KR20140145961A - 조류 지질 조성물, 및 이의 제조 및 이용 방법 - Google Patents

조류 지질 조성물, 및 이의 제조 및 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 높은 지질 함량의 조류를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 높은 지질 함량의 조류 바이오매스 및 이로부터 유도된 조류 지질 물질, 이의 제조 방법뿐만 아니라, 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤), 및 이를 포함하거나 이로부터 제조된 식이 조성물(예를 들면, 동물 사료)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바이오연료, 식이(예를 들면, 인간 및 동물 영양), 치료 및 연구 용도를 비롯한 각종 용도들에 사용된다.

Description

조류 지질 조성물, 및 이의 제조 및 이용 방법{ALGAL LIPID COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARING AND UTILIZING THE SAME}
본원은 본원에 전문이 참조 인용되는, 2011년 7월 13일자 출원 미국 가특허출원 일련번호 제61/507,390호에 대해 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 높은 지질 함량의 조류를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 높은 지질 함량의 조류 바이오매스 및 이로부터 유도된 조류 지질 물질, 이의 제조 방법, 및 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤), 및 이를 포함하거나 이로부터 제조된 식이 조성물(예를 들면, 동물 사료)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바이오연료, 식이(예를 들면, 인간 및 동물 영양), 치료 및 연구 용도를 비롯한 각종 용도들에서 사용된다.
최근 몇 년 내에, 조류로부터의 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤)의 생산은 관심 분야였다. 부분적으로, 이는 고품질 농업용지가 조류(조류 바이오매스)를 성장시키는 데 필요하지 않음으로 인한 것이다. 그러나, 여전히 조류로부터의 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤)의 상업적 생산은 도전 과제로 남았다.
또한, 지난 50년간에 걸쳐, 동물 영양을 제공하기 위한 접근법들이 변화되어 왔다. 동물에게 더 이상 어떠한 사료나 기타 입수가능한 물질을 공급하지 않는다. 그 대신, 동물의 식단을 총영양가 및 비용에 대해 면밀히 모니터링한다. 매우 종종, 특정 식단에 적용되는 동물을 사료의 영양가를 최대화하기 위해 조정되는 사료의 영양 성분에 있어서의 품질 및 성능 특성, 및 동물 성능 특성의 최적화에 대해 모니터링한다.
그러나, 비용이 임계 요소이다. 동물을 지탱시키는 것뿐만 아니라 많은 용도들에서 증진된 성장 및 가치를 유발하기 위한, 비용 효과적인 동물 사료에 대한 연구가 계속되고 있다.
발명의 개요
본 발명은 높은 지질 함량의 조류를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 높은 지질 함량의 조류 바이오매스 및 이로부터 유도된 조류 지질 물질, 이의 제조 방법뿐만 아니라, 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤), 및 이를 포함하거나 이로부터 제조된 식이 조성물(예를 들면, 동물 사료)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바이오연료, 식이 용도(예를 들면, 인간 및 동물 영양), 치료 용도 및 연구 용도를 비롯한 각종 용도들에서 사용된다.
따라서, 본 발명은 요망되는 높은 지방 함량을 포함하는 조류 바이오매스를 제공하는 데 충분한 배양 조건 하에서 조류를 배양하는 단계를 포함하는, 요망되는 높은 지방 함량(예를 들면, 67% 이상의 지방)을 포함하는 조류 바이오매스의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 요망되는 수준의 총 지방(예를 들면, 67% 이상의 지방)을 포함하는 조류 바이오매스를 수득할 수 있도록 하는 배양 조건을 규명하였다. 본 발명은 본 발명에 따라 생성된 조류 바이오매스의 총 지방 함량(예를 들면, 중량 기준)에 제한되지 않는다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 발생되고/되거나 사용된 조류 바이오매스는 67 중량% 이상의 지방 함량을 포함한다. 그러나, 본 발명은 또한 더 많은 양(예를 들면, 68% 초과, 69% 초과, 70% 초과, 71% 초과, 72% 초과, 73% 초과, 74% 초과, 75% 초과, 76% 초과, 77% 초과, 78% 초과, 79% 초과, 80% 초과, 81% 초과, 82% 초과, 85% 초과, 또는 그 이상) 또는 더 적은 양(예를 들면, 약 66%, 약 65%, 약 64%), 약 63%, 약 62%, 약 61%, 약 60%, 약 59%, 약 58%, 약 57%, 약 56%, 약 55%, 약 54%, 또는 그 이하) 양의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 실제로, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 임의의 요망되는 수준의 총 지방 함량을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키는 데 이용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 순차 방식으로 2 이상의 유형의 배양 배지 중에서 배양된다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 2 이상의 배양 배지 중 하나의 배양 배지는 50 g/L의 탄소원, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및 0.15 g/L의 염화마그네슘을 함유한다. 본 발명은 탄소원에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 탄수화물, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 자일로스, 삭카로스, 말토스 또는 가용성 전분, 및 올레산, 지방, 예컨대 대두 오일, 당밀, 글리세롤, 만니톨, 및 아세트산나트륨, 면실분, 글리세롤, 당밀 및 옥수수 침지액을 포함하나 이들에 국한되지 않는 각종 탄소원들이 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 2 이상의 배양 배지의 또 다른 배양 배지는 50 g/L의 탄소원, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 4.0 g/L의 황산마그네슘, 약 1 g/L의 우레아, 약 2 g/L의 염화칼슘, 약 2 g/L의 염화마그네슘 및 약 0.25 g/L의 인산이수소칼륨을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 2 이상의 배양 배지 중 하나의 배양 배지는 탄소원, 효모 추출물 및 해염을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 또한 본원에 기재된 바와 같이, 조류를 제1 배양 배지(예를 들면, 글루코스, 효모 추출물 및 해염 함유)에서 배양하고; 제2 배양 배지(예를 들면, 글루코스, 효모 추출물, 황산마그네슘, 염화칼슘 및 염화마그네슘 함유)로 전달하여 배양하며; 제3 배양 배지(예를 들면, 글루코스, 효모 추출물, 황산마그네슘, 우레아, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 인산이수소칼륨 함유)로 전달하여 배양한다. 몇몇 실시양태에서, 배양 배지들 중 하나를 페드-뱃치 공급물(fed-batch feed)로 보충한다. 한 바람직한 실시양태에서, 제3 배양 배지를 페드-뱃치 공급물로 보충한다. 본 발명은 이용되는 페드-뱃치 공급물의 유형 또는 기간에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 페드-뱃치 공급물은 우레아 및 인산이수소칼륨을 포함한다. 본 발명은 배양에 사용된 배지 성분의 양 및/또는 비에 의해 제한되지 않는다. 각각의 각종 배지(예를 들면, 제1 배양 배지, 제2 배양 배지, 뱃치 배지 및 페드-뱃치 배지)의 성분으로 이용될 수 있는 예가 본원에 상세히 기재되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 페드-뱃치 공정의 중지 후 12 내지 24시간에 배양물(예를 들면, 제3 배양 배지)으로부터 수거된다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 영양소 모두가 배지로부터 제거/소모된 후에 제3 배양 배지로부터 수거된다. 본 발명은 조류 바이오매스가 수거되는 방식에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 방법들을 포함하나 이들에 국한되지 않는 각종 방식을 사용하여, 바이오매스를 수거할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 원심분리에 의해 수거된다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스를 포함하는 배양 배지는 조류 바이오매스를 수거하기 전에 저온저장된다. 본 발명은 수거하기 전에 조류 바이오매스를 포함하는 배양 배지를 저온저장하는 온도에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 온도들을 포함하나 이들에 국한되지 않는 각종 온도들이 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스를 포함하는 배양 배지는 약 5℃ 내지 25℃로 저온저장된다. 본 발명은 본 발명에 사용되는 조류의 유형에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 조류들을 포함하나 이들에 국한되지 않는 각종 조류들이 (예를 들면, 독립적으로 또는 조합하여) 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조류는 클로렐라(Chlorella) 속, 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속, 또는 크립테코디늄(Crypthecodinium) 속으로부터의 균주 또는 종이다. 한 바람직한 실시양태에서, 조류는 쉬조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum)이다. 몇몇 실시양태에서, 제1 배양 배지는 약 50 g/L의 글루코스, 약 10 g/L의 효모 추출물 및 약 4 g/L의 해염을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 제2 배양 배지는 약 50 g/L의 글루코스, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및 0.15 g/L의 염화마그네슘을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 제3 배양 배지는 약 50 g/L의 글루코스, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 4.0 g/L의 황산마그네슘, 약 1 g/L의 우레아, 약 2 g/L의 염화칼슘, 약 2 g/L의 염화마그네슘 및 약 0.25 g/L의 인산이수소칼륨을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 배양 조건은 용존 산소를 약 10%로 유지하기 위한 기류 및 교반 조건 하에서 30℃에서 조류 배양을 실행하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제3 배양 배지(예를 들면, 주발효기(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 256,000 L 용기)의 접종 시에 존재하는 배양 배지)는 질소(N):인(P):칼륨(K)의 초기 비가 46:13:8.5인 배지를 함유한다. 한 바람직한 실시양태에서, N:P:K 비는 뱃치 배양 및 페드-뱃치 배양 방식에서 동일하다. 몇몇 실시양태에서, 마그네슘(Mg):칼슘(Ca)의 비는 뱃치 방식 및 페드-뱃치 방식 모두로 사용되는 배양 배지에서 3:1이나, 더 높은 비(예를 들면, 4:1, 4.5:1 또는 그 이상) 및 더 낮은 비(예를 들면, 2.5:1, 2:1, 1.5:1 또는 그 이하)가 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 1:1의 염화물(Cl2):황산염(SO4)의 비가 뱃치 방식 및 페드-뱃치 뱃치에 사용되는 배양 배지에서 사용되나, 더 높은 비(예를 들면, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 또는 그 이상) 및 더 낮은 비(예를 들면, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 또는 그 이하)가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 주발효기(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 256,000 L 용기)의 접종 시의 배지 내 황산염(SO4):인산염(PO4)의 비는 16:1이나, 더 높은 비(예를 들면, 20:1, 25:1, 30:1, 32:1 또는 그 이상) 및 더 낮은 비(예를 들면, 10:1, 8:1.5:1, 3:1 또는 그 이하)가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 요망되는 지방 함량(예를 들면, 67% 초과의 지방)을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키는 전체 배양(예를 들면, 접종물, 제1 종자 단계, 제2 종자 단계 및 주발효기 배양 포함)의 말기에 뱃치되고(batched) 공급된 황산염(SO4):인산염(PO4)의 총 비는 5.3:1이나, 더 높은 비(예를 들면, 5.5:1, 5.7:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 그 이상) 및 더 낮은 비(예를 들면, 5:1, 4.5:1, 4:1.3:1 또는 그 이하)가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 주발효기(예를 들면, 70,000 L, 12.0,000 L, 256,000 L 용기)의 접종 시의 배지 내의 염화물(Cl2):인산염(PO4)의 비는 16:1이나, 높은 비(예를 들면, 20:1, 25:1, 30:1, 32:1 또는 그 이상) 및 더 낮은 비(예를 들면, 10:1, 8:1, 5:1, 3:1 또는 그 이하)가 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 요망되는 지방 함량(예를 들면, 67% 초과의 지방)을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키는 전체 배양(예를 들면, 접종물, 제1 종자 단계, 제2 종자 단계 및 주발효기 배양 포함)의 말기에 뱃치되어 공급된 염화물(Cl2):인산염(PO4)의 총 비는 5.3:1이나, 더 높은 비(예를 들면, 5.5:1, 5.7:1.6:1, 7:1, 8:1 또는 그 이상) 및 더 낮은 비(예를 들면, 5:1, 4.5:1, 4:1.3:1 또는 그 이하)가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 조류 바이오매스에 요망되는 높은 지방 함량(예를 들면, 67 중량% 이상의 총 지방 함량)을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 바이오매스는 약 170-250 mg/g 도코사헥사엔산(DHA) 및/또는 약 150-400 mg/g 팔미트산을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 조류 바이오매스(예를 들면, 건조된 조류 바이오매스) 또는 이의 성분(예를 들면, 이의 지방산 성분)을 포함하는 지질 조성물, 식료 제품 또는 기타 물질을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스(예를 들면, 건조된 조류 바이오매스(예를 들면, 본원에 기재된 방법에 따라 발생된 것))는 요망되는 양의 총 지방 및/또는 기타 성분(예를 들면. 약 68% 초과의 총 지방, 약 69% 초과의 총 지방, 약 70% 초과의 총 지방, 약 71% 초과의 총 지방, 약 72% 초과의 총 지방, 약 73% 초과의 총 지방, 약 74% 초과의 총 지방, 약 75% 초과의 총 지방, 약 76% 초과의 총 지방, 약 77% 초과의 총 지방, 또는 약 78% 초과의 총 지방)을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 67% 초과의 총 지방 함유)는, 바이오매스가 5% 미만의 수분(예를 들면, 4.5% 미만의 수분, 4% 미만의 수분, 3.5% 미만의 수분, 3% 미만의 수분, 2.5% 미만의 수분, 2% 미만의 수분, 또는 1.5% 미만의 수분)을 함유하도록 건조된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 170-250 mg/g 이상 도코사헥사엔산(DHA)(예를 들면, 약 170-180 mg/g DHA, 약 180-190 mg/g DHA, 약 190-200 mg/g DHA, 약 200-210 mg/g DHA, 약 210-220 mg/g DHA, 약 220-230 mg/g DHA, 약 230-240 mg/g DHA, 약 240-250 mg/g DHA 또는 250 mg/g 초과 DHA)를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 150-400 mg/g 이상 팔미트산(IUPAC 명: 헥사데칸산(예를 들면, 약 150-200 mg/g, 약 200-225 mg/g, 약 225-250 mg/g, 약 250-275 mg/g, 약 275-300 mg/g, 약 300-325 mg/g, 약 325-350 mg/g, 약 350-375 mg/g, 약 375-400 mg/g 또는 400 mg/g 초과))를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 300-600 mg/g 이상 총 지방산(예를 들면, 약 300-350 mg/g, 약 350-400 mg/g, 약 400-450 mg/g, 약 450-500 mg/g, 약 500-550 mg/g, 약 550-600 mg/g 또는 600 mg/g 초과의 지방산)을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 15% 미만의 단백질(예를 들면, 약 14% 미만의 단백질, 약 13% 미만의 단백질, 약 12% 미만의 단백질, 약 11% 미만의 단백질, 약 10% 미만의 단백질, 약 9% 미만의 단백질, 또는 약 8% 미만의 단백질)을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스 또는 이의 성분은 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤)를 제조하는 데 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스 또는 이의 성분은 식료 제품(예를 들면, 동물 사료 또는 사료 성분)을 제조하는 데 사용된다.
도 1은 본 발명의 측면에 따른 대규모의 종속영양성(heterotrophic) 조류 바이오매스 생성 중에 발생되는 데이터를 나타낸다.
도 2는 수가지 독립적 대규모 조류 배양물로부터 수거된 지방산 프로파일을 보여준다.
도 3은 본원에 기재된 물질 및 방법을 이용하여 바이오매스로부터 수거된 복합 지방산 프로파일을 보여준다.
정의
본원에 사용되는 "인지질"이란 하기 일반 구조를 가지는 유기 화합물을 지칭한다:
Figure pct00001
상기 식 중에서, R1은 지방산 잔기이고, R2는 지방산 잔기 또는 -OH이며, R3은 -H 또는 함질소 화합물 콜린(HOCH2CH2N+(CH3)3OH-), 에탄올아민(HOCH2CH2NH2), 이노시톨 또는 세린이다. R1 및 R2는 동시에 OH일 수 없고, R3이 -OH일 때, 화합물은 디아실글리세로포스페이트ㄴ이고, 한편 R3이 함질소 화합물일 때, 화합물은 포스파티드, 예컨대 레시틴, 세팔린, 포스파티딜 세린 또는 플라스말로겐이다.
본원에 사용되는 "에테르 인지질"은 글리세롤 골격의 위치 1에 에테르 결합을 가지는 인지질을 지칭한다. 에테르 인지질의 예에는 알킬아실포스파티딜콜린(AAPC), 라이소-알킬아실포스파티딜콜린(LAAPC), 및 알킬아실포스파티딜에탄올아민(AAPE)이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. "비(non-)에테르 인지질"은 글리세롤 골격의 위치 1에 에테르 결합을 가지지 않는 인지질이다.
본원에 사용되는 용어 "오메가-3 지방산"은 분자의 메틸 말단으로부터 3번째 탄소 원자와 4번째 탄소 원자 사이에 탄화수소 사슬에 최종 이중 결합을 가지는 다중불포화 지방산을 지칭한다. 오메가-3 지방산의 비제한적 예에는 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(EPA), 4,7,10,13,16,19-도코사헥산산(DHA) 및 7,10,13,16,19-도코사펜탄산(DPA)이 포함된다.
본원에 사용되는 용어 "트리아실글리세리드", "트리글리세리드" 및 "트리아실글리세롤" 및 "TAG"는 글리세롤 및 3개의 지방산으로부터 유도되는 에스테르를 지칭하고, 여기서 "지방산"은 포화 또는 불포화인 긴 비분지 지방족 테일(사슬)을 가지는 카르복실산을 지칭한다. 팔미트산은 트리아실글리세리드의 하나의 비제한적 예이다.
본원에 사용되는 용어 "w/w(중량/중량)" 및 "w/w%"와 이와 문법적 균등 용어는 중량을 기준으로 한 조성물 내 소정의 물질의 양(백분율)을 지칭한다. 예를 들면, 50% w/w 인지질을 포함하는 조성물은 인지질의 질량이 조성물의 총 질량의 50%이라는 것(즉, 100 g의 조성물, 예컨대 오일 중 50 g의 인지질)을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "조류(algae)"는 신선한 물이나 염수에서 발생하고, 독립영양성 또는 종속영양성이나, 진정한 줄기, 뿌리 및 잎이 결여된 식물로서 과거에 분류되었던 단세포 또는 다세포 유기체를 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "종속영양성"은 자체 식료를 합성할 수 없고 영양을 위해 유기 물질(예를 들면, 복합 및/또는 단순 유기 물질)에 의존하는 유기체를 지칭한다. 따라서, 용어 "종속영양성 조류"는 자체 식료를 합성할 수 없고 영양을 위해 유기 물질에 의존하는 조류를 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "독립영양성"은 빛 또는 화학 에너지를 이용하여, 무기 물질로부터 자체 식료를 합성할 수 있는 유기체를 지칭한다. 용어 "조류"의 사용은 또한 미세조류와도 관련되고, 이에 따라 "미세조류"의 의미를 포괄한다. 용어 "조류 조성물"은 조류를 포함하는 임의의 조성물, 예컨대 수생 조성물을 지칭하고, 조류가 배양되는 물 본체 또는 및 배양액에 국한되지 않는다. 조류 조성물은 조류 배양물, 조류 바이오매스, 농축 조류 배양물, 또는 탈수 조류체일 수 있고, 액체, 반고체, 또는 고체 형태의 것일 수 있다. 비액체 조류 조성물은 고체의 수분 수준 또는 백분율 중량 측면에서 기재될 수 있다. "조류 배양물"은 살아있는 조류를 포함하는 조류 조성물이다. 용어 "조류"는 (통상 해초로 알려진) 거대조류 및 미세조류를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "조류 바이오매스" 또는 "바이오매스"는 소정의 시간에 소정의 영역 또는 생태계에서 성장한 조류 세포의 집합체 또는 덩어리를 지칭한다. 그 영역 또는 생태계는 천연 발생 환경(예를 들면, 물 본체) 또는 합성 환경(예를 들면, (예를 들면, 개방형 또는 폐쇄형) 발효기 또는 바이오리액터 내)일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "총 지방"은 물질 내에 존재하는 트리글리세리드, 인지질, 왁스 에스테르, 및 스테롤의 합계를 지칭한다. 예를 들면, 조류 바이오매스의 "총 지방" 함량은 바이오매스 내에 존재하는 트리글리세리드, 인지질, 왁스 에스테르, 및 스테롤의 합계를 지칭한다. 또한, 총 지방은 포화 지방 및 불포화 지방을 모두 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "보존제"는 풍미, 향, 색, 조직, 외관, 영양가 또는 안전성의 열화를 지연 또는 방지함으로써 식료 및 비식료의 저장 수명을 연장하는 제제를 지칭한다. 보존제는 부분 또는 완전 세포 파괴 또는 불능화를 초래하는 치명적 비가역적 작용을 제공할 필요가 없다. 무균제, 살균제, 소독제, 포자박멸제, 바이러스박멸제 및 결핵균박멸제는 경우에 따라 "살세균" 작용으로 지칭되는 것과 같은 비가역적 작용 방식을 제공한다. 이와 대조적으로 보존제는 그 보존제가 제거될 경우, 표적 미생물이 증식을 재개할 수 있다는 점에서, 가역적인 억제 작용 또는 미생물 정지 작용을 제공할 수 있다. 보존제와 살균제 간의 주요 차이는 주로 작용 방식(보존제는 미생물 사멸보다는 성장을 방지함) 및 노출 시간(보존제는 작용 기간이 수일 내지 수개월인 반면, 살균제는 작용 기간의 수분 이하임)과 관련된다.
본원에 사용되는 용어 "효모 및 효모 세포"는 세포벽, 세포막 및 세포내 성분들을 가지는, 균(Fungi) 계에서 분류되는 진핵 미생물을 지칭한다. 효모는 특이적 분류법적(taxonomic) 또는 계통발생학적(phylogenetic) 집단화를 형성하지는 않는다. 현재 약 1,500 종이 공지되어 있고; 모든 효모 종의 단지 1%만 설명된 것으로 추정한다. 용어 "효모"는 S. 세레비지아에(S. cerevisiae)의 동의어로 흔히 치급되지만, 그러나 효모의 계통 발생학적 다양성은 아스코마이코타(Ascomycota) 및 바시디오마이코타(Basidiomycota)의 두 분류군 모두에 뱃치되는 것으로 나타내어진다. 버딩(budding) 효모("참(true) 효모")는 삭카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목(order)으로 분류된다. 대부분의 효모는 버딩에 의해 무성색식으로 번식하나, 몇몇은 2분열(binary fission)에 의해 번식한다. 효모는 단세포이지만, 일부 종은 슈도하이파에(pseudohyphae), 또는 위 균사(false hyphae)로 알려진 버딩 세포들이 연결되어 형성된 스트링을 형성하여 다세포가 된다. 효모 크기는 종에 따라 매우 다양할 수 있지만, 전형적으로 직경이 3-4 μm으로 측정되지만, 몇몇 효모는 40 μm 초과에 이를 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "셀렌 풍부 효모" 및 "셀렌화 효모"는 무기 셀렌 염을 함유하는 배지에 배양되는 임의의 효모(예를 들면, 삭카로마이세스 세레비지아에)를 지칭한다. 본 발명은 사용되는 셀렌 염에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 아셀렌산나트륨, 셀렌산나트륨, 셀렌산코발트 또는 셀렌산코발트를 포함하나 이들에 국한되지 않는 각종 셀렌 염은 본 발명에서 유용한 것으로 간주된다. (예를 들면, 세포 또는 효모와 관련되지 않은) 유리 셀레노메티오닌도 또한 셀렌 풍부 효모의 셀렌 원으로서 사용될 수 있는데, 이는 효모가 이 형태의 셀렌을 혼입하고 있기 때문이다. 배양 중, 셀렌과 황 사이의 화학 유사성으로 인해, 효모는 세포 내에 통상적으로 황을 함유하는 유기 화합물인 것 내에 황 대신에 셀렌을 혼입하고 있다. 그러한 효모 제제 내의 셀렌 함유의 화합물은 폴리펩티드/단백질 내에 혼입되어 있는 형태로 존재할 셀레노메티오닌이다. 셀레노메티오닌의 형태로 존재하는 총 세포내 셀렌의 양은 가변적이나, 10 내지 100%, 20 내지 60%, 50 내지 75%, 및 60 내지 75%일 수 있다. 셀렌화된 효모 제제 내의 나머지 유기 셀렌의 나머지는 셀레노메티오닌 생합성을 위한 경로에 있어서의 중간체로 주로 구성된다. 이에는 셀레노시스테인, 셀레노시시아티오닌, 셀레노호모시스테인 및 셀레노아데노실셀레노메티오닌이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 피니쉬된 제품 내의 잔류 무기 셀렌 염의 양은 일반적으로 매우 낮다(< 2%). 그러나, 상기 백분율보다 더 큰 양(예를 들면, 2 내지 70%) 또는 더 낮은 양(예를 들면, 0.1 내지 2%)을 함유하는 제제도 본 발명에 의해 포괄되기 때문에, 본 발명은 상기 백분율에 의해 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "셀-플렉스(SEL-PLEX)"은, 효모의 성장 속도에 대한 셀렌 염의 유해한 영향을 최소화하고 무기 셀렌이 세포성 유기 물질 내로 혼입되도록 하는 방식으로 증가하는 양의 사탕수수 당밀 및 셀렌을 제공하는 페드-뱃치 발효로 배양되는, 건조된 비생육성 셀렌 풍부 효모(예를 들면, 등록 번호 CNCM I-3060, 프랑스 파리 소재의 국립 미생물연구소 파스퇴르 기관의 균주 은행(Collection Nationale De Cultures De Microorganismes (CNCM))의 삭카로마이세스 세레비지아에)을 지칭한다. 잔류 무기 셀렌은 (예를 들면, 엄격한 세정 공정을 이용하여) 제거되고, 총 셀렌 함량의 2%를 초과하지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "유기 셀렌"은 셀렌이 황을 치환하고 있는 임의의 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 유기 셀렌은 효모에 의해 생합성되는 상기 임의의의 화합물을 지칭하거나 화학적으로 합성되는 유리 유기 셀레노-화합물을 지칭할 수 있다. 후자의 한 예는 유리 셀레노메티오닌이다.
본원에 사용되는 용어 "무기 셀렌"는 일반적으로 임의의 셀렌 염(예를 들면, 아셀렌산나트륨, 셀렌산나트륨, 아셀렌산코발트 및 셀렌산코발트)을 지칭한다. 또한 각종 다른 무기 셀렌 원(예를 들면, 머크 인덱스(Merck index)에 열거된 것들)도 있다. 셀렌화된 효모는 아셀렌산나트륨, 셀렌산나트륨, 아셀렌산코발트, 셀렌산코발트, 셀렌산, 아셀렌산, 브롬화셀렌, 염화셀렌, 육불화셀렌, 산화셀렌, 옥시브롬화셀렌, 옥시염화셀렌, 옥시불화셀렌, 황화셀렌, 오브롬화셀렌, 사염화셀렌 및 사불화셀렌을 포함하나 이들에 국한되지 않는 무기 셀렌 원을 이용하여 발생될 수 있다.
"YCW"로도 칭해지는, 본원에 사용되는 용어 "효모 세포벽"은 효모의 혈장 막과 세포내 성분들을 둘러싸는 효모 유기체의 세포벽을 지칭한다. 효모 세포벽은 이 효모 세포벽의 바깥 층(주로 만난)과 안쪽 층(주로 글루칸 및 키틴) 모두를 포함한다. 세포벽의 기능은 구조를 제공하고 대사 활성 세포질을 보호한다. 신호전달 및 인지 경로가 효모 세포벽에서 일어난다. 효모 세포벽의 조성은 균주별로 또한 효모의 성장 조건에 따라 가변적이다.
본원에 사용되는 용어 "정제된" 또는 "정제한다"이 시료로부터 성분들을 제거하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 효모 세포벽 또는 효모 세포벽 추출물들은 비효모 세포벽 성분들(예를 들면, 혈장막 및/또는 효모 세포내 성분)의 제거에 의해 정제되고, 이들은 오염 물질들 또는 효모 세포벽 이외의 물질들을 제거함으로써 또한 정제된다. 비-효모 세포벽 성분들 및/또는 비효모 세포벽 오염 물질들을 제거하면 샘플 내 효모 세포벽 또는 이의 성분들의 비율이 증가된다.
본원에 사용되는 용어 "생체내(in vivo)"는 생물학적 기관 내에서 일어나는 살아있는 기관에서 수행되는 연구 및/또는 실험을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "시험관내(in vitro)"는 생물 기관 외부의 인공 환경 및 통상적으로 기관 내에서 일어나나 인공 환경에서 발생하도록 구성되는 생물학적 공정 또는 반응들을 지칭한다. 시험관내 환경에는 시험관 및 세포 배양이 포함될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography)" 및 용어 "HPLC"는 화합물을 분리하기 위한 한 형태의 액체 크로마토그래피를 지칭한다. 화합물들은 용액 내에 용해된다. 화합물들은 샘플 혼합물의 플러그를 칼럼에 주입함으로써 분리된다. HPLC 기기는 이동상 저장소, 펌프, 인젝터, 분리 칼럼 및 검출기를 포함한다. 칼럼 용출액 내의 분석물의 존재는 굴절률, 설정 파장에서의 UV-VIS 흡수, 적당한 파장에서의 여기 후 형광 또는 전기화학적 반응의 변화를 정량적으로 검출함으로써 기록된다.
본원에 사용되는 용어 "주사전자현미경(scanning electron microscopy)" 및 용어 "SEM"은 래스터(raster) 스캔 패턴 내에서 고에너지 전자빔으로 샘플 표면을 주사하여 영상화하는 전자현미경의 종류를 지칭한다. 전자들은 샘 샘플 표면의 지형, 조성 및 전기 전도도와 같은 다른 성질들에 관한 정보를 함유하는 신호들을 생성하는 샘플을 구성하는 원자와 상호작용한다.
본원에 사용되는 용어 "고정화제(fixation agent)"는 물질을 "고정"하거나 안정화하거나, 또는 그와 다른 방식으로 현 형태로 보존하여, 그 물질이 변성되거나 다른 형태로 변형되는 것을 방지하도록 하기 위해 한 물질을 다른 물질에 고정시킬 수 있는 약품을 지칭한다. 종종 고정화제는 샘플을 제조하기 위해 주사전자현미경(SEM)에서 사용된다. 일차적 고정화제: 본원에 사용되는 용어 "일차 고정화제"는 물질을 "고정하기" 위해 사용되는 제1 고정화제를 지칭한다. 이차 고정화제: 본원에 사용되는 용어 "이차 고정화제"는 물질을 "고정하기" 위해 사용되는 제2 고정화제를 지칭한다. 삼차 고정화제: 본원에 사용되는 용어 "삼차 고정화제"는 물질을 "고정하기" 위해 사용되는 제3 고정화제를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "분석물(analyte)"은 원자, 분자, 원자 및/또는 분자의 군, 물질 또는 화학 성분을 지칭한다. 일반적으로, 분석물은 그 자체로는 측정할 수 없으며, 상기 분석물의 측면들 또는 성질들(물리적, 화학적, 생물학적 성질 등)은 HPLC와 같은 분석 공정을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 "의자(분석물-성분)" 그 자체는 측정하지 않으며, 의자의 높이, 너비 등이 측정될 수 있다. 마찬가지로, 마이코톡신은 측정할 수 없으나, 그것의 농도와 관련된 마이코톡신 형광은 측정할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "신호(signal)"는 일반적으로 반응이 일어났음(예를 들면, 항체가 항원에 결합되었음)을 지시하는 임의의 검출가능한 과정을 언급할 때 사용된다. 신호는 정성적으로나 정량적으로 평가될 수 있다. "신호" 유형의 예에는 방사성 신호, 형광측정 신호 또는 요오드적정 산물/시약 신호가 포함되나 이들에 국한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "생체이용효율(bioavailability)"은 유기체에 이용가능하거나 순환계에 도달하는 분자 또는 성분의 분율을 지칭한다. 분자 또는 성분이 정맥내 투여될 때, 생체이용효율은 100%이다. 그러나, 분자 또는 성분이 다른 경로를 통해(예컨대, 구강으로) 투여되는 경우, 생체이용효율은 감소한다(불충분한 흡수 및 1차-통과 대사에 기인하여). 영양 설정에서, 생체이용효율은 영양소의 흡수 및 이용 속도를 지칭한다. 예를 들면, 상이한 형태의 동일 영양소들은 상이한 생체이용성을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "유효량(effective amount)"은 유리하거나 요망되는 결과를 도출하는 데 충분한 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 용도 또는 투약에서 또 다른 물질과 함께 투여 및/또는 조합될 수 있고, 특정한 제형 또는 투여 경로에 제한되고자 함이 아니다.
본원에 사용되는 용어 "소화하다(digest)"는 음식, 사료 또는 다른 유기 화합물들을 흡수 가능한 형태로 전환하는 것, 즉 열 및 수분 또는 화학 작용에 의해 연화, 분해 또는 절단하는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "소화계(digestive system)"는 소화가 일어날 수 있는 계(위장계를 포함하는)를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "사료(feedtuff)"는 동물들에게 소비되어 포유동물 식단의 에너지 및/또는 영양소에 기여하는 물질(들)을 지칭한다. 사료의 비제한적인 예들로서, 완전 혼합 사료(Total Mixed ration(TMR))(들), 여물(forage)(들), 펠렛(pellet)(들), 농축물(들), 프리믹스(premix), 부산물(들), 곡물(들), 양조된 곡물(들), 당밀, 섬유(들), 사료(fodder)(들), 잔디(들), 건초, 종자(kernel)(들), 잎(들), 밀(들), 용해물(들) 및 보충물 등을 들 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "식료 보충물", "식이 보충물", "식이 보충 조성물" 등은 식이의 부분으로서 사용되는 식이 또는 영양 보충물로서 제형되는 식료 제품을 지칭한다. 예시적 식이 보충물 조성물이 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 용어 "동물"은 동물계를 지칭한다. 이에는 가축, 농장 동물, 가정용 동물들, 반려 또는 애완동물들, 해양 및 담수 동물들, 그리고 야생 동물들이 포함되나 이들에 국한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "투여(administration)" 및 용어 "투여하는 것"은 약물, 프러드러그 또는 다른 제제를 포함하는 물질, 또는 개체(예를 들면, 대상내 또는 생체내, 시험관내 또는 생체외 세포, 조직 및 기관)에의 치료적 처치를 포함하는 물질을 수여하는 행위를 지칭한다. 예시적인 투여 경로는 눈(ophthalmic), 입(oral), 피부(topical 또는 transdermal), 코(nasal), 폐(inhalant), 구강 점막(buccal), 귀, 직장, 질(vaginal), 주사(예를 들면, 정맥 주사, 피하, 종양내, 복강내) 등을 통할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "공동 투여(co-administration)" 및 용어 "공동 투여하는 것(co-administering)"은 대상에의 2종 이상의 작용제들 또는 요법들 및/또는 물질(예를 들면, 사료)의 투여를 지칭한다. 2종 이상의 작용제 또는 요법의 공동 투여는 동시에 일어날 수 있거나, 혹은 제1 제제/요법이 제2 제제/요법 전에 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "처치(treatment)"는 질환(예를 들면, 진균 중독(mycotoxicosis))의 신호 또는 증상의 개선 및/또는 전환을 지칭한다. 상기 용어 "처치"는 실제 치료뿐만 아니라, 예방적 또는 방지적 수단들도 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 조성물 및 방법들을 이용한 처치로부터 이득을 보는 개체들은 이미 질환 및/또는 장애를 가진 자들뿐만 아니라, 질환 및/또는 장애를 예방(예를 들면 본 발명의 예방적 처치를 사용하여)하고자 하는 자들도 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "질환 위험에 처한(at risk for disease)"은 특정 질환을 경험할 수 있는 경향이 있는 개체를 지칭한다. 이러한 경향은 유전적(예를 들면, 유전성 장애와 같은 질환을 경험하는 특정한 유전적 경향)이거나, 다른 요소들(예를 들면, 연령, 체중, 환경 조건, 환경에 존재하는 유해 화합물에의 노출 등)에 기인한 것일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "질환(disease)", 용어 "감염(infection)" 및 용어 "병적 상태(pathological condition) 또는 반응"은 살아있는 개체(예컨대, 인간 및/또는 동물) 또는 이의 기관 또는 조직의 정상 기능의 수행을 방해하거나 변형시키는 정상 상태의 손상과 연관된 상태, 신호 및/또는 증상 등을 지칭하며, 이는 환경적 요소들(예컨대, 영양실조, 산업적 상해 또는 기후, 진균 중독 포함), 특정한 감염성 제제들(예컨대, 벌레, 세균, 바이러스, 프리온 등), 개체의 내재적 결함(예컨대, 각종 유전적 비정상) 또는 이러한 요인들과 기타 요인들의 조합들에 대한 반응일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "질환을 앓는(suffering from disease)"은 특정한 질환을 경험하고 있는 개체(예를 들면, 동물 또는 인간 개체)를 지칭하며, 임의의 특정한 신호, 증상 또는 질환에 국한되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "독성(toxic)"은 독소/독성물질의 접촉 또는 투여 전의 동일한 세포 또는 조직과 비교할 때, 대상, 세포 또는 조직에 대한의 임의의 유해하거나 해롭거나 기타 불리한 효과들을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "약학 조성물(pharmaceutical composition)"은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료에 특히 적합한 조성물을 구성하게 되는, 활성 제제(예를 들면 MIP를 포함하는 조성물)와 활성 또는 불활성 캐리어의 조합을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 용어 "약리학적으로 허용가능한"은 실질적으로 공지된 이로운 반응보다 공지된 부작용을 더 발생시키지 않는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "접종(inoculation)"은 미생물 또는 미생물들(예를 들면, 조류, 효모, 진균류, 세균류 등)의 현탁액을 배양 배지 내에 도입하는 행위를 지칭한다. 접종은 그것이 성장하거나 재생성시키게 되는 환경 내로 무언가를 도입하는 동작 또는 공정이다.
본원에 사용되는 용어 "접종물" 및 용어 "전구-접종물"은 접종에 사용되는 세포, 즉 배양을 개시하기 위해 첨가되는 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "원심분리(centrifugation)"는 물체를 고정축 주위로 회전시키며 상기 축에 수직하는 힘을 인가하는 회전 로터에 의해 발생하는 원심력을 사용하여 사이즈 또는 밀도에 따라 분자들을 분리하는 것을 지칭한다. 원심분리는 구심가속도를 사용하여 크고 작은 밀도의 물질들을 서로 다른 밀도의 층들로 균일하게 분산시키는 침강 원칙을 사용하여 작동한다.
본원에 사용되는 용어 "농도(concentration)"는 한정된 공간 당 물질의 양을 지칭한다. 농도는 주로 단위 부피당 질량으로 표현된다. 용액을 희석시키기 위해, 더 많은 용매를 첨가해야 하거나, (예를 들면, 농축된 효모 세포벽 추출물 또는 농축된 변형 효모 세포벽 추출물을 선택적 증발, 분무 건조, 동결 건조에 의해) 용질의 양을 감소시켜야 한다. 이와 반대로, 용액을 농축시키기 위해 더 많은 용질을 첨가하거나 용매의 양을 감소시켜야 한다.
본원에 사용되는 용어 "층(layer)"은 주로 물질의 밀도 성질과 관련하여 원심분리에 의한 분리 이후에 수득되는 상부 부분 또는 세그먼트를 형성하는 물질의 계층(stratum) 내에 조직화된 수평 침착물을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "수거하다(harvest)"는 생성된 물질들을 수집하거나 취합하는(예를 들면, 효모 생성 중에 생성된 물질들을 취합하는) 행위를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "건조(drying)"는 분무 건조, 동결 건조, 에어 건조, 진공 건조, 또는 물질 내의 액체를 감소시키거나 제거하는 임의의 공정을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "분무 건조"는 물질 내의 액체를 감소시키거나 제거하기 위해 액체를 증발시키도록 고온 가스를 사용하여 액체 함유 물질을 건조시키는 통용 방법을 지칭한다. 즉, 물질은 가열된 건조 공기의 드래프트(draft) 내로 분무 또는 아토마이징함으로써 건조된다.
본원에 사용되는 용어 "냉동 건조" 및 용어 "동결 건조" 및 용어 "냉동 건조(cryodesiccation)"는 승화(sublimation)에 의해 냉동 상태의 물질로부터 용액을 제거하는 것을 지칭한다. 이는 건조시킬 원료를 공융점(eutectic point) 아래로 냉동시키고, 그리고 그 다음 승화 잠열(latent heat)을 제공하여 실시한다. 입열(heat input)의 정확한 제어로 생성물의 번복 용융 없이 냉동 상태로부터 건조시킬 수 있다. 실질적 적용 시에, 상기 공정은 감압 조건 하에 가속화되고 정확하게 제어된다.
본원에 사용되는 용어 "건조 자유 유동 분말(dry free flowing powder)"은 자유 유동성 건조 분말, 예를 들면 큰 덩어리의 방해없이 용기, 백, 용기 등으로부터 부을 수 있는 분말을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "분쇄(grinding)"는 충격, 전단 또는 마모에 의해 입자 크기를 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "샘플"은 임의의 원(source)로부터 수득된 시료 또는 배양물뿐만 아니라, 예를 들면 합성 샘플, 생물학적 샘플 및 환경 샘플을 포함하는 광범위한 의미로 사용된다.
생물학적 샘플은 동물(인간 포함)로부터 수득될 수 있고, 유체, 고체, 조직 및 기체를 포괄한다. 생물학적 샘플에는 혈액 산물, 예컨대 혈장, 혈청 등이 포함된다. 환경적 샘플에는 환경적 물질, 예컨대 표면 물질, 토양, 물, 결정 및 산업용 샘플이 포함된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 높은 지질 함량의 조류를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 높은 지질 함량의 조류 바이오매스 및 이로부터 유도된 조류 지질 물질, 이의 제조 방법, 및 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤), 및 이를 포함하거나 이로부터 제조된 식이 조성물(예를 들면, 동물 사료)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바이오연료, 식이(예를 들면, 인간 및 동물 영양), 치료 및 연구 용도를 비롯한 각종 용도들에서 사용된다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, 상승된 양(예를 들면, w/w 기준)의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 제조 방법이 제공된다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 요망되는 높은 수준의 총 지방 함량(예를 들면, 상당히 더 낮은 총 지방 함량(예를 들면, 60% 이하의 총 지방)을 함유하는 조류 바이오매스의 통상적 발생 방법 대비, 60% 초과의 총 지방)을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 조류 기재의 바이오연료(예를 들면, 바이오디젤)의 한 도전과제는 바이오매스가 최종 연료 생성물에서 수득되는 것보다 더 많은 에너지 소비를 해야만 제조되지 않도록 확실히 하는 것이다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 65% 초과의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 66% 초과의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 67% 초과의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 68% 초과의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 69% 초과의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 70% 초과의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 w/w 기준 70% 초과(예를 들면, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90% 또는 그 이상의 초과)의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 발생 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 닫힌 바이오리액터 시스템(예를 들면, 발효기)를 이용하나, 본 발명은 이와 같이 제한되지 않는다(예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 열린 바이오리액터가 이용될 수 있다). 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스의 성장은 무균 조건 하에 수행된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조류는 페드-뱃치 공정으로 (예를 들면, 높은 지방 함량(예를 들면, 67% 초과의 지방)을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키기 위해) 성장된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 요망되는 고 총 지방 함량(예를 들면, 67% 이상의 총 지방)을 함유하는 조류 바이오매스를 생성시키기 위해 조류를 배양하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 요망되는 고 총 지방 함량(예를 들면, 67% 이상의 총 지방)을 포함하는 조류 바이오매스를 생성시키기 위해 단계식 방식으로 조류를 배양하는 단계를 포함하는, 조류의 배양 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 조류를 배양하는 단계식 공정은 저장된 조류 균주를 해동하고, 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 효모 추출물 및 해염을 포함하는 배지를 함유하는 1 L 쉐이크 플라스크에 해동된 조류를 (예를 들면, 무균으로) 첨가하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 탄소원은 50 g/L의 농도로 존재하고/하거나, 효모 추출물은 10 g L의 농도로 존재하고/하거나, 해염은 4 g/L의 농도로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 조류 및 배지를 함유하는 1 L 쉐이크 플라스크를, 조류가 지수적 성장기에 들어갔으나 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))을 전부 고갈시키지 않을 때까지 30℃에 유지시키고 진탕시킨다(예를 들면, 약 100-400 RPM). 본 발명의 실시양태의 전개 중에 수행된 실험으로, 조류가 지수 성장에 들어가나 72 내지 144시간의 기간에 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))을 전부 고갈시키지 않는다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 효모 추출물 및 해염을 포함하는 약 100-400 RPM(예를 들면, 250 RPM)에서 72-144시간 동안 30℃에서 1 L 배양 플라스크에서 배양된 조류를 사용하여, 제1 종자 단계 배양을 접종한다(예를 들면, 보다 큰 용기(예를 들면, 40, 27 또는 18 L 용기)). 몇몇 실시양태에서, 제1 종자 단계에 사용된 배양 배지는 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 효모 추출물, 황산마그네슘, 염화칼슘 및/또는 염화마그네슘을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 제1 종자 단계에 사용된 배양 배지는 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및/또는 0.15 g/L의 염화마그네슘을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제1 종자 단계 배양은 용존 산소를 약 7-15%(예를 들면, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%)에서 유지시키기 위한 기류 및 교반 조건 하에 30℃에서 수행하여, 보다 낮고 보다 높은 용존 산소 조건도 이용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 제1 종자 단계 배양은 용존 산소를 약 10%에 유지시키기 위한 기류 및 교반 조건 하에 30℃에서 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 조류 및 배지를 함유하는 제1 종자 단계 배양을, 조류가 지수 성장기에 들어가고, 20 g/L 이상의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))이 소모되나 탄소원이 전부 고갈되지 않을 때까지, 30℃에서 유지시키고 배양한다. 본 발명의 실시양태의 전개 중에 수행된 실험으로, 제1 종자 단계 배양의 접종 후에 24 내지 48시간 이내의 기간에 조류가 지수 성장에 들어가고 20 g/L 이상의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))을 소모하나, 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))을 완전히 고갈시키지 않는 것으로 결정되었다. 몇몇 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 효모 추출물, 황산마그네슘, 염화칼슘 및 염화마그네슘을 포함하는 배지에서 24 내지 48시간 동안 30℃에서 제1 종자 단계 배양에서 배양된 조류를 사용하여, 제2 종자 단계 배양을 보다 더 큰 용기(예를 들면, 2000 L 용기)에서 접종한다. 몇몇 실시양태에서, 제2 종자 단계 배양에 사용된 배양 배지는 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 효모 추출물, 황산마그네슘, 염화칼슘 및/또는 염화마그네슘을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 제2 종자 단계 배양에 사용된 배양 배지는 약 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및/또는 0.15 g/L의 염화마그네슘을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제2 종자 단계 배양은 용존 산소를 약 7 내지 15%(예를 들면, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%)로 유지하기 위한 기류 및 교반 조건 하에 30℃에서 수행되나, 보다 낮은 용존 산소 및 보다 높은 용존 산소 조건도 이용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 제2 종자 단계 배양은 용존 산소를 약 10%에 유지시키기 위한 기류 및 교반 조건 하에서 30℃에서 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 조류 및 배지를 함유하는 제2 종자 단계 배양을 조류가 지수 성장기에 들어가고, 20 g/L 이상의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))이 소모되나 탄소원이 전부 고갈되지 않을 때까지, 30℃에서 유지시키고 배양한다. 본 발명의 실시양태의 전개 중에 수행된 실험으로, 제2 종자 단계 배양의 접종 후에 24 내지 48시간 이내의 기간에, 조류가 지수 성장에 들어가고 20 g/L 이상의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))을 소모하나, 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))을 완전히 고갈시키지 않는 것으로 결정되었다. 몇몇 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 효모 추출물, 황산마그네슘, 염화칼슘 및 염화마그네슘을 포함하는 배지에서 24 내지 48시간 동안 30℃에서 제2 종자 단계 배양에서 배양된 조류를 사용하여, 조류의 추가 배양/발효를 위해 사용되는 배지를 함유하는 대규모 용기(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 220,000 L 이상의 용기(예를 들면, 주발효기))에서 접종한다. 몇몇 실시양태에서, 제2 종자 단계 배양을 대규모 용기(예를 들면, 주발효기)에 전달할 때, 대규모 용기(예를 들면, 주발효기)에 존재하는 배양 배지(예를 들면, 뱃치 배지)는 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 효모 추출물, 황산마그네슘, 우레아, 염화칼슘, 염화마그네슘 및/또는 인산이수소칼륨을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 대규모(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 220,000 L 이상의 용기(예를 들면, 주발효기)) 배양에 사용되는 배양 배지는 약 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 4.0 g/L의 황산마그네슘, 약 1 g/L의 우레아, 약 2 g/L의 염화칼슘, 약 2 g/L의 염화마그네슘 및/또는 약 0.25 g/L의 인산이수소칼륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 대규모 배양은 용존 산소를 약 7-15%(예를 들면, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%)에 유지하기 위한 기류 및 교반 조건 하에서 30℃에서 수행되나, 보다 높은 용존 산소 조건 및 보다 낮은 용존 산소 조건도 이용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 대규모 배양은 용존 산소를 약 10%에 유지하기 위한 기류 및 교반 조건 하에서 30℃에서 수행된다. 한 바람직한 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스))은 일정 기간(예를 들면, 1일 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상) 동안 (예를 들면, 페드-뱃치 공정을 이용하여) 10 g/L에 유지된다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 요망되는 양의 글루코스가 대규모 용기에서 조류에 의해 소비된 후(예를 들면, 약 20-30 g/L의 글루코스가 대규모 용기에서 조류에 의해 소비된 후(예를 들면, 30 g/L의 글루코스가 소비된 후)), 글루코스 및 페드-뱃치 공급물이 개시된다. 본 발명의 실시양태의 전개 중에 수행된 실험으로, 페드-뱃치 공급물이 약 34시간 동안 첨가되나, 보다 짧은 기간(예를 들면, 약 32, 28, 24, 20시간 이하) 및 보다 긴 기간(예를 들면, 36, 38, 42, 46, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168시간 이상)이 사용될 수 있는 것으로 결정되었다. 다른 한 바람직한 실시양태에서, 페드-뱃치 공정의 완료 시에, 조류의 배양은 모든 영양소가 배지로부터 제거/소비될 때까지 대규모 용기에서 계속된다. 본 발명의 실시양태의 전개 중에 수행된 실험으로, 영양소가 페드-뱃치 공정의 중지 후, 약 12 내지 2.4시간 이내에 배지로부터 고갈되는 것으로 결정되었다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 대규모 배양 배지/브로쓰로부터 수거되고, 본원에 기재된 바와 같이 이용된다. 몇몇 실시양태에서, 대규모 배양 브로쓰는 조류 바이오매스를 수득하기 위해 원심분리된다. 몇몇 실시양태에서, 대규모 배양 브로쓰는 원심분리 전에 냉각된다. 본 발명을 수행하는 데 메커니즘의 이해가 필요하지 않고 본 발명은 어떠한 특정 작용 메커니즘에도 국한되지 않으나, 몇몇 실시양태에서, 배양 브로쓰의 배양은 상승된 수준의 총 지방(예를 들면, 지질/오일)을 포함하는 조류 바이오매스의 밀도를 증가시키고, 배양 브로쓰의 저온저장 부재 시에 달성되는 것보다 바이오매스의 회수가 보다 크게 한다(예를 들면, 실시예 3 참조). 본 발명은 원심분리 전에 대규모 배양을 저온저장하는 온도에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 대규모 배양은 0 내지 50℃, 5 내지 40℃, 5 내지 25℃, 5 내지 15℃ 또는 5 내지 10℃의 온도로 저온저장된다.
따라서, 본 발명은 요망되는 지방 함량(예를 들면, 67% 초과의 지방 함량)을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키기 위해, 조류 배양(예를 들면, 단독 및/또는 제1 및/또는 제2 종자 단계에 후속하여)의 뱃치 방식 및 페드-뱃치 방식 모두를 이용한다. 본 발명은 뱃치 방식 또는 페드-뱃치 방식으로 사용되는 배지에 존재하는 개별 성분에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 주발효기(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 220,000 L 용기)의 접종 시에 존재하는 배양 배지는 질소(N):인(P):칼륨(K)의 초기 비가 46:13:8.5인 배지를 함유한다. 한 바람직한 실시양태에서, N:P:K 비는 뱃치 방식 및 페드-뱃치 배양 방식에서 동일하다. 몇몇 실시양태에서, 마그네슘(Mg):칼슘(Ca)의 비는 뱃치 방식 및 페드-뱃치 방식 모두에 사용되는 배양 배지에서 3:1이다. 또 다른 실시양태에서, 염화물(C12):황산염(SO4)의 비는 뱃치 방식 및 페드-뱃치 방식 모두에 사용되는 배양 배지에서 1:1이다. 몇몇 실시양태에서, 주발효기(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 220,000 L 용기)의 접종 시의 배지 내의 황산염(SO4):인산염(PO4)의 비는 16:1이다. 몇몇 실시양태에서, 요망되는 지방 함량(예를 들면, 67% 초과의 지방)을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키는 전체 배양(예를 들면, 접종물, 제1 종자 단계, 제2 종자 단계 및 주발효기 배양 포함)의 말기에 뱃치되고 공급된 황산염(SO4):인산염(PO4)의 총 비는 5.3:1이다. 몇몇 실시양태에서, 주발효기(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 220,000 L 용기)의 접종 시의 배지 내의 염화물(Cl2):인산염(PO4)의 비는 16:1이다. 몇몇 실시양태에서, 요망되는 지방 함량(예를 들면, 67% 초과의 지방)을 함유하는 조류 바이오매스를 발생시키는 전체 배양(예를 들면, 접종물, 제1 종자 단계, 제2 종자 단계 및 주발효기 배양 포함)의 말기에 뱃치되고 공급된 염화물(Cl2):인산염(PO4)의 총 비는 5.3:1이다.
이하 실시예 2에 기재된 바와 같이, 본 발명은 또한 요망되는 양의 총 지방 및 기타 성분을 함유하는 조류 바이오매스(예를 들면, 건조된 조류 바이오매스(예를 들면, 본원에 기재된 방법에 따라 발생됨))를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 67% 초과의 총 지방(예를 들면, 약 68% 초과의 총 지방, 약 69% 초과의 총 지방, 약 70% 초과의 총 지방, 약 71% 초과의 총 지방, 72% 초과의 총 지방, 약 73% 초과의 총 지방, 약 74% 초과의 총 지방, 약 75% 초과의 총 지방, 약 76% 초과의 총 지방, 약 77% 초과의 총 지방, 약 78% 초과의 총 지방 또는 그 초과 양의 총 지방)을 함유하는 조류 바이오매스(예를 들면, 건조된 바이오매스)를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스(예를 들면, 67% 초과의 총 지방 함유)를, 바이오매스가 5% 미만의 수분(예를 들면, 4.5% 미만의 수분, 4% 미만의 수분, 3.5% 미만의 수분, 3% 미만의 수분, 2.5% 미만의 수분, 2% 미만의 수분, 또는 1.5% 미만의 수분)을 함유하도록 건조시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 170-250 mg/g 이상 도코사헥사엔산(DHA)(예를 들면, 약 170-180 mg/g DHA, 약 180- 190 mg/g DHA, 약 190-200 mg/g DHA, 약 200-210 mg/g DHA, 약 210-220 mg/g DHA, 약 220-230 mg/g DHA, 약 230-240 mg/g DHA, 약 240-250 mg/g DHA, 또는 250 mg/g 초과의 DHA)를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 150-400 mg/g 이상 팔미트산(TUPAC 명: 헥사데칸산(예를 들면, 약 150-200 mg/g, 약 200-225 mg/g, 약 225-250 mg/g, 약 250-275 mg/g, 약 275-300 mg/g, 약 300-325 mg/g, 약 325-350 mg/g, 약 350-375 mg/g, 약 375-400 mg/g 또는 400 mg/g 초과))을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 300-600 mg/g 이상 총 지방산(예를 들면, 약 300-350 mg/g, 약 350-400 mg/g, 약 400-450 mg/g, 약 450-500 mg/g, 약 500-550 mg/g, 약 550-600 mg/g 또는 600 mg/g 초과의 지방산))을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스(예를 들면, 5% 미만의 수분을 함유하는 건조된 바이오매스)는 약 15% 미만의 단백질(예를 들면, 약 14% 미만의 단백질, 약 13% 미만의 단백질, 약 12% 미만의 단백질, 약 11% 미만의 단백질, 약 10% 미만의 단백질, 약 9% 미만의 단백질, 또는 약 8% 미만의 단백질)을 함유한다.
본 발명은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 이용되는 조류의 균주 또는 종에 의해 제한되지 않는다. 실제로, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 하나 이상의 종을 포함하나 이들에 국한되지 않는 각종 조류들은 본 발명에 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 조류는 클로렐라 속의 한 종이다. 몇몇 실시양태에서, 조류는 쉬조키트리움 속의 한 종이다. 몇몇 실시양태에서, 조류는크립테코디니이움(Crypthecodinium) 속의 한 종이다. 몇몇 실시양태에서, 조류는 트라우스토키트리움 스트리아툼(Thraustochytrium striatum), 트라우스토키트리움 로세움(Thraustochytrium roseum), 트라우스토키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum), 크립트테코디니움 코니이(Crypthecodinium cohnii) sp., 및/또는 아우란티오키트리움(Aurantiochytrium) sp.이다. 한 바람직한 실시양태에서, 쉬조키트리움 리마시눔이 본원에 기재된 방법 및 조성물에 이용된다. 본 발명은 상승된 수준의 본원에 개시된 지질을 가지는, 조류 바이오매스의 발생 방법에 의해 생성되는 지질의 유형에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 발생되는 지질에는 미리스트산, 팔미트산, 올레산, 리놀레산, 도코사펜타엔산(DPA), 도코사헥사엔산(DHA), 및 스테아르산이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 이 지질은 심혈관 및 염증 질환, 및 아동 시기의 적절한 뇌 발달 및 망막 시각을 위한 유아 영양과 같은 각종 질환들의 예방을 위해, 동물 건강과 인간 건강 모두에 유용하였다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 조류를 배지(예를 들면, 약 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및/또는 0.15 g/L의 염화마그네슘을 포함함)를 포함하는 제1 공급물 뱃치 용기에서 배양하는 단계; 제1 공급물 뱃치 배양을 제2 종자 뱃치 배양 배지(예를 들면, 약 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g L 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및/또는 0.15 g/L의 염화마그네슘을 포함함)에 (예를 들면, 무균적으로) 전달하는 단계; 제2 종자 뱃치 배양을 배지를 함유하는 대규모 배양 용기(예를 들면, 주발효기(예를 들면, 가령약 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 4.0 g/L의 황산마그네슘, 약 1 g/L의 우레아, 약 2 g/L의 염화칼슘, 약 2 g/L의 염화마그네슘 및/또는 약 0.25 g/L의 인산이수소칼륨을 포함하는 배지를 함유하는 70,000 L, 120,000 L, 220,000 L의 용기)에 (예를 들면, 무균적으로) 전달하는 단계를 포함하는, 조류 종으로부터 상승된 수준(예를 들면, 67% 초과의)의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스(예를 들면, 쉬조키트리움 리마시눔)의 생성 방법으로서, 대규모 배양 용기의 글루코스 수준은 페드-뱃치 공정을 이용하여 10 g/L로 유지되고, 조류 세포는 모든 영양소가 배지로부터 제거/소비된 후에 페드-뱃치 공정의 중지 후, 12 내지 24시간 이내에 대규모 배양으로부터 수거되는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 조류 종(예를 들면, 쉬조키트리움 리마시눔)으로부터의 상승된 수준(예를 들면, 67% 초과)의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 생성 방법으로서, 배양 배지(예를 들면, 각 발효 단계(예를 들면, 제1 종자 단계, 제2 종자 단계 및/또는 뱃치 배양(페드-뱃치)의 배양 단계 중에))는 탄소원(예를 들면, 당), 효모 추출물, 인산염 원(예를 들면, 인산이수소칼륨, 황산마그네슘 및/또는 황산아연), 질소 원(예를 들면, 우레아), 염화마그네슘, 및/또는 염화칼슘을 포함하는 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 조류의 균주로부터 상승된 수준(예를 들면, 67% 초과)의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스의 생성 방법으로서, 배양 배지(예를 들면, 각 발효 단계(예를 들면, 제1 종자 단계, 제2 종자 단계 및/또는 뱃치 배양(페드-뱃치) 배양 단계 중에))는 당, 효모 추출물, 인산이수소칼륨, 황산마그네슘, 황산아연, 우레아, 염화마그네슘, 및/또는 염화칼슘을 포함하는 방법을 제공한다. 그러나, 본 발명은 조류가 성장하는 배양 배지에 이용되는 영양소 유형에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 탄소원이 배지에 첨가된다. 탄소원의 예에는 탄수화물, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 자일로스, 삭카로스, 말토스 또는 가용성 전분, 및 올레산, 지방, 예컨대 대두 오일, 당밀, 글리세롤, 만니톨, 및 아세트산나트륨, 면실분, 글리세롤, 당밀 및 옥수수 침지액이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 질소원이 배지에 첨가된다. 질소원의 예에는 천연 질소원, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 육류 추출물, 카사미노산 및 옥수수 침지액, 유기 질소원, 예컨대 글루탐산나트륨 우레아, 또는 무기 질소원, 예컨대 아세트산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 황산나트륨이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 인산염원이 배지에 첨가된다. 인산염원의 예에는 인산칼륨 및 인산이수소칼륨, 무기 염, 예컨대 황산암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산아연, 및 황산구리가 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 염화마그네슘, 염화칼슘, 및/또는 비타민이 배양 배지 내에 포함된다.
본 발명은 배양 배지 내의 각각의 상기 성분들의 양(예를 들면, 농도)에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 조류 성장에 유해하지 않은 양이 이용된다. 한 바람직한 실시양태에서, 각 배지 성분의 양(예를 들면, 농도 및 또는 비)은 높은 지방 함량 조류(예를 들면, 67% 이상의 지방 함량을 포함하는 조류 바이오매스)의 형성을 촉진하는 수준(예를 들면, 각 발효 단계(예를 들면, 제1 종자 단계, 제2 종자 단계 및/또는 뱃치 배양(페드-뱃치) 배양 단계 중에)으로 설정된다. 몇몇 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당)은 배지의 리터 당, 약 20 내지 120 g으로 배양 배지 내에 존재한다. 다른 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당)은 배지의 리터 당, 약 30 내지 70 g으로 배양 배지 내에 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당)은 배지의 리터 당, 약 40 내지 60 g으로 배양 배지 내에 존재한다. 한 바람직한 실시양태에서, 탄소원(예를 들면, 당)은 배지의 리터 당, 약 50 g으로 배양 배지 내에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 우레아 대 인산이수소칼륨(우레아:KH2PO4)의 비는 약 5:0.1(예를 들면, 약 4.5:0.1; 4:0.25; 3:0.25; 4:0.3; 5:0.3; 5:0.5; 4:0.5; 3:0.5; 2:0.5; 또는 1:0.5)이나; 보다 높은 비 및 보다 낮은 비도 사용될 수 있다(예를 들면, 1:1, 1:2, 1:3 등). 한 바람직한 실시양태에서, 배양 배지 내의 우레아 대 인산이수소칼륨의 비는 4:1이다. 몇몇 실시양태에서, 배양 배지는 염화나트륨을 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 배양 배지는 염화나트륨을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 황산마그네슘(MgSO4):염화칼슘(CaCl2)의 비는 1:1이다. 몇몇 실시양태에서, 황산마그네슘(MgSO4):염화칼슘(CaCl2)의 비는 1:2이다. 실제로, 1:1; 1:1.125; 1:1.5; 1:1.75; 1:2; 1:2.125; 1:2.25; 1:2.5; 2.5:1; 2.25:1; 2.125:1; 2:1; 1.75:1; 1.5:1; 1.25:1 또는 1.125:1이 포함하나 이들에 국한되지 않는, 황산마그네슘(MgSO4):염화칼슘(CaCl2)의 각종 비들이 사용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 제1 종자 배양 배지 내의 황산마그네슘(MgSO4):염화칼슘(CaCl2)의 비는 1:1이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 종자 배양 배지 내의 황산마그네슘(MgSO4):염화칼슘(CaCl2)의 비는 1:1이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에서 제3 배양 배지로 칭해지기도 하는 대규모 배양 배지(예를 들면, 주발효기(예를 들면, 70,000 L, 120,000 L, 2.20,000 L 용기) 내의 황산마그네슘(MgSO4):염화칼슘(CaCl2)의 비는 1:2이다.
다른 한 바람직한 실시양태에서, 배지의 제조 후에, 배지의 pH가 조정될 필요가 없다. 예를 들면, 본 발명의 단계별 발효 공정 중에, 조류가 성장되는 배양 배지의 pH는 조정될 필요가 있었다. 본 발명을 수행하기 위해 메커니즘의 이해가 필요하지 않고, 본 발명이 임의의 특별한 작용 메커니즘에 국한되지 않으나, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 단계별 발효 공정의 멸균 및/또는 무균 조건은 발효 중에 배양 배지의 pH를 조정할 필요가 없게 한다. 몇몇 실시양태에서, 배양 배지의 pH는 4.0 내지 6.5이다. 본 발명의 단계별 발효 공정 중의 조류 배양물은 10 내지 40℃, 바람직하게 17 내지 35℃, 가장 바람직하게는 약 30℃의 온도에서 수행될 수 있고, 배양은 통기-교반 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등에 의해 수행될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 조류는 용존 산소가 10% 또는 약간 그것을 초과하는 비로 유지되도록 하는 조건 하에 배양된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 상승된 수준(예를 들면, 67% 초과)의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스(예를 들면, 본원에 기재되고/되거나, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 발생되는 건조된 조류 바이오매스)의 전부 또는 일부를 포함하는 식료, 사료, 영양 또는 치료 보충물을 제공한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 상승된 수준(예를 들면, 67% 초과)의 총 지방을 포함하는 분무 건조된 조류 바이오매스를 포함하는 식료, 사료, 영양 또는 치료 보충물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 상승된 수준(예를 들면, 67% 초과)의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스로부터 추출되고/되거나 단리된 지질을 포함하는 식료, 사료, 영양 또는 치료 보충물을 제공한다. 본 발명은 상승된 수준(예를 들면, 67% 초과)의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스로부터 추출되고/되거나 단리된 지질을 포함하는 지질의 유형에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 지질은 미리스트산, 팔미트산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산(ALA), 스테아리돈산(SDA), 에이코사트리엔산, 에이코사테트라엔산, 에이코사페니아엔산(EPA), 도코사펜타엔산(DPA), 클루파노돈산, 도코사헥사엔산(DHA), 테트라코사펜타엔산, 및/또는 테트라코사헥사엔산을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 지질은 DHA 및/또는 팔미트산을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 제1 배양 배지(예를 들면, 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 10 g/L의 효모 추출물 및 4 g/L의 해염 함유)에서 조류 균주(예를 들면, 쉬조키트리움 리마시눔)을 배양하고, 배양물을 약 72 내지 144시간의 기간 동안 25 내지 35℃ 범위의 온도에서 배양하며; 배양물을 제2 배양 배지(예를 들면, 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g L 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및/또는 0.15 g/L의 염화마그네슘 함유)에 전달하고, 배양물을 24 내지 48시간의 기간 동안 25 내지 35℃ 범위의 온도에서 항온 배양하며; 배양물을 제3 배양 배지(예를 들면, 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및/또는 0.15 g/L의 염화마그네슘 함유)에 전달하고, 배양물을 24 내지 48시간의 기간 동안 25 내지 35℃ 범위의 온도에서 항온 배양하며; 배양물을 제4 배양 배지(예를 들면, 50 g/L의 탄소원(예를 들면, 당(예를 들면, 글루코스)), 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 4.0 g/L의 황산마그네슘, 약 1 g/L의 우레아, 약 2 g/L의 염화칼슘, 약 2 g/L의 염화마그네슘 및/또는 약 0.25 g/L의 인산이수소칼륨 함유)에 전달하고, 배양물을 약 24 내지 192시간(예를 들면, 약 36, 약 38, 약 42, 약 46, 약 60, 약 72, 약 84, 약 96, 약 108, 약 120, 약 132, 약 144, 약 156, 약 168, 약 180 또는 약 192시간)의 기간 동안 25 내지 35℃ 범위(예를 들면, 30℃)의 온도에서 항온 배양하며; 배양물로부터 세포 바이오매스를 분리하는 단계; 및 바이오매스로부터 지질을 추출하는 것을 포함하는, 지질(예를 들면, 본원에 개시된 지질(예를 들면, 도코사헥사엔산))의 제조 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 조류 배양물(예를 들면, 조류 바이오매스를 생성시키기 위해 성장)은 본원에 기재된 바와 같은 각종 영양소 배지를 이용하여, 플라스크 또는 대형 발효기 내, 100 ml 내지 수십만 리터 범위의 적당한 부피 및 용기에서 성장된다.
또 다른 측면에서, 지질을 함유하는 세포 바이오매스의 분리는 원심분리, 여과 및/또는 응집 또는 이와 유사한 기법을 이용하여 수득된다. 한 바람직한 실시양태에서, 조류 바이오매스는 원심분리를 이용하여 배양물로부터 수득된다. 다른 한 바람직한 실시양태에서, 원심분리는 (예를 들면, 상승된 수준의 지질을 함유하는 세포를 회수하기 위해) 세포 배양을 냉각시킨 후에 일어난다. 몇몇 실시양태에서, 수득된 조류 바이오매스는 분무 건조되어 사용된다(예를 들면, 동물 사료 또는 바이오연료 생성을 위해 직접 사용된다).
한 실시양태에서, 조류는 상이한 조류 종(예를 들면, 본원에 기재된 조류 종들 중 한 종 이상)의 혼합물이다. 몇몇 실시양태에서, 상승된 수준의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스로부터 추출된 상승된 수준의 총 지방 및/또는 지질을 함유하는 조류 바이오매스는 식물 원(source)을 포함하나 이들에 국한되지 않는 다른 원들로부터의 지질(예를 들면, 다중불포화 지방산)로 보충된다.
몇몇 실시양태에서, 상승된 수준의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스는 지질을 약 60 내지 90%(예를 들면, 약 65 내지 90%, 약 66 내지 89%, 약 67 내지 88%, 약 68 내지 87%, 약 68 내지 86%, 약 69 내지 85%, 또는 약 70 내지 80%) 범위의 농도(w/w)로 포함한다. 따라서, 상승된 수준의 지질을 함유하는 조류 바이오매스는 지질을 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 등의 농도로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상승된 수준의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스는 지질을 67% 이상의 농도로 포함한다.
몇몇 실시양태에서, DHA는 1% 내지 75% 총 지질/지방산 범위의 본 발명의 조류 바이오매스 조성물 내에 포함된다. 따라서, DHA는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75% 등의 총 지방산 양으로 조성물 내에 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, DHA는 1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 30%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 5% 내지 30%, 10% 내지 15%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 30%, 15% 내지 20%, 15% 내지 25%, 15% 내지 30%, 20% 내지 25%, 20% 내지 30%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75% 등의 범위의 총 지방산의 양으로 조성물 내에 포함될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 팔미트산은 1% 내지 75% 총 지질/지방산의 범위로 본 발명의 조류 바이오매스 조성물 내에 포함된다. 따라서, 팔미트산은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75% 등의 총 지방산 양으로 조성물 내에 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 팔미트산은 1% 내지 5%, 1% 내지 10%, 1% 내지 15%, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 30%, 5% 내지 10%, 5% 내지 15%, 5% 내지 20%, 5% 내지 25%, 5% 내지 30%, 10% 내지 15%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 30%, 15% 내지 20%, 15% 내지 25%, 15% 내지 30%, 20% 내지 25%, 20% 내지 30%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75% 등 범위의 총 지방산 양으로 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 부가적 실시양태는 동물 사료 첨가제의 제조 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 조류를 배양하여, 요망되는 상승된 수준의 총 지방(예를 들면, 67% 초과의 총 지방)을 함유하는 조류 바이오매스를 생성시키는 단계; 조류 바이오매스로부터 조류 지질을 추출하여, 조류 오일을 생성시키는 단계; 및/또는 조류 바이오매스로부터 물을 제거하여, 고체 함량이 약 5% 내지 100% 중량 백분율인 조류 바이오매스를 생성시키는 단계를 포함하는, 조류(예를 들면, 조류 바이오매스)로부터의 지질을 포함하는 동물 사료 첨가제의 제조 방법으로서, 동물 사료 첨가제는 조류로부터의 지질을 포함하는 방법이다. 몇몇 실시양태에서, 조류로부터 수집된 지방산은 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 오메가-3 지방산이다. 다른 실시양태에서, 조류 바이오매스로부터 추출된 조류 지질은 고체 함량이 약 5% 내지 100% 중량 백분율인 조류 바이오매스와 조합된다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 기타 식료 성분과 조합되어, 가공 식료 또는 사료 제품(예를 들면, 동물 및/또는 인간 사료 제품)을 생성시킬 수 있다. 그러한 기타 식료 성분은 하나 이상의 효소 보충물, 비타민 식료 첨가제 및 미네랄 식료 첨가제를 포함한다. 생성되는 (조합된) 사료 첨가제는 적절한 양으로 기타 식료 성분, 예컨대 곡류 및 식물 단백질과 혼합되어, 가공된 식료 제품을 형성할 수 있다. 상기 성분들의 가공된 식료 제품으로의 가공은 임의의 통상 사용되는 가공 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 사료/식료 첨가제는 식료/사료 단독으로, 또는 이에 비타민, 미네랄, 기타 사료 효소, 농업용 연산품(예를 들면, 밀 분쇄물 또는 옥수수 글루텐 밀)을 첨가하거나, 또는 그것과 조합한 보충물로서 사용될 수 있다.
다른 한 측면에서, 본 발명은 동물/인간에게 조류로부터 수집된 지질/지방산을 포함하는 사료 첨가제를 공급하는 것을 포함하는, 증가된 조직 함량의 오메가-3 지방산을 가지는 동물 및/또는 인간의 생성 방법으로서, 사료 첨가제는 (a) 배양된 조류 바이오매스로부터 추출된 조류 지질 및/또는 (b) 배양된 조류로부터의 조류 바이오매스를 추가로 포함하며, 여기서 물은 조류 바이오매스로부터 제거되어 약 5 내지 100% 중량 백분율의 고체 함량을 달성하며, 동물/인간이 오메가-3 지방산의 증가된 조직 함량을 나타내는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 조성물로 이익을 볼 수 있는 임의의 특별한 포유동물(예를 들면, 동물 또는 인간)에 국한되지 않는다. 실제로, 본 발명의 동물에는 알, 육류, 젖 또는 기타 제품이 인간 또는 기타 동물에 의해 소비되는 임의의 동물들이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 동물에는 어류, 가금류(닭, 칠면조, 오리 등), 돼지, 양, 염소, 토끼, 소 및 젖소가 포함되나 이들에 국한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 대상에게 치료 유효량의 본 발명의 조성물을 투여함으로써 필요로 하는 대상에서의 포유동물의 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 피치료 포유동물성 질환에는 심혈관 질환, 염증 질환, 및 각종 암 질환들이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 피치료 심혈관 질환에는 트리글리세리드 과잉혈증, 관동맥성 심장 질환, 발작, 급성 심근 경색 및 아테롬성 동맥경화증이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 피치료 염증 질환에는 천식, 관절염, 알레르기성 비염, 건선, 아토피성 피부염, 염증성 대장 질환, 크론병, 및 알레르기성 비결막염이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 피치료 암 질환에는 전립선암, 유방암 및 결장암이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 부가적 실시양태에서, 피치료 포유동물성 질환에는 정신의학 장애가 포함된다. 정신의학 장애에는 우울증, 양극 장애, 정신분열증이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물을 사용하여, 인지 기능을 유지 및/또는 증진할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 대상에게 상승된 수준의 총 지방(예를 들면, 67% 초과의 총 지방)을 함유하는 조류 바이오매스에 의해 제공되고/되거나 그로부터 수득되는 치료 유효량의 지질 조성물을 투여함으로써 필요로 하는 대상에서의 포유동물성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 치료로부터 이익을 찾을 수 있는 대상에는 조류 및 포유동물 대상이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 포유동물에는 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 돼지, 설치류(예를 들면 래트 및 마우스), 토끼류, 영장동물(인간외 영장류 포함), 인간 등, 및 자궁 내 포유동물이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 본 발명에 따라 치료할 필요가 있는 임의의 포유동물성 대상이 적당하다. 본 발명의 포유동물에는 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 돼지, 설치류(예를 들면 래트 및 마우스), 토끼류, 영장동물(인간외 영장류 포함), 인간 등, 및 자궁 내 포유동물이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 몇몇 실시양태에 따라, 포유동물은 인간외 포유동물이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 인간 대상이다. 양성 모두의 임의의 신장 단계(예를 들면, 신생아, 유아, 유소년, 청소년 및 성인)의 포유동물성 대상이 본 발명에 따른 예시적 조류에는 닭, 오리, 칠면조, 거위, 메추라기, 꿩, 평흉류(예를 들면, 타조), 사육 새(예를 들면, 앵무새 및 카나리아), 및 난내(in ovo)의 새가 포함된다.
조류
본원에 기재된 방법을 이용하여 상승된 수준의 총 지방을 생성시킬 수 있는 임의의 조류, 또는 상승된 수준의 총 지방을 함유하는 조류 바이오매스는 본 발명의 방법, 조성물, 식이 보충물, 바이오연료 및/또는 바이오연료 전구체 및/또는 사료 첨가제에 사용될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류는 트라우스토키트리움, 다이노파이세아에(Dinophyceae), 크립토파이세아(Cryptophyceae), 트레보욱시오파이세아에(Trebouxiphyceae), 핀귀오파이세아에(Pinguiophyceae), 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조류는 트라우스토키트리움 스트리아툼, 트라우스토키트리움 로제움, 트라우스토키트리움 아우레움, 크립테코디늄 코니이, 파리에토클로리스(Parietochloris) spp., 로도모나스(Rhodomonas) spp., 크립토모나스(Cryptomonas) spp., 파리에토클로리스 spp., 헤미세브니스(Hemisebnis) spp., 포르피리디움(Porphyridium) spp., 글로쏘마스틱스(Glossomastix) spp., 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조류는 파리에토클로리스 인사이스(Parietochloris incise), 로도모나스 살리나(Rhodomonas salina), 헤미셀미스 브루네센스(Hemiselmis brunescens), 포르피리디움 크루엔툼(Porphyridium cruentum) 및 글로쏘마스틱스 크리소플라스타(Glossomastix chrysoplasta), 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조류는 쉬조키트리움 리마시눔이다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 조류는 상이한 조류 종들의 혼합물이다. 다른 실시양태에서, 조류는 단일 조류 종이다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 조류 지질/지방산은 조류 오일로서 제공된다. 다른 실시양태에서, 조류 지질/지방산은 조류 바이오매스(예를 들면, 건조된(예를 들면, 분말형) 바이오매스)로서 제공된다.
또한, 본 발명의 조류에는 야생형 조류, 돌연변이형(천연 또는 유도) 조류, 또는 유전적으로 조작된 조류가 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 식이 보충물, 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 및/또는 사료 첨가제에 사용되는 조류는 비유전적으로 변형된 유기체이다. 본원에 사용되는 용어 "유전적으로 변형된 변이체" 및 "유전적으로 변형된 유기체"는 요망되는 결과가 달성되도록 정상(예를 들면, 야생형, 천연 발생형) 형태로부터 변형(예를 들면, 변이, 변화)된 게놈을 가지는 조류 균주를 지칭한다.
부가적으로, 본 발명의 조류에는 야생형 조류의 세포에 비해 감소된 두께의 세포벽을 가지고 이로써 감소된 두께의 세포벽이 조류 지질 분획의 추출능 및/또는 생체이용효율을 향상시키는(예를 들면, 조류의 소화 용이 및 조류 바이오매스의 세포로부터 조류 지질/지방산의 추출능 용이를 향상시키는) 조류가 포함된다. 야생형 조류의 세포에 비해 감소된 두께를 가지는 세포벽이 있는 세포를 가지는 조류는 천연 발생적일 수 있거나, 야생형 균주에 비해 감소된 두께의 세포벽을 가지도록 돌연변이화 및/또는 유전적으로 조작될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 조류는 야생형 조류의 세포에 비해 감소된 두께의 세포벽을 가지고 이로써 감소된 두께의 세포벽은 조류 지질 분획의 추출능 및/또는 생체이용효율을 향상시키는 조류이다. 감소된 세포벽을 가지는 조류의 생성 방법에는 전문에 본원에 참조 인용되는 WO 2006/107736 A1에 나와 있는 것들이 포함된다. 따라서, 조류는 화학제 또는 방사선을 포함하나 이들에 국한되지 않는, 당업자에게 공지된 돌연변이 유발 요인으로 돌연변이가 유발될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 화학적 돌연변이 유발 요인에는 에틸 메탄술포네이트(EMS), 메틸메탄 술포네이트(MMS), N-에틸-N-니트로소우레아(ENU), 트리에틸멜라민(TEM), N-메틸-N-니트로소우레아(MNU), 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 황산디에틸, 아크릴아미드 단량체, 멜팔란, 질소 머스타드, 빈크리스틴, 디메틸니트로사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘(MNNG), 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12-디메틸-벤즈(아)안트라센(DMBA), 에틸렌 옥시드, 헥사메틸포스포라미드, 비술판, 디에폭시알칸(디에폭시옥탄(DEO), 디에폭시부탄(BEB) 등), 2-메톡시-6-클로로-9(3-(에틸-2-클로르-o-에틸아미노프로필아미노)아크리딘 이염산염(ICR-170), 포름알데히드 등이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 방사선 돌연변이 유발 방법에는 x-선, 감마-방사선, 자외선광 등이 포함되나 이들에 국한되지 않는다.
세포벽 돌연변이체는 세제에 대한 증가된 민감성에 기초하여, 또는 세포벽 두께 변경의 현미경 관찰에 의해(예를 들면, WO 2006/107736 A1 참조), 또는 감소된 세포벽 두께 또는 감소된 세포벽 완전성을 검출하기 위한 당업계에 공지된 임의의 기타 방법에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 조류는 실시예 1 내지 3에 기재된 기법에 따라 배양될 수 있다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 조류는 10℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 배양된다. 따라서, 조류는 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃ 등의 온도에서 배양될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조류는 20℃ 내지 35℃ 범위의 온도에서 성장할 수 있으나, 보다 낮은 온도(예를 들면, 20℃ 미만) 및 보다 높은 온도(예를 들면, 35℃ 초과)도 사용될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 조류는 약 30℃에서 성장한다.
몇몇 실시양태에서, 배양 후, 조류가 수거된다. 몇몇 실시양태에서, 원심분리, 응집 또는 여과를 포함하나 이들에 국한되지 않는, 당업자에게 공지된 통상적 절차를 이용하여 조류의 수거가 수행된다. 한 바람직한 실시양태에서, 수거 전에, 조류 배양물을 냉각시킴으로써, 상승된 수준의 총 지방을 함유하는 조류 세포가 성공적으로 수거되도록 한다. 이어서, 수거된 조류 세포 또는 조류 바이오매스는 지질/지방산 원으로서 직접 사용되거나, 지질/지방산을 포함하는 조류 오일을 수득하도록 추출된다. 조류 바이오매스가 직접 사용하게 되도록 하는 몇몇 실시양태에서, 물을 조류 바이오매스로부터 제거하여, 약 5 내지 100 중량 백분율의 고체 함량을 달성한다. 부가적 실시양태에서, 직접 사용하는 조류 바이오매스는 세포 내의 조류 오일의 추출능 및/또는 생체이용효율을 증가시키도록 적어도 부분적으로 붕괴된 세포벽을 추가로 포함하는 조류 세포로 이루어진다. 조류 세포의 붕괴는 세포를 비등수로 처리하는 것을 포함하나 이들에 국한되지 않는 공지된 기법에 따라, 분쇄, 파쇄, 초음파처리, 프렌치 프레스, 또는 통상업자에게 공지된 기타 방법에 의해 수행될 수 있다.
조류 바이오매스가 사용될 때, 물을 조류 바이오매스로부터 제거하여, 약 5 내지 100%의 고체 함량을 달성한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 물을 조류 바이오매스로부터 제거하여, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 등의 고체 함량을 달성한다. 부가적 실시양태에서, 물을 조류 바이오매스로부터 제거하여, 약 5% 내지 50%, 5% 내지 60%, 5% 내지 70%, 5% 내지 80%, 5% 내지 90%, 5% 내지 95%, 10% 내지 30%, 10% 내지 40%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60% 10% 내지 65%, 10% 내지 70%, 10% 내지 75%, 10% 내지 80%, 10% 내지 85%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 15% 내지 40%, 15% 내지 50%, 15% 내지 60%, 15% 내지 65%, 15% 내지 70%, 15% 내지 75%, 15% 내지 80%, 15% 내지 85%, 15% 내지 90%, 15% 내지 95%, 15% 내지 100%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 65%, 20% 내지 70%, 20% 내지 75%, 20% 내지 80%, 20% 내지 85%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 25% 내지 50%, 25% 내지 60%, 25% 내지 70%, 25% 내지 75%, 25% 내지 80%, 25% 내지 85%, 25% 내지 90%, 25% 내지 95%, 25% 내지 100%, 30% 내지 50%, 30% 내지 60%, 30% 내지 70%, 30% 내지 75%, 30% 내지 80%, 30% 내지 85%, 30% 내지 90%, 30% 내지 95%, 45% 내지 100%, 50% 내지 70%, 50% 내지 75%, 50% 내지 80%, 50% 내지 85%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 55% 내지 75%, 55% 내지 80%, 55% 내지 85%, 55% 내지 90%, 55% 내지 95%, 55% 내지 100%, 60% 내지 75%, 60% 내지 80%, 60% 내지 85%, 60% 내지 90%, 60% 내지 95%, 60% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 85%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 75% 내지 85%, 75% 내지 90%, 75% 내지 95%, 75% 내지 100%, 80% 내지 85%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 85% 내지 90%, 85% 내지 95%, 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 95% 내지 100% 등의 범위의 고체 함량을 달성한다.
몇몇 실시양태에서, 바이오매스의 조류 세포를 붕괴 또는 분해하고, 조류 지질을 추출한다. 조류 세포를 통상적 기법에 따라 습식 또는 건식으로 추출하며, 지질/지방산을 함유하는 조성물을 생성시킬 수 있다. 조류 세포의 붕괴 또는 분해는 세포를 비등수로 처리하는 것을 포함하나 이들에 국한되지 않는 공지된 기법에 따라, 분쇄, 파쇄, 초음파처리, 프렌치 프레스, 또는 임의의 기타 공지된 방법과 같은 기계적 분쇄에 의해 수행될 수 있다. 분해된 세포로부터의 지질/지방산의 추출은 세포 분해 후 고체상으로부터의 액체상 분리, 용매 첨가에 의한 액체상 내의 지질/지방산의 추출, 용매 증발, 및 분해된 세포의 액체상으로부터 수득된 지질/지방산의 회수를 포함하나 이들에 국한되지 않는, 조류 및 기타 공지된 유기체와 함께 사용되는 표준 절차를 따른다.
본 발명은 추출에 사용되는 임의의 특별한 용매에 국한되지 않는다. 용매에는 헥산, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 디에틸 에테르, 디옥산, 이소프로필 에테르, 디클로로메탄, 테트라히드로푸란, 석유 에테르 및 이들의 조합이 포함되나 이들에 국한되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스로부터 유도된 지질/지방산은 (예를 들면, 본원에 기재된 방법, 조성물, 바이오연료, 식료 제품, 식이 보충물, 사료 첨가제 또는 기타 조성물에 사용하기 위한) 유리 지방산, 콜레스테롤 에스테르, 염 에스테르, 지방산 에스테르, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 디아실글리세리드, 모노글리세롤, 스핑코인지질, 스핑고당지질, 또는 이들의 임의의 조합의 형태로 제공된다.
조류 바이오매스의 제조 방법
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 상승된 수준의 총 지방(예를 들면, 67% 초과의 지질)을 포함하는 조류 바이오매스를 제공하는 데 충분한 배양 조건 하에서 조류를 배양하는 단계(여기서, 조류 바이오매스는 조류의 대수적 성장기의 종료 시에 수거됨(예를 들면, 실시예 1 및 2 참조))를 포함하는, 상승된 수준의 총 지방(예를 들면, 67% 초과의 지질)을 포함하는 조류 바이오매스의 제조 방법을 제공한다. 본원에 사용되는 용어 "대수적 성장기"란 지수적으로 증가하는 수의 조류 세포를 그 특징으로 하는 배양 단계를 지칭한다. 일반적으로, 배양 시스템에서, 침체기, 지수적 또는 "대수적 성장기", 음의 성장 촉진기, 및 플래토(plateau) 또는 "정지기(stationary phase)"를 포함하는 접종 후의 특징적 성장 패턴이 있다. 예를 들면, 대수적 성장기에서는, 조류 성장이 지속됨에 따라, 세포는 세포 분할의 최대 속도에 도달할 수 있고, 세포수는 시간에 로그 관계로 증가한다. 로그 상태의 개시 후의 시간 내, 세포 분할 속도는 감소하기 시작할 수 있고, 세포들 중 몇몇은 사멸하기 시작할 수 있다. 이는 선에 벗어난 점차적 수평화(flattening)에 의해 성장 곡선 상에 반영된다. 궁극적으로, 세포 사멸 속도는 본질적으로 세포 분할 속도와 균등하고, 총 생육 집단은 시간에 대해 동일하게 유지될 수 있다. 이는 정체기 또는 플래토기로서 알려져 있고, 경사가 0에 접근하는 선에서 벗어난 수평화로서 성장 곡선 상에 나타내어진다. 한 바람직한 실시양태에서, 조류 바이오매스는 (예를 들면, 배양물 내의 오염 미생물(예를 들면, 효모, 세균, 바이러스 등)의 오염 및/또는 성장을 방지하기 위해) 무균 조건 하에 배양된다.
몇몇 실시양태에서, 배양 조건은 조류가 상승된 수준의 총 지방(예를 들면, w/w 기초로 67% 초과)을 생성시키는 데 충분하다. 배양 조건은 조류를 성장시키는 데 적당한 배양 배지를 포함하고, 이로써 상승된 수준의 총 지방(예를 들면, w/w 기준의 67% 초과)을 함유하는 조류 바이오매스를 제공한다. 적당한 배양 배지가 본원에 기재되어 있다. 배지는 또한 염, 비타민, 미네랄, 금속 및 기타 영양소도 또한 포함할 수 있다. 바람직하게, 배양 조건은 조류가 상승된 수준의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스를 발생시키는 조건 하에서 성장하는 데 적당한 영양소 양 및 온도를 제공하기에 충분하다.
몇몇 실시양태에서, 배양은 총 지방의 양을 증가시키는 데 적당한 시간 동안 영양소(예를 들면, 질소, 인)를 제한하는 것을 포함한다. 예를 들면, 어느 영양소가 결핍될 수 있거나, 특정 영양소가 결핍된 별도의 배양 배지(예를 들면, 인 불포함 또는 질소 불포함 배지, 또는 보다 낮은 수준의 영양소를 함유하는 배양 배지)에 전달된다. 몇몇 실시양태에서, 배양 배지는 영양소가 지수적 성장 중에, 단 다른 영양소의 결핍 전에 후반기에 고갈되어지도록 하는 초기 함량의 영양소를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 배양은 배양 중에 영양소(예를 들면, 질소, 인)를 제한하는 것을 포함하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 단일 조류 바이오매스의 배양은 순차 방식으로 2 이상 유형의 배지 내에서 일어난다. 몇몇 실시양태에서, 단일 조류 바이오매스의 배양은 순차적 방식으로 3 이상 유형의 배지 내에서 일어난다. 마찬가지 방식으로, 단일 조류 바이오매스의 배양은 2개 이상의 용기에서 일어날 수 있고, 여기서 제1 용기는 후속 용기를 접종하기 위해 사용되고, 후속 용기는 또 다른 후속 용기 등을 접종하기 위해 사용된다. 본 발명을 수행하기 위해 메커니즘의 이해가 필요하지 않고, 본 발명은 임의의 특별한 작용 메커니즘에 국한되지 않으나, 몇몇 실시양태에서, 다중 유형의 배지를 함유하는 다중 용기 내에서의 단일 조류 바이오매스의 순차 배양은, 조류 바이오매스가 단일 용기 및/또는 성장 배지 중에 성장한 (예를 들면, 동일 조류 종의) 조류 바이오매스의 성장에 비해, 바이오매스의 총 지방 함량이 상승되도록 하는 방식으로 성장하도록 한다.
조류의 배양은 조류 바이오매스를 제공하도록 조류를 배양하는 데 적당한 통상적 바이오리액터 내에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 조류는 뱃치, 페드-뱃치, 세포 리사이클 및 연속 발효를 포함하나 이들에 국한되지 않는 공정에 의해 배양될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 조류는 페드-뱃치 공정에서 배양된다.
본 발명은 배양 배지로부터 조류를 수거하는 임의의 특별한 방식 또는 방법에 국한되지 않는다. 배양 배지로부터 조류 세포를 수거하기 위해 각종 방법들이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 수거는 분리, 예를 들면 여과(예를 들면, 벨트 여과, 회전 드럼 여과) 및/또는 원심분리에 의해 배양 배지로부터 조류 바이오매스를 회수하는 것을 포함한다. 필요한 경우, 수거된 조류 세포를 이어서 O2의 존재를 감소 또는 제거하기 위해 기체(예를 들면, CO2, N2)의 비산화 대기 하에 세정, 냉동, 동결건조, 분무 건조 및/또는 저장할 수 있다. 임의적으로, 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 부틸화 히드록시아니졸(BHA), tert-부틸히드로퀴논(TBHQ), 에톡시퀸, 베타-카로틴, 비타민 E 및 비타민 C를 포함하나 이들에 국한되지 않는 합성 및/또는 천연 산화방지제가 수거된 세포에 첨가될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 상승된 수준의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스를 제공하는 데 충분한 배양 조건 하에서 조류를 배양하고, 조류 바이오매스를 수거하는 것을 포함하는, 상승된 수준의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스의 제조 방법을 제공한다.
미세조류 바이오매스
본 발명은 몇몇 실시양태에서, (예를 들면, 바이오연료 생성에 사용하기 위한 및/또는 식료 또는 사료 제품으로서의) 조류 바이오매스 및/또는 이의 분획 및/또는 추출물을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 바이오매스의 10% 이상 건조 중량, 예시적으로 바이오매스의 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20% 건조 중량의 오메가-3 지방산 함량을 포함한다. 한 실시양태에서, 조류 바이오매스는 본 발명의 방법에 따라 제조된다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 상승된 총 지방 수준(예를 들면, 67% 초과의 w/w)을 포함하는 조류 바이오매스를 제공하는 데 충분한 배양 조건 하에서 조류를 배양하는 것을 포함하고, 상기 조류 바이오매스가 음의 성장 촉진기 또는 정지기에서 수거되는 방법에 의해 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 조류 바이오매스는 지수 대수적 성장기 중에 배양물로부터 수거된다.
조류 바이오매스로부터 제조된 지질 조성물
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 상승된 수준의 총 지방을 함유하도록 하는 조건 하에서 성장한 조류 바이오매스로부터 지질, 지방산 추출물(예를 들면, 지질/지방산 조성물)을 제조하는 방법으로서, 조류 바이오매스에 상승된 총 지방 함량(예를 들면, 바이오매스의 67% 초과의 총 지방 함량)을 제공하는 데 충분한 배양 조건 하에서 배양된 조류 바이오매스로부터 지질을 수득하는 것을 포함하고, 상기 조류 바이오매스가 조류의 음의 성장 촉진기 또는 정지기에서 수거되는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 조류 바이오매스는 조류의 대수적 성장기 중에 수거된다.
본 발명의 조류 바이오매스로부터 지질 조성물을 수득하는 방법에는 추출, 열, 압력, 비누화, 초음파처리, 동결, 분쇄, 이온 교환, 크로마토그래피, 막 분리, 전기투석, 역삼투, 증류, 화학 유도체화, 결정화 등이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 예를 들면, 조류 지질은 에탄올, 아세트산에틸, 이소프로필 알코올, 메탄올, 아세트산에틸, 헥산, 염화메틸렌, 메탄올, 석유, 클로로포름 등을 포함하나 이들에 국한되지 않는 용매를 이용한 추출을 포함하나 이들에 국한되지 않는 임의의 적당한 방법에 의해, 또는 가압 액체 탄화수소, 예컨대 부탄, 펜탄, 프로판, 또는 기타(공용매 포함 또는 불포함)에 의해, 또는 (공용매 포함 또는 불포함) 초임계 유체 추출을 통해 조류 세포로부터 추출될 수 있다. 임의적으로, 추출된 지질/지방산 오일을, 용매를 제거하고/하거나 농축된 지질 물질을 감소 또는 제거하기 위해 감압 하에 증발시킨다. 다른 실시양태에서, 세포는 지질 조성물을 수득하기 위해, 예를 들면 (예컨대 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로서 사용하기 위한) 오일 형태로 파쇄 또는 분해된다. 몇몇 실시양태에서, 추출된 오일을 정련한다. 본 발명은 정련 유형에 의해 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 추출된 오일을 화학적으로 정련한다. 몇몇 실시양태에서, 추출된 오일을 물리적으로 정련한다. 몇몇 실시양태에서, 추출된 오일을 화학적으로 또한 이와 동시에 물리적으로 정련한다. (예를 들면, 조류 세포의 총 지방 함량을 (예를 들면, 67% 초과)로 상승시키기 위한 조건 하에서 성장한 조류 바이오매스로부터) 추출된 오일을 임의의 통상적 정련 방법을 이용하여 정련할 수 있다. 정련 공정은 추출된 지질/지방산/오일로부터 몇몇 또는 모든 불순물을 제거할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 정련 공정은 추출된 지질/지방산/오일을 탈검화, 표백, 여과, 탈취 및/또는 연마하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 추출된 지질 조성물 내에 함유된 지질/지방산/오일을, 예를 들면 우레아 첨가, 분별 증류, 칼럼 크로마토그래피, 및/또는 초임계 유체 분별과 같은 방법을 이용함으로써 지질 분획을 농축하기 지질을 가수분해함으로써 농축된다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스로부터 지질 조성물을 수득하는 단계는 바이오매스로부터 지질 조성물을 추출하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조류 바이오매스로부터 지질 조성물을 수득하는 단계는 바이오매스를 극성 용매와 접촉시키는 것을 포함한다.
예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 지질/지방산/오일은 지질 및/또는 지방산을 추출하기에는 충분하나 용매에 불용성인 화합물을 추출하기에는 불충분한 추출 조건 하에 용매를 사용하여 추출되어, 지질 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 지질/지방산 조성물은 본 발명의 조류 바이오매스로부터 추출되고, 여기서 세포성 파편 및/또는 석출된 불용성 화합물은 지질/지방산 및 용매를 함유하는 분획으로부터 분리된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 여과, 원심분리, 및/또는 이들의 조합과 같은 분리 방법을 이용하여 세포성 파편 및 석출된 화합물을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 세포성 파편 및/또는 석출된 불용성 화합물(예를 들면, 용매에 가용성이지 않은 조류 바이오매스의 부분)(예를 들면, 단백질, 섬유 등)이 회수되어 (예를 들면, 식료 또는 사료 제품에) 이용된다.
몇몇 실시양태에서, 용매는 극성 용매이다. 극성 용매의 예에는 에탄올, 아세트산에틸, 이소프로필 알코올, 메탄올, 아세트산에틸, 및 이들의 혼합물이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 한 실시양태에서, 극성 용매가 에탄올이다. 용매를 이용한 지질 조성물의 추출은 각종 방식들로 수행될 수 있다. 예를 들면, 추출은 뱃치 공정, 연속 공정, 또는 연속 역류 공정일 수 있다. 연속 역류 공정에서, 미세조류와의 용매 접촉은 오일을 용매 내로 침출시켜, 점차 더 많아지는 용매-오일 분획을 제공한다. 추출 후, 용매를 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제거할 수 있다. 용매를 제거하기 위해, 예를 들면, 증류, 회전 증발, 또는 상승 필름 증발기 및 스팀 스트리퍼 또는 임의의 적당한 탈용매제를 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 추출된 지질/지방산을 흡수 공정(예를 들면, 표백)에 노출하여, 예를 들면 존재할 수 있는 색체(color body) 및/또는 포스파티드와 같은 하나 이상의 바람직하지 않은 화합물을 제거한다. 몇몇 실시양태에서, 흡수 공정은 지질/지방산 추출물을 표백 물질(예를 들면, 중성토(예를 들면, 천연 점토 또는 표포토(fuller's earth)), 산 활성토, 활성탄, 활성 점토, 규산염, 및/또는 이들의 조합)과 접촉시키는 것을 포함하는 표백 공정이다. 본 발명은 이용하는 표백 물질의 양에 의해 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 추출된 지질/지방산은 탈검 단계에 노출된다. 탈검 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이에는 예를 들면, 물 탈검, 산 탈검, 효소 탈검, 및 막 탈검이 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 지질/지방산 추출물을 (예를 들면, 흡수 공정 후에) 탈검에 적용하고, 여기서 탈검은 지질/지방산 추출물을, 지질/지방산 추출물 조성물 내에 존재할 수 있는 검 및/또는 클로로필형 화합물을 석출하는 데 유효한 양의 수성 산들의 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 이용하는 수성 산의 유형 또는 양에 의해 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 수성 산들의 혼합물은 황산 및/또는 인산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 동등량의 수성 산들을 지질 조성물과 혼합한다. 한 바람직한 실시양태에서, 오일과 배합 시에, 수성 산은 산성 pH를 제공하는 데 충분한 양의 것이다. 산 혼합 후에 형성되는 석출물을, 예를 들면 원심분리 및/또는 여과(예를 들면, 막 여과)를 이용하여 지질 조성물로부터 제거할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 탈검한 지질/지방산 추출물 조성물을 (예를 들면, 조성물의 수분 함량을 감소시키기 위해) 건조시킨다. 본 발명은 건조 조건(예를 들면, 시간, 온도, 및/또는 진공 조건)에 의해 제한되지 않는다. 전술된 바와 같이, 몇몇 실시양태에서, 건조된 지질/지방산 조성물의 수분 함량은 약 10% w/w 미만(예를 들면, 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 또는 0.01% w/w 미만)이다.
지질 조성물
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 조류 바이오매스로부터 제조된 지질 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 지질 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 지질 조성물은 트라우스토키트리움 속의 조류로부터의 조류 바이오매스 또는 이의 부분/분획이다. 몇몇 실시양태에서, 조류 바이오매스는 다이노파이세아에, 크립토파이세아, 트레보욱시오파이세아에, 핀귀오파이세아에, 및/또는 이들의 조합으로부터 선택되는 조류를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조류 바이오매스는 트라우스토키트리움 스트리아툼, 트라우스토키트리움 로제움, 트라우스토키트리움 아우레움, 크립테코디늄 코니이, 파리에토클로리스 spp., 로도모나스 spp., 크립토모나스 spp., 파리에토클로리스 spp., 헤미세브니스 spp,; 포르피리디움 spp., 글로쏘마스틱스 spp., 및/또는 이들의 조합으로부터 선택되는 조류를 포함하고, 다른 실시양태에서, 조류 바이오매스는 파리에토클로리스 인사이스, 로도모나스 살리나, 헤미셀미스 브루네센스, 포르피리디움 크루엔툼 및 글로쏘마스틱스 크리소플라스타, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 조류를 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 조류 바이오매스는 쉬조키트리움 리마시눔을 포함한다.
식료 제품 및 동물 사료 첨가제
몇몇 실시양태에서, 전세포 조류 바이오매스, 이의 분획 및/또는 추출물은 소비(예를 들면, 포유동물에 의한 소비(예를 들면, 인간 또는 동물 소비))를 위해 또는 (예를 들면, 식료의 지질 함량 및/또는 영양 성분을 증가시키기 위한) 식료 첨가제로서 사용된다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 동물 사료(예를 들면, 소 사료, 낙농 사료, 수중배양 사료, 가금 사료 등)로 사용될 때, 본 발명의 조류 바이오매스에 의해 생성되는 지질/지방산은 식료 제품(예를 들면, 동물 사료) 내에 혼입된다. 몇몇 실시양태에서, 전세포 조류 바이오매스, 이들의 분획 및/또는 추출물이 약학적 또는 영양적 목적 및/또는 산업적 용도를 위해 사용된다.
전세포 조류 바이오매스, 분획, 및/또는 이들의 추출물은 특별한 용도 또는 사용에 적당한 각종 형태들/조성물들 중 어느 하나로 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 전세포 조류 바이오매스, 분획, 및/또는 이들의 추출물이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 전세포 조류 바이오매스, 분획, 및/또는 이들의 추출물은 분말 형태로 또는 액체 형태의 유리 오일로서(예를 들면, 지질 조성물 또는 이의 분획 또는 농축물) 제공된다. 전세포 조류 바이오매스, 분획, 및/또는 이의 추출물은 인간 및/또는 동물 소비를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 전세포 조류 바이오매스, 분획, 및/또는 이의 추출물은 사료, 식이 보충물, 식료, 약학적 제형, 낙농품, 및/또는 유아식으로서 또는 이들 내에 혼입되어 제공된다.
예를 들면, 한 실시양태에서, 전세포 조류 바이오매스, 분획, 및/또는 이의 추출물은 건조되어(예를 들면, 분무 건조, 터널 건조, 진공 건조), 육질 및/또는 산물이 인간 또는 동물(예를 들면, 애완동물, 가축)에 의해 소비되는 임의의 동물 또는 수중배양 생물(예를 들어, 어류, 새우, 게, 랍스터 등)을 위한 사료 또는 식료 보충물로서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 전세포 조류 바이오매스, 분획, 및/또는 이의 추출물은 건조 수분-감소제(예를 들면, 분쇄된 곡류, 예컨대 분쇄된 옥수수)와 혼합된다.
본원에 기재된 조성물은 완전 식료 제품, 식료 제품의 성분, 식이 보충물, 식이 보충물의 부분, 또는 사료 첨가제로서 사용될 수 있고, 액체, 반고체 또는 고체 형태의 것일 수 있다. 본 발명의 조성물은 부가적으로 약학 조성물의 형태일 것일 수 있다. 본 발명의 조성물, 식이 보충물, 식료 제품, 영아용 식료 제품, 사료 첨가제, 및/또는 약학 조성물은 개인의 건강을 촉진하는 방법에 이용될 수 있다. 조성물은 액체, 반고체 또는 고체 형태의 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 정제, 겔 팩, 캡슐, 젤라틴 캡슐, 향미있는 드링크로서, 또는 그러한 드링크, 조리용 오일, 샐러드 오일 또는 드레싱, 소스, 시럽, 마요네스, 마가린 등으로 재구성될 수 있는 분말로서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 식료 제품, 식이 보충물 등에는 낙농 제품, 영아용 식료, 영아식, 음료, 바, 분말, 식료 토핑, 드링크, 시리얼, 아이스크림, 사탕, 스낵 믹스, 구운 식료 제품 및 튀긴 식료 제품이 포함될 수 있으나 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 음료에는 에너지 드링크, 기능식품용 드링크, 스무디, 스포츠 드링크, 오렌지 주스 및 기타 과일 드링크가 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 바에는 식사 대용품, 영양 바, 스낵 바 및 에너지 바, 압출 바 등이 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 낙농 제품에는 요거트, 요거트 드링크, 치즈 및 밀크가 포함되나 이들에 국한되지 않는다. 경구 투여를 위한 조성물은 식이 보충물 또는 약학적 제제의 제조를 위한 임의의 공지 방법에 따라 제조될 수 있고, 그러한 조성물은 식이학적으로 또는 약학적으로 맛있는 제제를 제공하기 위해, 맛 증진 물질, 예컨대 감미제 또는 풍미제, 안정화제, 유화제, 착색제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 비타민, 미네랄, 및 임의의 생리학적으로 허용가능한 원으로부터의 미량 요소도 또한 본 발명의 조성물 내에 포함될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 조성물을 치료 유효량으로 포함한다. 본 발명의 조성물은 공지된 약학 기법에 따라 투여하기 위해 제형될 수 있다. 예를 들면, 문헌[R emington, The Science and Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995)]를 참조한다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조에서, 지질 조성물 (이의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함)은 통상 특히 허용가능한 담체와 혼합된다. 담체는 제형 내의 임의의 다른 성분과 상용가능할 것이고, 대상에게 유해해서는 안된다.
바이오연료
조류로부터 바이오연료를 제조하기 위한 현존 기법들 중 다수는, 시장에서의 석유디젤 중 임의의 유의한 분획을 교체할 것이 필요하게 되는 규모로 작동될 때, 비용이 많이 들고, 비효율적이며, 지속가능하지 않다. 조류를 수거하고 가공하기 위한 에너지의 공급 및 소비가 종종 과소평가된다. 통상 조류로부터 바이오디젤을 생성시키기 위해, 조류를 전형적으로 물 중 약 0.2 g/L의 농도로 배양물로부터 수거한다. 수거한 조류를 이어서 탈수하고, 조류 농도를 증가시켜, 약 15% 고체의 조류 페이스트를 형성한다. 이어서, 페이스트는 물을 증발시킴으로써 완전히 건조시킨다. 이어서, 물을 증발시킴으로써, 오일을 건조시킨다. 이어서, 오일을 유기 용매, 예컨대 헥산을 이용하여 건조된 조류로부터 추출하고, 상기 용매는 증류에 의해 조류 오일로부터 제거된다. 조류로부터 바이오디젤을 발생시키는 상기 통상적 방법은 과다 비용이 든다.
예를 들면, 조류가 물의 천연체에서 성장할 때, 조류 바이오매스는 물 부피를 고려할 때 비교적 희석된 것이다. 1 갤론의 물의 생성은 약 20,000 내지 40,000 갤론의 물의 가공을 필요로 한다. 그러한 대량의 물의 전송 및 가공의 에너지 비용은 크다. 예로서, 자체 질량의 25%가 지질인 조류가 25 g/m2/일로 생성될 수 있을 때, 2,500 갤론의 오일/에이커/연이 생성될 수 있다. 이 예에서는, 2,500 갤론의 오일을 생성시키기 위해 5천만 갤론의 물이 가공되어야 한다. 물을 탈수에 필요한 중심 시설에 펌핑하기 위한 표준 방법은 너무 에너지 집약적이고 비용 과다이다. 예로서, 2천만 갤론/년을 생성시킨 비교적 작은 조류 오일 설비는 오일 생성물 내에 함유된 것보다 물을 폰드(pond)로부터 중심 설비에 물을 펌핑하는 데 더 많은 에너지를 소비하게 되고, 이에 따라 순(net) 음의 에너지 밸런스가 초래된다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 조류 바이오매스에 상승된 총 지방 함량(예를 들면, 바이오매스의 67% 초과의 총 지방 함량)를 제공하는 데 충분한 배양 조건 하에서 배양된 조류 바이오매스로부터 지질을 수득하는 단계를 포함하는, 상승된 수준의 총 지방을 함유하도록 하는 조건 하에서 성장한, 조류 바이오매스로부터 조류 바이오매스 및/또는 지질/지방산 추출물(예를 들면, 지질/지방산 조성물)을 제조하는 방법으로서, 조류 바이오매스를 음의 성장 촉진기 또는 조류의 정지기에서 수거하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 조류 바이오매스를 조류의 대수적 성장기 중에 수거한다. 본 발명의 조류 바이오매스로부터 지질 조성물을 수득하기 위한 방법이 본원에 기재되어 있다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 발생된 조류 배양물 및/또는 조류 바이오매스로부터 유도된, 지질, 탄화수소, 또는 양자 모두를 포함하는 바이오연료 피드스톡 또는 바이오연료를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 지질 또는 이를 포함하는 조류 조성물은 극성에 따라 하위 분류된다: 중성 지질 및 극성 지질. 주요 중성 지질은 트리글리세리드 및 유리 포화 및 불포화 지방산이다. 주요 극성 지질은 아실 지질, 예컨대 당지질 및 인지질이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 지질 및 탄화수소를 포함하는 조성물이 기재되어 있고, 조성물 내에 존재하는 지방산 및/또는 탄화수소의 유형 및 상대량에 의해 구별된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조류 조성물 내에 존재하는 탄화수소는 대부분 직쇄 알칸 및 알켄이고, 36개 이하의 탄소 원자를 가지는 파라핀 등을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 조류 배양물 및/또는 조류 바이오매스 또는 이의 지질 분획으로부터 유도된 지질을 가공하는 단계를 포함하는, 액체 연료의 제조 방법을 제공한다. 가공 조류 유도 바이오연료 피드스톡에 의해 제조된 본 발명의 생성물은 디젤, 바이오디젤, 케로신, 제트 연료, 가솔린, JP-1, JP-4, JP-5, JP-6, JP-7, JP-8, 열 안정성 제트 추진체(Jet Propellant Thermally Stable (JPTS)), 피셔-트롭쉬(Fischer-Tropsch) 액, 에탄올 함유의 수송 연료를 포함한 알코올 기재 연료, 셀룰로스계 바이오매스 기재의 수송 연료를 포함한 기타 바이오매스 기재 액체를 포함하나 이들에 국한되지 않는 각종 액체 연료들에 혼입되거나 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조류 오일 내의 트리아실글리세리드는 예를 들면 염기 촉매화 에스테르교환 공정(검토를 위해, 예를 들면, 본원에 전문이 본원에 참조 인용되는 문헌[K. Shaine Tyson, Joseph Bozell, Robert Wallace, Eugene Petersen, and Luc Moens, "Biomass Oil Analysis: Research Needs and Recommendations, NREL/TP-510-34796, June 2004]을 참조한다)을 이용함으로써, 지방산 메틸 에스테르(FAME 또는 바이오디젤)로 전환된다. 몇몇 실시양태에서, 트리아실글리세리드를 2시간 동안 60℃에서 NaOH의 존재 하에 메탄올과 반응시켜, 지방산 메틸 에스테르(바이오디젤) 및 글리세롤을 발생시킨다. 다른 실시양태에서, 바이오디젤 및 글리세롤 연산품은 불혼화성이고, 통상 테칸테이션 또는 원심분리에 의해 다운스트림 분리한 후, 세정 및 정제한다. 유리 지방산(FFA)은 트리글리세리드의 천연 가수분해 생성물이고, 트리아실글리세리드 및 물의 반응에 의해 형성된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 발명은 유리 지방산의 생성을 바람직하게 1% 미만으로 제한하는 당업계에 공지된 기법에 의해 조류 오일을 급속히 또한 실질적으로 건조시키는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 당업계에 공지된 기법에 의해 유리 지방산을 전환시키거나 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조류 오일 내의 트리아실글리세리드는 산-촉매 에스테르교환, 효소-촉매 에스테르교환, 또는 초임계 메탄올 에스테르교환에 의해 지방산 메틸 에스테르(FAME 또는 바이오디젤)로 전환된다. 초임계 메탄올 에스테르교환은 촉매를 필요로 하지 않는다(예를 들면, 문헌[Kusdiana, D. and Saka, S., "Effects of water on biodiesel fuel production by supercritical methanol treatment", Bioresource Technology 91 (2004), 289-295]; [Kusdiana, D. and Saka, S., "Kinetics of Esterification in rapeseed oil to biodiesel fuel as treated in supercritical methanol" Fuel 80 (2001), 693-698]; [Saka, S., and Kusdiana, D., "Biodiesei fuel from rapeseed oil as prepared in supercritical methanol", Fuel 80 (2001), 225-231]을 참조한다). 초임계 메탄올에서의 반응은 반응 시간을 2시간에서 5분으로 감소시킨다. 또한, 염기성 촉매 NaOH의 부재는 다운스트림 정제를 단순화하고, 원료 비용을 감소시키며, 유리 지방산으로부터의 비누 관련 문제를 소거한다. 유리 지방산은 문제가 되기 보다는, 중요 피드스톡이 되며, 이는 이하와 같이 초임계 메탄올에서 바이오디젤로 전환된다.
몇몇 실시양태에서, 트리아실글리세리드는 수소로 환원되어, 그린 디젤로 일반적으로 알려진 생성물인, 파라핀, 프로판, 이산화탄소 및 물을 생성시킨다. 파라핀은 이성질화되어 디젤을 생성시키거나, 디젤과 직접 배합될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 통상적 염기 촉매 에스테르교환에 비해 수소첨가의 이점이 있다. 예를 들면, (수소화분해로도 알려진) 수소첨가 공정은 열화학적이어서, 생화학 공정에 비해 사료 불순물에 더욱 더 강하다(예를 들면, 수소화분해는 유리 지방산 및 물에 대해 비교적 민감하지 않다). 유리 지방산은 파라핀으로 바로 전환되고, 물은 공정의 열 효율을 단순히 감소시키나, 화학 기작을 유의적으로 변경시키지는 않는다. 또 다른 비제한적 예에서, 파라핀 생성물은 순수 탄화수소이고, 이에 따라 석유 기재 탄화수소와 구분불가능하다. 15% 더 낮은 에너지 함량을 가지고 저온 날씨에 동결할 수 있는 바이오디젤과는 달리, 그린 디젤은 석유 기재 디젤과 유사한 에너지 함량 및 유동 특성(예를 들면, 점도)을 가진다. 각종 실시양태들에서, 본 발명의 방법은 액체 연료, 예컨대 제트-연료, 디젤, 케로신, 가솔린, JP-1, JP-4, JP-5, JP-6, JP-7, JP-8, 및 JPTS를 생성하는 것으로 당업계에 공지된, 수소화분해 단계 및 이성질화 단계를 포함한다.
실험예
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시양태 및 측면을 설명하고 추가 설명하기 위해 제공된 것으로, 그 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
실시예 1
고지방 조류 바이오매스의 성장
종속영양성 조류 생성을 위한 방법, 및 특히 높은 지방/지질 수준을 포함하는 조류 바이오매스를 발생시키기 위해 조류를 배양하는 방법을 특징화하고 확립하기 위해 본 발명의 실시양태를 전개하는 동안 실험을 수행하였다. 일련의 통상적 종속영양성 조류 생성 연구들을 수행하여, 뱃치로 행하였다.
쉬조키트리움 리마시눔의 배양물을 수득하여, -80℃에서 1.5 mL 냉동 바이얼에서 저장하였다. 각 실험에 대해, 냉동 바이얼을 해동하고, 배지를 1.0 L 진탕 플라스크에 무균 첨가함으로써 공정을 개시하였다. 1 L 플라스크 내의 배지는 50 g/L의 당, 10 g/L의 효모 추출물, 및 4 g/L의 해염을 함유하였다. 3 L의 3 내지 6일 진탕 플라스크 배양물을 사용하여, 24 내지 48시간 동안 성장시킨 배지 함유의 250 L 용기를 접종한 후, 주요 용기(17,000 내지 28,000 L)로 전달하여, 36 내지 72시간 동안 뱃치 공정으로서 실행하였다. 뱃치 수행의 온도는 25 내지 30℃이었다. 온도 범위는 시스템의 정확한 조절 결여로 인해 컸다. 종자(250 L) 및 뱃치(17,000 내지 2.8,000 L) 실행에 사용된 배지는 이하와 같았다:
[표 1A]
종래 뱃치 및 종자 배양물에 사용된 배지
Figure pct00002
기체 크로마토그래피([AOAC 중력법 922.06] 참조), 산 가수분해([산 가수분해 안콤 테크놀로지 방법 1, 02-10-09에 의한 총 지방(Total Fat by Acid Hydrolysis Ankom Technology Method 1, 02-10-09)] 참조), 및 고온 용매 추출([안콤 테크놀로지 방법 2, 01-30-09] 및 [AOCS 방법 5-04] 참조)에 의해 뱃치 배양물의 조류 바이오매스의 총 지방 함량을 구하였다. 간략히 말해, 발효 브로쓰를 위한 통상적 분석 절차는 다음과 같았다: 브로쓰 샘플을 원심분리에 의해 농축하였다. 데칸테이션 후, 샘플을 24시간 동안 동결 건조시켰고, 수득되는 수분은 1% 미만이었다. 샘플을 산 가수분해 전에 중량 측정하고, 세정하며, 오븐에서 건조시켰다. 이에 이어서, 석유 에테르를 이용한 구배 열 조건 하에서 추출 공정을 행하였다. 자동화 기기를 이용하여, 가수분해 및 추출 공정을 착수하였다. 추가 건조 후, 질량 손실에 기초하여 결과를 구하였다.
하기 표 1B에 나와 있는 바와 같이, 25 내지 30℃의 온도 범위에서의 뱃치 생산에서 달성된 총 지방/지질 수준(w/w)은 8 내지 38%였다.
[표 1B]
25 내지 30℃의 뱃치 실행으로 성장한 조류 바이오매스의 총 지방 함량
Figure pct00003
지방/지질 수준의 양이 너무 낮아 가치가 없는 것으로 간주되어, 배양된 조류에서 생성된 지질의 수준을 증가시키기 위한 노력으로 부가적 실험을 행한 바, 상기 지방/지질 수준의 양을 증가시키기 위해 노력을 행하였다.
본 발명의 실시양태를 전개하는 동안, 배지 내 구성성분, 및/또는 이의 양 또는 비의 변화가 상이한 조류 성장 특성을 제공할 수 있는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 또한, 조류 배양물 시스템의 스케일-업이 조류 성장 특성을 변경시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 특히, 배양된 조류에 의해 생성된 지질의 수준을 증가시키기 위한 시도로서 MgSO4, 우레아, CaCl2, MgCl2 및 KH2PO의 양 및 비를 변경시켰다.
10 L의 뱃치 부피에 생성된 발효 결과가 이하와 같이 나타난다:
[표 2]
발효 조건 및 결과
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 3]
부가적 10 L 발효 조건 및 결과
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 4]
부가적 10 L 발효 조건 및 결과
Figure pct00008
본 발명의 실시양태를 전개하는 동안에 수행된 상기 실험들은 배지 내에 존재하는 물질의 특정 양/비가 조류 성장 특성(예를 들면, 달성된 총 바이오매스 및 바이오매스 자체 내의 지방 및/또는 기타 성분의 양)에 직접적 영향을 미침을 가리켰다. 이어서, 10 L 실행에서 높은 지방 함량 바이오매스를 제공한 매개변수를 이용하여, 그것이 높은 지방 함량 바이오매스의 대규모 생산을 위해 성공적인지의 여부를 결정하였다.
실시예 2
높은 지방 조류 바이오매스의 대규모 생산
상기 실시예 1에 기재된 종속영양성 조류 바이오매스를 발생시키기 위한 초기 시도는 효모 발효 공정에 기초한 절차를 이용하였다. 공정은 생산 시설(미국 켄터키주 니콜라스빌 소재) 및 단지 25 내지 30℃로 조절될 수 있는 온도의 제한으로 인해 상기 공정을 뱃치에서 실행하였다. 시스템의 정확한 조절의 결여로 인해 온도 범위가 컸다. 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 미국 켄터키주 니콜라스빌 플랜트에서 달성된 지방 수준은 8 내지 38% 범위였다. 그러나, 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시양태를 전개하는 동안에 부가적 실험을 수행하여, 조류 성장 및 바이오매스 발생/성질을 변경시키기 위해 종속영양성 조류 바이오매스 생성 중에 이용될 수 있는 기질의 특정 비/양을 규명하였다. 발효 중의 배지의 수준 및 비의 변경(예를 들면, MgSO4, 우레아, CaCl2, MgCl2, 및 KH2PO4)를 규명하고 특징 분석하여, 조류 성장을 변경시키고, 상이한 성질(예를 들면, 유의적으로 더 높은 지방 함량 바이오매스)을 가지는 바이오매스를 발생시켰다. 이하 기재된 바와 같이, 높은 지방 함량 조류 바이오매스(예를 들면, 67% 초과의 지방 함량)를 발생시키는 데 유효한 기질의 규명된 비/양을 함유하는 배지를 포함하는) 공정을 추가 시험하고, 대규모로 또한 페드-뱃치로서 실행하였다(이로써, 실행 중에 질소, 인, 칼륨 및 탄소의 양이 변경 및 조절되게 됨).
쉬조키트리움 리마시눔의 배양액을 수득하여, -80℃에서 1.5 mL 냉동 바이얼 내에 보관하였다. 각 배양물에 대해, 냉동 바이얼을 해동하고 배지의 1.0 L 진탕 플라스크에 무균 첨가하였다. 1 L 플라스크 내의 배지는 표 5에 나와 있는 성분들을 함유하였다:
[표 5]
1.0 L 배양물에 사용되는 배지
Figure pct00009
조류가 대수/지수적 성장기에 들어가게 되는 시간까지, 단 배지 내 글루코스가 고갈되기 전에(통상 72 내지 144시간), 배지 내에 쉬조키트리움 리마시눔을 함유하는 진탕 플라스크의 온도를 30℃에서 유지시키고 250 RPM에서 진탕하였다.
이어서, 1 L 배양 플라스크의 내용물을 보다 큰 용기(40 L 또는 27 L 또는 18 L 용기)에 연결되도록 사용된 멸균 커넥터를 가지는 2.0 L 흡인기로 무균 전달하였다. 따라서, 1 L 배양 플라스크 배양물을 접종물로 사용하고, 하기 표 6에 기재된 배지를 함유하는 종자 용기(40 L 또는 27 L 또는 18 L)에 무균 첨가하였다:
[표 6]
18 L 또는 27 L의 제1 종자 배양을 위해 사용되는 배지
Figure pct00010
용존 산소를 10% 이상으로 유지시키도록 하는 기류 및 교반 조건 하에, 또한 20 g/L 이상의 글루코스가 소비될 때까지, 제1 종자 단계(40/18/27 L)를 30℃에서 실행하였다. 멸균 조건 하에 성장할 때, pH 조절이 필요하지 않았다. 오히려, pH는 발효 공정 전반에 걸쳐 양호한 범위 내에 유지되었다. 제1 종자 단계(40/18/27 L)는 조류 성장이 로그/지수적 성장 단계 내에 있을 때 완전한 것으로 간주되었고, 글루코스는 배지로부터 고갈되지 않았으나, 20 g/L 이상의 글루코스가 소비되었다(일반적으로, 이는 약 24 내지 48시간에 일어났다). 보다 큰 용기(4000/2000 L)를 제1 종자 단계 배양(예를 들면, 이는 배지로 충전되어, 멸균 조건 하에 30℃로 유도됨)를 위해 준비하였다.
제1 종자 배양의 완료 시에, 제1 종자 단계(40/18/27 L) 배양 용기의 내용물을 하기 표 7에 기재된 2,000 L 이상의 배지를 가지는 용기에 전달하였다:
[표 7]
4,000/2000 L 제2 종자 배양을 위해 사용되는 배지
Figure pct00011
용존 산소를 10% 이상으로 유지시키도록 하는 기류 및 교반 조건 하에, 또한 20 g/L 이상의 글루코스가 소비될 때까지 제2 종자 단계(4000/2000 L) 배양을 30℃에서 실행하였다. 멸균 조건 하에 성장할 때, pH 조절이 필요하지 않았다. 오히려, pH는 발효 공정 전반에 걸쳐 양호한 범위 내에 유지하였다. 제2 종자 단계(4000/2000 L)는 조류 성장이 로그/지수적 성장 단계 내에 있을 때 완전한 것으로 간주되었고, 글루코스는 배지로부터 고갈되지 않았으나, 20 g/L 이상의 글루코스가 소비되었다(일반적으로, 이는 약 24 내지 48시간에 일어났다).
제2 종자(4000/2000 L) 배양의 완료 시에, 제2 종자 배양의 내용물을 하기 표 8에 기재된 바와 같이, 30℃에서 70,000 L 내지 220,000 L 범위의 부피의 멸균 배지를 가지는 용기에 전달하였다:
[표 8]
Figure pct00012
30 g/L의 글루코스가 제3 배양 용기(70,000-220,000 L 용기) 내에 존재하는 조류에 의해 소비되었을 때, 글루코스 및 페드-뱃치 사료 공급을 개시하였다. 글루코스를, 제3 배양 용기(70,000-220,000 L 용기)에서 조류를 대규모 배양하는 동안에 10 g/L로 유지시켰다. 표 9에 나와 있는 바와 같이, 페드-뱃치 공정에 사용된 사료는 하기의 것들을 함유하였다:
[표 9]
페드-뱃치 공정을 위해 사용되는 배지
Figure pct00013
페드-뱃치 사료를 34시간에 걸쳐 첨가하였다. 본 발명을 수행하기 위해 메커니즘의 이해가 필요하지 않고, 본 발명이 어떠한 특별한 작용 메커니즘에도 제한되지 않더라도, 몇몇 실시양태에서, 이 시간은 사료 공급 개시에 ~20시간 걸린다는 관찰(30 g/L의 글루코스가 제3 배양 용기 내에 존재하는 조류에 의해 소비됨)에 기초하여 확인되었다. 이어서, 모든 영양소를 배지로부터 제거(소비)되도록 하기 위해, (예를 들면, 약 로그 시간 54에) 사료 공급을 중지하였고, 조류 바이오매스의 수거가 지수적 성장 종료 시에 일어났으며, 이는 일반적으로 로그 시간 66 내지 76에서 일어난다.
배양 브로쓰를 15 내지 30% 고체를 달성하기 위한 조건 하에 슬러지 제거 원심분리하였고, 한편 농축물을 분무 건조하여, 5% 미만의 최종 수분이 되도록 물을 제거하였다.
수개의 독립적 대규모 배양의 결과가 도 1 및 하기 표 10 내지 12에 나와 있다:
[표 10]
대규모 생산 배양물 결과.
Figure pct00014
* 불량 수거 샘플
** 본 뱃치에서의 공정 조절 문제
○ F1-2-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 93,700 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-3-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 84,000 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-4-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 92,300 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-5-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 82,300 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-6-11
■ 80,000 L의 뱃치 부피 및 83,600 L의 수거 부피를 가짐
○ F2-1-11
■ 110,000 L의 뱃치 부피 및 113,000 L의 수거 부피를 가짐
○ F2-2-11
■ 110,000 L의 뱃치 부피 및 125,600 L의 수거 부피를 가짐
각 대규모 페드-뱃치 배양으로부터 발생된 바이오매스를, 총 지방(포화 및 불포화 지방) 함량; 수분, 도코사헥사엔산(DHA)함량, 팔미트산 함량, 조질의 단백질 함량 및 회분 함량의 분석을 비롯하여 특징 분석하였다(예를 들면, [지방 함량 및/수분 - [AOCS Am 5-04 'Rapid Determination of Oil/Fat Utilizing High Temperature Solvent Extraction' v. 3/31/10]; DHA/팔미트산 - [AOCS Method Ce 1b-89 and AOAC Method of Analysis 991.39]; 단백질 - AOAC 990.03; 회분 - [-AOAC 942.05 Vol adjusted Biomass (g/L) - Stone, et. al. Dry Weight Measurement of Microbial Biomass and Measurement Variability Analysis. Biotechnology Techniques. Vol.] 참조).
[표 11]
대규모 배양물의 특징 분석
Figure pct00015
Figure pct00016
[표 12]
대규모 배양물의 특징 분석
Figure pct00017
부가적으로, 바이오매스의 지방산 프로파일을 특징 분석하였다. 도 2에 나와 있는 바와 같이, 발생된 각 조류 바이오매스의 지방산 프로파일은 바이오매스의 총 지방 함량과 무관하게 매우 유사하고/일정하다. 분석한 모든 샘플들의 집합적 프로파일을 고려할 때의 복합 지방산 프로파일이 도 3에 나와 있다.
각 조류 바이오매스에 대해 글리세리드 프로파일도 또한 결정하였다. 바이오매스의 총 글리세리드 함량 중, 약 4 내지 8%가 디글리세리드였고, 1% 미만은 글리세롤이었으며, 약 3 내지 7%는 모노글리세리드였고, 약 84 내지 88%는 트리글리세리드였다.
실시예 3
바이오매스 수거
본 발명의 실시양태를 전개하는 동안에 수행된 실험으로, 바이오매스 내 증가된 총 지방 수준이 조류 바이오매스의 원심분리에 대해 유의적 문제를 유발한다는 것이 규명되었다. 원심분리후 바이오매스 함량의 회수는 단지 약 45 내지 85% 총 바이오매스 중량이었다. 이는, 예를 들면 이하 표 13에 나와 있다:
[표 13]
직접 수거 샘플 대 분무 건조된 생성물로부터의 지방 및 단백질 수율의 비교
Figure pct00018
* 불량 수거 샘플 ** 본 뱃치에서의 공정 조절 문제
○ F1-2-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 93,700 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-3-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 84,000 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-4-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 92,300 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-5-11
■ 70,000 L의 뱃치 부피 및 82,300 L의 수거 부피를 가짐
○ F1-6-11
■ 80,000 L의 뱃치 부피 및 83,600 L의 수거 부피를 가짐
○ F2-1-11
■ 110,000 L의 뱃치 부피 및 113,000 L의 수거 부피를 가짐
○ F2-2-11
110,000 L의 뱃치 부피 및 125,600 L의 수거 부피를 가짐
회수 문제는 바이오매스 내 저밀도의 지질/오일의 양 증가로 인한 것으로 규명되었다. 따라서, 이 문제를 해결하기 위한 노력으로 본 발명의 실시양태 도중에 실험을 수행하였다.
바이오매스의 회수를 증진시키는 능력을 나타낸 한 접근법은 원심분리 전에 조류 바이오매스를 포함하는 배양물을 저온저장하는 것이었다. 본 발명을 수행하기 위해 메커니즘의 이해가 필요하지 않고, 본 발명이 어떠한 특별한 작용 메커니즘에도 제한되지 않더라도, 몇몇 실시양태에서, 배양물의 저온저장은 지질/오일의 밀도를 증가시켰고, 바이오매스의 보다 큰 회수율을 가져왔다.
원심분리 전에 바이오매스를 저온저장시키는 효과를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
실험실 시험 1: 2 갤론의 브로쓰를 수집하여 16 플러스 시간 동안 7 내지 8℃에서 저장하였다. 8×50 ml 원심분리관을 수집하고 수조에 두어, 이하 표 14에 기재된 표적 온도들에 도달하게 하였다. 모든 샘플들을 5분 동안 5000 rpm에서 원심분리하였다.
[표 14]
시험 1의 배양 온도 및 원심분리 결과
Figure pct00019
실험실 시험 2: 새 브로쓰 샘플을 수집하고, 10 내지 30℃의 온도 범위에 걸쳐 시험하였다. 이들을 시험 1에서와 같이 하룻밤 동안 냉장하지 않았다. 모든 샘플들을 빙수조에 정치하여 표적 온도가 되도록 하였다. 샘플을 5분 동안 5000 rpm에서 원심분리하였다.
[표 15]
시험 2의 배양 온도 및 원심분리 결과
Figure pct00020
실시예 2 및 도 1에 기재된 바와 같이, 대규모 생산 중에, 회수(원심분리) 전의 바이오매스의 저온저장은 바이오매스의 총 회수율의 유의적 증가를 가져온다. 다중 대규모 수행이 대략 95%의 총 회수율로 완료되었다.
상기 명세서에 언급된 모든 공보들 및 특허들은 본원에 참조 인용된다. 본 발명의 전술된 조성물 및 방법의 각종 변형 및 변동이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않는 한 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었으나, 청구되는 본 발명은 그러한 특정 실시양태에 부당히 제한되어서는 안됨을 이해하여야 한다. 실제로, 관련 분야의 숙련가에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 전술된 방식의 각종 변형도 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 한다.

Claims (32)

  1. 67% 이상의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스(agal biomass)를 제공하는 데 충분한 배양 조건 하에서 조류를 배양하는 단계를 포함하는, 67% 이상의 총 지방을 포함하는 조류 바이오매스를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조류 바이오매스는 순차 방식으로 2 이상 유형의 배양 배지에서 배양되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 2 이상의 배양 배지 중 하나의 배양 배지는 50 g/L의 탄소원, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및 0.15 g/L의 염화마그네슘을 함유하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 탄소원은 당인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 당은 글루코스인 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 2 이상의 배양 배지 중 하나의 배양 배지는 50 g/L의 탄소원, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 4.0 g/L의 황산마그네슘, 약 1 g/L의 우레아, 약 2 g/L의 염화칼슘, 약 2 g/L의 염화마그네슘 및 약 0.25 g/L의 인산이수소칼륨을 함유하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 탄소원은 당인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 당은 글루코스인 것인 방법.
  9. 제2항에 있어서, 2 이상의 배양 배지 중 하나의 배양 배지는 탄소원, 효모 추출물 및 해염을 함유하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 탄소원은 당인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 당은 글루코스인 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 조류는 글루코스, 효모 추출물 및 해염을 함유하는 제1 배양 배지에서 배양되고; 글루코스, 효모 추출물, 황산마그네슘, 염화칼슘 및 염화마그네슘을 함유하는 제2 배양 배지로 전달되어 거기에서 배양되며; 글루코스, 효모 추출물, 황산마그네슘, 우레아, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 인산이수소칼륨을 함유하는 제3 배양 배지로 전달되어 거기에서 배양되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제3 배양 배지는 페드-뱃치 공급물(fed-batch feed)로 보충된 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 페드-뱃치 공급물은 우레아 및 인산이수소칼륨을 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 조류 바이오매스는 페드-뱃치 공정의 중지 후 12 내지 24시간에 제3 배양 배지로부터 수거되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 조류 바이오매스는 모든 영양소가 배지로부터 제거/소비된 후, 제3 배양 배지로부터 수거되는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 조류 바이오매스는 조류 바이오매스를 포함하는 제3 배양 배지의 원심분리를 통해 수거되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제3 배양 배지는 조류 바이오매스를 수거하기 전에 저온저장되는(chilled) 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제3 배양 배지는 약 5 내지 25℃로 저온저장되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 조류는 쉬조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum)인 것인 방법.
  21. 제12항에 있어서, 제1 배양 배지는 약 50 g/L의 글루코스, 약 10 g/L의 효모 추출물 및 약 4 g/L의 해염을 함유하는 것인 방법.
  22. 제12항에 있어서, 제2 배양 배지는 약 50 g/L의 글루코스, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 0.15 g/L의 황산마그네슘, 약 0.15 g/L의 염화칼슘 및 0.15 g/L의 염화마그네슘을 함유하는 것인 방법.
  23. 제12항에 있어서, 제3 배양 배지는 약 50 g/L의 글루코스, 약 7.5 g/L의 효모 추출물, 약 4.0 g/L의 황산마그네슘, 약 1 g/L의 우레아, 약 2 g/L의 염화칼슘, 약 2 g/L의 염화마그네슘 및 약 0.25 g/L의 인산이수소칼륨을 함유하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 배양 조건은 용존 산소를 10%로 유지하기 위한 기류 및 교반 조건 하에서 30℃에서 조류 배양을 실행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 조류는 멸균 조건 하에 배양되는 것인 방법.
  26. 약 170-250 mg/g 도코사헥사엔산(DHA) 및 약 150-400 mg/g 팔미트산을 포함하는, 67 중량% 이상의 총 지방 함량을 가지는 조류 바이오매스.
  27. 제26항의 조류 바이오매스로부터 제조된 지질 조성물.
  28. 제27항의 지질 조성물을 포함하는 식료 제품.
  29. 제26항의 조류 바이오매스를 포함하는 식료 제품.
  30. 67 중량% 이상의 총 지방 함량을 가지는 조류 바이오매스.
  31. 바이오연료 제조에서의, 67 중량% 이상의 총 지방 함량을 가지는 조류 바이오매스의 용도.
  32. 제31항에 있어서, 바이오연료는 바이오디젤인 것인 용도.
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