给予。参见例如Remington的The Science And Practice of Pharmacy (第9版，1995)。在制造本发明的药物组合物中，脂质组合物(包括其生理上可接受的盐)通常特别与可接受的载体混合。载体与制剂中的任何其它成分相容，并且必须对受试者无害。
生物燃料
当以替代市场上的石油柴油的任何有意义的级分所需的规模操作时，用于由藻类制备生物燃料的许多现有的技术昂贵、低效和不能成立。通常低估收获和处理藻类的能量供应和费用。常规上为了由藻类生产生物柴油，藻类通常以在水中约0.2 g/L的浓度从培养物收获。随后将收获的藻类脱水，这提高藻类浓度以形成约15%固体的藻类糊状物。随后通过蒸发水充分干燥糊状物。随后使用有机溶剂(例如己烷)从干燥的藻类萃取油，所述有机溶剂通过蒸馏从藻油中除去。用于从藻类产生生物柴油的这种常规方法过于昂贵。
例如，当在天然水体中生长藻类时，考虑水的体积，藻类生物质相对稀释。产生一加仑油需要加工约20,000-40,000加仑水。运输和加工这样大体积的水的能量成本高。作为实例，如果可以25 g/m2/天生产其质量的25%为脂质的藻类，则可生产2,500加仑油/英亩/年。对于该实例，必须加工5,000万加仑水以生产2,500加仑油。将水泵送至集中的设备用于脱水的标准方法实在是太能量-密集并且成本昂贵。作为实例，比起包含在油产物中的能量，生产2,000万加仑/年的相对小的藻油设备将消耗更多的能量将水从池塘泵送至中心设施，这导致净负能量平衡。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于从在含有升高水平的总脂肪的条件下生长的藻类生物质制备藻类生物质和/或脂质/脂肪酸提取物(例如，脂质/脂肪酸组合物)的方法，所述方法包括由在足以提供具有升高的总脂肪含量(例如，总脂肪含量大于生物质的67%)的藻类生物质的培养条件下培养的藻类生物质得到脂质，其中所述藻类生物质在藻类的负生长加速期或静止期收获。在另一实施方案中，藻类生物质在藻类的对数生长期期间收获。本文描述用于由本发明的藻类生物质得到脂质组合物的方法。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含衍生自根据本发明的方法产生的藻类培养物和/或藻类生物质的脂质、烃或二者的生物燃料原料或生物燃料。在一些实施方案中，根据极性将脂质或包含脂质的藻类组合物细分为中性脂质和极性脂质。主要的中性脂质为甘油三酯和游离的饱和和不饱和的脂肪酸。主要的极性脂质为酰基脂质，例如糖脂和磷脂。在一些实施方案中，描述包含本发明的脂质和烃的组合物并且通过存在于组合物中的脂肪酸和/或烃的类型和相对量来区分。在一些实施方案中，存在于本发明的藻类组合物中的烃主要为直链烷烃和烯烃，并且可包括具有至多36个碳原子的石蜡等。
在一些实施方案中，本发明提供了制备包含衍生自本文所述的藻类培养物和/或藻类生物质或其脂质级分的加工脂质的液体燃料的方法。通过加工藻类衍生的生物燃料原料制备的本发明的产品可掺入到或用于多种液体燃料，包括但不限于柴油、生物柴油、煤油、喷气燃料、汽油、JP-1、JP-4、JP-5、JP-6、JP-7、JP-8、Jet Propellant Thermally Stable (JPTS)、费托液体、基于醇的燃料(包括含乙醇的运输燃料)、其它基于生物质的液体燃料(包括基于纤维素生物质的运输燃料)。
在一些实施方案中，将藻油中的三酰基甘油酯转化为脂肪酸甲酯(FAME或生物柴油)，例如，通过使用碱-催化的酯交换过程(其综述参见，例如，K. Shaine Tyson，Joseph Bozell，Robert Wallace，Eugene Petersen和Luc Moens，"Biomass Oil Analysis: Research Needs and Recommendations(生物质油分析：研究需求和推荐)"，NREL/TP-510-34796，2004年6月，其通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，在60℃下，在NaOH存在下，三酰基甘油酯与甲醇反应2小时，以产生脂肪酸甲酯(生物柴油)和甘油。在其它实施方案中，生物柴油和甘油副产物不混溶，并且通常通过倾析或离心，接着洗涤和纯化，在下游分离。游离脂肪酸(FFA)为甘油三酯的天然水解产物，并且通过三酰基甘油酯与水反应而形成。在一些实施方案中，本发明的方法还包括通过本领域已知的技术快速和充分干燥藻油的步骤，以限制游离脂肪酸的生产(优选至少于1%)。在本发明的另一实施方案中，所述方法还可包括通过本领域已知的技术转化或除去游离脂肪酸的步骤。
在一些实施方案中，通过酸-催化的酯交换、酶-催化的酯交换或超临界甲醇酯交换，将藻油中的三酰基甘油酯转化为脂肪酸甲酯(FAME或生物柴油)。超临界甲醇酯交换不需要催化剂(参见，例如，Kusdiana，D.和Saka，S.，"Effects of water on biodiesel fuel production by supercritical methanol treatment(通过超临界甲醇处理，水对生物柴油燃料生产的影响)" Bioresource Technology 91 (2004)，289-295；Kusdiana，D.和Saka，S.，"Kinetics of transesterification in rapeseed oil to biodiesel fuel as treated in supercritical methanol(当在超临界甲醇中处理时，油菜籽油到生物柴油燃料的酯交换的动力学)" Fuel 80 (2001)，693-698；Saka，S.和Kusdiana，D.，"Biodiesel fuel from rapeseed oil as prepared in supercritical methanol(在超临界甲醇中制备的来自油菜籽油的生物柴油燃料)" Fuel 80 (2001)，225-231)。在超临界甲醇中的反应将反应时间从2小时降低至5分钟。此外，不存在碱催化剂NaOH大大简化下游纯化，降低原料成本和消除与来自游离脂肪酸的皂相关的问题。游离脂肪酸不是一个问题，而是成为在如下的超临界甲醇中转化为生物柴油的有价值的原料。
在一些实施方案中，三酰基甘油酯被氢还原产生石蜡、丙烷、二氧化碳和水，产物通常称为生柴油。石蜡可异构化生产柴油或与柴油直接共混。在一些实施方案中，比起常规的碱-催化的酯交换，氢化存在优点。例如，氢化过程(也称为加氢裂化)为热化学的，因此与生物化学过程相比对进料杂质更稳健(例如，加氢裂化对游离脂肪酸和水相对不敏感)。游离脂肪酸容易转化为石蜡，水仅降低过程的总体热效率，而不会显著改变化学性。在另一个非限制性实例中，石蜡产物为纯烃，因此与基于石油的烃不可区分。与具有15%的较低能量含量并且可在冷气候中冻结的生物柴油不同，生柴油具有与基于石油的柴油类似的能量含量和流动特性(例如，粘度)。在各种实施方案中，本发明的方法包括本领域众所周知的生产液体燃料的加氢裂化和异构化的步骤，所述液体燃料例如喷气燃料、柴油、煤油、汽油、JP-1、JP-4、JP-5、JP-6、JP-7、JP-8和JPTS。
实验
提供以下实施例以证明和进一步说明本发明的某些优选的实施方案和方面，并且不应解释为限制其范围。
实施例1
高脂肪藻类生物质的生长
在开发本发明的实施方案期间进行实验来表征和建立用于异养藻类生产的方法，具体而言是培养藻类的方法，以产生含有高脂肪/脂质水平的藻类生物质。分批进行和运行一系列常规的异养藻类生产研究。
得到Schizochytrium limacinum培养物并且于-80℃储存在1.5mL冷冻管中。对于每一个实验，过程由融化冷冻管开始，并且无菌加入至具有培养基的1.0 L振动烧瓶中。在1 L烧瓶中的培养基含有50 g/L糖、10 g/L酵母提取物和4 g/L海盐。将3升3-6天的在先摇瓶培养物用于接种含有培养基的250 L容器，生长24-48小时，随后转移至主容器(17,000-28,000L)，并且作为分批过程运行36-72小时。分批运行的温度保持在25-30℃。由于缺乏系统的精确控制，温度范围大。用于接种(250L)和分批(17,000-28,000L)运行的培养基如下：
原料 计量  
糖 50 g/L
酵母提取物 7.5 g/L
MgSO4 0.1538 g/L
尿素 2 g/L
CaCl2 0.1538 g/L
MgCl2 0.1538 g/L
消泡剂 0.3 ml
表1A. 用于传统的分批和接种培养物的培养基。
通过气相色谱法(参见AOAC比重测定方法922.06)、酸水解(参见通过酸水解的总脂肪，Ankom Technology方法1，02-10-09)和高温溶剂萃取(参见Ankom Technology方法2，01-30-09和AOCS方法5-04)，测定分批培养物的藻类生物质的总脂肪含量。简要地，用于发酵液的典型的分析程序如下：发酵液样品通过离心浓缩。倾析后，将样品冷冻干燥24小时，所得到的水分少于1%。在酸水解前，将样品称重，洗涤和在烘箱中干燥。接着在梯度热条件下用石油醚进行萃取过程。利用自动化仪器进行水解和萃取过程。进一步干燥后，基于质量损失测定结果。
如下表1B所示，在25-30℃温度范围下，在分批生产中实现的总脂肪/脂质水平(w/w)为8-38%。
运行记录编号 总脂肪(%)
A-1-10 33.75
A-2-10 38.59
A-3-10 27.30
A-4-10 38.51
A-5-10 7.82
A-7-10 33.33
A-8-10 34.85
A-9-10 27.21
表1B. 在25-30℃之间，在分批运行中生长的藻类生物质的总脂肪含量。
由于认为这些量太低而没有价值，因此尽力提高脂肪/脂质水平的量，并且进行另外的实验，以尽量提高在培养的藻类中生产的脂质的水平。
在开发本发明的实施方案期间，进行实验以确定是否在培养基中组分和/或所述组分的量或比率的变化可提供不同的藻类生长特性。此外，进行实验以确定是否藻类培养物系统的放大将改变藻类生长特性。具体地，改变MgSO4、尿素、CaCl2、MgCl2和KH2PO4的量和比率，以试图提高通过培养的藻类生产的脂质的水平。
在10L的分批体积中产生的发酵结果如下所示。
实验室试验运行-10L            
             
成分/记录编号 NB4-030311 NB6-030311 NB4-032311 NB6-032311 NB3-032811 NB4-032811
(g/L)            
糖 50 50 50 50 50 50
酵母提取物 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
MgSO4 0.1538 0.1538 0.1538 0.1538 0.5 1
NaCl 0 0 0 0 0 0
尿素 2 2 2 2 1 1
ZnSO4 0.1538 0.1538 0.1538 0.1538 0.1538 0.1538
CaCl2 0.1538 0.1538 0.1538 0.1538 1 2
MgCl2 0.1538 0.1538 0.1538 0.1538 0.5 1
KH2PO4 - - 1.5 1.5 0.5 1
痕量(液体)-ml 10 10 10 10 20 20
氯化铁            
硫酸锌            
硫酸锰            
硼酸            
硫酸铜            
进料            
尿素:KH2PO4 尿素200g/L 尿素200g/L 2:1 2:1.5 2:0.5 2:0.5
             
温度设定点 30 30 30 30 30 30
脂肪% 8.13 6.89 88.98 84.28 56.1 64.3
标注 强NH3气味 强NH3气味        
  ph问题 ph问题        
  出现泡沫 出现泡沫        
表2：10L发酵条件和结果。
成分/记录编号 NB6-032811 NB3-040711 NB4-040711 NB6-040711 NB3-041911 NB4041911 NB6041911
(g/L)              
糖 50 50 50 50 50 50 50
酵母提取物 7.5 7.5 7.5 5 7.5 7.5 6.25
MgSO4 2 2 2 2 2 2 2
NaCl 0 0 0 0 0 0 0
尿素 1 1 1 1 1 1 1
ZnSO4 0.1538 0.1538 0.1538 0.1538 0 0 0
CaCl2 4 4 4 4 4 4 4
MgCl2 2 2 2 2 2 2 2
KH2PO4 2 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
痕量(液体)-ml 20 20 20 20 20 20 20
氯化铁              
硫酸锌              
硫酸锰              
硼酸              
硫酸铜              
进料              
尿素:KH2PO4 2:0.5 2:0.5 2:0.5 2:0.5      
               
温度设定点 30 30 30 30 30 30 30
脂肪% 73.7 71.16 73.49 73.88 68.69 76.56 72.56
表3：另外的10L发酵条件和结果。
表4：另外的10L发酵条件和结果。
在开发本发明的实施方案期间进行的这些实验表明，存在于培养基中的底物的某些量/比率对于藻类生长特性(例如，获得的总生物质以及在生物质本身内的脂肪量和/或其它组分含量)具有直接影响。在10L运行中提供高脂肪含量生物质的参数随后用于确定它们是否将成功地用于大规模生产高脂肪含量生物质。
实施例2
大规模生产高脂肪藻类生物质
在上文实施例1中描述的产生异养藻类生物质的初始努力利用了基于酵母发酵过程的程序。由于生产设备(Nicholasville，KY)和仅可控制在25-30℃的温度限制，分批运行该过程。由于缺乏系统的精确控制，温度范围大。如上文表1中所示，在Nicholasville，KY设备上获得的脂肪水平在8-38%的范围。然而，如上文所示，在开发本发明的实施方案期间进行另外的实验，其提供底物的某些比率/量的鉴定，所述底物可在异养藻类生物质生产期间被利用以改变藻类生长和生物质产生/性质。鉴定和表征在发酵期间培养基(例如，MgSO4、尿素、CaCl2、MgCl2和KH2PO4)的水平和比率的变化，以改变藻类生长和产生具有显著不同性质(例如，显著较高的脂肪含量生物质)的生物质。如下文所描述，进一步测试该过程(包括含有所鉴定的比率/量的有效产生高脂肪含量藻类生物质(例如，大于67%脂肪含量)的底物的培养基)，并且以大规模以及作为分批进料(由此允许在运行期间改变和控制氮、磷、钾和碳的量)运行。
得到Schizochytrium limacinum的培养物，并且于-80℃储存在1.5mL冷冻管中。对于每一次培养，融化冷冻管，并且无菌加入至1.0L含培养基的摇瓶。1 L烧瓶中的培养基含有如表5所示的组分：
成分 计量 制造商
糖 50 g/L Cargill-Hammond，IN，USA
酵母提取物 10 g/L Sensient-Indianapolis，IN，USA
海盐 4 g/L Sigma-Aldrich-St. Louis，MO USA
表5. 用于1.0L培养的培养基。
在培养基中含有Schizochytrium limacinum的摇瓶的温度保持在30℃，并且在250 RPM下摇动，直至藻类已进入对数/指数生长期但在培养基中的葡萄糖耗尽之前的时间(通常72-144小时)。
随后将1L培养烧瓶的内含物无菌转移至具有用于与较大的容器(40L或27 L或18 L容器)连接的无菌连接器的2.0L吸气瓶。因此，将1L培养烧瓶培养物用作接种体，并且无菌加入到含有在下表6中描述的培养基的接种容器(40L或27L或18L)中：
成分 g/L 制造商
糖 50 Cargill-Hammond，IN，USA
酵母提取物 7.5 Sensient-Indianapolis，IN，USA
MgSO4 0.1538 Norkem Limited-Kutahya，Turkey
CaCl2 0.1538 Occidental Chemical Company-Dallas，TX
MgCl2 0.1538 North American Salt Company-Overland Park，KS
表6. 用于18L或27L的第一接种培养物的培养基。在空气流和搅动条件下，在30℃下进行第一接种阶段(40/18/27L)，以保持溶解的氧在10%或超过10%，直至至少20 g/L的葡萄糖被消耗。当在无菌条件下生长时，不需要pH控制。而是，在整个发酵过程期间pH保持在健康的范围。当藻类在对数/指数生长期生长时，认为第一接种阶段(40/18/27L)完成，葡萄糖未从培养基耗尽，但是至少20 g/L的葡萄糖已消耗(通常，这在约24-48小时时发生)。准备好较大的容器(4000/2000L)用于第一接种阶段的培养物(例如，其填充培养基，并且在无菌条件下达到30℃)。
当完成第一接种培养后，将第一接种阶段(40/18/27L)培养容器的内含物转移至具有至少2,000L的下表7中所述的培养基的容器中：
成分 g/L 制造商
糖 50 Cargill-Hammond，IN，USA
酵母提取物 7.5 Sensient-Indianapolis，IN，USA
MgSO4 0.1538 Norkem Limited-Kutahya，Turkey
CaCl2 0.1538 Occidental Chemical Company-Dallas，TX
MgCl2 0.1538 North American Salt Company-Overland Park，KS
表7. 用于4,000/2000L的第二接种培养物的培养基。
在空气流和搅动条件下，在30℃下进行该第二接种阶段(4000/2000L)培养，以保持溶解的氧在10%或超过10%，直至至少20 g/L的葡萄糖被消耗。当在无菌条件下生长时，不需要pH控制。而是，在整个发酵过程期间pH保持在健康的范围。当藻类在对数/指数生长期生长时，认为第二接种阶段(4000/2000L)完成，葡萄糖未从培养基耗尽，但是至少20 g/L的葡萄糖已消耗(通常，这在约24-48小时时发生)。
当完成第二接种(4000/2000L)培养后，在30℃下，将第二接种培养物的内含物无菌转移至具有70,000 L-220,000 L体积范围的如下表8中所述的无菌培养基的第三培养容器中：
当30 g/L的葡萄糖已被存在于第三培养容器(70,000-220,000 L容器)中的藻类消耗时，开始葡萄糖和分批进料。在第三培养容器(70,000-220,000 L容器)中，在大规模培养藻类期间，葡萄糖保持在10 g/L。如在下表9中所述，用于分批进料过程的进料含有：
表9. 用于分批进料过程的进料。
经过34小时时间段，加入分批进给的进料。尽管不必理解机理来实践本发明，并且同时本发明不局限于任何具体的作用机理，但是在一些实施方案中，基于对于开始进料(对于由存在于第三培养容器中的藻类消耗的30 g/L葡萄糖)耗时约20小时的观察结果鉴定该时间段。随后停止进料(例如，在约记录第54小时)，以允许所有的营养物质从培养基除去(消耗)。当指数生长末期时进行收获藻类生物质，这通常在记录第66-76小时时发生。
在获得15-30%固体的条件下，使培养物发酵液除渣离心，将浓缩物喷雾干燥，以除去水至最终的水分少于5%。
若干独立的大规模培养物的结果显示于图1和下表10-12：
表10. 大规模生产培养结果。
*不良收获的样品
**该批次具有过程控制问题
○F1-2-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为93,700 L
○F1-3-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为84,000 L
○F1-4-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为92,300 L
○F1-5-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为82,300 L
○F1-6-11
■分批体积为80,000 L并且收获体积为83,600 L
○F2-1-11
■分批体积为110,000 L并且收获体积为113,000L
○F2-2-11
■分批体积为110,000 L并且收获体积为125,600L
表征由每一个大规模、分批进料培养产生的生物质，包括分析总脂肪(饱和和不饱和的脂肪)含量；水分、二十二碳六烯酸(DHA)含量、棕榈酸含量、粗蛋白质含量和灰分含量(参见，例如，脂肪含量和/水分-AOCS Am 5-04 ‘Rapid Determination of Oil/Fat Utilizing High Temperature Solvent Extraction (利用高温溶剂萃取快速测定油/脂肪)’ 版本3/31/10；DHA/棕榈酸-AOCS方法Ce 1b-89和AOAC分析方法991.39；蛋白质-AOAC 990.03；灰分-AOAC 942.05；体积调整的生物质(g/L)-Stone等人，Dry Weight Measurement of Microbial Biomass and Measurement Variablity Analysis(微生物生物质的干重测量和测量变异性分析). BioTechnology Techniques。第6卷：207-212。
表11. 大规模培养物的表征
表12. 大规模培养物的表征
此外，表征生物质的脂肪酸特征。如图2所示，所产生的每一种藻类生物质的脂肪酸特征高度类似/一致，不依赖于生物质的总脂肪含量。考虑所有分析样品的共同特征，在图3中提供综合的脂肪酸特征。
对于每一种藻类生物质，还测定甘油酯特征。在生物质的总甘油酯含量中，约4-8%为甘油二酯，少于1%为甘油，约3-7%为甘油一酯和约84-88%为甘油三酯。
实施例3
生物质收获
在开发本发明的实施方案期间进行的实验鉴定，在生物质中提高的总脂肪水平引起与藻类生物质的离心有关的显著问题。在离心后生物质含量的回收率的范围仅为生物质总重量的约45-85%。例如在下表13中显示：
表13. 比较来自直接收获样品和喷雾干燥产物的脂肪和蛋白质收率。
*不良收获的样品　**该批次具有过程控制问题
F1-2-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为93,700 L
F1-3-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为84,000 L
F1-4-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为92,300 L
F1-5-11
■分批体积为70,000 L并且收获体积为82,300 L
F1-6-11
■分批体积为80,000 L并且收获体积为83,600 L
F2-1-11
■分批体积为110,000 L并且收获体积为113,000L
F2-2-11
■分批体积为110,000 L并且收获体积为125,600L
回收率问题鉴定为可归因于生物质中低密度脂质/油的量的增加。因此，在本发明的实施方案期间进行实验，以试图解决该问题。
显示增强生物质的回收率的能力的一种方法是，在离心前冷却包含藻类生物质的培养物。尽管不需要理解机理来实践本发明，并且本发明不局限于任何具体的作用机理，但是在一些实施方案中，冷却培养物提高了脂质/油的密度并且允许生物质较大的回收率。
进行实验以确定在离心前冷却生物质的效果。
实验室试验1：收集2加仑发酵液，并且在7-8℃下储存16小时以上。收集8 X 50 ml离心管，并且放置在水浴中，以达到在下表14中描述的标靶温度。所有样品在5000 rpm下离心5分钟。
温度(℃) 视觉观察
10 优良的分离，没有漂浮的细胞。澄清的上清液。
20 良好的分离，没有漂浮的细胞。比10℃浑浊
25 与20℃类似；更浑浊
30 良好的分离，没有漂浮的细胞；更浑浊
35 良好的分离，没有漂浮的细胞；非常浑浊
40 仍分离；漂浮的细胞；乳状上清液
45 差的分离
50 几乎不分离，具有许多漂浮的细胞
表14. 试验1的培养温度和离心结果。
实验室试验2：收集新的发酵液样品，并且在10-30℃温度范围测试。不像试验1那样将它们冷却过夜。让所有样品搁置在冰水浴中，至标靶温度。将样品在5000 rpm下离心5分钟。
温度(℃) 视觉观察 密度(g/ml)
10 优良的分离，没有漂浮的细胞。澄清的上清液。 1.01967
15 良好的分离，没有漂浮的细胞。非常浑浊的上清液  
20 样品仍分离；可见的絮凝。  
25 与20℃非常类似；提高的浑浊  
30 仍良好的分离；提高的浑浊 1.02915
表13. 试验2的培养温度和离心结果。
如在实施例2和图1中描述的，在大规模生产期间，在回收(离心)前冷却生物质导致生物质的总回收率显著提高。已完成多次大规模运行，其中总回收率为约95%。
在以上说明书中提及的所有出版物和专利通过引用结合到本文中。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，对于所描述的本发明的组合物和方法的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。虽然已结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应理解的是，要求保护的本发明不过度局限于这些具体的实施方案。实际上，对于相关领域技术人员来说明显的用于实施本发明的所述方式的各种修改意旨在本发明的范围内。

Claims (32)

1. 一种制备包含至少67%总脂肪的藻类生物质的方法，所述方法包括在足以提供包含67%或更多总脂肪的藻类生物质的培养条件下培养藻类。
2. 权利要求1的方法，其中所述藻类生物质以序贯的方式在两种或更多种类型的培养基中培养。
3. 权利要求2的方法，其中所述两种或更多种培养基中的一种培养基含有50 g/L的碳源、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和0.15 g/L氯化镁。
4. 权利要求3的方法，其中所述碳源为糖。
5. 权利要求4的方法，其中所述糖为葡萄糖。
6. 权利要求2的方法，其中所述两种或更多种培养基中的一种培养基含有50 g/L的碳源、约7.5 g/L酵母提取物、约4.0 g/L硫酸镁、约1 g/L尿素、约2 g/L氯化钙、约2 g/L氯化镁和约0.25 g/L磷酸一钾。
7. 权利要求6的方法，其中所述碳源为糖。
8. 权利要求7的方法，其中所述糖为葡萄糖。
9. 权利要求2的方法，其中所述两种或更多种培养基中的一种培养基含有碳源、酵母提取物和海盐。
10. 权利要求9的方法，其中所述碳源为糖。
11. 权利要求10的方法，其中所述糖为葡萄糖。
12. 权利要求2的方法，其中所述藻类在含有葡萄糖、酵母提取物和海盐的第一培养基中培养；转移至含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸镁、氯化钙和氯化镁的第二培养基并且在其中孵育；和转移至含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸镁、尿素、氯化钙、氯化镁和磷酸一钾的第三培养基并且在其中孵育。
13. 权利要求12的方法，其中所述第三培养基有用分批进料补充。
14. 权利要求13的方法，其中所述分批进料包含尿素和磷酸一钾。
15. 权利要求12的方法，其中在停止分批进料过程后12-24小时，从第三培养基收获所述藻类生物质。
16. 权利要求15的方法，其中在所有的营养物质已从培养基除去/消耗后，从第三培养基收获所述藻类生物质。
17. 权利要求15的方法，其中通过离心包含所述藻类生物质的第三培养基，收获所述藻类生物质。
18. 权利要求17的方法，其中在收获藻类生物质之前，将所述第三培养基冷却。
19. 权利要求18的方法，其中将所述第三培养基冷却至约5-25℃。
20. 权利要求1的方法，其中所述藻类为Schizochytrium limacinum。
21. 权利要求12的方法，其中所述第一培养基含有约50 g/L葡萄糖、约10 g/L酵母提取物和约4 g/L海盐。
22. 权利要求12的方法，其中所述第二培养基含有约50 g/L葡萄糖、约7.5 g/L酵母提取物、约0.15 g/L硫酸镁、约0.15 g/L氯化钙和0.15 g/L氯化镁。
23. 权利要求12的方法，其中所述第三培养基含有约50 g/L葡萄糖、约7.5 g/L酵母提取物、约4.0 g/L硫酸镁、约1 g/L尿素、约2 g/L氯化钙、约2 g/L氯化镁和约0.25 g/L磷酸一钾。
24. 权利要求1的方法，其中所述培养条件包括在空气流和搅动条件下于30℃进行藻类培养，以保持溶解的氧在10%。
25. 权利要求1的方法，其中在无菌条件下培养藻类。
26. 一种总脂肪含量为按重量计至少67%的藻类生物质，所述生物质包含约170-250 mg/g二十二碳六烯酸(DHA)和约150-400 mg/g棕榈酸。
27. 一种脂质组合物，所述组合物由权利要求26的藻类生物质制备。
28. 一种食品，所述食品包含权利要求27的脂质组合物。
29. 一种食品，所述食品包含权利要求26的藻类生物质。
30. 一种总脂肪含量为按重量计至少67%的藻类生物质。
31. 总脂肪含量为按重量计至少67%的藻类生物质在制备生物燃料中的用途。
32. 权利要求31的用途，其中所述生物燃料为生物柴油。
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