BR112013033977B1

BR112013033977B1 - processo de preparação de uma biomassa de alga

Info

Publication number: BR112013033977B1
Application number: BR112013033977-2A
Authority: BR
Inventors: Kyle A. Raney; Rebecca A. Timmons
Original assignee: Alltech, Inc
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2020-11-10
Also published as: DOP2013000288A; IL229663B; AP2013007319A0; MX344443B; AU2012280937A1; AP4026A; UA112080C2; CL2013003791A1; MY180625A; CA2837215C; JP2014524745A; EA201301254A1; NZ618123A; HK1199739A1; EP2732025A2; MA35195B1; AU2012280937B2; PE20140770A1; WO2013010090A2; US20130017594A1

Abstract

COMPOSIÇÕES DE LIPÍDIO DE ALGA E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO DAS MESMAS. Esta invenção refere-se às composições compreendendo algas com alto teor de lipídio e métodos de preparação e utilização das mesmas. Em particular, a invenção se refere à biomassa de algas com alto teor de lipídio e materiais de lipídio de alga derivados da mesma, métodos de preparar a mesma, bem como aos biocombustíveis (por exemplo, biodiesel) e composições dietéticas (por exemplo, alimentações animais) compreendendo ou feitas dos mesmos. Composições e métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo biocombustível, dietéticas, (por exemplo, nutrição humana e animal), terapêuticas, bem como pedidos de pesquisa.

Description

[001] Este Pedido reivindica a prioridade para o Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos número de série 61/507.390 depositado em 13 de Julho de 2011, pelo presente incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Esta invenção refere-se às composições compreendendo algas com alto teor de lipídio e métodos de preparação e utilização das mesmas. Em particular, a invenção se refere à biomassa de algas com alto teor de lipídio e materiais de lipídio de alga derivados da mesma, métodos de preparar a mesma, bem como aos biocombustíveis (por exemplo, biodiesel) e composições dietéticas (por exemplo, alimentações animais) compreendendo ou feitas dos mesmos. Composições e métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo biocombustível, dietéticas (por exemplo, nutrição humana e animal), terapêuticas, bem como pedidos de pesquisa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Nos últimos diversos anos, a produção de biocombustível (por exemplo, biodiesel) de algas tem sido uma área de interesse. Em parte, isto é devido à alta qualidade da área agrícola não sendo requerido cultivar algas (biomassa de alga). No entanto, a produção comercial de biocombustível (por exemplo, biodiesel) de algas tem permanecido um desafio.

[004] Além disso, durante os últimos cinquenta anos, métodos para fornecimento de nutrição animal mudaram. Os animais não são mais alimentados seja qual for a forragem ou outro material que possa estar disponível. Em vez disso, as dietas de animais são intimamente monitoradas quanto ao valor nutricional total e custo. Muito frequentemente, os animais em dietas específicas são monitorados quanto às características de desempenho e qualidade com os componentes nutricionais da alimentação sendo ajustados para maximizar o valor nutricional da alimentação e otimização das características de desempenho animal.

[005] No entanto, o custo é um fator crítico. Existe uma pesquisa contínua de alimentações animais baratas, não apenas para sustentar animais, porém na maioria dos casos, para causar crescimento e valor realçados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A invenção se refere às composições compreendendo algas com alto teor de lipídio e métodos de preparação e utilização das mesmas. Em particular, a invenção se refere à biomassa de algas com alto teor de lipídio e materiais de lipídio de alga derivados da mesma, métodos de preparar a mesma, bem como aos biocombustíveis (por exemplo, biodiesel) e composições dietéticas (por exemplo, alimentações animais) compreendendo ou feitas dos mesmos. Composições e métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo biocombustível, dietéticas (por exemplo, nutrição humana e animal), terapêuticas, bem como pedidos de pesquisa.

[007] Consequentemente, a invenção fornece um processo de preparação de uma biomassa de alga contendo um alto teor de gordura, desejado (por exemplo, pelo menos 67% de gordura total) compreendendo cultura de algas sob condições de cultura suficientes para fornecer uma biomassa de alga contendo um alto teor de gordura, desejado. A invenção identificou condições de cultura sob as quais é possível obter uma biomassa de alga compreendendo um nível desejado de gordura total (por exemplo, pelo menos 67% de gordura total). A invenção não está limitada ao teor de gordura total (por exemplo, por peso) de uma biomassa de alga gerada de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferida, uma biomassa de alga gerada e/ou usada de acordo com a invenção compreende um teor de gordura de pelo menos 67% por peso. No entanto, a invenção também fornece composições e métodos de geração de uma biomassa de alga contendo maior (por exemplo, mais do que 68%, mais do que 69%, mais do que 70%, mais do que 71%, mais do que 72%, mais do que 73%, mais do que 74%, mais do que 75%, mais do que 76%, mais do que 77%, mais do que 78%, mais do que 79%, mais do que 80%, mais do que 81%, mais do que 82%, mais do que 85%, ou mais) ou menor (por exemplo, cerca de 66%, cerca de 65%, cerca de 64%, cerca de 63%, cerca de 62%, cerca de 61%, cerca de 60%, cerca de 59%, cerca de 58%, cerca de 57%, cerca de 56%, cerca de 55%, cerca de 54%, ou menos) quantidade de gordura total. De fato, métodos e composições descritos aqui podem ser utilizados para gerar uma biomassa de alga contendo qualquer nível desejado de teor de gordura total. Em algumas modalidades, a biomassa de algas é cultivada em dois ou mais tipos de meio de cultura de uma maneira sequencial. Por exemplo, em algumas modalidades, um meio de cultura de dois ou mais meios de cultura contém 50 g/L de uma fonte de carbono, cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e 0,15 g/L de cloreto de magnésio. A invenção não está limitada pela fonte de carbono. De fato, uma variedade de fontes de carbono pode ser usada incluindo, porém não limitada a carboidratos tais como glicose, frutose, xilose, sacarose, maltose ou amido solúvel bem como ácido oléico, gorduras tais como óleo de soja, melaço, glicerol, manitol, e acetato de sódio, farinha de semente de algodão, glicerol, melaço e milhocina. Em algumas modalidades, outro meio de cultura de dois ou mais meio de cultura contém 50 g/L de uma fonte de carbono, cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 4,0 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 1 g/L de ureia, cerca de 2 g/L de cloreto de cálcio, cerca de 2 g/L de cloreto de mag- nésio e cerca de 0,25 g/L de fosfato de monopotássio. Em algumas modalidades, um meio de cultura de dois ou mais meios de cultura contém uma fonte de carbono, extrato de levedura e sal marinho. Em algumas modalidades, e como descrito aqui, as algas são cultivadas em um primeiro meio de cultura (por exemplo, contendo glicose, extrato de levedura e sal marinho); transferidas em e incubadas em um segundo meio de cultura (por exemplo, contendo glicose, extrato de levedura, sulfato de magnésio, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio); e transferidas em e incubadas em um terceiro meio de cultura (por exemplo, contendo glicose, extrato de levedura, sulfato de magnésio, ureia, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio e fosfato de monopotássio). Em algumas modalidades, um dos meios de cultura é suplementado com um suprimento de alimentação em bateladas. Em uma mo-dalidade preferida, o terceiro meio de cultura é suplementado com um suprimento de alimentação em bateladas. A invenção não está limitada pelo tipo, ou duração, de fornecimento de alimentação em bateladas utilizados. Em algumas modalidades, o suprimento de alimentação em bateladas compreende ureia e fosfato de monopotássio. A invenção não está limitada pelas quantidades e/ou relações de componentes de meios usados nas culturas. Exemplos que podem ser utilizados como componentes de cada um dos vários meios (por exemplo, primeiros meios de cultura, segundos meios de cultura, meios em bateladas e meios de alimentação em bateladas) são descritos em detalhes aqui. Em algumas modalidades, a biomassa de alga é colhida de uma cultura (por exemplo, de um terceiro meio de cultura) entre 12 a 24 horas após cessação do processo de alimentação em bateladas. Em algumas modalidades, a biomassa de alga é colhida do terceiro meio de cultura após todos os nutrientes terem sido removidos/consumidos do meio. A invenção não está limitada pelo modo de como a biomassa de alga é colhida. De fato, uma variedade de meios pode ser usada para colher as biomassas incluindo, porém não está limitada aos métodos descritos aqui. Em algumas modalidades, a biomassa de alga é colhida por meio de centrifugação. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreendendo a biomassa de alga é resfriado antes da colheita da biomassa de alga. A invenção não está limitada pela temperatura para a qual o meio de cultura compreendendo a biomassa de alga é resfriado antes da colheita. De fato, uma variedade de temperaturas pode ser usada incluindo, porém não está limitada àquelas descritas aqui. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreendendo a biomassa de alga é resfriado para entre cerca de 5 e 25 C. A invenção não está limitada pelo tipo de algas usadas na invenção. De fato, uma variedade de algas pode ser usada (por exemplo, independentemente ou em combinação) incluindo, porém ão está limitada àquelas descritas aqui. Em algumas modalidades, as algas são uma linhagem ou espécie do gênero Chlorella, do gênero Schizochytrium, ou do gênero Crypthecodinium. Em uma modalidade preferida, as algas são Schizochytrium limacinum. Em algumas modalidades, o primeiro meio de cultura contém cerca de 50 g/L de glicose, cerca de 10 g/L de extrato de levedura e cerca de 4 g/L de sal marinho. Em algumas modalidades, o segundo meio de cultura contém cerca de 50 g/L de glicose, cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e 0,15 g/L de cloreto de magnésio. Em algumas modalidades, o terceiro meio de cultura contém cerca de 50 g/L de glicose, cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 4,0 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 1 g/L de ureia, cerca de 2 g/L de cloreto de cálcio, cerca de 2 g/L de cloreto de magnésio e cerca de 0,25 g/L de fosfato de monopotássio. Em algumas modalidades, as condições de cultura compreendem realizar a cultura de algas a 30 C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a cerca de 10%. Em algumas modali- dades, o terceiro meio de cultura (por exemplo, os meios de cultura presentes no momento da inoculação de um fermentador principal (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 256.000 L)) contém meio com uma relação inicial de nitrogênio (N):fósforo (P):potássio (K) de 46:13:8.5. Em uma modalidade preferida, a relação de N:P:K é a mesma nos modos de cultura em batelada e alimentação em batelada. Em algumas modalidades, a relação de magnésio (Mg):cálcio (Ca) é de 3:1 nos meios de cultura usados tanto nos modos em batelada quanto alimentação em bateladas, embora relações maiores (por exemplo, 4:1, 4.5:1, ou mais) e menores (por exemplo, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, ou menos) possam ser usadas. Em outra modalidade, a relação de cloreto (CI2):sulfato (SO4)) de 1:1 é usada nos meios de cultura usados tanto nos modos em batelada quanto alimentação em bateladas, embora relações maiores (por exemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, ou mais) e menores (por exemplo, 1:2, 1:3. 1:4, 1:5, ou menos) possam ser usadas. Em algumas modalidades, a relação de sulfato (SO4):fosfato (PO4) nos meios no momento de inoculação de um fer- mentador principal (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 256.000 L) é de 16:1, embora relações maiores (por exemplo, 20:1, 25:1, 30:1, 32:1, ou mais) e menores (por exemplo, 10:1, 8:1. 5:1, 3:1, ou menos) possam ser usadas. Em algumas modalidades, a relação total de sulfato (SO4):fosfato (PO4) que foi produzida em batelada e alimentada no término de uma cultura completa (por exemplo, incluindo inóculo, primeiro estágio de semente, segundo estágio de semente e principais culturas fermentadoras) que gera uma biomassa de alga contendo um teor de gordura desejado (por exemplo, mais do que 67% de gordura) é de 5.3:1, embora relações maiores (por exemplo, 5,5:1, 5,7:1, 6:1, 7:1, 8:1 ou mais) e menores (por exemplo, 5:1, 4,5:1, 4:1. 3:1, ou menos) possam ser usadas. Em algumas modalidades, a relação de cloretos (CI2):fosfato (PO4) nos meios no momento de ino- culação de um fermentador principal (por exemplo, vaso 70.000 L, 120.000 L, 256.000 L) é de 16:1, embora relações maiores (por exemplo, 20:1, 25:1, 30:1, 32:1, ou mais) e menores (por exemplo, 10:1, 8:1. 5:1, 3:1, ou menor) possam ser usadas. Em algumas modalidades, a relação total de cloretos (CI2):fosfato (PO4) que foi produzida em batelada e alimentada no término de uma cultura completa (por exemplo, incluindo inóculo, primeiro estágio de semente, segundo estágio de semente e principais culturas fermentadoras) que gera uma biomassa de alga contendo um teor de gordura desejado (por exemplo, mais do que 67% de gordura) é de 5.3:1, embora relações maiores (por exem-plo, 5.5:1, 5.7:1. 6:1, 7:1, 8:1 ou mais) e menores (por exemplo, 5:1, 4.5:1,4:1. 3:1, ou menor) possam ser usadas.

[008] A invenção também fornece uma biomassa de alga tendo um teor elevado de gordura, desejado (por exemplo, teor de gordura total de pelo menos 67% por peso). Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 170 a 250 mg/g de ácido docosahexae- noico (DHA) e/ou cerca de 150 a 400 mg/g de ácido palmítico. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição de lipídio, um produto alimentício ou outro material compreendendo a biomassa de alga (por exemplo, biomassa de alga secada) ou um componente da mesma (por exemplo, um componente de ácido graxo da mesma). Em algumas modalidades, a biomassa de alga (por exemplo, a bio-massa de alga seca (por exemplo, gerada de acordo com um método descrito aqui)) contém uma quantidade de gordura total desejada e/ou outros componentes (por exemplo, mais do que cerca de 68% de gordura total, mais do que cerca de 69% de gordura total, mais do que cerca de 70% de gordura total, mais do que cerca de 71% de gordura total, mais do que cerca de 72% de gordura total, mais do que cerca de 73% de gordura total, mais do que cerca de 74% de gordura total, mais do que cerca de 75% de gordura total, mais do que cerca de 76% de gordura total, mais do que cerca de 77% de gordura total, ou mais do que cerca de 78% de gordura total). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, contendo mais do que 67% de gordura total) é secada de modo que a biomassa contenha menos do que 5% de umidade (por exemplo, menos do que 4,5% de umidade, menos do que 4% de umidade, menos do que 3,5% de umidade, menos do que 3% de umidade, menos do que 2,5% de umidade, menos do que 2% de umidade, ou menos do que 1,5% de umidade). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém cerca de 170 a 250 mg/g ou mais de ácido docosa- hexaeníco (DHA) (por exemplo, cerca de 170 a 180 mg/g de DHA, cerca de 180 a 190 mg/g de DHA, cerca de 190 a 200 mg/g de DHA, cerca de 200 a 210 mg/g de DHA, cerca de 210 a 220 mg/g de DHA, cerca de 220 a 230 mg/g de DHA, cerca de 230 a 240 mg/g de DHA, cerca de 240 a 250 mg/g de DHA, ou mais do que 250 mg/g de DHA). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém cerca de 150 a 400 mg/g ou mais de ácido palmítico (nome IUPAC: ácido hexadecanoide (por exemplo, cerca de 150 a 200 mg/g, cerca de 200 a 225 mg/g, cerca de 225 a 250 mg/g, cerca de 250 a 275 mg/g, cerca de 275 a 300 mg/g, cerca de 300 a 325 mg/g, cerca de 325 a 350 mg/g, cerca de 350 a 375 mg/g, cerca de 375 a 400 mg/g, ou mais do que 400 mg/g)). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém cerca de 300 a 600 mg/g ou mais de ácidos totalmente graxos (por exemplo, cerca de 300 a 350 mg/g, cerca de 350 a 400 mg/g, cerca de 400 a 450 mg/g, cerca de 450 a 500 mg/g, cerca de 500 a 550 mg/g, cerca de 550 a 600 mg/g, ou mais do que 600 mg/g de ácidos graxos)). Em algumas modalida- des, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém menos do que cerca de 15% de proteína (por exemplo, menos do que cerca de 14% de proteína, menos do que cerca de 13% de proteína, menos do que cerca de 12% de proteína, menos do que cerca de 11% de proteína, menos do que cerca de 10% de proteína, menos do que cerca de 9% de proteína, ou menos do que cerca de 8% de proteína). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga ou componente da mesma da invenção é usada na preparação de biocombustível (por exemplo, biodiesel). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga ou componente da mesma da invenção é usada na preparação de um produto alimentício (por exemplo, um alimento animal ou componente alimentício).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009] A figura 1 descreve os dados gerados durante a produção de biomassa de algas heterotrófica, em grande escala de acordo com os aspectos da invenção.

[0010] A figura 2 mostra o perfil de ácido graxo de biomassa de algas colhidas de diversas culturas de alga, de grande escala independentes.

[0011] A figura 3 mostra um perfil de ácido graxo compósito de uma biomassa colhida utilizando os materiais e métodos descritos aqui.

DEFINIÇÕES

[0012] Como usado aqui, "fosfolipídio" se refere a um composto orgânico tendo a seguinte estrutura geral:

[0013] em que R1 é um resíduo de ácido graxo, R2 é um resíduo de ácido graxo ou -OH, e R3 é um -H ou composto contendo nitrogênio colina (HOCH2CH2N+(CH3)3OH-), ehanolamina (HOCH2CH2NH2), inositol ou serina. R1 e R2 não podem simultaneamente ser OH. Quando R3 é um -OH, o composto é um diacilglicerofosfato, ao mesmo tempo em que quando R3 é um composto contendo nitrogênio, o composto é um fosfatídeo tal como lecitina, cefalina, fosfatidil serina ou plasmalogênio.

[0014] Um "éter fosfolipídio" como usado aqui se refere a um fos- folipídio tendo uma ligação de éter na posição 1 do esqueleto glicerol. Exemplos de fosfolipídiosde éter incluem, porém não estão limitados à alquilacilfosfatidilcolina (AAPC), liso-alquilacilfosfatidilcolina (LAAPC), e alquilacilfosfatidiletanolamina (AAPE). Um "fosfolipídio de não éter" é um fosfolipídio que não tem uma ligação de éter na posição 1 do esqueleto glicerol.

[0015] Como usado aqui, o termo "ácido graxo ômega-3" se refere a ácidos graxos poli-insaturados que têm a ligação dupla final na cadeia hidrocarboneto entre o terceiro e quarto átomos de carbono da extremidade metila da molécula. Exemplos não limitardes de ácidos graxos ômega 3 incluem, ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (EPA), ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexanoico (DHA) e ácido 7,10,13,16,19- docosapentanoico (DPA).

[0016] Como usado aqui, os termos "triacilglicerídeo" "triglicerídeo" e "triacilglicerol" e "TAG" referem-se a um éster derivado de glicerol e três ácidos graxos, em que o "ácido graxo" se refere a um ácido car- boxilico com uma cauda (cadeia) alifática não ramificada longa, que é saturada ou insaturada. Ácido palmítico é um exemplo não limitante de um triacilglicerídeo.

[0017] Como usado aqui, os termos "% de peso/peso (peso/peso) "e "peso/peso em %" e equivalentes gramaticais referem-se à quantidade (porcentagem) de uma determinada substância em uma composição em base de peso:peso. Por exemplo, uma composição compreendendo 50% de peso/peso de fosfolipídios significa que a massa dos fosfolipídios é de 50% da massa total da composição (isto é, 50 gramas de fosfolipídios em 100 gramas da composição, tal como um óleo).

[0018] Como usado aqui o termo "algas" se refere a um organismo unicelular ou multicelular anteriormente classificado como plantas, que ocorre em água salgada ou doce, autotrófico ou heterotrófico, porém que não tem troncos, raízes, e folhas reais. Como usado aqui o termo "heterotrófico" se refere a um organismo que não pode sintetizar seu próprio alimento e é dependente de substâncias orgânicas (por exemplo, substâncias orgânicas complexas e/ou simples) para nutrição. Desse modo, o termo "algas heterotróficas" refere-se às algas que não podem sintetizar seu próprio alimento e é dependente de substâncias orgânicas para a nutrição. Como usado aqui, o termo "autotrófico" se refere a um organismo capaz de sintetizar seu próprio alimento a partir de substâncias inorgânicas, usando energia química ou luz. O uso do termo "algal" também se refere às microalgas e desse modo abrange o significado de "microalgal". O termo "composição de água" se refere a qualquer composição que compreende algas, tal como uma composição aquática, e não está limitada ao corpo de água ou à cultura em que as algas são cultivadas. Uma composição de alga pode ser uma cultura de alga, biomassa de alga, uma cultura de alga concentrada, ou uma massa desidratada de algas, e pode estar em uma forma líquida, semissólida, ou sólida. Uma composição de alga não líquida pode ser descrita em termos de nível de umidade ou porcentagem em peso dos sólidos. Uma "cultura de algas" é uma composição de algas que compreende algas vivas. O termo "algas" inclui macroalgas (co- mumente conhecidas como alga marítima) e microalgas.

[0019] Como usado aqui, os termos "biomassa de alga" ou "biomassa" se refere a uma coleção ou massa de células de alga desenvolvidas em uma determinada ou ecossistema em um determinado momento. A área ou ecossistema pode ser um ambiente de ocorrência natural (por exemplo, corpo de água) ou um ambiente sintético (por exemplo, em um fermentador ou biorreator (por exemplo, aberto ou fechado)).

[0020] Como usado aqui, o termo "gordura total" se refere à soma de triglicerídeos, fosfolipídios, éster de cera, e esteróis presentes em um material. Por exemplo, teor de "gordura total" de uma biomassa de alga se refere à soma de triglicerídeos, fosfolipídios, éster de cera, e esteróis presentes na biomassa. Além disso, a gordura total inclui gorduras tanto saturadas quanto insaturadas.

[0021] Como usado aqui, o termo "conservante" se refere a um agente que prolonga a vida de armazenagem de produtos alimentícios e não alimentícios retardar ou impedir a deterioração de aroma, odor, cor, textura, aparência, valor nutritivo, ou segurança. Uma necessidade conservativa não fornece uma ação letal, irreversível resultando em incapacitação ou desctruição da célula microbiana parcial ou completa. Esterilizantes, desinfetantes, esporicidas, virucidas e agentes tubercu- locidais fornecem um modo irreversível de ação, algumas vezes referido como ação "bacteriana". Ao contrário, um conservante pode fornecer uma ação inibidora ou bacteriostática que é reversível, pelo fato de que os micróbios alvo podem resumir a multiplicação, se o conservante for removido. As principais diferenças entre um conservante e um desinfetante primeiramente envolvem o modo de ação (um conservante impede o desenvolvimento diferente de exterminar os microorganismos) e tempo de exposição (um conservante leva de dias a meses para agir enquanto um desinfetante leva pelo menos alguns minutos para agir).

[0022] Como usado aqui, o termo "levedura" e "células de levedura" se refere a micro-organismos eucarióticos classificados no reino dos fungos, tendo uma parede celular, membrana celular e componentes intracelulares. As leveduras não formam um agrupamento taxonô- mico ou filogenético específico. Atualmente cerca de 1.500 espécies são conhecidas; estima-se que apenas 1% de todas as espécies foi descrita. O termo "levedura" é frequentemente considerado como sinônimo para S. cerevisiae, porém a diversidade filogenética de leveduras é conhecida por seu deslocamento tanto nas divisões de As- comycota quanto Basidiomycota. As leveduras de brotamento ("leve-duras reais") são classificadas na ordem Saccharomycetales. A maioria das espécies de levedura se reproduz assexualmente por brotamento, embora algumas se reproduzam por fissão binária. Leveduras são unicelulares, embora algumas espécies tornem-se multicelulares através da formação de um filamento de células de brotamento conectadas conhecidas como pseudohyphae, ou false variar grandemente dependendo das espécies, tipicamente medindo 3 a 4 pm em diâmetro, embora alguma levedura possa alcançar acima de 40 pm.

[0023] Como usado aqui, os termos "levedura enriquecido por selênio" e "levedura selenizada" referem-se a qualquer levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) que é cultivada em um meio contendo sais de selênio inorgânicos. A presente invenção não está limitada pelo sal de selênio. De fato, uma variedade de sais de selênio é contemplada e deve ser útil na presente invenção incluindo, porém não limitada à selenita de sódio, selenato de sódio, selenita de selenita de colbato ou selenato de colbato. Selenometionina livre (por exemplo, não associada com uma célula ou levedura) pode também ser usada como uma fonte de selênio para levedura enriquecida por selênio visto que a levedura incorpora esta forma de selênio. Durante o cultivo, por causa da similaridade química entre selênio e enxofre, a levedura incorpora o selênio no lugar do enxofre em que são normalmente compostos orgânicos contendo enxofre dentro da célula. Um composto contendo selênio em tais preparações de levedura é selenometionina que estará presente em uma forma que é incorporada em polipeptí- deos/proteínas. A quantidade de total selênio celular presente na forma de selenometionina em tais preparações variarão, porém pode estar entre 10 e 100%, 20 a 60%, 50 a 75% e entre 60 e 75%. O restante do selênio orgânico em preparações de levedura selenizadas é predominantemente feito de intermediários na série de reação para bios- síntese de selenometionina. Estes incluem, porém não estão limitados a, selenocisteína, selenocistationina, selenohomoeisteína e seleno- adenosilselenometionina. A quantidade de sal de selênio inorgânico residual no produto finalizado é geralmente bastante baixa (< 2%). No entanto, a presente invenção não está limitada pela porcentagem, quando as preparações que contêm mais (por exemplo, entre 2 e 70%) ou menos (por exemplo, entre 0,1 e 2%) do que esta porcentagem são abrangidas pela invenção.

[0024] Como usado aqui, o termo "SEL-PLEX" se refere a uma levedura secada, enriquecida com selênio não viável (por exemplo, Sacchoromyces cerevisiae de número de acesso CNCM I-3060, Collection Nationale De Cultures De Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, Paris, França) cultivada em uma fermentação de alimentação em bateladas que fornece quantidades incrementais de sais de selênio e melaço de cana de uma maneira que minimiza os efeitos prejudiciais de sais de selênio na taxa de crescimento da levedura e fornece uma incorporação ideal de selênio inorgânico em material inorgânico celular. Selênio inorgânico residual é eliminado (por exemplo, usando rigoroso processo de lavagem) e não excede 2% do teor de selênio total.

[0025] Como usado aqui, o termo "selênio inorgânico" se refere a qualquer composto orgânico em que o selênio substitui o enxonfre. Desse modo, o selênio orgânico pode referir-se a qualquer tal composto biossintezado por levedura, ou pode refereir-se qos compostos de seleno orgânicos livres que são quimicamente sintetizados. Um exemplo do ultimo é seleno meti o nina livre.

[0026] Como usado aqui, o termo "selênio inorgânico" geralmente refere-se a qualquer sal de selênio (por exemplo, selenita de sódio, selenato de sódio, selenita de cobalto e selenato de cobalto). Existe também uma variedade de outras fontes de selênio inorgânico (veja, por exemplo, aquelas listadas no índice Merck). Levedura selenizada pode ser gerada usando uma fonte de selênio inorgânico incluindo, porém não limitada à selenita de sódio, selenato de sódio, selenita de cobalto, selenato de cobalto, ácido selênico, ácido selenoso, brometo de selênio, cloretos de selênio, hexafluoreto de selênio, óxido de selênio, oxibrometo de selênio, oxicloretos de selênio, oxifluoretos de selênio, sulfetos de selênio, tetrabrometo de selênio, tetracloretos de selênio e tetrafluoreto de selênio.

[0027] Como usado aqui, o termo "parede celular de levedura" também referido como "YCW" se refere à parede celular de um organismo de levedura que circunda a membrana de plasma e os componentes intracelulares da levedura. A parede celular da levedura inclui tanto a camada externa (principalmente manana) quanto a camada interna (principalmente glucano e quitina) da parede de célula de levedura. Uma função da parede celular é fornecer estrutura A funda pare- de celular é fornecer estrutura e proteger o citoplasma metabolicamen- te ativo. Séries de reação de sinalização e reconhecimento ocorrem na parede celular da levedura. A composição de célula levedura varia de linhagem para linhagem e de acordo com as condições de crescimento de levedura.

[0028] Como usado aqui, o termo "purificado" ou "para purificar" se refere à remoção de componentes de uma amostra. Por exemplo, paredes celulares de célula ou extratos de parede celular são purificadas por remoção de componentes de parede celular de não levedura (por exemplo, membrana de plasma e/ou componentes intracelulares de levedura); elas são também purificadas por remoção de contaminardes ou outros agentes diferentes da parede celular de levedura. A remoção de componentes de parede celular de não levedura e/ou contaminan- tes de parede celular de não levedura resulta em um aumento no percentual de parede celular de levedura ou componente da mesma em uma amostra.

[0029] Como usado aqui, o termo "in vivo" se refere aos estudos e/ou experimentos conduzidos em um organismo vivo, que ocorrem em um organismo biológico.

[0030] Como usado aqui, o termo "in vitro" se refere a um ambiente artificial for a do organismo vivo e a processos biológicos ou reações que normalmente ocorrem em um organismos, porém são feitas ocorrer em um ambiente artificial. Ambientes in vitro podem compreender, porém não estão limitados aos tubos de teste e cultura celular.

[0031] Como usado aqui, o termo "cromatografia líquida de alto desempenho" e o termo "HPLC" refere-se a uma forma de cromatografia líquida para separar os compostos. Os compostos são dissolvidos em solução. Os compostos são separados injetando-se um tampão da mistura de amostra na coluna. Os instrumentos de HPLC compreendem um reservatório de fase móvel, uma bomba, um injetor, uma co- luna de separação, e um detector. A presença de analitos no efluente da coluna é registrada detectando-se quantitativamente uma mudança no índice refrativo, a absorção de UV-VIS em um comprimento de onda fixo, fluorescência após excitação com um comprimento de onda adequado, ou resposta eletroquímica.

[0032] Como usado aqui, o termo "microscopia eletrônica de varredura" e o termo "SEM" refere-se a uso de um tipo de microscópio eletrônico que imagea a superfície da amostra varrendo-a com um feixe de energia elevada em um padrão de varredura raster. Os elétrons interagem com os átomos que prepararam a amostra produzindo sinais que contêm informação acerca da topografia de superfície da amostra, composição e outras propriedades tal como a condutividade elétrica.

[0033] Como usado aqui, o termo "agente de fixação" se refere a um produto químico que é capaz de fixar uma substância à outra a fim de "fixar", estabilizar, ou de outro modo preservar a substância em sua forma atual para prevenir a substância de degradar ou de outro modo mudar. Frequentemente, agentes de fixação são usados na microscopia eletrônica de varredura (SEM) para preparar a amostra. Agente de fixação primária: como usado aqui, os termos "agentes de fixação primários" se referem a um agente de fixação usado para "fixar" uma substância. Agente de fixação secundário: como usado aqui, o termo "agente de fixação secundário" se refere ao segundo agente de fixação usado para "fixar" uma substância. Agente de fixação terciário: como usado aqui, o termo "agente de fixação terciário" se refere ao terceiro agente de fixação usado para "fixar" uma substância.

[0034] Como usado aqui, o termo "analito" se refere a um átomo, uma molécula, um agrupamento de átomos e/ou moléculas, uma substância, ou constituinte químico. Um analito, em e do próprio não pode ser medido; de preferência, aspectos ou propriedades (físicas, quími cas, biológicas, etc.) do analito podem ser determinados usando um procedimento analítico, tal como HPLC. Por exemplo, alguém não pode medir a "cadeira" (componente de analito) em e do próprio, porém, a altura, diâmetro, etc. de uma cadeira pode ser medida. Igualmente, alguém não pode medir uma micotoxina, porém pode medir a fluorescência de micotoxina que é relacionada à sua concentração.

[0035] Como usado aqui, o termo "sinal" é geralmente usado em referência a qualquer processo detectável que indica que uma reação ocorreu (por exemplo, ligação de anticorpo ao antígeno). Os sinais podem ser avaliados qualitativamente bem como quantitativamente. Exemplos de tipos de "sinais" incluem, porém não estão limitados aos sinais radioativos, sinais fluo ri métricos ou sinais de produto/reagente colori métrico.

[0036] Como usado aqui, o termo "biodisponibilidade" se refere à fração de uma molécula ou componente que é disponível para um organismo ou alcança a circulação sistêmica. Quando uma molécula ou componente é administrada intravenosamente, sua biodisponibilidade é de 100%. No entanto, quando uma molécula ou componente é administrada por meio de outras rotinas (tal como oralmente), sua biodisponibilidade diminui (devido à absorção incompleta e metabolismo de primeira passagem). Em um parâmetro nutricional, biodisponibilidade se refere às taxas de absorção e utilização de um nutriente. Diferentes formas do mesmo nutriente, por exemplo, podem ter diferentes biodis- ponibilidades.

[0037] Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" se refere à quantidade de uma composição suficiente para realizar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada e/ou combinada com outro material em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se destina a ser limitada a uma formulação ou rotina de administração particular.

[0038] Como usado aqui, o termo "digestão" se refere à conversão de alimento, gêneros alimentícios, ou outros compostos orgânicos em forma absorvível; para amolecer, decompor, ou quebrar por aquecimento e umidade ou ação química.

[0039] Como usado aqui, "sistema digestivo" se refere a um sistema (incluindo o sistema gastrointestinal) em que a digestão pode ou não ocorrer.

[0040] Como usado aqui, o termo "produtos alimentícios" se refere um material(s) que é(são) consumido por mamíferos (por exemplo, seres humanos e animais) e contribui energia e/ou nutrientes para uma dieta de mamífero. Exemplos de produtos alimentícios, porém não estão limitados à Ração Mista Total (TMR), forragem(s), pélete(s), concentrado^), pré-mistura(s) coproduto(s), grão(s), grão(s) de destilaria, melaço, fibra(s), forragem(ns), gramínea(es), feno, cereal(s), folhas, farinha grossa, solúvel(s), e suplemento(s).

[0041] Como usado aqui, os termos "suplemento alimentício" "suplemento dietético" "composição de suplemento dietético" e similares se referem a um produto alimentício formulado como um suplemento dietético ou nutricional a ser usado como parte de uma dieta. Composições de suplemento dietético exemplares são descritas aqui.

[0042] Como usado aqui, o termo "animal" se refere àqueles do reino Animalia. Este inclui, porém não está limitada a gado, animais de fazenda, animais domésticos, animais de estimação, animais marinhos e de água doce, e animais selvagens.

[0043] Como usado aqui, os termos "administração" e o termo "administrando" se referem à ação de fornecer uma substância, incluindo um fármaco, profármaco, ou outro agente, ou tratamento terapêutico a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo ou células, tecidos ou órgãos in vivo, in vitro, ou ex vivo). Rotinas exemplares de administração podem ser através dos olhos (oftálmica), boca (oral), pele (tópica ou transdérmica), nariz (nasal), pulmões (inalantes), mucosa oral (bucal), ouvido, retal, vaginal, por injeção (por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente, intratumoralmente, intraperitonealmente, etc.) e similares.

[0044] Como usado aqui, o termo "coadministração" e o termo "coadministrando" se refere à administração de pelo menos dois agen- te(s) ou terapias a um indivíduo e/ou material (por exemplo, produto alimentício). A coadministração de dois ou mais agentes ou terapias pode ser concurrente, ou um primeiro agente/terapia pode ser administrado antes de um segundo agente/terapia.

[0045] Como usado aqui, o termo "tratamento" se refere às medidas tomadas que facilitam a melhora e/ou reversão dos sintomas de doença. O termo "tratamento" se refere tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas. Por exemplo, indivíduos que podem se beneficiar do tratamento com composições e métodos da presente invenção incluem aqueles já com uma doença e/ou distúrbio bem como àqueles em que uma doença e/ou distúrbio deve ser prevenida (por exemplo, usando um tratamento profilático da presente invenção).

[0046] Como usado aqui, o termo "em risco quanto à doença" se refere a um indivíduo que é predisposto a experimentar uma doença particular. Esta predisposição pode ser genética (por exemplo, uma tendência genética particular para experimentar a doença, tal como distúrbios hereditários), ou devido a outros fatores (por exemplo, idade, peso, condições ambientais, exposições a compostos nocivos presentes no ambiente, etc.).

[0047] Como usado aqui, o termo "doença", o termo "infecção" e o termo "resposta ou condição patológica" refere-se a um estado, sinais, e/ou sintomas que são associados com um comprometimento do estado normal de um animal vivo ou de qualquer um de seus órgãos ou tecidos que interrompe ou modifica o desempenho das funções normais, e pode ser uma resposta aos fatores ambientais (tais como má nutrição, riscos industriais, ou clima, incluindo micotoxicose), agentes infecciosos específicos (tais como vermes, bactérias, ou viruses), ao defeito inerente do organismo (tal como várias anomalias genéticas), ou combinações daqueles e outros fatores.

[0048] Como usado aqui, o termo "sofrendo de doença" se refere a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo animal ou ser humano) que está experimentando uma doença particular e não está limitada a quaisquer sinais ou sintomas, ou doenças particulares.

[0049] Como usado aqui, o termo "tóxico" se refere a qualquer efeito(s) nocivo, deletério, prejudicial, ou de outro modo negativo em um indivíduo, uma célula, ou tecido em comparação com a mesma célula ou tecido antes de contatar ou da administração da toxi- na/toxi cante.

[0050] Como usado aqui, o termo "composição farmacêutica" se refere à combinação de um agente ativo com um veículo, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0051] Como usado aqui, o termo "farmaceuticamente aceitável" e o termo "farmacologicamente aceitável" se referem às composições que não substancialmente produzem reações adversas mais conhecidas do que as reações benéficas conhecidas.

[0052] Como usado aqui, o termo "inoculação" se refere à ação de introduzir um micro-organismo ou suspensão de micro-organismos (por exemplo, algas, levedura, fungos, bactérias, etc.) em um meio de cultura. A inoculação é a ação ou processo de introdução de qualquer coisa em um ambiente em que ele se desenvolverá ou reproduzirá.

[0053] Como usado aqui, o termo "inoculo" e o termo "pré-inóculo" refere-se às células usadas em uma inoculação, tal como células adi- cionadas para iniciar uma cultura.

[0054] Como usado aqui, o termo "centrifugação" se refere à separação de moléculas por tamanho ou densidade usando forças centrífugas geradas por um motor giratório que coloca um objeto em rotação em torno de um eixo fixo. A centrífuga funciona usando o princípio de sedimentação, onde a aceleração centrípeta é usada para eventualmente distribuir substâncias de densidade maior e menor em diferentes camadas de densidade.

[0055] Como usado aqui, o termo "concentração" se refere à quantidade de uma substância por espaço definido. A concentração geralmente é expressa em termos de massa por unidade de volume. Para diluir uma solução, alguém deve adicionar mais solvente, ou reduzir a quantidade de soluto (por exemplo, por evaporação seletiva, secagem por spray, secagem por congelamento, por exemplo, o extrato de parede de célula de levedura concentrado ou extrato de parede de célula de levedura modificada concentrado). Ao contrário, para concentrar uma solução, alguém deve adicionar amis soluto, ou reduzir a quantidade de solvente.

[0056] Como usado aqui, o termo "camada" se refere a um depósito geralmente horizontal organizado em estrato de um material formando uma parte sobrejacente ou segmento obtido após separação por centrifugação em relação com as propriedades de densidade do material.

[0057] Como usado aqui, o termo "colheita" se refere à ação de colher ou introduzir juntamente os materiais que foram produzidos (por exemplo, bintroduzir juntamente os materiais produzidos durante a produção de levedura).

[0058] Como usado aqui, o termo "secagem" se refere à secagem por spray, secagem por ar, secagem a vácuo e outra espécie de processo que reduz ou elimina o líquido em uma substância.

[0059] Como usado aqui, o termo "secagem por spray" se refere a um método comumente usado de secagem de uma substância contendo líquido usando gás quente para evaporar o líquido para reduzir ou eliminar o líquido na substância. Em outras palavras, o material é secado por meio de vaporização ou atomização em uma corrente de ar seco aquecido.

[0060] Como usado aqui, o termo "secagem por congelamento" e o termo "liofilização" e o termo "criodessecação" refere-se à remoção de um solvente da substância em um estado congelado por sublimação. Isto é realizado por congelamento do material a ser secado abaixo de seu ponto eutético e em seguida fornecendo o aquecimento latente de sublimação. O controle preciso de entrada de calor permite secagem do estado de congelamento sem o produto derreter novamente. Em aplicação prática, o processo é acelerado e precisamente controlado sob condições de pressão reduzida.

[0061] Como usado aqui, o termo "pó de fluxo livre seco" se refere a um pó seco de fluxo livre, por exemplo, um pó que pode ser vertido de um recipiente, bolsa, vasso, etc., sem impedimento de grandes grumos.

[0062] Como usado aqui, o termo "moagem" se refere à redução de tamanho de partícula por impacto, cisalhamento, ou atrito.

[0063] Como usado aqui, o termo "amostra" é usado em um amplo sentido incluindo um espécime ou cultura obtida de qualquer fonte, bem como amostras biolpogicas e ambientais. Amostras biológicas podem ser obtidas de animais (incluindo humanos) e abrange fluidos, sólidos, tecidos, e gases. As amostras biológicas incluem produtos sanguíneos, tais como plasma, soro e similares. Amostras ambientais incluem tais como amostras de material de superfície, solo, água, cristais e industriais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0064] Esta invenção se refere às composições compreendendo algas com alto teor de lipídio e métodos de preparação e utilização das mesmas. Em particular, a invenção se refere à biomassa de algas com alto teor de lipídio e materiais de lipídio de alga derivados da mesma, métodos de preparar a mesma, bem como aos biocombustíveis (por exemplo, biodiesel) e composições dietéticas (por exemplo, alimentações animais) compreendendo ou feitas dos mesmos. Composições e métodos da invenção encontram uso em uma variedade de aplicações incluindo biocombustível, dietéticas (por exemplo, nutrição humana e animal), terapêuticas, bem como pedidos de pesquisa.

[0065] Consequentemente, em um aspecto da invenção, é fornecido um processo para a preparação de uma biomassa de alga contendo quantidades elevadas (por exemplo, em uma base de pe- so/peso) de gordura total. Por exemplo, como descrito aqui, em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo uma desejada, nível elevado de teor de gordura total (por exemplo, mais do que 60% de gordura total, ao contrário de métodos convencionais que geram biomassa de alga contendo um nível significantemente menor de teor de gordura total (por exemplo, 60% ou menos de gordura total)). Um desafio maior de bio-combustível com base em alga (por exemplo, biodiesel) é assegurar que a biomassa não seja feita às custas de mais energia do que é obtido no produto de combustível final. Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo mais do que 65% de gordura total. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo mais do que 66% de gordura total. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo mais do que 67% de gordura total. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo mais do que 68% de gordura total. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo mais do que 69% de gordura total. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo mais do que 70% de gordura total. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de geração de uma biomassa de alga contendo mais do que 70% (por exemplo, mais do que 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90% ou mais) gordura total em uma base de peso/peso. Em algumas modalidades, o método utiliza um sistema de biorreator fechado (por exemplo, um fermentador), embora a invenção não seja limitada desse modo (por exemplo, em algumas modalidades, biorrea- tores abertos podem ser utilizados). Em uma modalidade preferida, o cultivo de uma biomassa de alga da invenção é conduzido sob condições assépticas. Em outra modalidade preferida, as algas são cultivadas (por exemplo, para gerar uma biomassa de alga contendo um alto teor de gordura (por exemplo, mais do que 67% de gordura)) em um processo de alimentação em bateladas.

[0066] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de cultivo de algas para produzir uma biomassa de alga compreendendo um teor elevado de gordura total desejado (por exemplo, 67% ou mais de gordura total) como descrito nos exemplos 1 e 2. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção fornece um método de cultivo de algas compreendendo cultivar as algas de uma maneira em etapas a fim de produzir uma biomassa de alga compreendendo um teor elevado de gordura total, desejado (por exemplo, 67% ou mais de gordura total). Em algumas modalidades, um processo em etapas para cultivo de algas compreende descongelar uma linhagem armazenada de algas e adicionar (por exemplo, assepticamente) as algas descongeladas a para um frasco de agitação de 1L contendo algas e meio compreendendo uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), extrato de levedura e sal marinho. Em algumas modalidades, a fonte de carbono está presente em uma concentração de 50 g/L, o extrato de levedura está presente em uma concentração de 10 g/L e/ou do sal marinho está presente em uma concentração de 4 g/L. Em algumas modalidades, o frasco de agitação de 1L contendo algas e meio é mantido a 30 C e agitado (por exemplo, a cerca de 100- 400 RPM) até tal tempo que as algas tenham entrado na fase de crescimento exponencial, porém não tenham depauperado totalmente a fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)). Os experimentos conduzidos durante o desenvolvimento das modalidades da invenção determinaram que as algas entram em crescimento exponencial, porém não depauperam totalmente a fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)) em um período de tempo entre 72 a 144 horas. Desse modo, em algumas modalidades, algas cultivadas em um frasco de cultura de 1L a 30 C durante 72 a 144 horas a cerca de 100-400 RPM (por exemplo, 250 RPM) em meio compreendendo uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), extrato de levedura e sal marinho são usadas para inocular um primeiro estágio de cultura de semente (por exemplo, em um vaso grande (por exemplo, vaso de 40, 27 ou 18 L)). Em algumas modalidades, o meio de cultura usado in a primeiro estágio de semente compreende uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), extrato de levedura, sulfato de magnésio, cloreto de cálcio e/ou cloreto de magnésio. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura usado in a primeiro estágio de semente compreende cerca de 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e/ou 0,15 g/L de cloreto de magnésio. Em algumas modalidades, o primeiro es- tágio de cultura de semente é realizado a 30 C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a cerca de 7- 15% (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%), embora condições de oxigênio dissolvido menores e maiores possam ser utilizadas. Em uma modalidade preferida, o primeiro estágio de cultura de semente é realizado a 30 C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a cerca de 10%. Em algumas modalidades, o primeiro estágio de cultura de semente contendo algas e meio é mantido a 30 C e cultivado até tal tempo em que as algas tenham entrado na fase de crescimento exponencial e pelo menos 20 g/L de fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)) foram consumidos, porém a fonte de carbono não foi totalmente depauperada. Experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da inven-ção determinam que as algas entram em crescimento exponencial, consumem pelo menos 20 g/L de fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)) porém não depauperam totalmente a fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)) em um período de tempo entre 24 a 48 horas após inoculação do primeiro estágio de cultura de semente. Em algumas modalidades, algas cultivadas no primeiro estágio de cultura de semente a 30 C durante 24 a 48 horas em meio compreendendo uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), extrato de levedura, sulfato de magnésio, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio são usadas para inocular um segundo estágio de cultura de semente em ainda um vaso grande (por exemplo, vaso de 2000 L). Em algumas modalidades, o meio de cultura usado em um segundo estágio de cultura de semente compreende uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), extrato de levedura, sulfato de magnésio, cloreto de cálcio e/ou cloreto de magnésio. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura usado em um segundo estágio de cultura de semente compreende cerca de 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e/ou 0,15 g/L de cloreto de magnésio. Em algumas modalidades, o segundo estágio de cultura de semente é realizado a 30 C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a cerca de 7 a 15% (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%), embora condições de oxigênio dissolvido inferiores ou maiores possam ser utilizadas. Em uma modalidade preferida, o segundo estágio de cultura de semente é realizado a 30 C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a cerca de 10%. Em algumas modalidades, o segundo estágio de cultura de semente contendo algas e meio é mantido a 30 C e cultivado até tal tempo em que as algas entraram na fase de crescimento exponencial, e pelo menos 20 g/L de fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)) foram consumidos, porém a fonte de carbono não foram totalmente depauperados. Experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção determinam que as algas entram em crescimento exponencial, consumem pelo menos 20 g/L de fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), porém não depauperam totalmente a fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)) em um período de tempo entre 24 a 48 horas após inoculação do segundo estágio de cultura de semente. Em algumas modalidades, algas cultivadas no segundo estágio de cultura de semente a 30 C durante 24 a 48 horas em meio compreendendo uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), extrato de levedura, sulfato de magnésio, cloreto de cálcio e cloreto de magnésio são usadas para inocular um vaso de grande escala (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 220.000 L ou maior (por exemplo, um fermentador principal)) contendo meio usado para outro cultivo/fermentação das algas. Em algumas modali dades, na transferência do segundo estágio de cultura de semente para o vaso de grande escala (por exemplo, fermentador principal), o meio de cultura (por exemplo, o meio em bateladas) presente no vaso de grande escala (por exemplo, fermentador principal) compreende uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), extrato de levedura, sulfato de magnésio, ureia, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio e/ou fosfato de monopotássio. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura usado em uma cultura de grande escala (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 220.000 L ou maior (por exemplo, fermentador principal)) compreende cerca de 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 4,0 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 1 g/L de ureia, cerca de 2 g/L de cloreto de cálcio, cerca de 2 g/L de cloreto de magnésio e/ou cerca de 0,25 g/L de fosfato de monopotássio, Em algumas modalidades, a cultura em grande escala é realizada a 30 C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a cerca de 7-15% (por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%), embora condições de oxigênio dissolvido inferiores ou maiores possam ser utilizadas. Em uma modalidade preferida, a cultura em grande escala é realizada a 30 C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a cerca de 10%. Em uma modalidade preferida, a fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)) é mantida a 10 g/L durante um período de tempo (por exemplo, 1 ou mais dias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais dias (por exemplo, usando um processo de alimentação em bateladas)). Por exemplo, em algumas modalidades, após uma quantidade desejada de glicose ser consumida por algas no vaso de grande escala (por exemplo, após cerca de 20 a 30 g/L de glicose foram consumidos pelas algas no vaso de grande escala (por exemplo, após 30 g/L de glicose foram consumidos)), glicose e forne- cimento de alimentação em bateladas são iniciadas. Experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção determinam que os suprimentos de alimentação em bateladas sejam adicionados durante cerca de 34 horas, embora períodos de tempo mais curtos (por exemplo, cerca de 32, 28, 24, 20 horas ou menos) e mais longos (por exemplo, 36, 38, 42, 46, 60 , 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 horas ou mais) possam ser usados. Em outras modalidades preferidas, na conclusão do processo de alimentação em bateladas, o cultivo das algas é continuado nos vasos de grande escala até todos os nutrientes serem removidos/consumidos do meio. Experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção determinam que os nutrientes são depauperados do meio entre cerca de 12 e 24 horas após a cessação do processo de alimentação em bateladas. Em algumas modalidades, a biomassa de alga é colhida do meio/caldo de cultura em grande escala e utilizada como descrito aqui. Em algumas modalidades, o caldo de cultura em grande escala é centrifugada para obter a biomassa de alga. Em algumas modalidades, o caldo de cultura em grande escala é resfriado antes da centrifugação. Embora um entendimento de um mecanismo não seja necessário para praticar a invenção, e a invenção não está limitada a qualquer mecanismos de ação particular, em algumas modalidades, o resfriamento do caldo de cultura aumenta a densidade da biomassa de alga compreendendo níveis elevados de gordura total (por exemplo, lipídios/óleo) e permite uma recuperação da massa maior do que é obtido na ausência do resfriamento do caldo de cultura (veja, por exemplo, exemplo 3). A invenção não está limitada pela temperatura a qual a cultura em grande escala é resfriada antes da centrifugação. Em algumas modalidades, a cultura em grande escala é resfriada para uma temperatura entre 0 a 50 C, entre 5 a 40 C, 5 a 25 C, 5 a 15 C ou 5 a 10 C.

[0067] Desse modo, a invenção utiliza tanto os modos de batelada quanto alimentação em bateladas de cultura de algas (por exemplo, sozinha e/ou subsequente a um primeiro e/ou segundo estágio de semente) a fim de gerar uma biomassa de alga que contém um teor de gordura desejado (por exemplo, um teor de gordura maior do que 67%). A invenção não está limitada pelos componentes individuais presentes nos meios usados ou nos modos de batelada ou alimentação em bateladas. Em algumas modalidades, os meios de cultura presentes no momento da inoculação de um fermentador principal (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 220.000 L) contêm o meio com uma relação inicial de nitrogênio (N):fósforo (P):potássio (K) de 46:13:8.5. Em uma modalidade preferida, a relação de N:P:K é igual nos modos de cultura em batelada e alimentação em bateladas. Em algumas modalidades, a relação de magnésio (Mg):cálcio (Ca) é 3:1 nos meios de cultura usados tanto nos modos em batelada quanto alimentação em bateladas. Em outra modalidade, a relação de cloretos (CI2):sulfato (SO4)) é 1:1 nos meios de cultura usados tanto nos modos em batelada quanto alimentação em bateladas. Em algumas mo-dalidades, a relação de sulfato (SO4):fosfato (PO4) nos meios no momento de inoculação de um fermentador principal (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 220.000 L) é 16:1. Em algumas modalidades, a relação total de sulfate (SO4):fosfato (PO4) que foi produzida em batelada e alimentada no término de uma cultura completa (por exemplo, incluindo inoculo, primeiro estágio de semente, segundo estágio de semente e principais culturas fermentadoras) que gera uma biomassa de alga contendo um teor de gordura desejado (por exemplo, mais do que 67% de gordura) é 5.3:1. Em algumas modalidades, a relação de cloretos (CI2):fosfato (PO4) nos meios no momento de inoculação de um fermentador principal (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 220.000 L) é de 16:1. Em algumas modalidades, a relação total de clo retos (CI2):fosfato (PO4) que foi produzida em batelada e alimentada no término de uma cultura completa (por exemplo, incluindo inoculo, primeiro estágio de semente, segundo estágio de semente e principais culturas fermentadoras) que gera uma biomassa de alga contendo um teor de gordura desejado (por exemplo, mais do que 67% de gordura) é de 5.3:1.

[0068] Como descrito no exemplo 2 abaixo, a invenção também fornece uma composição compreendendo uma biomassa de alga (por exemplo, a biomassa de alga seca (por exemplo, gerada de acordo com um método descrito aqui)) contendo uma quantidade de gordura total desejada e/ou outro componentes. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção fornece uma biomassa de alga (por exemplo, uma biomassa seca) contendo mais do que 67% de gordura total (por exemplo, mais do que cerca de 68% de gordura total, mais do que cerca de 69% de gordura total, mais do que cerca de 70% de gordura total, mais do que cerca de 71% de gordura total, mais do que cerca de 72% de gordura total, mais do que cerca de 73% de gordura total, mais do que cerca de 74% de gordura total, mais do que cerca de 75% de gordura total, mais do que cerca de 76% de gordura total, mais do que cerca de 77% de gordura total, mais do que cerca de 78% de gordura total ou quantidade maior de gordura total). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga (por exemplo, contendo mais do que 67% de gordura total) é secada de modo que a biomassa contenha menos do que 5% de umidade (por exemplo, menos do que 4,5% de umidade, menos do que 4% de umidade, menos do que 3,5% de umi-dade, menos do que 3% de umidade, menos do que 2,5% de umidade, menos do que 2% de umidade, ou menos do que 1,5% de umidade). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém cerca de 170 a 250 mg/g ou mais de ácido docosahexae- noico (DHA) (por exemplo, cerca de 170 a 180 mg/g de DHA, cerca de 180 a 190 mg/g de DHA, cerca de 190 a 200 mg/g de DHA, cerca de 200 a 210 mg/g de DHA, cerca de 210 a 220 mg/g de DHA, cerca de 220 a 230 mg/g de DHA, cerca de 230 a 240 mg/g de DHA, cerca de 240 a 250 mg/g de DHA, ou mais do que 250 mg/g de DHA). Em al gumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém cerca de 150 a 400 mg/g ou mais de ácido palmítico (nome IUPAC: ácido hexadecanoide (por exemplo, cerca de 150 a 200 mg/g, cerca de 200 a 225 mg/g, cerca de 225 a 250 mg/g, cerca de 250 a 275 mg/g, cerca de 275 a 300 mg/g, cerca de 300 a 325 mg/g, cerca de 325 a 350 mg/g, cerca de 350 a 375 mg/g, cerca de 375 a 400 mg/g, ou mais do que 400 mg/g)). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém cerca de 300 a 600 mg/g ou mais de ácidos totalmente graxos (por exemplo, cerca de 300 a 350 mg/g, cerca de 350 a 400 mg/g, cerca de 400 a 450 mg/g, cerca de 450 a 500 mg/g, cerca de 500 a 550 mg/g, cerca de 550 a 600 mg/g, ou mais do que 600 mg/g de ácidos graxos)). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga da invenção (por exemplo, uma biomassa seca contendo menos do que 5% de umidade) contém menos do que cerca de 15% de proteína (por exemplo, menos do que cerca de 14% de proteína, menos do que cerca de 13% de proteína, menos do que cerca de 12% de proteína, menos do que cerca de 11% de proteína, menos do que cerca de 10% de proteína, menos do que cerca de 9% de proteína, ou menos do que cerca de 8% de proteína).

[0069] A invenção não está limitada pela linhagem ou espécie de algas utilizadas nos métodos e composições descritas aqui. De fato, uma variedade de algas encontra uso na invenção incluindo, porém não limitada a uma ou mais espécies do gênero Thraustochytrium. Em algumas modalidades, as algas são de uma espécie do gênero Chlore- lla. Em algumas modalidades, as algas são de uma espécie do gênero Schizochytrium. Em algumas modalidades, as algas são de uma espécie do gênero Crypthecodinium. Em algumas modalidades, as algas são Thraustochytrium striatum, Thraustochytríum roseum, Thrausto- chytríum aureum, Crypthecodinium cohnii, e/ou Aurantiochytrium sp. Em uma modalidade preferida, Schizochytrium limacinum é utilizada nos métodos e composições descritas aqui. A invenção não está limitada pelo tipo de lípidios produzidos por um processo para gerar uma biomassa de alga com níveis elevados de lipídios descritos aqui. Em algumas modalidades, os lipídios gerados por um processo da invenção incluem, porém não estão limitados ao ácido mirístico, ácido pal- mítico, ácido oléico, ácido linoleico, ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), e ácido esteárico. Estes lipídios foram úteis tanto para a saúde animal quanto humana, para a prevenção de várias doenças tais como doenças cardiovasculares e inflamatórias e em nutrição infantil para desenvolvimento cerebral e visão retinal apropriados em crianças.

[0070] Em outra modalidade, a invenção fornece um processo para a produção de uma biomassa de alga contendo níveis elevados (por exemplo, mais do que 67%) de gordura total de uma espécie de algas (por exemplo, Schizochytrium limacinum), em que o processo compreende cultivar algas em um primeiro vaso de alimentação em bateladas compreendendo o meio (por exemplo, compreendendo cerca de 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e/ou 0,15 g/L de cloreto de magnésio), transferir (por exemplo, assepticamente) a primeira cultura de alimentação em bateladas para um segundo meio de cultura de batelada de semente (por exemplo, compreendendo cerca de 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e/ou 0,15 g/L de cloreto de magnésio), transferir (por exemplo, asseptica- mente) a segunda cultura em batelada de sementes para um vaso de cultura de grande escala contendo meio (por exemplo, um fermentador principal (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 220,000 L, contendo, por exemplo, meio compreendendo cerca de 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 4,0 g/L de sulfato de magné-sio, cerca de 1 g/L de ureia, cerca de 2 g/L de cloreto de cálcio, cerca de 2 g/L de cloreto de magnésio e/ou cerca de 0,25 g/L de fosfato de monopotássio), em que o nível de glicose da cultura em vaso de grande escala é mantido a 10 g/L usando um processo de alimentação em bateladas, em que as células de alga são colhidas da cultura em grande escala entre 12 a 24 horas após a cessação do processo de alimentação em bateladas após todos os nutrientes terem sido removi- dos/consumidos do meio.

[0071] Outra modalidade da invenção fornece um processo para a produção de uma biomassa de alga contendo níveis elevados (por exemplo, mais do que 67%) de gordura total de uma espécie de algas (por exemplo, Schizochytríum limacinum), em que o meio de cultura (por exemplo, durante cada estágio de fermentação (por exemplo, primeiro estágio de semente, segundo estágio de semente e/ou cultura em batelada (alimentação em bateladas) estágio de cultivo)) compreende uma fonte de carbono (por exemplo, um açúcar), extrato de levedura, uma fonte de fosfato (por exemplo, fosfato de monopotássio, sul-fato de magnésio e/ou sulfato de zinco), uma fonte de nitrogênio (por exemplo, ureia), cloreto de magnésio, e/ou cloreto de cálcio. Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um processo para a produ ção de uma biomassa de alga contendo níveis elevados (por exemplo, mais do que 67%) de gordura total de uma linhagem de algas em que o meio de cultura (por exemplo, durante cada estágio de fermentação (por exemplo, primeiro estágio de semente, segundo estágio de semente e/ou cultura em bateladas (alimentação em bateladas) estágio de cultivo)) compreende açúcar, extrato de levedura, fosfato de monopotássio, sulfato de magnésio, sulfato de zinco), ureia, cloreto de magnésio, e/ou cloreto de cálcio. No entanto, a invenção não está limitada pelo tipo de nutriente utilizado em um meio de cultura em que as algas são cultivadas. Em algumas modalidades, uma ou mais fontes de car-bono são adicionadas ao meio. Exemplos de fontes de carbono incluem, porém não estão limitados aos carboidratos tais como glicose, fru- tose, xilose, sacarose, maltose ou amido solúvel bem como ácido oléi- co, gorduras tais como óleo de soja, melaço, glicerol, manitol, e acetato de sódio, farinha de semente de algodão, glicerol, melaço e milhoci- na. Em algumas modalidades, uma ou mais fontes de nitrogênio são adicionadas ao meio. Exemplos de fontes de nitrogênio incluem, porém não estão limitados às fontes de nitrogênio naturais tais como peptona, extrato de levedura, extrato de malte, extrato de carne, ácido de casamino e milhocina, fontes de nitrogênio orgânicas tais como glu- tamato de sódio e ureia, ou fontes de nitrogênio inorgânicos tais como acetato de amónio, sulfato de amónio, cloreto de amónio, nitrato de amónio e sulfato de sódio. Em algumas modalidades, uma ou mais fontes de fosfato são adicionadas ao meio. Exemplos de fontes de fosfato incluem, porém não estão limitadas a fosfato de potássio e fosfato de di-hidrogênio de potássio, sais inorgânicos, tais como sulfato de amónio, sulfato de sódio, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de zinco, e sulfato de cobre. Em algumas modalidades, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, e/ou vitaminas são incluídos no meio de cultura.

[0072] A invenção não está limitada pela quantidade (por exemplo, concentração) de cada um destes componentes no meio de cultura. Em algumas modalidades, uma quantidade é utilizada que não é nociva ao cultivo de alga. Em uma modalidade preferida, a quantidade (por exemplo, concentração e/ou relação) de cada ingrediente de meio é fixada em um nível (por exemplo, durante cada estágio de fermentação (por exemplo, primeiro estágio de semente, segundo estágio de semente e/ou cultura em bateladas (alimentação em bateladas) estágio de cultivo) que promove a formação de algas com alto teor de gordura (por exemplo, uma biomassa de alga compreendendo 67% ou mais de teor de gordura). Em algumas modalidades, a fonte de carbono (por exemplo, açúcar) está presente no meio de cultura a cerca de 20 a 120 gramas por litro de meio. Em outras modalidades, a fonte de carbono (por exemplo, açúcar) está presente no meio de cultura a cerca de 30-70 gramas por litro de meio. Ainda em outras modalidades, a fonte de carbono (por exemplo, açúcar) está presente no meio de cultura em cerca de 40 a 60 gramas por litro de meio. Em uma modalidade preferida, a fonte de carbono (por exemplo, açúcar) está presente no meio de cultura em cerca de 50 gramas por litro de meio. Em algumas modalidades, a relação de ureia para fosfato de monopotássio (ureia:KH2PO4) é entre cerca de 5:0,1 (por exemplo, cerca de 4.5:0,1; 4:0,25; 3:0,25; 4:0,3; 5:0,3; 5:0,5; 4:0,5; 3:0,5; 2:0,5; ou 1:0,5); embora relações maiores e menores possam ser usadas (por exemplo, 1:1, 1:2, 1:3 etc.). Em uma modalidade preferida, a relação de ureia para fosfato de monopotássio no meio de cultura é de 4:1. Em algumas modalidades, um meio de cultura não contém cloretos de sódio. Em outras modalidades, um meio de cultura contém cloretos de sódio. Em algumas modalidades, a relação de sulfato de magnésio (MgSO4):cloretos de cálcio (CaCI2) é 1:1. Em algumas modalidades, a relação de sulfato de magnésio (MgSO4):cloretos de cálcio (CaCI2) é 1:2. De fato, uma variedade de relações de sulfato de magnésio (MgSO4):cloretos de cálcio (CaCI2) pode ser usada incluindo, porém não está limitada a 1:1; 1:1.125; 1:1.5; 1:1.75; 1:2; 1:2.125; 1:2.25; 1:2.5; 2.5:1; 2.25:1; 2.125:1; 2:1; 1.75:1; 1.5:1; 1.25:1 ou 1.125:1. Em uma modalidade preferida, a relação de sulfato de magnésio (MgSO4):cloretos de cálcio (CaCI2) em um primeiro meio de cultura de semente é de 1:1. Em outra modalidade preferida, a relação de sulfato de magnésio (MgS 04): cio retos de cálcio (CaCI2) em um segundo meio de cultura de semente é de 1:1. Ainda em outra modalidade pre-ferida, a relação de sulfato de magnésio (MgSO4):cloretos de cálcio (CaCI2) em um meio de cultura em grande escala (por exemplo, fer- mentador principal (por exemplo, vaso de 70.000 L, 120.000 L, 220.000 L) também referido como um terceiro meio de cultura aqui) é de 1:2.

[0073] Em uma outra modalidade preferida, após preparação do meio, o pH do meio não precisa ser ajustado. Por exemplo, durante um processo de fermentação em etapas da invenção, o pH do meio de cultura em que as algas são cultivadas não precisa ser ajustado. Embora um entendimento do mecanismo não seja necessário para praticar a invenção e a invenção não está limitada a qualquer mecanismo de ação particular, em algumas modalidades, condições estéreis e/ou assépticas do processo de fermentação em etapas da invenção negam a necessidade de ajustar o pH do meio de cultura durante a fermentação. Em algumas modalidades, o pH do meio de cultura está entre 4,0 e 6,5. O cultivo das algas durante um processo de fermentação em etapas da invenção pode ser realizado em uma temperatura entre 10 e 40 C., preferivelmente 17 a 35 C, e mais preferivelmente em torno de 30 C. O cultivo pode ser realizado por cultura por aeração- agitação, cultura por agitação, cultura estacionária e similares. Em uma modalidade preferida, as algas são cultivadas sob condições de modo que o oxigênio dissolvido seja mantido a ou levemente acima de 10%.

[0074] Em algumas modalidades, a invenção fornece um alimento, alimentação, suplemento nutricional ou terapêutico compreendendo toda ou uma porção de uma biomassa de alga (por exemplo, a biomassa de alga seca descrita aqui e/ou gerada de acordo com os métodos e composições descritos aqui) compreendendo níveis elevados (por exemplo, maior do que 67%) de gordura total. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção fornece um alimento, alimentação, suplemento nutricional ou terapêutico compreendendo a biomassa de alga seca por spray compreendendo níveis elevados (por exemplo, maiores do que os 67%) de gordura total. Em outras modalidades, a invenção fornece um alimento, alimentação, suplemento nutricional ou terapêutico compreendendo lipídios extraídos e/ou isolados de uma biomassa de alga compreendendo níveis elevados (por exemplo, maior do que os 67%) de gordura total. A invenção não está limitada pelo tipo de lipídio extraído e/ou isolado de uma biomassa de alga compreendendo níveis elevados (por exemplo, maiores do que os 67%) de gordura total. Em algumas modalidades, os lipídios compreendem ácido mirístico, ácido palmítico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido alfa- linolênico (ALA), ácido estearidônico (SDA), ácido eicosatrienoico, ácido eicosatetraenoico, ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosa- pentaenoico (DPA), ácido clupanodônico, ácido docosahexaenoico (DHA), ácido tetracosapentaenoico, e/ou ácido tetracosahexaenoico. Em uma modalidade preferida, os lipídios compreendem DHA e/ou ácido palmítico.

[0075] Em algumas modalidades, a invenção fornece um processo para a preparação de lipídios (por exemplo, aqueles descritos aqui (por exemplo, ácido docosahexaenoico)) compreendendo: cultura de linhagem de algas (por exemplo, Schizochytrium limacinum) em um primeiro meio de cultura (por exemplo, contendo 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), 10 g/L de extrato de levedura e 4 g/L de sal marinho) e incubar a cultura em uma temperatura na faixa de 25 a 35 C durante um período de cerca de 72- 144 horas; transferir a cultura para um segundo meio de cultura (por exemplo, contendo 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e/ou 0,15 g/L de cloreto de magnésio) e incubar a cultura em uma temperatura na faixa de 25 a 35 C durante um período de cerca de 24 a 48 horas; transferir a cultura para um terceiro meio de cultura (por exemplo, contendo 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 0,15 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 0,15 g/L de cloreto de cálcio e/ou 0,15 g/L de cloreto de magnésio) e incubar a cultura em uma temperatura na faixa de 25 a 35 C durante um período de cerca de 24 a 48 horas; transferir a cultura para um quarto meio de cultura (por exemplo, contendo 50 g/L de uma fonte de carbono (por exemplo, açúcar (por exemplo, glicose)), cerca de 7,5 g/L de extrato de levedura, cerca de 4,0 g/L de sulfato de magnésio, cerca de 1 g/L de ureia, cerca de 2 g/L de cloreto de cálcio, cerca de 2 g/L de cloreto de magnésio e/ou cerca de 0.25 g/L de fosfato de monopotássio) e incubar a cultura em uma temperatura na faixa de 25-35 C (por exemplo, 30 C) durante um período de tempo de cerca de 24-192 horas (por exemplo, cerca de 36, cerca de 38, cerca de 42, cerca de 46, cerca de 60 , cerca de 72, cerca de 84, cerca de 96, cerca de 108, cerca de 120, cerca de 132, cerca de 144, cerca de 156, cerca de 168, cerca de 180 ou cerca de 192 horas); separar a biomassa celular da cultura; e extrair os lipídios da biomassa.

[0076] Em algumas modalidades, culturas de algas (por exemplo, se desenvolvem para produzir uma biomassa de alga) são cultivadas em volumes e vasos adequados, variando de 100 ml a centenas de milhares de litros, em frascos ou grandes fermentadores, usando vários meios de nutriente como descrito aqui.

[0077] Ainda em outro aspecto, a separação da biomassa celular contendo lipídos é obtida usando técnicas de centrifugação, filtragem e/ou floculação ou similares. Em uma modalidade preferida, uma biomassa de alga é obtida de uma cultura usando centrifugação. Em uma outra modalidade preferida, a centrifugação ocorre após a cultura celular ser resfriada (por exemplo, para permitir a recuperação de células contendo níveis elevados de lipídio). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga obtida é secada por spray e usada (por exemplo, diretamente usadas em alimentações animais ou para produção de biocombustível).

[0078] Em uma modalidade, as algas são uma mistura de diferentes espécies de algas (por exemplo, uma ou mais das espécies de algas descritas aqui). Em algumas modalidades, uma biomassa de alga contendo níveis elevados de gordura total e/ou lipídios extraídos de uma biomassa de alga contendo níveis elevados de gordura total é suplementada com lipídios (por exemplo, ácidos graxos poli- insaturados) de outras fontes incluindo, porém não limitadas à fontes de planta.

[0079] Em algumas modalidades, uma biomassa de alga contendo níveis elevados de gordura total compreende lipídios em uma concentração (peso/peso) em uma faixa de cerca de 60-90% (por exemplo, cerca de 65 a 90%, cerca de 66 a 89%, cerca de 67 a 88%, cerca de 68 a 87%, cerca de 68 a 86%, cerca de 69 a 85%, ou cerca de 70 a 80%). Desse modo, uma biomassa de alga contendo níveis elevados de lipídios pode compreender lipídios em uma concentração de 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 8%2, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% e similares. Em uma modalidade, uma biomassa de alga contendo níveis elevados de gordura total compreende lipídios em uma concentração de pelo menos 67%.

[0080] Em algumas modalidades, DHA é incluído em uma composição de biomassa de alga da invenção em uma faixa de 1% a 75% de lipídios/ácidos graxos totais. Desse modo, o DHA pode ser fornecido na composição em uma quantidade de ácidos totalmente graxos de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, e similares. Em outras modalidades, o DHA pode ser incluído em uma composição em uma quantidade de ácidos totalmente graxos em uma faixa de 1% a 5%, 1% a 10%, 1% a 15%, 1% a 20%, 1% a 25%, 1% a 30%, 5% a 10%, 5% a 15%, 5% a 20%, 5% a 25%, 5% a 30%, 10% a 15%, 10% a 20%, 10% a 25%, 10% a 30%, 15% a 20%, 15% a 25%, 15% a 30%, 20% a 25%, 20% a 30%, 25% a 30%, 30% a 35%, 35% a 40%, 40% a 45%, 45% a 50%, 50% a 55%, 55% a 60%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 75%, e similares.

[0081] Em algumas modalidades, ácido palmítico é incluído em uma composição de biomassa de alga da invenção em uma faixa de 1% a 75% de lipídios/ácidos graxos totais. Desse modo, o ácido palmítico pode ser fornecido na composição em uma quantidade de ácidos totalmente graxos de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, e similares. Em outras modalidades, o ácido palmítico pode ser incluído em uma composição em uma quantidade de ácidos totalmente graxos em uma faixa de 1% a 5%, 1% a 10%, 1% a 15%, 1% a 20%, 1% a 25%, 1% a 30%, 5% a 10%, 5% a 15%, 5% a 20%, 5% a 25%, 5% a 30%, 10% a 15%, 10% a 20%, 10% a 25%, 10% a 30%, 15% a 20%, 15% a 25%, 15% a 30%, 20% a 25%, 20% a 30%, 25% a 30%, 30% a 35%, 35% a 40%, 40% a 45%, 45% a 50%, 50% a 55%, 55% a 60%, 60% a 65%, 65% a 70%, 70% a 75%, e similares.

[0082] Modalidades adicionais da invenção incluem processos de preparação de aditivos de alimentação animal. Desse modo, um aspecto da presente invenção é um processo de preparação de um aditivo de alimentação animal compreendendo lipídios de algas (por exemplo, uma biomassa de alga), o processo compreendendo: cultivar algas para produzir uma biomassa de algas contendo um nível de gordura total elevado, desejado (por exemplo, mais do que 67% de gordura total); e extrair lipídio de algas da biomassa de algas para produzir um óleo de algas; e/ou remover água de biomassa de algas para pro-duzir uma biomassa de algas com um teor de sólidos de cerca de 5% a 100% em peso; em que o aditivo de alimentação animal compreende lipídios das algas. Em algumas modalidades, os ácidos graxos coletados das algas são ácidos graxos ômega 3 de cadeia curta, média ou longa. Em outras modalidades, o lipídio de algas extraídos da biomassa de algas é combinado com uma biomassa de algas com um teor de sólidos de cerca de 5% a 100% em peso.

[0083] Um aditivo alimentício de acordo com a invenção pode ser combinado com outros componentes alimentícios para produzir produtos alimentícios ou alimentos processados (por exemplo, produtos alimentícios animais e/ou humanos). Outros tais componentes alimentícios incluem um ou mais suplementos de enzima, aditivos de alimentação de vitamina e aditivos de alimentação minerais. O aditivo alimentício resultante (combinado) pode ser misturado em uma quantidade apropriada com os outros componentes alimentícios tais como proteínas de planta e cereal para formar um produto alimentício processado. O processamento destes componentes em um produto alimentício processado pode ser realizado usando quaisquer aparatos de processamento convencionalmente usados. Aditivos de alimentação/ali mento da presente invenção podem ser usados como um suplemento em uma alimentação/alimento por si mesmo, em adição com vitaminas, minerais, outras enzimas alimentícias, coprodutos agrícolas (por exemplo, farelo de trigo ou carne de glúten de milho), ou em uma combinação com esses.

[0084] Em um outro aspecto, a invenção fornece um processo de produção de um animal e/ou ser humano tendo um teor de tecido aumentado de ácidos graxos ômega 3, o processo compreendendo alimentar a um animal/ser humano com um aditivo alimentício compreendendo lipídios/ácidos graxos coletados de algas, o aditivo alimentício também compreendendo: (a) um lipídio de algas extraído de uma biomassa de algas cultivadas e/ou (b) uma biomassa de algas de algas cultivadas, em que água é removida da biomassa de algas para obter um teor de sólidos de cerca de 5 a 100% em peso, em que o animal/ser humano exibe teor de tecido aumentado de ácidos graxos ômega 3. A invenção não está limitada a qualquer mamífero particular (por exemplo, animal ou ser humano) que pode se beneficiar de uma composição da invenção. De fato, os animais da invenção incluem, porém não estão limitados a, qualquer animal cujos ovos, carne, leite ou outros produtos são consumidos por seres humanos ou outros animais. Desse modo, os animais da invenção incluem, porém não estão limitados a, peixes, aves domésticas (frangos, perus, patos, etc.), porcos, ovelha, bodes, coelhos, gados de carne e leiteiros.

[0085] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para o tratamento de uma doença mamífera em um indivíduo em ne- cessidade do mesmo por administração ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da invenção. Em algumas modalidades, uma doença mamífera que é tratada inclui, porém não está limitada a doença cardiovascular, uma doença inflamatória, e várias doenças de câncer. Em outras modalidades, as doenças cardiovasculares a serem tratadas incluem, porém não estão limitadas à hipertrigliceridemia, doença cardíaca coronária, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio e aterosclerose. Em outras modalidades, as doenças inflamatórias a serem tratadas incluem, porém não estão limitados à asma, artrite, rinite alérgica, psoríase, dermatite atópica, doenças inflamatórias do intestino, doença de Crohn, e rinoconjuntivite alérgica. Ainda em outras modalidades, as doenças de câncer a serem tratadas incluem, porém não estão limitados a câncer de próstata, câncer de mama e câncer de cólon. Em modalidades adicionais, as doenças mamíferas a serem tratadas incluem distúrbios psiquiátricos. Distúrbios psiquiátricos incluem, porém não estão limitados à depressão, distúrbio bipolar, esquizofrenia. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para manter e/ou realçar a função cognitiva.

[0086] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença mamífera em um indivíduo em necessidade do mesmo por administração ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de lipídio fornecida por e/ou obtida de uma biomassa de alga contendo um nível elevado de gordura total (por exemplo, mais do que 67% de gordura total). Indivíduos que podem encontrar benefício de tratamento incluem, porém não estão limitados a aves e indivíduos mamíferos. Mamíferos da presente invenção incluem, porém não estão limitados a caninos, felinos, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, rodentes (por exemplo, ratos e camundongos), lagomorfos, primatas (incluindo primatas não huma- nos), seres humanos, e similares, e mamíferos no útero. Qualquer indivíduo mamífero em necessidade de ser tratado de acordo com a presente invenção é adequado. Os mamíferos da presente invenção incluem, porém não estão limitados a caninos, felinos, bovinos, caprinas, equinas, ovinas, porcinas, rodentes (por exemplo, ratos e camundongos), lagomorfos, primatas (incluindo primatas não humanos), seres humanos, e similares, e mamíferos no útero. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o mamífero é um mamífero não humano. Em algumas modalidades, o mamífero é um indivíduo humano. Os indivíduos mamíferos de ambos os sexos e em qualquer estágio de desenvolvimento (por exemplo, neonato, bebê, juvenil, adolescente, adulto) podem ser tratados de acordo com a presente invenção. Aviários ilustrativos de acordo com a presente invenção incluem frangos, patos, perus, gansos, codornas, faisão, emas (por exemplo, avestruzes), pássaros domesticados (por exemplo, papagaios e canários), e pássaros em ovo.

Algas

[0087] Quaisquer algas capazes de produzir, usando os processos descritos aqui, níveis elevados de gordura total ou biomassa de alga contendo níveis elevados de gordura total podem ser usados nos processos, composições, suplementos dietéticos, biocombustível e/ou precursor de biocombustível e/ou aditivos de alimentação da invenção. Desse modo, em algumas modalidades, as algas da presente invenção são selecionadas de Thraustochytríum, Dinophyceae, Cryptophyceae, Trebouxiophyceae, Pinguiophyceae, e combinações das mesmas. Em outras modalidades, as algas da invenção são selecionadas de Thraustochytríum striatum, Thraustochytríum roseum, Thraustochytríum aureum, Crypthecodinium cohnii, Paríetochlorís spp., Rhodomonas spp., Cryptomonas spp., Paríetochlorís spp., Hemisebnis spp., Porphyrídium spp., Glossomastix spp., e combinações das mes- mas. Em outras modalidades, as algas da invenção são selecionadas de Paríetochloris incise, Rhodomonas salina, Hemiselmis brunescens, Porphyridium cruentum e Glossomastix chrysoplasta, e combinações das mesmas. Ainda em outras modalidades, as algas da invenção é Schizochytrium limacinum.

[0088] Em algumas modalidades da invenção, as algas são uma mistura de diferentes espécies de alga. Em outras modalidades, as algas são uma espécie de algas simples. Em algumas modalidades da presente invenção, as algas lipídios/ácidos graxos são fornecidas como um óleo de alga. Em outras modalidades, as algas lipídios/ácidos graxos são fornecidas como uma biomassa de alga (por exemplo, uma biomassa seca (por exemplo, em pó)).

[0089] Além disso, as algas da invenção incluem, porém não estão limitadas às algas do tipo selvagem, mutantes (naturalmente ou induzidas) ou geneticamente projetadas. Em uma modalidade preferida, uma alga usada nos processos, composições, suplementos dietéticos, biocombustível ou precursor de biocombustível e/ou aditivos de alimentação da invenção é um organismo não geneticamente modificado. Como usado aqui, os termos "variante geneticamente modificado," e "organismos geneticamente modificados" referem-se a uma linhagem de algas que tem um genoma que é modificado (por exemplo, mutado, mudado) de sua forma normal (por exemplo, do tipo selvagem, de ocorrência natural) de modo que um resultado desejado seja obtido.

[0090] Adicionalmente, as algas da invenção incluem algas tendo células com parede de célula de espessura reduzida em comparação com as algas do tipo selvagem, pela qual a parede de célula de espessura reduzida melhora a extractabilidade e/ou biodisponibilidade da fração de lipídio de algas (por exemplo, melhorando a facilidade de digestibilidade das algas e a facilidade da extractabilidade dos lipí- dios/ácidos graxos de algas das células da biomassa de alga). Algas tendo células com paredes de célula de espessura reduzida em comparação com as células de algas do tipo selvagem podem ser de ocorrência natural, mutadas e/ou geneticamente projetadas para ter paredes de célula de espessura reduzida em comparação com as linhagens do tipo selvagem. Desse modo, em uma modalidade da invenção as algas são uma alga tendo uma parede de célula de espessura reduzida em comparação com as algas do tipo selvagem, pela qual a parede de célula de espessura reduzida melhora extractabilidade e/ou biodisponibilidade da fração de lipídio de algas. Métodos de produção de algas com paredes de célula reduzidas incluem aqueles encontrados no WO 2006/107736 A1, aqui incorporado por referência em sua totalidade. Desse modo, as algas podem ser mutagenizadas com mu- tagênios conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, porém não estão limitadas a agentes químicos ou radiação. Em modalidades particulares, os mutagênicos químicos incluem, porém não estão limitados a metanossulfonato de etila (EMS), metilmetano sulfonato (MMS), N-etil-N-nitrosoureia (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil-N- nitrosoureia (MNU), procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalan, mostarda de nitrogênio, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-ami no purina, 7,12 dimetil- benz(a)antraceno (DMBA), etileno óxido, hexametilfosforamida, bissul- fano, diepoxialcanos (diepoxioctano (DEO), diepoxibutano (BEB), e similares), diidrocloridratos de 2-metóxi-6-cloro-9(3-(etil-2-clor-o- etipaminopropilamino)acridina (ICR-170), formaldeído, e similares. Métodos de mutagênese de radiação incluem, porém não estão limitados a, raiosX, gama radiação, luz ultravioleta, e similares.

[0091] Os mutantes de parede celular podem ser selecionados para uma base de sensibilidade aumentada a detergentes ou por ob servação microscópia de alterações na espessura da parede celular (veja, por exemplo, WO 2006/107736 A1) ou qualquer outro método conhecido na técnica para detectar a espessura da parede celular reduzida ou integridade da parede celular reduzida.

[0092] As algas da invenção podem ser cultivadas de acordo com as técnicas descritas nos exemplos 1 a 3.

[0093] Consequentemente, em algumas modalidades as algas são cultivadas em temperatura em uma faixa de 10 °C a 35 °C. Desse modo, as algas podem ser cultivadas em uma temperatura de 10 °C, 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21°C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, e similares. Em outras modalidades, as algas podem ser cultivadas em faixas de 20 °C a 35 °C, embora temperaturas mais frias (por exemplo, menos do que 20 °C) e mais quentes (por exemplo, mais do que 35 °C) possam ser usadas. Em uma modalidade preferida, as algas são cultivadas a cerca de 30 °C.

[0094] Em algumas modalidades, seguindo o cultivo, as algas são colhidas. Em algumas modalidades, a colheita de algas é realizada usando procedimentos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, porém não limitados à centrifugação, flocula- ção ou filtragem. Em uma modalidade preferida, antes da colheita, a cultura de algas é resfriada, desse modo permitindo células de alga contendo níveis elevados de gordura total serem colhidas de forma bem sucedida. As células de alga colhidas ou biomassa de alga podem em seguida ser usadas diretamente como uma fonte de lipí- dio/ácido graxo ou extraídas para obter óleo de algas compreendendo os lipídios/ácidos graxos. Em algumas modalidades em que a biomassa de alga deve ser usada diretamente, água é removida da biomassa de alga para obter um teor de sólidos de cerca de 5 a 100 em peso. Em modalidades adicionais, uma biomassa de alga que deve ser usa da diretamente é compreendida de células de alga também compreendendo paredes de célula que são pelo menos parcialmente rompidas para aumentar a extractabilidade e/ou biodisponibilidade do óleo de alga nas células. O rompimento das células de alga pode ser realizado de acordo com técnicas conhecidas incluindo, porém não limitadas ao tratamento das células com água fervente ou por rompimento mecânico tal como moagem, pulverização, sonicação, prensa francesa, ou qualquer outro método conhecido por um técnico versado.

[0095] Quando a biomassa de alga usada diretamente, água é removida da biomassa de alga para obter um teor de sólidos de cerca de 5 a 100%. Consequentemente, em algumas modalidades, água é removida da biomassa de alga para obter um teor de sólidos de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, e similares. Em modalidades adicionais, água é removida da biomassa de alga para obter um teor de sólidos na faixa de cerca de 5% a 50%, 5% a 60%, 5% a 70%, 5% a 80%, 5% a 90%, 5% a 95%, 10% a 30%, 10% a 40%, 10% a 50%, 10% a 60% 10% a 65%, 10% a 70%, 10% a 75%, 10% a 80%, 10% a 85%, 10% a 90%, 10% a 95%, 10% a 100%, 15% a 40%, 15% a 50%, 15% a 60%, 15% a 65%, 15% a 70%, 15% a 75%, 15% a 80%, 15% a 85%, 15% a 90%, 15% a 95%, 15% a 100%, 20% a 50%, 20% a 60%, 20% a 65%, 20% a 70%, 20% a 75%, 20% a 80%, 20% a 85%, 20% a 90%, 20% a 95%, 20% a 100%, 25% a 50%, 25% a 60%, 25% a 70%, 25% a 75%, 25% a 80%, 25% a 85%, 25% a 90%, 25% a 95%, 25% a 100%, 30% a 50%, 30% a 60%, 30% a 70%, 30% a 75%, 30% a 80%, 30% a 85%, 30% a 90%, 30% a 95%, 45% a 100%, 50% a 70%, 50% a 75%, 50% a 80%, 50% a 85%, 50% a 90%, 50% a 95%, 50% a 100%, 55% a 75%, 55% a 80%, 55% a 85%, 55% a 90%, 55% a 95%, 55% a 100%, 60% a 75%, 60% a 80%, 60% a 85%, 60% a 90%, 60% a 95%, 60% a 100%, 70% a 80%, 70% a 85%, 70% a 90%, 70% a 95%, 70% a 100%, 75% a 85%, 75% a 90%, 75% a 95%, 75% a 100%, 80% a 85%, 80% a 90%, 80% a 95%, 80% a 100%, 85% a 90%, 85% a 95%, 85% a 100%, 90% a 95%, 95% a 100%, e similares.

[0096] Em algumas modalidades, as células de alga da biomassa são rompidas ou lisadas e os lipídios de alga extraídos. As células de alga podem ser extraídas úmidas ou secas de acordo com técnicas convencionais para produzir uma composição contendo lipídios/ácidos graxos. A ruptura ou lise das células de alga pode ser realizada de acordo com as técnicas convencionais incluindo, porém não limitadas ao tratamento das células com água fervente ou por rompimento mecânico tal como moagem, pulverização, sonicação, prensa francesa, ou qualquer outro método conhecido. A extração dos lipídios/ácidos graxos das células lisadas segue procedimentos-padrão usados com organismos de alga ou outros que são conhecidos incluindo, porém não limitadas à separação da fase líquida seguindo a lise celular, ex-tração dos lipídios/ácidos graxos na fase pela adição de um solvente, evaporação do solvente, e recuperação dos lipídios/ácidos graxos obtidos da fase líquida das células lisadas.

[0097] A invenção não está limitada a qualquer solvente particular usado para extração. Solventes incluem, porém não estão limitados a hexano, clorofórmio, etanol, metanol, isopropanol, dietil éter, dioxano, isopropil éter, diclorometano, tetraidrofurano, éter de petróleo e combinações das mesmas.

[0098] Em algumas modalidades, lipídios/ácidos graxos derivados de uma biomassa de alga da invenção são fornecidos na forma de ácidos graxos livres, ésteres de colesterolcolesterol, ésteres de sal, ésteres de ácido graxo, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, diacilgliceróis, monogliceróis, esfingofosfolipídios, esfingoglicolipídios, ou qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, para uso em processos, composições, biocombustíveis, produtos alimentícios, suplementos dietéticos, aditivos de alimentação ou outras composições descritas aqui).

Método para a Preparação de uma Biomassa de Alga

[0099] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para a preparação de uma biomassa de alga que contém níveis elevados de gordura total (por exemplo, mais do que 67% de lipídios), compreendendo: cultivar algas sob uma condição de cultura suficiente para fornecer uma biomassa de alga que contém níveis elevados de gordura total (por exemplo, mais do que 67% de lipídios), em que a biomassa de alga é colhida na terminação de uma fase de crescimento logarítmico das algas (veja, por exemplo, exemplos 1 e 2). Como usado aqui, o termo "fase de crescimento logarítmico," se refere a um estágio de cultura caracterizado por números exponencialmente crescentes de células de alga. Geralmente, em um sistema de cultura, existe um padrão de crescimento característico seguinte à inoculação que uma fase lag, um exponencial ou "fase de crescimento logarítmico," uma fase de aceleração de crescimenti negativo, e um platô ou "fase estacionária." Por exemplo, na fase de crescimento logarítmico, visto que o crescimento das algas continua, as células podem alcançar sua taxa máxima de divisão celular e os números de células aumentam em relação log ao tempo. Dentro do tempo após o começo da fase log, a fase de divisão cellular pode começar a declinar e algunas células podem começar a morrer. Isto é refletido em uma curva de crescimento por um nivelamento gradual da linha. Eventualmente a taxa de morte de células é essencialmente igual à taxa de divisão celular, e a população viável total pode permanecer a mesma durante um período de tempo. Isto é conhecido como a fase estacionária ou platô e é representado em uma curva de crescimento como um nivelamento da linha, onde o declive aproxima-se de zero. Em uma modalidade preferida, a biomassa de alga é cultivada em condições assépticas (por exemplo, para impedir a contaminação e/ou crescimento de micro-organismos con- taminantes (por exemplo, leveduras, bactérias, vírus, etc.) na cultura).

[00100] Em algumas modalidades, a condição de cultura é suficiente para as algas produzirem níveis elevados de gordura total (por exemplo, mais do que 67% em uma base de peso/peso). As condições de cultura compreendem um meio de cultura adequado para o cultivo das algas, desse modo fornecendo a biomassa de algas contendo níveis elevados de gordura total (por exemplo, mais do que 67% em uma base de peso/peso). Meios de cultura adequados são descritos aqui. O meio pode também compreender sais, vitaminas, minerais, metais, e outros nutrientes. Preferivelmente, a condição de cultura é suficiente para fornecer uma quantidade adequada de nutriente e temperatura para as algas cultivarem-se sob condições que geram uma biomassa de alga que contém níveis elevados de gordura total.

[00101] Em algumas modalidades, o cultivo compreende limitar um nutriente (por exemplo, nitrogênio, fósforo) durante um período de tempo adequado para aumentar a quantidade de gordura total. Por exemplo, a cultura pode ser ficar sem um certo nutriente ou transferir- se para um meio de cultura separado sem um nutriente específico (por exemplo, meio sem fósforo ou meio sem nitrogênio, ou um meio de cultura contendo níveis mais baixos de um nutriente). Em algumas modalidades, o meio de cultura contém um teor inicial de um nutriente de modo que o nutriente torne-se depauperado em um período de tempo mais posterior durante o crescimento exponencial, porém antes da depauperação de outros nutrientes. Em algumas modalidades, o cultivo não compreende limitar um nutriente (por exemplo, nitrogênio, fósforo) durante a cultura. Em algumas modalidades, o cultivo de bio- massa de alga simples ocorre em dois ou mais tipos de meio de uma maneira sequencial. Em algumas modalidades, o cultivo de uma biomassa de alga simples ocorre em três ou mais tipos de meio de uma maneira sequencial. De uma maneira similar, o cultivo de uma biomassa de alga simples pode ocorrer em dois ou mais vasos, em que um primeiro vaso é usado para inocular um vaso subsequente, o vaso subsequente é usado para inocular ainda outro vaso subsequente, e assim por diante. Embora um entendimento de um mecanismo não seja necessário para praticar a invenção, e a invenção não está limitada a qualquer mecanismo de ação particular, em algumas modalidades, cultivo sequencial de uma biomassa de alga simples em múltiplos vasos contendo múltiplos tipos de meio permite a biomassa de alga desenvolver-se de um tal modo que teor de gordura total da biomassa seja elevado em comparação com o crescimento de uma biomassa de alga (por exemplo, das mesmas espécies de alga) cultivada em um vaso simples e/ou meio de crescimento.

[00102] O cultivo das algas pode ser realizado em um biorreator convencional para cultivo das algas para fornecer biomassa de algas. Por exemplo, as algas podem ser cultivadas por um processo incluindo, porém não limitadas à batelada, alimentação em bateladas, reciclagem de célula, e fermentação contínua. Em uma modalidade preferida, as algas são cultivadas em um processo de alimentação em bateladas.

[00103] A invenção não está limitada a qualquer maneira ou método particular de colheita das algas do meio de cultura. Uma variedade de métodos pode ser usada para colher as células de alga do meio de cultura. Em uma modalidade, a colheita compreende recuperar a biomassa de alga do meio de cultura por separação, por exemplo, por filtragem (por exemplo, filtragem por esteira, filtragem por tambor giratório) e/ou centrifugação. Se desejado, as células de alga colhidas po- de, em seguida, ser lavadas, congeladas, liofilizadas, secadas por spray, e/ou armazenadas sob uma atmosfera não oxidante de um gás (por exemplo, CO2, N2) para reduzir ou eliminar a presença de O2. Opcionalmente, antioxidantes sintéticos e/ou naturais incluindo, porém não limitados a hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), terc-butilhidroquinona (TBHQ), etoxiquina, beta-caroteno, vitamina E, e vitamina C também pode ser adicionada às células colhidas.

[00104] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para a preparação de uma biomassa de alga que contém níveis eleva-dos de gordura total, o método compreendendo: cultivar algas sob uma condição de cultura suficiente para fornecer uma biomassa de alga que contém níveis elevados de gordura total e colheita da biomassa de alga.

Biomassa de Microalgas

[00105] A invenção fornece, em algumas modalidades, uma biomassa de alga e/ou uma fração e/ou um extrato da mesma (por exemplo, para uso em produção de biocombustível e/ou como um alimento ou produto de alimentação).

[00106] Em algumas modalidades, a biomassa de alga compreende um teor de ácido graxo de ômega-3 de pelo menos 10% de peso seco da biomassa, ilustrativamente, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 10% a cerca de 20% de peso seco da biomassa. Em uma modalidade, a biomassa de alga é preparada de acordo com os métodos da invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, a biomassa de alga é preparada por um método compreendendo: cultura de algas sob uma condição de cultura suficiente para fornecer uma biomassa algal, compreendendo níveis elevados de gordura total (por exemplo, mais do que 67% peso/peso), em que a biomassa de alga é colhida em uma fase de aceleração de crescimento negativa ou uma fase estacionária. Em outra modalidade, a biomassa de alga é colhida da cultura durante a fase de crescimento logarítmica, exponencial.

Composições Lipídicas Preparadas de Biomassa Algal

[00107] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para preparar um extrato de lipídeo/ácido graxo (por exemplo, uma composição de lipídeo/ácido graxo) de uma biomassa de alga desenvolvida sob condições para conter níveis elevados de gordura total, o método compreendendo obter lipídeos de uma biomassa de alga cultivada sob uma condição de cultura suficientes para fornecer uma biomassa de alga com teor elevado de gordura total (por exemplo, teor de gordura total mais do que 67% da biomassa), em que a biomassa de alga é colhida em uma fase de aceleração de crescimento negativa ou uma fase estacionária das algas. Em outra modalidade, a biomassa de alga é colhida durante uma fase de crescimento logarítmica das algas.

[00108] Métodos para obtenção de uma composição lipídica de uma biomassa de alga da invenção incluem, porém não estão limitados a, extração, calor, pressão, saponificação, sonicação, congelamento, moagem, permuta de íon, cromatografia, separação de membrana, eletrodiálise, osmose reversa, destilação, derivatização química, cristalização, etc. Por exemplo, lipídeos algais podem ser extraídos das células algais por qualquer método adequado incluindo, porém não limitado à extração com um solvente incluindo, porém não limitado a, etanol, acetato de etila, álcool isopropílico, metanol, acetato de etila, hexano, cloretos de metileno, metanol, petróleo, clorofórmio, e similares, ou por hidrocarbonetos líquidos pressurizados, tais como butano, pentano, propano, ou outros (com ou sem cossolventes), ou por meio de extração de fluido supercrítica (com ou sem cossolventes). Opcionalmente, o óleo de lipídeo/ácido graxo extraído é evaporado sob pressão reduzida para reduzir ou remover o solvente e/ou produzir uma amostra de material lipídico concentrado. Em outras modalida- des, as células são rompidas ou lisadas para obter a composição lipí- dica, por exemplo, em uma forma de óleo (por exemplo, para uso como um biocombustível ou um precursor de biocombustível). Em algumas modalidades, os óleos extraídos são submetidos a refinamento. A invenção não está limitada pelo tipo de refinamento. Em algumas modalidades, os óleos extraídos são quimicamente refinados. Em algumas modalidades, os óleos extraídos são fisicamente refinados. Em algumas modalidades, os óleos extraídos são tanto quimicamente quanto fisicamente refinados. Óleos extraídos (por exemplo, de uma biomassa de alga desenvolvida sob condições para elevar o teor de gordura total da célula algal (por exemplo, para acima de 67%)) podem ser refinados usando qualquer método de refinamento convencional. O processo de refinamento pode remover um pouco ou todas as impurezas dos lipídeos/ácidos graxos/óleos. Em algumas modalidades, o processo de refinamento compreende uma ou mais etapas para de- sengomar, branquear, filtrar, desodorizar e/ou polir os lipídeos/ácidos graxos/óleos.

[00109] Em algumas modalidades, os lipídeos/ácidos graxos/óleos contidos na composição lipídica extraída são concentrados hidrolisan- do-se os lipídeos para concentrar a fração de lipídeo empregando um método tal como, por exemplo, adução de ureia, destilação fracionai, cromatografia de coluna, e/ou fracionamento de fluido supercrítica.

[00110] Consequentemente, em uma modalidade, a etapa de obtenção de uma composição lipídica de uma biomassa de alga da invenção compreende extrair a composição lipídica da biomassa. Em outra modalidade, a etapa de obtenção de uma composição lipídica de uma biomassa de alga da invenção compreende contatar a biomassa com um solvente polar.

[00111] Por exemplo, em algumas modalidades, lipídeo/ácido gra- xo/óleo é extraído da biomassa de alga para fornecer uma composição lipídica usando um solvente sob uma condição de extração suficiente para extrair lipídeos e/ou ácidos graxos, porém não suficiente para extrair compostos que são insolúveis no solvente. Em uma modalidade, uma composição de lipídeo/ácido graxo é extraída de uma biomassa de alga da invenção em que os resíduos celulares e/ou compostos insolúveis precipitados são separados da fração contendo lipídeo/ácido graxo e solvente. Em outra modalidade, o método também compreende separar os resíduos celulares e compostos precipitados usando um método de separação tal como filtração, centrifugação, e/ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, os resíduos celulares e/ou compostos insolúveis precipitados (por exemplo, aquelas partes da biomassa de alga que não são solúveis em um solvente (por exemplo, proteínas, fibra, etc.) são recuperadas e utilizadas (por exemplo, em um alimento ou produto alimentício).

[00112] Em algumas modalidades, o solvente é um solvente polar. Exemplos de solventes polares incluem, porém não estão limitados a, etanol, acetato de etila, álcool isopropílico, metanol, acetato de etila, e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o solvente polar é etanol. Extração da composição lipídica com um solvente pode ser realizada de uma variedade de maneiras. Por exemplo, a extração pode ser um processo de batelada, um processo contínuo, ou um processo contra corrente contínuo. Em um processo contra corrente contínuo, o contato do solvente com as microalgas lixívia o óleo no solvente, fornecendo uma fração de óleo crescentemente mais solvente. Seguindo a extração, o solvente pode ser removido usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, destilação, evaporação giratória, ou um evapo- rador de película crescente e redutor de vapor ou qualquer dessolve- dor adequado pode ser usado para remover o solvente.

[00113] Em uma modalidade, os lipídeos/ácidos graxos extraídos são expostos a um processo de absorção (por exemplo, branquea- mento) para remover um ou mais compostos indesejáveis tais como, por exemplo, corpos coloridos e/ou fosfatídeos que podem estar presentes. Em algumas modalidades, o processo de absorção é um processo de branqueamento compreendendo contatar o extrato de lipídeo/ácido graxo com um material de branqueamento (por exemplo, terra neutra (por exemplo, argila natural ou terra de pisoeiro), terra ativada por ácido, carbono ativado, argilas ativadas, silicates, e ou uma combinação dos mesmos). A invenção não está limitada pela quantidade de material de branqueamento utilizada.

[00114] Em uma modalidade, os lipídeos/ácido graxos extraídos são expostos a uma etapa de desengomação. Métodos de desengo- mação são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, desengomação de água, desengomação de ácido, desengomação enzimática, e desengomação de membrana. Em algumas modalidades, o extrato de lipídeo/ácido graxo é submetido à desengomação (por exemplo, seguindo um processo de absorção), em que a desengomação compreende contatar o extrato de lipídeo/ácido graxo com uma mistura de ácidos aquosos que estão em quantidades efetivas para precipitar gomas e/ou compostos do tipo clorofila que podem estar presentes na composição de extrato de lipídeo/ácido graxo. A invenção não está limitada pelo tipo ou quantidade de ácidos aquosos utilizados. Em uma modalidade, a mistura de ácidos aquosos compreende ácido sulfúrico e/ou ácido fosfórico. Em outra modalidade, quantidades iguais de ácidos aquosos são misturadas com a composição lipídica. Em uma modalidade preferida, quando misturados com o óleo, os ácidos aquosos são em uma quantidade suficiente para fornecer um pH ací- dico. Precipitados que se formam após mistura de ácido podem ser removidos da composição lipídica, por exemplo, usando centrifugação e/ou filtração (por exemplo, filtração de membrana). Em algumas modalidades, a composição de extrato de lipídeo/ácido graxo desengo- mada é submetida à secagem (por exemplo, para reduzir o teor de umidade da composição). A invenção não está limitada pela condição de secagem (por exemplo, tempo, temperatura, e/ou uma condição a vácuo). Como descrito aqui, em algumas modalidades, o teor de umidade da composição de lipídeo ácido graxo seca é menos do que cerca de 10% peso/peso (por exemplo, menos do que cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,05, ou 0,01% peso/peso).

Composição Lipídica

[00115] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição lipídica preparada da biomassa algal da invenção. Em algumas modalidades, a composição lipídica é preparada de acordo com um método da invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição lipídica é uma biomassa de alga ou uma porção/fração da mesma de algas do gênero Thraustochytríum. Em algumas modalidades, a biomassa de alga compreende uma alga selecionada de Dinophyceae, Cryptophyceae, Trebouxiophyceae, Pinguiophyceae, e/ou combinações das mesmas. Em outras modalidades, a biomassa de alga compreende uma alga selecionada de Thraustochytríum striatum, Thraustochytríum roseum, Thraustochytríum aureum, Cryptheco- dinium cohnii, Paríetochlorís spp., Rhodomonas spp., Cryptomonas spp., Paríetochlorís spp., Hemisebnis spp:, Porphyrídium spp., Glos- somastix spp., e/ou combinações das mesmas. Em outras modalidades, a biomassa de alga compreende uma alga selecionada de Paríetochlorís incise, Rhodomonas salina, Hemiselmis brunescens, Porphyrídium cruentum e Glossomastix chrysoplasta, e combinações das mesmas. Em uma modalidade preferida, a biomassa de alga compreende Schizochytrium limacinum.

Produtos Alimentares e Aditivos Alimentícios Animais

[00116] Em algumas modalidades, uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou extrato das mesmas é usada para consumo (por exemplo, por um mamífero (por exemplo, consumo humano ou animal)) ou como um aditivo alimentício (por exemplo, para aumentar o teor de lipídio e/ou componentes nutricionais de um alimento). Por exemplo, em algumas modalidades, quando usados como alimentação animal (por exemplo, alimentação de gado vacum, alimentação de laticínio, alimentação de aquicultura, ração para aves, etc.), os lipí- deos/ácido graxos produzidos por uma biomassa de alga da invenção são incorporados em um produto alimentício (por exemplo, alimentação animal). Em algumas modalidades, uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou extrato da mesma é usado para os propósitos farmacêuticos ou nutricionais e/ou aplicações industriais.

[00117] Uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou extrato da mesma pode ser fornecida em qualquer uma das variedades de formas/composições adequadas para uma aplicação ou uso particular. Em algumas modalidades, uma biomassa lagal de célula inteira, fração, e/ou extrato da mesma é fornecida. Em outra modalidade, uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou extrato da mesma é fornecida em uma forma de pó ou como um óleo livre em uma forma líquida (por exemplo, composição lipídica ou uma fração ou concentrado da mesma). Uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou ex-trato da mesma pode ser usada para o consumo humano e/ou animal. Por exemplo, em algumas modalidades, uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou extrato da mesma é fornecida como ou incorporada em uma alimentação, um suplemento dietético, um alimento, uma formulação farmacêutica, um produto de laticínio, e/ou uma fórmula para criança.

[00118] Por exemplo, em uma modalidade, uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou extrato da mesma é secada (por exemplo, secagem por spray, secagem em túnel, secagem a vácuo) e usada como uma alimentação ou suplemento alimentício para qualquer animal ou organismo de aquicultura (por exemplo, peixe, camarão, camarão, lagosta, etc.) cuja carne e/ou produtos são consumidos por humanos ou animais (por exemplo, animais de estimação, animais de criação). Em outra modalidade, uma biomassa algal de célula inteira, fração, e/ou extrato da mesma é misturada com um agente de redução de umidade (por exemplo, grão moído tal como milho moído).

[00119] As composições descritas aqui podem ser usadas como um produto alimentício completo, como um componente de um produto alimentício, como um suplemento dietético ou como parte de um suplemento dietético, como um aditivo alimentício e pode ser em forma líquida, semissólida ou sólida. As composições da invenção adicionalmente podem ser na forma de uma composição farmacêutica. As composições, suplementos dietéticos, produtos alimentícios, produtos alimentícios para bebês, aditivos alimentícios, e/ou composições farmacêuticas da invenção podem ser utilizadas nos métodos de promoção da saúde de um indivíduo. As composições podem ser em forma líquida, semissólida ou sólida. Por exemplo, as composições podem ser administradas como comprimidos, pacotes de gel, cápsulas, cápsulas de gelatina, drinques aromatizados, como um pó que pode ser reconstituído em tal drinque, óleo de cozimento, óleo de salada ou recheio, molho, xarope, maionese, margarina ou similares. Além disso, o produto alimentício, suplementos dietéticos, e similares, da presente invenção pode incluir, porém não estão limitados a, produtos de laticínio, alimento para bebês, fórmula para bebês, bebidas, barras, um pó, uma cobertura de alimentos, um drinque, um cereal, um sorvete, um confeito, uma mistura para lanche, um produto de alimento cozido e um produto de alimento frito. Bebidas da invenção include, porém não estão limitadas a drinques de energia, drinques nutracêuticos, smoothies, drinques para esportes, suco de laranja e outros drinques de fru- ta. Uma barra da presente invenção inclui, porém não está limitada a, um substituto de carne, uma barra nutricional, uma barra para lanche e uma barra de energia, uma barra extrusada, e similares. Produtos de laticínio da invenção incluem, porém não estão limitados a, um iogurte, drinques de iogurte, queijos e leite. Composições destinadas à administração oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido para a fabricação de suplementos dietéticos ou preparações farmacêuticas, e tais composições podem incluir include pelo menos um aditivo selecionado do grupo que consiste em substância de melhora do sabor, tais como agentes adoçantes ou agentes aroma- tizantes, estabilizantes, emulsificantes, agentes colorantes e agentes conservantes a fim de fornecer uma preparação dieteticamente ou farmaceuticamente palatável. Vitaminas, minerais e elementos de traço de qualquer fonte fisiologicamente aceitável podem também ser incluídos na composição da invenção.

[00120] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende as composições da invenção em uma quantidade terapeuticamente. As composições da invenção podem ser formuladas para administração de acordo com técnicas de farmácia conhecidas. Veja, por exemplo, Remington, The Science e Practice of Pharmacy (9a. Ed. 1995). Na fabricação de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, as composições lipídicas (incluindo os sais fisiologicamente aceitáveis dos mesmos) são tipicamente misturadas com, entre outras coisas, um veículo aceitável. O veículo será compatível com quaisquer outros ingredientes na formulação e não deve ser prejudicial ao indivíduo.

Biocombustível

[00121] Muitas das tecnologias existentes para fabricação de biocombustível de alvas são caras, ineficientes e insustentáveis, quando operadas em uma escala que é requerida para remover qualquer fra- ção significativa de petrodiesel no mercado. O suprimento e consumo de energia para colher e processar algas são frequentemente subestimados. Para produzir biodiesel de algas convencionalmente, as algas são tipicamente colhidas de uma cultura em uma concentração de cerca de 0,2 g/L em água. As algas colhidas são em seguida desidratadas, o que aumenta a concentração algal para formar uma pasta algal de cerca de 15% sólidos. A pasta é em seguida totalmente secada por evaporação da água. Óleo é em seguida extraído das algas secas com um solvente orgânico, tal como hexano, que é removido por destilação do óleo algal. Este método convencional para geração de biodiesel de algas é proibitivamente caro.

[00122] Por exemplo, quando algas desenvolvem-se em um corpo natural de água, uma biomassa de alga é relativamente diluída, considerando o volume de água. A produção de um galão de óleo requer processar de cerca de 20.000 a 40.000 galões de água. O custo de energia de transporte e processamento, tal grande volume de água, é elevado. Como exemplo, 2.500 galões de óleo/acre/ano deve ser produzido se algas com 25% de sua massa como lipídeos deve ser produzida em 25 g/m.sup.2/dia. Para este exemplo, 50 milhões de galões de água devem ser processados para produzir os 2.500 galões de óleo. O método padrão de bombeamento de água para uma facilidade centralizada para desidratação é simplesmente bastante energia- intensiva e custo proibitivo. Como exemplo, uma facilidade de óleo algal relativamente pequenas que produziu 20 milhões de gal/ano consumiria mais energia para bombear água do tanque para uma facilidade central, do que aquela contida no produto oleoso, resultando em um equilíbrio de energia negativa líquida.

[00123] Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece um método para preparar uma biomassa de alga e/ou extrato de lipídeo/ácido graxo (por exemplo, uma composição de lipídeo/ácido graxo) de uma biomassa algal, desenvolvida sob condições para conter níveis elevados de gordura total, o método compreendendo obter lipídeos de uma biomassa de alga cultivada sob uma condição de cultura suficientes para fornecer uma biomassa de alga com teor elevado de gordura total (por exemplo, teor de gordura total mais do que 67% da biomassa), em que a biomassa de alga é colhida em uma fase de aceleração de crescimento negativa ou uma fase estacionária das algas. Em outra modalidade, a biomassa de alga é colhida durante uma fase de crescimento logarítmica das algas. Métodos para obtenção de uma composição lipídica de uma biomassa de alga da invenção são descritos aqui.

[00124] Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção fornece uma matéria prima de biocombustível ou um biocombustível compreendendo lipídeos, hidrocarbonetos, ou ambos, derivados de uma cultura algal e/ou biomassa algal gerada de acordo com os métodos da invenção. Em algumas modalidades, composições lipídicas ou algais compreendendo a mesma são subdivididas de acordo com a polaridade: lipídeos neutros e lipídeos polares. Os principais lipídeos neutros são os triglicerídeos e ácidos graxos saturados e insaturados livres. Os principais lipídeos polares são lipídeos de acila, tais como glicolipídeos e fosfolipídeos. Em algumas modalidades, uma composição compreendendo lipídeos e hidrocarbonetos da invenção é descrita e distinguida pelos tipos e quantidades relativas de ácidos graxos e/ou hidrocarbonetos presentes na composição. Em algumas modalidades, os hidrocarbonetos presentes em composições algais da invenção são principalmente alcanos e alcenos de cadeia linear, e podem incluir parafinas e similares tendo até 36 átomos de carbono.

[00125] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de fabricação de um combustível líquido que compreende processar lipídeos derivados de uma cultura algal e/ou biomassa algal ou fração lipídica das mesmas descritas aqui. Produtos da invenção feitos pelo processamento de matérias primas de biocombustível derivadas de algas podem ser incorporados ou usados de uma variedade de combustíveis líquidos, incluindo, porém não limitados a, diesel, biodiesel querosene, combustível de avião, gasolina, JP-1, JP-4, JP-5, jp_θ jp_ 7, JP-8, Propelentes de Avião Termicamente Estáveis (JPTS), líquidos Fischer-Tropsch, combustíveis com base em álcool incluindo combustíveis de transporte contendo etanol, outros combustíveis líquidos com base em biomassa, incluindo combustíveis de transporte com base em biomassa celulósica.

[00126] Em algumas modalidades, triacilglicerídeos em óleo algal é convertido em metil ésteres de ácido graxo (FAME ou biodiesel), por exemplo, usando um processo de transesterificação de catalisado na base (para um visão geral veja, por exemplo, K. Shaine Tyson, Joseph Bozell, Robert Wallace, Eugene Petersen, e Luc Moens, "Biomass Oil Analysis: Research Needs and Recommendations, NREL/TP-510- 34796, Junho de 2004, pelo presente incorporado por referência em sua íntegra). Em algumas modalidades, os triacilglicerídeos são reagidos com metanol na presença de NaOH a 60 C. durante 2 horas para gerar um metil éster de ácido graxo (biodiesel) e glicerol. Em outras modalidades, o biodiesel e coprodutos de glicerol são imiscíveis e tipicamente separados a jusante por meio de decantação ou centrifugação, seguido por lavagem e purificação. Ácidos graxos livres (FFAs) são um produto de hidrólise natural de triglicerídeo e formado reagindo triacilglicerídeos e água. Em algumas modalidades, métodos da invenção também compreendem uma etapa para rapidamente e substancialmente secar o óleo algal por técnicas conhecidas na arte para limitar a produção de ácidos graxos livres, preferivelmente para menos de 1%. Em outra modalidade da invenção, os métodos podem também compreender uma etapa para converter ou remover os ácidos graxos livres por técnicas conhecidas na arte.

[00127] Em algumas modalidades, triacilglicerídeos em óleo algal são convertidos em metil ésteres de ácido graxo (FAME ou biodiesel) por transesterificação catalisada por ácido, transesterificação catalisada por enzima, ou transesterificação de metanol supercrítica. Transesterificação de metanol supercrítica não requer um catalisador (Veja, por exemplo, Kusdiana, D. e Saka, S., "Effects of water on biodiesel fuel production by supercritical methanol treatment," Bioresource Technology 91 (2004), 289-295; Kusdiana, D. e Saka, S., "Kinetics of transesterification in rapeseed oil to biodiesel fuel as treated in supercritical methanol," Fuel 80 (2001), 693-698; Saka, S., e Kusdiana, D., "Biodiesel fuel from rapeseed oil as prepared in supercritical metanol," Fuel 80 (2001), 225-231). A reação em metanol supercritico reduz o tempo de reação de 2 horas para 5 minutos. Além disso, a ausência do catalisador de base NaOH simplifica enormemente a purificação a jusante, reduz o custo de material bruto, e elimina o problema com sabões de ácidos graxos livres. Em vez de ser um problema, os ácidos graxos livres tornam-se matérias primas valiosas que são convertidos em biodiesel no metanol supercritico como segue.

[00128] Em algumas modalidades, triacilglicerídeos são reduzidos com hidrogênio para produzir parafinas, propano, dióxido de carbono e água, um produto geralmente conhecido como diesel verde. As parafinas podem ser isomerizadas para produzir diesel ou misturadas diretamente com diesel. Em algumas modalidades, existem vantagens de hidrogenação por transesterificação catalisada na base convencional. Por exemplo, o processo de hidrogenação (também referido como hi- drocraqueamento) é termoquímico e, portanto, muito mais robusto para alimentar impurezas, quando comparado a processos bioquímicos (por exemplo, hidrocraqueamento é relativamente insensível a ácidos graxos livres e água). Ácidos graxos livres são facilmente convertidos em parafinas, e a água simplesmente reduz a eficiência térmica total do processo, porém não altera significantemente a química. Em outro exemplo não limitante, o produto de parafina é um hidrocarboneto puro e, portanto, indistinguível de hidrocarbonetos com base em petróleo. Ao contrário do biodiesel que tem um teor de umidade 15% menor e pode congelar em condições metereológicas de frio, diesel verde tem teor de energia similar e características de fluxo (por exemplo, viscosidade) ao diesel com base em petróleo. Em várias modalidades, os métodos da invenção abrangem as etapas de hidrocraqueamento e isomerização, que são bem conhecidos na técnica para produzir combustíveis líquidos, tais como combustível para avião, diesel, querosene, gasolina, JP-1, JP-4, JP-5, JP-6, JP-7, JP-8, e JPTS.

EXPERIMENTAL

[00129] Os seguintes exemplos são fornecidos a fim de demonstrar e também ilustrar certas modalidades preferidas e aspectos da presente invenção e não são construídos como limitantes do escopo das mesmas.

EXEMPLO 1 Crescimento de biomassa algal com alto teor de gordura

[00130] Experimentos foram conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção a fim de caracterizar e estabelecer métodos para produção de algas heterotróficas e, em particular, métodos de cultivar algas, a fim de gerar uma biomassa de alga contendo níveis elevados de gordura/lipídeo. Uma série de estudos de produção de algas heterotrófica convencional foi realizada e conduzida em batelada.

[00131] Uma cultura de Schizochytrium limacinum foi obtida e armazenada em cri of rasco netes de 1,5 mL a -80 C. Para cada experimento, o processo foi iniciado descongelando-se criofrasconetes e as- septicamente adicionando a frascos agitantes de 1,0 L com meio. O meio nos frascos de 1 L continham 50 g/L de açúcar, 10 g/L de extrato de levedura, e 4 g/L de sal marinho. Três litros de cultura de frasco agitante com 3 a 6 dias de idade foram usados para inocular um vaso de 250 L contendo meio, cultivados durante 24 a 48 horas, e em seguida transferidos para um vaso principal (17.000 a 28.000 L) e conduzidos como um processo de batelada durante 36 a 72 horas. A temperatura dos ciclos de batelada foi mantida entre 25 e 30°C. A faixa de temperatura foi grande devido à ausência de controle preciso do sistema. Os meios usados nos ciclos de semente (250L) e batelada (17.000 a 28.000L) foram como segue:

Tabela 1A. Meio usado em batelada tradicional e culturas de semente.

[00132] Teor de gordura total da biomassa de alga das culturas em batelada foi determinado por cromatografia de gás (veja o método gra- vimétrico AOAC 922.06), a hidrólise de ácido (veja, total fat by Acid Hydrolysis Ankom Technology Method 1, 02-10-09), e Extração de Solvente de Temperatura Elevada (veja, Ankom Technology Method 2, 01-30-09 e AOCS Method 5-04). Em síntese, um procedimento de análise típica para fermentação de caldo foi como segue: amostras de caldo foram concentradas por centrifugação. Após decantar, a amostra foi secada por congelamento durante 24 horas com umidade resultante menor do que um por cento. As amostras foram pesadas antes da hidrólise de ácido, lavadas e secadas em um forno. Isto foi seguido por um processo de extração sob condições térmicas de gradiente com éter de petróleo. O processo de hidrólise e extração foi empreendido utilizando instrumentos automatizados. Após outra secagem, os resultados foram determinados na base de perda de massa.

[00133] Como mostrado na tabela 1B abaixo, os níveis de gordura total/lipídios (peso/peso) obtidos nas produções em bateladas em uma faixa de temperatura de 25 a 30 C foi de 8 a 38 %. Ciclo Log# Gordura total (%)

Tabela 1B. Teor de gordura total de biomassa de alga cultivada em ciclo de batelada entre 25-30 C.

[00134] Esforços foram feitos para aumentar as quantidades de níveis de gordura/lipídios visto que estas quantidades foram consideradas muito baixas para serem de valor e experimentos adicionais foram realizados em esforço para aumentar o nível de lipídios produzidos em algas cultivadas.

[00135] Durante o desenvolvimento de modalidades da invenção, experimentos foram conduzidos a fim de determinar se mudanças nos constituintes e/ou quantidades ou relações dos mesmos nos meios podem fornecer características de cultivo de alga diferentes. Além disso, experimentos foram conduzidos para determinar se a graduação de um sistema de cultura de alga pode alterar as características de cultivo de alga. Em particular, as quantidades e relações de MgSO4, ureia, CaCh, MgCh, e KH2PO4 foram modificadas em uma tentativa de aumentar o nível de lipídio produzido por algas cultivadas.

[00136] Resultados de fermentações produzidos em um volume em batelada de 10L são mostrados abaixo:

Tabela 2: Resultados e condições de fermentação de 10 L.

Tabela 3: Resultados e condições de fermentação de 10 L adicio- nais.

Tabela 4: Resultados e condições de fermentação de 10 L adicionais.

[00137] Estes experimentos, conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção, indicaram que certas quantida- des/relações de substratos presentes nos meios tinham um impacto direto sobre as características de cultivo de alga (por exemplo, biomassa total obtida bem como quantidade de gordura e/ou outro teor de componente na própria biomassa). Parâmetros que fornecem um alto teor de gordura biomassa nos ciclos de 10L foram em seguida utilizados para determinar se eles podem ser bem sucedidos para a produção em grande escala de uma biomassa com alto teor de gordura.

EXEMPLO 2 Produção em grande escala de biomassa de alga de alto teor de gordura

[00138] As tentativas iniciais de gerar uma biomassa de alga hete- rotrófica descritas no Exemplo 1 acima utilizaram os procedimentos com base em processos de fermentação de levedura. Os processos foram executados em batelada devido às limitações na facilidade de produção (Nicholasville, KY) e temperaturas que podem apenas ser controladas entre 25 e 30 C. A faixa de temperatura foi grande devido à falta de controle preciso do sistema. Como indicado na Tabela 1, acima, os níveis de gorduras obtidos na planta de KY, Nicholasville, abrangeram de 8 a 38 %. No entanto, como indicado acima, os experimentos adicionais foram realizados durante o desenvolvimento de modalidades da invenção que forneceu a identificação de certas rela- ções/quantidades de substratos que poderiam ser utilizados durante a produção de biomassa de alga heterotrófica para alterar as proprieda- des/geração de biomassa e crescimento de alga. A modificação dos níveis das e relações dos meios (por exemplo, MgSO4, ureia, CaCh, MgCh, e KH2PO4) durante a fermentação foi identificada e caracterizada por alterar o crescimento de alga, e gerar uma biomassa com pro-priedades significantemente diferentes (por exemplo, uma biomassa de teor de gordura significantemente maior). Como descrito abaixo, o processo (incluindo os meios contendo as relações/quantidade identifi-cadas de substratos eficazes na geração de uma biomassa de alga de alto teor de gordura (por exemplo, mais do que 67 % de teor de gordura)) foi também testado e executado foi em grande escala e também como uma alimentação em batelada (desse modo, permitindo a modificação e controle de quantidades de nitrogênio, fósforo, potássio, e carbono durante a execução).

[00139] Uma cultura de Schizochytrium limacinum foi obtida e ar-mazenada em 1,5 mL de cri of rasco netes a -80 °C. Para cada cultura, um cri of rasco nete foi descongelado e assepticamente adicionado ao fraco de agitação de 1,0 L de meios. Os meios no frasco de 1 L conti-nham os componentes como mostrado na Tabela 5:

Tabela 5. Meios usados para 1,0 L de cultura.

[00140] Os teores dos frascos de agitação contendo Schizochytrium limacinum nos meios foram mantidos a 30°C e agitados a 250 RPM até o momento em que as algas tivessem entrado em fase de crescimento exponencial/logarítmico, porém antes da depleção de glicose nos meios (geralmente 72 a 144 horas).

[00141] Os teores de frascos de cultura de 1L foram em seguida assepticamente transferidos em garrafas aspirador de 2,0 L com co-nectores estéreis que foram usados para se conectar aos vasos grandes (40 L ou 27 L ou 18 L de vasos). Desse modo, as culturas de frasco de cultura de 1L foram usados como inóculo e assepticamente adicionados a um vaso de semente (40 L ou 27 L ou 18L) contendo os meios descritos na Tabela 6 abaixo:

Tabela 6. Meios usados para 18 L ou 27 L, primeiras culturas de semente.

[00142] O primeiro estágio de semente (40/18/27L) foi executado a 30 C, sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a ou acima de 10 %, e até pelo menos 20 g/L de glicose serem consumidos. Quando desenvolvido sob condições estéreis, nenhum controle de pH foi requerido. De preferência, o pH permaneceu dentro de uma faixa saudável durante todo o processo de fermentação. O primeiro estágio de semente (40/18/27L) foi considerado concluído quando o crescimento da alga foi dentro do estágio de crescimento exponencial/log, a glicose não tinha sido esgotada dos meios, porém pelo menos 20 g/L de glicose tinham sido consumido (em geral, isto ocorreu entre cerca de 24 e 48 horas). Um vaso grande (4000/2000L) foi feito pronto para o primeiro estágio de cultura de semente (por exemplo, foi carregado com meios e conduzido para 30°C sob condições estéreis).

[00143] Na conclusão da primeira cultura de semente, os teores do vaso de cultura de primeiro estágio de semente (40/18/27L) foi transferido para um vaso com pelo menos 2.000L meios descritos na Tabela 7 abaixo:

Tabela 7. Meios usados para 4.000/2000L, segunda cultura de se-mente.

[00144] Esta segunda cultura de estágio de semente (4000/2000L) foi executada a 30°C, sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a ou acima de 10 %, e até pelo menos 20 g/L de glicose foram consumidos. Quando desenvolvida sob condições estéreis, nenhum controle de pH foi requerido. De preferência, o pH permaneceu dentro de uma faixa saudável durante todo o processo de fermentação. O segundo estágio de semente (4000/2000L) foi consi-derado concluído quando o crescimento da alga foi dentro do estágio de crescimento exponencial/log, a glicose tinha sido esgotada dos meios, porém pelo menos 20 g/L de glicose tinham sido consumidos (em geral, isto ocorreu entre cerca de 24 a 48 horas).

[00145] Na conclusão da segunda cultura de semente (4000/2000L), os teores da segunda cultura de semente foram assep- ticamente transferidas em um terceiro vaso de cultura com um volume variando entre 70.000 L a 220.000 L de meios estéreis a 30°C como descrito na Tabela 8 abaixo:

[00146] Quando 30 g/L de glicose tinham sido consumidos pela al- ga no terceiro vaso de cultura (vaso de 70.000-220.000 L), fornecimento de alimentação em bateladas e glicose foram iniciados. A glicose foi mantida a 10 g/L durante a cultura em grande escala de algas no terceiro vaso de cul-tura (vaso de 70.000 a 220.000 L). Como descrito na Tabela 9 abaixo, a ali-mentação usada para o processo de alimentação em bateladas continha:

Tabela 9. Alimentação usada para o processo de alimentação em batelada.

[00147] O suprimento de alimentação em bateladas foi adicionado durante um período de 34 horas. Embora uma compreensão do mecanismo não é necessária para praticar a presente invenção, e ao mesmo tempo em que a presente invenção não está limitada a qualquer mecanismo de ação, em algumas modalidades, este período de tempo foi identificado com base na observação de que levou ~ 20 horas para a alimentação iniciar (para 30 g/L de glicose serem consumidos pelas algas presentes no terceiro vaso de cultura). A alimentação foi em seguida interrompida (por exemplo, em torno de 54 horas log) a fim de permitir que os nutrientes sejam removidos (consumidos) a partir dos meios. A colheita da biomassa de alga ocorreu na terminação do cres- cimento exponencial, que ocorre geralmente entre as horas log 66 a 76.

[00148] O caldo de cultura foi dessentimentado centrifugado sob condições para obter 15 a 30 % de sólidos, com o spray concentrado secado para remover água para uma umidade final menor do que 5%.

[00149] Os resultados de várias culturas de grande escala, inde-pendentes são mostrados na Figura 1 e tabelas 10 a 12 abaixo:

Tabela 10. Resultados de cultura de produção em grande escala. *amostra colhida em leito ** problemas de controle de processo com esta batelada o F1-2-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 93,700 L o F1-3-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 84.000 L o F1-4-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 92,300 L o F1-5-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 82,300 L o F1-6-11 ■ Teve um volume de batelada de 80.000 L e um volume de colheita de 83,600 L o F2-1-11 ■ Teve um volume de batelada de 110.000 L e um volume de colheita de 113,000 L o F2-2-11 ■ Teve um volume de batelada de 110.000 L e um volume de colheita de 125.600 L

[00150] A biomassa gerada a partir da cultura de alimentação em bateladas, de grande escala foi caracterizada, incluindo análise do teor de gordura total (gordura saturada e insaturada); umidade, teor de ácido docosaexaenoico (DHA), teor de ácido palmítico, teor de proteína crua e teor de cinza (Veja, por exemplo, Fat content and/Mistura - AOCS Am 5-04 ‘Rapid Determination of Oil/Fat Utilizing High Temperature Solvent Extraction’ v. 3/31/10; DHA/Palmitico - AOCS Method Ce 1b-89 e AOAC Method of Analysis 991.39; Protein - AOAC 990.03; Ash - AOAC 942.05 Volume ajustado de biomassa (g/L) - Stone, e outro, Dry Weight Measurement of Microbial Biomass e Measurement Variablity Analysis. Biotechnology Techniques. Volume 6: 207- 212.

Tabela 11. Caracterização de culturas de grande escala

Tabela 12. Caracterização de cu Ituras de grande escala

[00151] Adicionalmente, o perfil de ácido graxo da biomassa foi ca- . 8W9006^’de2 ’ petição racterizado. Como mostrado na Figura 2, o perfil de ácido graxo de cada biomassa de alga gerada é altamente similar/consistente, independente do teor de gordura total da biomassa. Um perfil de ácido graxo de compósito, levando em consideração os perfis coletivos de todas as amostras analisadas, é fornecido na Figura 3.

[00152] O perfil de glicerídeo foi também determinado para cada biomassa de alga. Do teor de glicerídeo total da biomassa, cerca de 4 a 8 % foram diglicerídeos, menos do que 1 % de glicerol, cerca de 3 a 7 % de monoglicerídeos e cerca de 84 a 88 % de triglicerídeos.

EXEMPLO 3 Colheita de biomassa

[00153] Os experimentos conduzidos durante o desenvolvimento de modalidades da invenção identificaram que os níveis de gordura total aumentados em uma biomassa causou problemas significantes com respeito à centrifugação da biomassa de alga. A recuperação de teor de biomassa após centrifugação variou de apenas cerca de 45 a 85 % de peso de biomassa total. Isto é mostrado, por exemplo, na Tabela 13 abaixo:

Tabela 13. Comparação de Gordura e Proteína produzida a partir da amostra direta colhida versus o produto seco por spray. *amostra colhida em leito ** problemas de controle de processo com esta batelada F1-2-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 93.700 L F1-3-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 84.000 L F1-4-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 92,300 L F1-5-11 ■ Teve um volume de batelada de 70.000 L e um volume de colheita de 82,300 L F1-6-11 ■ Teve um volume de batelada de 80.000 L e um volume de colheita de 83,600 L F2-1-11 ■ Teve um volume de batelada de 110.000 L e um volume de colheita de 113,000L F2-2-11 ■ Teve um volume de batelada de 110.000 L e um volume de colheita de 125.600L

[00154] Os problemas de recuperação foram identificados ser atribuíveis ao aumento na quantidade de lipídeo de baixa densidade/óleo na biomassa. Desse modo, os experimentos foram conduzidos durante modalidades da invenção em um esforço para tratar este problema.

[00155] Um método que apresentou a capacidade de realçar a re-cuperação da biomassa foi resfriar a cultura compreendendo a bio- massa de alga antes da centrifugação. Embora uma compreensão de um mecanismo não seja necessária para praticar a invenção, e a invenção não está limitada a qualquer mecanismo particular de ação, em algumas modalidades, a refrigeração da cultura aumentou a densidade do lipídio/óleo e permitiu uma recuperação maior da biomassa.

[00156] Os experimentos foram conduzidos a fim de determinar os efeitos da refrigeração à biomassa antes da centrifugação.

[00157] Experiência de laboratório um: 2 galões de caldo coletados e armazenados a 7 a 8 C durante mais 16 horas. Oito tubos centrífugos de 50 ml X foram coletados e colocados em um banho de água para obter temperaturas alvo descritas na tabela 14 abaixo. Todas as amostras foram centrifugadas a 5000 rpm durante 5 minutos.

Tabela 14. Resultados de centrifugação e temperatura de cultura de experiência 1.

[00158] Experiência de laboratório 2: Amostras de caldo fresco foram coletadas e testadas sobre uma faixa de temperatura de 10 a 30 C. Elas não foram refrigeradas durante a noite em uma experiência 1. Todas as amostras foram deixadas assentar-se em um banho de água gelada para a temperatura-alvo. As amostras foram centrifugadas a 5000 rpm durante 5 minutos.

Tabela 13. Resultados de centrifugação e temperatura de cultura de experiência 2.

[00159] Como descrito no exemplo 2 e figura 1, durante produção em grande escala, a refrigeração da biomassa antes da recuperação (centrifugação) induz um aumento significante na recuperação total da biomassa. Múltiplos ciclos em grande escala foram concluídos com recuperação total de aproximadamente 95 %.

[00160] Todas as publicações e patentes mencionadas na especificação acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações das composições e métodos descritos da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica sem afastar-se do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicado não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção, que são óbvios para aqueles nos campos relevantes, são destinadas a ser incluídas no escopo da presente invenção.

Claims

1. Processo de preparação de uma biomassa de alga com-preendendo mais de 67% de gordura total, compreendendo cultivar a cultura de algas em dois ou mais tipos de meio de cultura de uma ma-neira sequencial, em que a dita cultura é caracterizada pelo fato de que o cultivo é em dois estágios com dois meios de cultura diferentes de uma maneira sequencial, o processo compreendendo: (i) cultivar, em um primeiro estágio, a alga em um primeiro meio de cultura compreendendo 50 g/L de uma fonte de carbono, 7,5 g/L de extrato de levedura, 0,15 g/L de sulfato de magnésio, 0,15 g/L de cloreto de magnésio, e 0,15 g/L de cloreto de cálcio; e subsequen-temente, (ii) cultivar, em um segundo estágio, a alga em um segundo meio de cultura compreendendo 50 g/L de uma fonte de carbono, 7,5 g/L de um extrato de levedura, 1 g/L de uma segunda fonte de nitrogênio, 0,25 g/L de fosfato de monopotássio, 4,0 g/L de sulfato de magné-sio, 2 g/L de cloreto de magnésio, 2 g/L de cloreto de cálcio, e menos que 4g/L de cloreto de sódio, em que o nitrogênio e fosfato estão em uma proporção de 7:1 a 4:1, e em que o tipo de alga é selecionado de um grupo consistindo de Thraustochytríum, Schizochytrium, e Auranti- ochytrium.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é um açúcar.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o açúcar é glicose.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por adicionalmente compreender cultivar as algas em um meio de cultura inicial contendo glicose, extrato de levedura e sal marinho antes de serem cultivadas no primeiro meio de cultura.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo meio de cultura é suplementado com um suprimento de alimentação em bateladas.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o suprimento de alimentação em bateladas compreende ureia e fosfato de monopotássio.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a biomassa de alga é colhida do meio de cultura entre 12 a 24 horas após cessação do processo de alimentação em bateladas.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a biomassa de alga é colhida do meio de cultura após todos os nutrientes terem sido removidos/consumidos do meio.

9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a biomassa de alga é colhida por meio de centrifugação do meio de cultura compreendendo a biomassa de alga.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracteriza-do pelo fato de que o meio de cultura é resfriado antes da colheita da biomassa de alga.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é resfriado para entre 5 e 25° C.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as algas são Schizochytrium limacinum.

13. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura inicial compreende 50 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de levedura, e 4 g/L de sal marinho.

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura compreendem realizar a cultura de algas a 30° C sob condições de fluxo de ar e agitação a fim de manter o oxigênio dissolvido a 10%.

15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as algas são cultivadas sob condições estéreis.

16. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que no segundo meio de cultura o magnésio e cálcio estão em uma proporção de 4,5:1 a 1:1.

17. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de nitrogênio é selecionada de ureia, pep- tona, extrato de malte, extrato de carne, milhocina, glutamato de sódio, acetato de amónio, sulfato de amónio, cloreto de amónio, nitrato de amónio e combinações dos mesmos.