EA027917B1 - Липидные композиции из водорослей и способы их получения и применения - Google Patents

Abstract

Изобретение касается композиций, содержащих водоросли с высоким содержанием липидов, и способов их получения и применения. В частности, изобретение касается биомассы водорослей с высоким содержанием липидов и полученных из неё липидных материалов, способов их получения, а также биотоплива (например, дизельного биотоплива) и пищевых композиций (например, кормов для животных), содержащих или произведенных из них. Композиции и способы изобретения находят применение в различных приложениях, включая биотопливо, пищевое применение (например, для человека и для животных), терапевтическое применение, а также в научных исследованиях.

Description

Настоящее изобретение касается композиций, содержащих водоросли с высоким содержанием липидов, и способов их получения и применения. В частности, изобретение касается биомассы водорослей с высоким содержанием липидов и полученных из неё липидных материалов, способов их получения, а также биотоплива (например, дизельного биотоплива) и пищевых композиций (например, кормов для животных), содержащих или произведенных из них. Композиции и способы изобретения находят применение в различных приложениях, включая биотопливо, пищевое применение (например, для человека и для животных), терапевтическое применение, а также в научных исследованиях.

Уровень техники

В течение последних нескольких лет производство биотоплива (например, дизельного биотоплива) из водорослей оказалось сферой интереса. В частности, это связано с тем, что для выращивания водорослей (биомассы водорослей) не требуется сельскохозяйственная земля высокого качества. Однако коммерческое производство биотоплива (например, дизельного биотоплива) из водорослей остается нерешенной проблемой.

Кроме того, за последние 50 лет изменились подходы к обеспечению животных кормами. Животных больше не кормят теми кормами или другими материалами, которые есть под рукой. Вместо этого рацион животных тщательно контролируется на общую питательную ценность и затраты. Очень часто животные на определенном рационе подвергаются контролю на показатели качества и откорма, при этом питательные компоненты корма подбираются так, чтобы добиться максимальной питательной ценности корма и оптимизировать показатели откорма животных.

Тем не менее, решающим фактором является стоимость. Идет постоянный поиск экономически эффективных кормов, не только для содержания животных, но во многих случаях для усиления откорма и повышения их ценности.

Сущность изобретения

Изобретение касается композиций, содержащих водоросли с высоким содержанием липидов, и способов их получения и применения. В частности, изобретение касается биомассы водорослей с высоким содержанием липидов и полученных из неё липидных материалов, способов их получения, а также биотоплива (например, дизельного биотоплива) и пищевых композиций (например, кормов для животных), содержащих или произведенных из них. Композиции и способы изобретения находят применение в различных приложениях, включая биотопливо, пищевое применение (например, для человека и для животных), терапевтическое применение, а также в научных исследованиях.

Соответственно, изобретением предусмотрен способ получения биомассы водорослей с требуемым высоким содержанием жира (например, по меньшей мере 67% общего жира), который включает культивирование водорослей в условиях, достаточных для получения биомассы водорослей с требуемым высоким содержанием жира. Изобретением установлены условия культивирования, при которых можно получить биомассу водорослей с требуемым уровнем общего жира (например, по меньшей мере 67% общего жира). Изобретением не налагаются ограничения на общее содержание жира (например, по весу) в биомассе водорослей, полученной согласно изобретению. В предпочтительном воплощении биомасса водорослей, полученная и/или используемая в соответствии с изобретением, имеет содержание жира по меньшей мере 67 мас.%. Однако изобретением также предусмотрены композиции и способы получения биомассы водорослей, содержащей большее (например, более 68, более 69, более 70, более 71, более 72, более 73, более 74, более 75, более 76, более 77, более 78, более 79, более 80, более 81, более 82, более 85% или больше) или меньшее (например, примерно 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54% или меньше) количество общего жира. Так, описанные здесь способы и композиции могут применяться для получения биомассы водорослей, содержащей любой желательный уровень общего содержания жира. В некоторых воплощениях биомасса водорослей культивируется в двух или нескольких типах культуральной среды последовательным образом. Например, в некоторых воплощениях одна культуральная среда из двух или нескольких культуральных сред содержит 50 г/л источника углерода, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и 0,15 г/л хлорида магния.

Изобретением не налагаются ограничения на источники углерода. Так, можно использовать различные источники углерода, в том числе такие углеводы, как глюкоза, фруктоза, ксилоза, сахароза, мальтоза или растворимый крахмал, а также олеиновую кислоты, жиры типа соевого масла, мелассу, глицерин, маннитол и ацетат натрия, хлопковую муку, глицерин, патоку и кукурузный экстракт. В некоторых воплощениях другая культуральная среда из двух или нескольких культуральных сред содержит 50 г/л источника углерода, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 4,0 г/л сульфата магния, 1 г/л мочевины, 2 г/л хлорида кальция, 2 г/л хлорида магния и 0,25 г/л однозамещенного фосфата калия. В некоторых воплощениях одна культуральная среда из двух или нескольких культуральных сред содержит источник углерода, дрожжевой экстракт и морскую соль. В некоторых воплощениях, как описано здесь, водоросли культивируют в первой культуральной среде (например, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт и морскую соль); переносят во вторую культуральную среду (например, содержащую глюкозу, дрожжевой экстракт,

- 1 027917 сульфат магния, хлорид кальция и хлорид магния) и инкубируют в ней; а затем переносят в третью культуральную среду (например, содержащую глюкозу, дрожжевой экстракт, сульфат магния, мочевину, хлорид кальция, хлорид магния и однозамещенный фосфат калия) и инкубируют в ней. В некоторых воплощениях в одну из культуральных сред подается подпитка. В предпочтительном воплощении подпитка подается в третью культуральную среду. Изобретением не налагаются ограничения на тип или продолжительность подпитки. В некоторых воплощениях подпитка включает мочевину и КН₂РО₄. Изобретением не налагаются ограничения на количество и/или соотношение компонентов среды, используемой при культивировании. Примеры того, какие компоненты могут использоваться в каждой из различных сред (например, первой культуральной среде, второй культуральной среде, периодической среде и среде подпитки), подробно описаны далее. В некоторых воплощениях биомассу водорослей собирают из культуры (например, из третьей культуральной среды) через 12-24 ч после прекращения процесса подпитки. В некоторых воплощениях биомассу водорослей собирают из третьей культуральной среды после удаления/расходования всех питательных веществ из среды. Изобретением не налагаются ограничения на то, каким образом собирают биомассу водорослей. Так, для сбора биомассы можно использовать различные способы, в том числе способы, описанные здесь. В некоторых воплощениях биомассу водорослей собирают путем центрифугирования. В некоторых воплощениях культуральную среду, содержащую биомассу водорослей, охлаждают перед сбором биомассы водорослей. Изобретением не налагаются ограничения на температуру, до которой охлаждают культуральную среду, содержащую биомассу водорослей перед сбором. Так, можно использовать различные температуры, в том числе температуры, описанные здесь. В некоторых воплощениях культуральную среду, содержащую биомассу водорослей, охлаждают до температуры между 5 и 25°С. Изобретением не налагаются ограничения на тип водорослей, используемых в изобретении. Так, можно использовать различные водоросли (например, независимо или в сочетании), в том числе те, что описаны здесь. В некоторых воплощениях водоросли представлены штаммом или видом из рода СЬ1оте11а, рода δοϊιίζοοίινίπιιιη или рода СтурШесоЛишт. В предпочтительном воплощении водоросли представлены δΠιίζοΠινΙπιιιη 1утасшит. В некоторых воплощениях первая культуральная среда содержит 50 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта и 4 г/л морской соли. В некоторых воплощениях вторая культуральная среда содержит 50 г/л глюкозы, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и 0,15 г/л хлорида магния. В некоторых воплощениях третья культуральная среда содержит 50 г/л глюкозы, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 4,0 г/л сульфата магния, 1 г/л мочевины, 2 г/л хлорида кальция, 2 г/л хлорида магния и 0,25 г/л однозамещенного фосфата калия. В некоторых воплощениях условия культивирования включают культивирование водорослей при 30°С при таких условиях подачи воздуха и перемешивания, чтобы уровень растворенного кислорода составлял примерно 10%. В некоторых воплощениях третья культуральная среда (например, культуральная среда, присутствующая в момент инокуляции главного ферментера, например, сосуда на 70000, 120000, 256000 л) содержит среду с исходным соотношением азот:фосфор:калий (Ν:Ρ:Κ)=46:13:8,5. В предпочтительном воплощении соотношение Ν:Ρ:Κ одинаково при периодическом режиме и культивировании с подпиткой. В некоторых воплощениях соотношение магний:кальций (Мд:Са) составляет 3:1 в культуральной среде, используемой при периодическом режиме и культивировании с подпиткой, хотя можно использовать и большие (например, 4:1, 4,5:1 или больше), и меньшие (например, 2,5:1, 2:1, 1,5:1 или меньше) соотношения. В другом воплощении соотношение хлорид:сульфат (С1₂:8О₄)=1:1 в культуральной среде используется и в периодическом режиме, и при культивировании с подпиткой, хотя можно использовать и большие (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 или больше), и меньшие (например, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или меньше) соотношения. В некоторых воплощениях соотношение сульфат:фосфат (§О₄:РО₄) в среде во время инокуляции главного ферментера (например, сосуда на 70000, 120000, 256000 л) составляет 16:1, хотя можно использовать и большие (например, 20:1, 25:1, 30:1, 32:1 или больше), и меньшие (например, 10:1, 8:1, 5:1, 3:1 или меньше) соотношения. В некоторых воплощениях общее соотношение сульфат:фосфат (§О₄:РО₄), которое подавалось и входило в подпитку, по окончании полного культивирования (например, включая инокулят, первую стадию посева, вторую стадию посева и культивирование в главном ферментере) с образованием биомассы водорослей, имеющей требуемое содержание жира (например, более 67% жира), составляет 5,3:1, хотя можно использовать и большие (например, 5,5:1, 5,7:1, 6:1, 7:1, 8:1 или больше), и меньшие (например, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3:1 или меньше) соотношения. В некоторых воплощениях соотношение хлорид:фосфат (С1₂:РО₄) в среде в момент инокуляции главного ферментера (например, сосуда на 70000, 120000, 256000 л) составляет 16:1, хотя можно использовать и большие (например, 20:1, 25:1, 30:1, 32:1 или больше), и меньшие (например, 10:1, 8:1, 5:1, 3:1 или меньше) соотношения. В некоторых воплощениях общее соотношение хлорид:фосфат (С1₂:РО₄), которое подавалось и входило в подпитку, по окончании полного культивирования (например, включая инокулят, первую стадию посева, вторую стадию посева и культивирование в главном ферментере) с образованием биомассы водорослей, имеющей требуемое содержание жира (например, более 67% жира), составляет 5,3:1, хотя можно использовать и большие (например, 5,5:1, 5,7:1, 6:1, 7:1, 8:1 или больше), и меньшие (например, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3:1 или меньше) соотношения.

Изобретением также предусмотрена биомасса водорослей, имеющая требуемое высокое содержание жира (например, общее содержание жира по меньшей мере 67% по массе). В некоторых воплощени- 2 027917 ях биомасса содержит 170-250 мг докозагексаеновой кислоты (ΏΗΑ) и/или 150-400 мг/г пальмитиновой кислоты. В некоторых воплощениях изобретением предусмотрена липидная композиция, пищевой продукт или другой материал, включающий биомассу водорослей (например, сухую биомассу водорослей) или её компонент (например, жирно-кислотный компонент). В некоторых воплощениях биомасса водорослей (например, сухая биомасса водорослей, например, полученная в соответствии с описанным здесь способом) содержит требуемое количество общего жира и/или других компонентов (например, более 68% общего жира, более 69% общего жира, более 70% общего жира, более 71% общего жира, более 72% общего жира, более 73% общего жира, более 74% общего жира, более 75% общего жира, более 76% общего жира, более 77% общего жира, более 78% общего жира). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, содержащая более 67% общего жира) подвергается сушке таким образом, чтобы влажность биомассы составляла менее 5% (например, менее 4,5%, менее 4%, менее 3,5%, менее 3%, менее 2,5%, менее 2% или менее 1,5%). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит 170-250 мг/г или больше докозагексаеновой кислоты (ΏΗΑ) (например, 170-180 мг/г ΏΗΑ, 180-190 мг/г ΏΗΑ, 190-200 мг/г ΏΗΑ, 200-210 мг/г ΏΗΑ, 210-220 мг/г ΏΗΑ, 220-230 мг/г СИЛ, 230-240 мг/г ΏΗΑ, 240-250 мг/г СИЛ или более 250 мг/г ΏΗΑ). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит 150-400 мг/г или больше пальмитиновой кислоты (название по ΙϋΡΑϋ: гексадекановая кислота) (например, 150-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 300-325, 325350, 350-375, 375-400 или более 400 мг/г). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит 300-600 мг/г или больше всех жирных кислот (например, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600 или более 600 мг/г жирных кислот). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит менее 15% белка (например, менее 14% белка, менее 13% белка, менее 12% белка, менее 11% белка, менее 10% белка, менее 9% белка или менее 8% белка). В некоторых воплощениях биомасса водорослей или её компонент по изобретению используется при производстве биотоплива (например, дизельного биотоплива). В некоторых воплощениях биомасса водорослей или её компонент по изобретению используется при получении пищевого продукта (например, корма для животных или компонента корма).

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлены данные, полученные при крупномасштабной продукции биомассы гетеротрофных водорослей в соответствии с аспектами изобретения.

На фиг. 2 представлен жирно-кислотный профиль биомассы водорослей, собранных из нескольких независимых крупномасштабных культур водорослей.

На фиг. 3 представлен сводный жирно-кислотный профиль собранной биомассы с использованием описанных здесь материалов и методов.

Определения

Термин фосфолипид в настоящем изобретении относится к органическим соединениям, имеющим следующую общую структуру:

о •о-—-с-—дГ о

где К¹ означает остаток жирной кислоты; К² означает остаток жирной кислоты или -ΟΗ; К³ означает -Η или азотсодержащее соединение холин (ΗΟΕΗ₂ΕΗ₂Κ+(ΕΗ3)₃ΟΗ), этаноламин (ΗΟΟΗ₂ΟΗ₂ΝΗ₂), инозитол или серин. К¹ и К² не могут одновременно означать ΟΗ. Если К³ означает -ΟΗ, то соединение представляет собой диацилглицерофосфат, а если К³ означает азотсодержащее соединение, то соединение представляет собой фосфатид типа лецитина, кефалина, фосфатидилсерина или плазмалогена.

Эфир фосфолипида в настоящем изобретении относится к фосфолипидам, имеющим простую эфирную связь в положении 1 глицеринового остова. Примеры эфиров фосфолипидов включают, без ограничения, алкилацилфосфатидилхолин (ААРС), лизо-алкилацитилфосфатидилхолин (ΕΑΑΡΟ) и алкилацилфосфатидилэтаноламин (ААРЕ). Неэфирные фосфолипиды не имеют эфирной связи в положении 1 глицеринового остова.

В настоящем изобретении термин омега-3-жирные кислоты относится к полиненасыщенным жирным кислотам, имеющим конечную двойную связь в углеводородной цепи между третьим и четвертым атомами углерода со стороны метильного конца молекулы. Неограничивающие примеры омега-3жирных кислот включают 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), 4,7,10,13,16,19- 3 027917 докозагексаеновую кислоту (ΌΗΑ) и 7,10,13,16,19-докозапентановую кислоту (ΌΡΑ).

Термины триацилглицерид, триглицерид и триацилглицерин и ΤΑΟ в настоящем изобретении относятся к сложным эфирам, происходящим из глицерина и трех жирных кислот, где жирная кислота означает карбоновую кислоту с длинным неразветвленным алифатическим хвостом (цепью), которая бывает насыщенной либо ненасыщенной. Пальмитиновая кислота является одним из примеров триацилглицерида.

В настоящем изобретении термины мас.%, (та/та) и мас.% и их грамматические эквиваленты относятся к количеству (проценту) данного вещества в композиции по массе. Например, композиция, содержащая 50 мас.%, фосфолипидов, означает, что масса фосфолипидов составляет 50% от общей массы композиции (т.е. 50 г фосфолипидов на 100 г композиции типа масла).

Термин водоросли в настоящем изобретении относится к одноклеточным или многоклеточным организмам, ранее причислявшимся к растениям, которые встречаются в пресной или соленой воде и бывают автотрофными или гетеротрофными, но у них отсутствуют настоящие стебли, корни и листья. В настоящем изобретении термин гетеротрофные относится к таким организмам, которые не могут синтезировать свою собственную пищу и зависят от органических веществ (например, сложных и/или простых органических веществ) для питания. Таким образом, термин гетеротрофные водоросли относится к таким водорослям, которые не могут синтезировать свою собственную пищу и зависят от органических веществ для питания. В настоящем изобретении термин аутотрофные относится таким организмам, которые способны синтезировать свою собственную еду из неорганических веществ, используя световую или химическую энергию. Применение термина водоросли также относится к микроводорослям и тем самым охватывает и значение микроводоросли. Термин композиция из водорослей относится к любым композициям, содержащим водоросли, как-то водным композициям, и не ограничивается водоемом или культурой, в которой культивируются водоросли. Композиция из водорослей может представлять собой культуру водорослей, биомассу водорослей, концентрат культуры водорослей или обезвоженную массу водорослей и может иметь жидкий, полутвердый или твердый вид. Нежидкая композиция водорослей может быть описана в терминах влажности или содержания твердых веществ. Культура водорослей есть такая композиция из водорослей, которая содержит живые водоросли. Термин водоросли включает в себя макроводоросли (широко известные как морские водоросли) и микроводоросли.

В настоящем изобретении термины биомасса водорослей или биомасса относятся к совокупности или массе клеток водорослей, растущих на данном участке или в экосистеме в данный момент времени. Участок или экосистема может представлять собой природную среду (например, водоем) или искусственную среду (например, в ферментере или биореакторе, например, открытом или закрытом).

В настоящем изобретении термин общий жир относится к сумме триглицеридов, фосфолипидов, сложных эфиров воска и стеринов, содержащихся в материале. Например, содержание общего жира в биомассе водорослей означает сумму триглицеридов, фосфолипидов, сложных эфиров воска и стеринов, содержащихся в биомассе. Кроме того, общий жир включает как насыщенные, так и ненасыщенные жиры.

В настоящем изобретении термин консервант относится к средствам, которые увеличивают срок хранения продуктов питания и непродовольственных товаров путем замедления или предотвращения ухудшения вкуса, запаха, цвета, текстуры, внешнего вида, пищевой ценности или безопасности. Консервант не обязательно обладает летальным, необратимым действием, приводящим к частичному или полному разрушению или потере жизнеспособности микробных клеток. Таким необратимым действием, которое иногда называют бактерицидным действием, обладают стерилизирующие вещества, дезинфицирующие средства, спорицидные, вироцидные и туберкулоцидные средства. Напротив, консервант может обладать ингибирующим или бактериостатическим действием, которое является обратимым, так что микробы-мишени могут возобновить размножение при удалении консерванта. Основные различия между консервантами и дезинфицирующими средствами заключаются прежде всего в способе действия (консервант предотвращает рост, а не убивает микроорганизмы) и времени экспозиции (для действия консерванта требуются дни и месяцы, тогда как для дезинфицирующих средств достаточно лишь нескольких минут).

В настоящем изобретении термин дрожжи и дрожжевые клетки относится к эукариотическим микроорганизмам, относящимся к царству грибов, имеющих клеточную стенку, клеточную мембрану и внутриклеточные компоненты. Дрожжи не образуют определенную таксономическую или филогенетическую группировку. В настоящее время известно около 1500 видов; считается, что описан только 1% от всех видов дрожжей. Термин дрожжи часто применяется как синоним 8. ссгсуыас, но филогенетическое разнообразие дрожжей проявляется в том, что их размещают как в отделе А§сотусо1а, так и Βαδίάίотусо!а. Почкующиеся дрожжи (настоящие дрожжи) относятся к порядку 8ассНаготусс1а1с5. Большинство видов дрожжей размножаются бесполым путем почкования, хотя некоторые размножаются делением. Дрожжи являются одноклеточными, хотя некоторые виды становятся многоклеточными посредством образования цепочки соединенных почкующихся клеток, известных как псевдогифы или ложные гифы. Размер дрожжей может сильно различаться в зависимости от вида, как правило, он составляет 3-4 мкм в диаметре, хотя некоторые дрожжи могут достигать более 40 мкм.

- 4 027917

В настоящем изобретении термины обогащенные селеном дрожжи и селенизированные дрожжи относятся к таким дрожжам (например, 8ассЬатотусс8 ссгсуыас). которые культивируются в среде, содержащей неорганические соли селена. Настоящее изобретение не налагает ограничений на используемые соли селена. Так, в настоящем изобретении предусматривается использование разнообразных солей селена, в том числе селенита натрия, селената натрия, селенита кобальта или селената кобальта. В качестве источника селена для обогащения дрожжей также можно использовать свободный селенометионин (например, не связанный с клетками или дрожжами), так как дрожжи инкорпорируют эту форму селена. При культивировании из-за химического сходства между селеном и серой дрожжи инкорпорируют селен вместо серы в те органические соединения, которые в норме содержат серу. Селенсодержащие соединения в таких препаратах дрожжей представлены селенометионином, который присутствует в такой форме, которая встраивается в полипептиды/белки. В таких препаратах количество общего клеточного селена, присутствующего в виде селенометионина, колеблется, но может составлять от 10 до 100%, 20-60%, 5075% и от 60 до 75%. Остальная часть органического селена в селенизированных препаратах дрожжей главным образом состоит из промежуточных соединений пути биосинтеза селенометионина. К ним относятся, без ограничения, селеноцистеин, селеноцистатионин, селеногомоцистеин и селеноаденозилселенометионин. Содержание остаточной неорганической соли селена в готовом продукте, как правило, весьма небольшое (< 2%). Однако настоящее изобретение не налагает ограничений на него, поскольку препараты, содержащие больше (например, от 2 до 70%) или меньше (например, от 0,1 до 2%), чем этот процент, также охватываются изобретением.

В настоящем изобретении термин 8ЕЕ-РЬЕХ относится к сухим, нежизнеспособным, обогащенным селеном дрожжам (например, 8ассЬототусс8 ссгсуыас с номером доступа СЫСМ 1-3060, СоИссйои №Чюпа1с бс СиНитск бс Мютоотдашктск (СЫСМ), ΙηδΙίΙυΙ РаЛсиг Рапх Франция), которые культивируются с подпиткой, обеспечивающей постепенную подачу тростниковой патоки и солей селена таким образом, чтобы свести к минимуму вредное действие солей селена на скорость роста дрожжей и позволяет оптимальное включение неорганического селена в клеточный органический материал. Остаточный неорганический селен удаляется (например, при помощи жесткого процесса промывки) и не превышает 2% от общего содержания селена.

В настоящем изобретении термин органический селен относится к любым органическим соединениям, в которых селен заменяет серу. Так, органический селен может относиться к любым таким соединениям, которые подвергаются биосинтезу у дрожжей, или же он может относиться к свободным органическим селеносодержащим соединениям, которые синтезируются химическим путем. Примером последних является свободный селенометионин. В настоящем изобретении термин неорганический селен в общем относится к любым солям селена (например, селениту натрия, селенату натрия, селениту кобальта и селенату кобальта). Существует также ряд других источников неорганического селена (например, те, что перечислены в справочнике Мсгск 1пбсх). Селенизированные дрожжи можно получить с помощью источника неорганического селена, включая, без ограничения, селенит натрия, селенат натрия, селенит кобальта, селенат кобальта, селеновую кислоту, селенистую кислоту, бромид селена, хлорид селена, гексафторид селена, оксид селена, оксибромид селена, оксихлорид селена, оксифторид селена, сульфиды селена, тетрабромид селена, тетрахлорид селена и тетрафторид селена.

В настоящем изобретении термин клеточная стенка дрожжей, а также сокращенно УС^, относится к клеточной стенке дрожжевых организмов, которая окружает плазматическую мембрану и внутриклеточные компоненты дрожжей. Клеточная стенка дрожжей включает в себя как наружный слой (в основном маннан), так и внутренний слой (в основном глюкан и хитин) клеточной стенки дрожжей. Функция клеточной стенки состоит в обеспечении структуры и защите метаболически активной цитоплазмы. В клеточной стенке дрожжей располагаются сигнальные пути и пути распознавания. Состав клеточной стенки дрожжей колеблется от штамма к штамму и зависит от условий роста дрожжей.

В настоящем изобретении термин очищенный или очистить относится к удалению компонентов из образца. Например, клеточные стенки дрожжей или экстракты клеточной стенки дрожжей очищают путем удаления компонентов, не относящихся к клеточной стенке дрожжей (например, плазматической мембраны и/или внутриклеточных компонентов дрожжей); их также очищают путем удаления примесей или других веществ, отличных от клеточной стенки дрожжей. Удаление компонентов, не относящихся к клеточной стенке дрожжей и/или примесей, приводит к повышению содержания клеточной стенки дрожжей или её компонентов в образце.

В настоящем изобретении термин ίη у1уо относится к таким исследованиям и/или экспериментам, которые проводятся на живых организмах и протекают внутри биологических организмов.

В настоящем изобретении термин ίη уйго относится к искусственной среде вне живых организмов и к таким биологическим процессам или реакциям, которые в норме протекают в организме, но проводятся в искусственной среде. Среда ίη уйго может включать, без ограничения, пробирки и культуры клеток.

В настоящем изобретении термин высокоэффективная жидкостная хроматография и термин НРЬС относятся к разновидности жидкостной хроматографии для разделения соединений. Соединения растворяют в растворе. Соединения разделяют путем внесения пробы образца через инжектор на колон- 5 027917 ку. Установка для НРЬС содержит резервуар для подвижной фазы, насос, инжектор, разделительную колонку и детектор. Присутствие аналитов в вытекающей из колонки жидкости отмечается по количественным изменениям показателя преломления, поглощения ИУ-У18 при заданной длине волны, флуоресценции после возбуждения при подходящей длине волны или электрохимического ответа.

В настоящем изобретении термин сканирующая электронная микроскопия и термин 8ЕМ относятся к применению такого типа электронного микроскопа, который дает изображения поверхности образца путем сканирования его пучком электронов с высокой энергией в режиме растрового сканирования. Электроны взаимодействуют с атомами, составляющими образец, и выдают сигналы, которые содержат информацию о топографии поверхности образца, составе и других свойствах, таких как электропроводность.

В настоящем изобретении термин фиксирующее средство относится к таким химическим веществам, которые способны фиксировать одно вещество с другим так, чтобы зафиксировать, стабилизировать или иным образом сохранить субстанцию в её нынешнем виде, чтобы предохранить вещество от разрушения или иного изменения. Фиксирующие средства часто применяются в сканирующей электронной микроскопии (8ЕМ) при подготовке образца. Первичное фиксирующее средство: в настоящем изобретении термин первичное фиксирующее средство означает первое фиксирующее средство, используемое для фиксации субстанции. Вторичное фиксирующее средство: в настоящем изобретении термин вторичное фиксирующее средство означает второе фиксирующее средство, используемое для фиксации субстанции. Третичное фиксирующее средство: в настоящем изобретении термин третичное фиксирующее средство означает третье фиксирующее средство, используемое для фиксации субстанции.

В настоящем изобретении термин аналит относится к атомам, молекулам, группе атомов и/или молекул, субстанции или химическому компоненту. Аналит сам по себе невозможно измерить; можно лишь определить какие-то аспекты или свойства аналита (физические, химические, биологические и др.) аналитическим методом типа НРЬС. Например, невозможно измерить стул (анализируемый компонент) сам по себе, но можно измерить высоту, ширину и т.д. стула. Также нельзя измерить микотоксин, но можно измерить флуоресценцию микотоксина, которая связана с его концентрацией.

В настоящем изобретении термин сигнал вообще используется в отношении любого детектируемого процесса, который указывает на то, что произошла реакция (например, связывание антитела с антигеном). Сигналы можно оценивать и качественно, и количественно. Примеры различных типов сигналов включают, без ограничения, радиоактивные сигналы, флуориметрические сигналы или колориметрические сигналы продуктов/реагентов.

В настоящем изобретении термин биодоступность относится к той доли молекул или компонентов, которая доступна для организма или попадает в системный кровоток. При внутривенном введении молекул или компонентов их биодоступность составляет 100%. Однако при введении молекул или компонентов другими способами (например, перорально) их биодоступность уменьшается (вследствие неполного поглощения и пресистемного метаболизма). В отношении питания биодоступность относится к скорости всасывания и использования питательных веществ. К примеру, различные формы одного и того же питательного вещества могут обладать различной биодоступностью.

В настоящем изобретении термин эффективное количество относится к такому количеству композиции, которое достаточно для получения выгодных или требуемых результатов. Эффективное количество может вводиться и/или комбинироваться с другим материалом за один или несколько приемов или дозировок и не должно ограничиваться определенной композицией или способом введения.

В настоящем изобретении термин переваривание относится к превращению пищи, кормов или других органических соединений в усваиваемую форму; к размягчению, разложению или разрушению под действием нагревания и влаги или химического воздействия.

В настоящем изобретении термин пищеварительная система относится к такой системе (в том числе желудочно-кишечному тракту), в которой может происходить или происходит переваривание.

В настоящем изобретении термин корма относится к таким материалам, которые потребляются млекопитающими (например, людьми и животными) и поставляют энергию и/или питательные вещества в рационе млекопитающих. Примеры кормов включают, без ограничения, То1а1 М1хеб Кайои (ТМК), фураж, гранулы, концентраты, премиксы, сопродукты, зерно, винокуренное зерно, патоку, клетчатку, корма, травы, сено, ядрышки, листья, муку, растворимые компоненты и добавки.

В настоящем изобретении термины пищевая добавка, кормовая добавка, композиция пищевой добавки и т.п. относятся к пищевым продуктам, составленным в виде пищевой или кормовой добавки, которая используется как часть рациона. Типичные композиции пищевых добавок описаны здесь.

В настоящем изобретении термин животное относится к представителям царства животных. К ним относятся, без ограничения, домашний скот, сельскохозяйственные животные, домашние животные, комнатные животные, морские и пресноводные животные и дикие животные.

В настоящем изобретении термины вводить и введение относятся к акту введения субстанций, включая лекарственные препараты, пролекарства или другие средства, либо к терапевтической обработке субъекта (например, субъекта или клеток, тканей и органов ίη νίνο, ίη νίίτο или ех νίνο). Типичными способами введения являются введение через глаза (офтальмологическое), рот (пероральное), кожу (то- 6 027917 пическое или трансдермальное), нос (интраназальное), легкие (ингаляционное), слизистые оболочки полости рта (буккальное), уши, ректальное, вагинальное, посредством инъекции (например, внутривенно, подкожно, внутрь опухоли, внутрибрюшинно и т.д.) и др.

В настоящем изобретении термин совместное введение и термин вводится совместно означает введение субъекту по меньшей мере двух средств или лекарств и/или материала (например, кормов). Совместное введение двух или нескольких средств или лекарств может быть одновременным или же первое средство/лекарство может вводиться перед вторым средством/лекарством.

В настоящем изобретении термин лечение относится к мерам, предпринимаемым для улучшения и/или снятия симптомов заболевания. Термин лечение относится и к терапевтическому лечению, и к профилактическому лечению или профилактическим мероприятиям. Например, субъекты, которые могут получить пользу от лечения с помощью композиций и способов настоящего изобретения, включают тех, у которых уже имеется заболевание и/или расстройство, а также тех, у которых заболевание и/или расстройство должно быть предотвращено (например, с помощью профилактического лечения по настоящему изобретению).

В настоящем изобретении термин подверженный риску заболевания относится к таким субъектам, которые предрасположены к определенному заболеванию. Такая предрасположенность может быть генетической (например, определенная генетическая тенденция к возникновению заболеваний типа наследственных заболеваний) или вследствие других факторов (например, возраста, веса, условий окружающей среды, воздействия вредных соединений, присутствующих в окружающей среде, и т.д.).

В настоящем изобретении термины болезнь, инфекция и патологическое состояние или реакция относятся к таким состояниям, признакам и/или симптомам, которые связаны с ухудшением нормального состояния живых животных или любых из их органов или тканей, что нарушает или изменяет выполнение нормальных функций и может быть реакцией на факторы окружающей среды (как-то недоедание, промышленные загрязнения или климат, в том числе микотоксикоз), определенные возбудители инфекций (например, черви, бактерии или вирусы) или наследственные дефекты организма (как-то различные генетические аномалии) либо комбинации этих и других факторов.

В настоящем изобретении термин страдает заболеванием относится к таким субъектам (например, животным или людям), которые болеют определенным заболеванием, и не ограничивается какими-то конкретными признаками или симптомами либо заболеваниями.

В настоящем изобретении термин токсичный относится к любым вредным, оказывающим вредное влияние или иные отрицательные эффекты на субъекта, клетки или ткани по сравнению с теми же клетками или тканями до контакта или введения токсина/яда.

В настоящем изобретении термин фармацевтическая композиция относится к комбинации активного вещества с носителем, инертным или активным, в результате чего композиция особенно подходит для диагностического или терапевтического применения ίη νίίτο, ίη νίνο или ех νίνο.

В настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемый и термин фармакологически приемлемый относятся к таким композициям, которые практически вызывают не больше известных отрицательных реакций, чем известных положительных реакций.

В настоящем изобретении термин инокуляция относится к акту введения микроорганизмов или суспензии микроорганизмов (например, водорослей, дрожжей, грибов, бактерий и т.д.) в культуральную среду. Инокуляция является актом или процессом введения чего-либо в ту среду, в которой оно будет расти или размножаться.

В настоящем изобретении термины инокулят и рассада относятся к клеткам, используемым при инокуляции, типа клеток, добавляемых для запуска культуры.

В настоящем изобретении термин центрифугирование относится к разделению молекул по размеру или плотности с помощью центробежных сил, возникающих при вращении ротора, которые приводят объект во вращение вокруг неподвижной оси при применении силы перпендикулярно этой оси. Центрифуга работает по принципу осаждения, при этом центростремительное ускорение используется для равномерного распределения веществ с большей и меньшей плотностью в слои с различной плотностью.

В настоящем изобретении термин концентрация относится к количеству вещества в определенном пространстве. Концентрация обычно выражается в единицах массы на единицу объема. Для разбавления раствора нужно добавить больше растворителя или уменьшить количество растворенного вещества (например, путем избирательного испарения, распылительной сушки, сушки вымораживанием, например, концентрированный экстракт клеточной стенки дрожжей или концентрированный экстракт модифицированной клеточной стенки дрожжей). В противоположность этому для концентрирования раствора нужно добавить больше растворенного вещества или уменьшить количество растворителя.

В настоящем изобретении термин слой относится к обычно горизонтальным отложениям, организованным в виде слоя материала, образующего налегающую часть или сегмент, полученный после разделения методом центрифугирования в соответствии со свойствами плотности материала.

В настоящем изобретении термин собирать относится к акту сбора или объединения продуцируемых материалов (например, объединения материалов, полученных в процессе продуцирования у дрожжей).

- 7 027917

В настоящем изобретении термин высушивание относится к сушке распылением, сублимационной сушке, воздушной сушке, вакуумной сушке или любым другим процессам, которые уменьшают или устраняют жидкость в веществе.

В настоящем изобретении термин сушка распылением относится к широко используемому методу сушки веществ, содержащих жидкость, с помощью горячего газа для испарения жидкости, чтобы уменьшить или устранить жидкость в веществе. Иными словами, материал сушат посредством распыления или пульверизации в струе нагретого сухого воздуха.

В настоящем изобретении термины сублимационная сушка и лиофилизация и термин криосушка означают удаление растворителя из вещества в замороженном состоянии путем сублимации. Это осуществляется путем замораживания материала, подлежащего сушке, ниже эвтектической точки, и затем подведения скрытой теплоты сублимации. Точный контроль подвода теплоты позволяет сушить из замороженного состояния без обратного плавления продукта. В практическом применении этот процесс ускоряется и точно контролируется в условиях пониженного давления.

В настоящем изобретении термин сухой сыпучий порошок относится к сыпучему сухому порошку, например, такому порошку, который можно высыпать из контейнера, сумки, сосуда и т.д. без помех из-за больших комков.

В настоящем изобретении термин измельчение означает уменьшение размера частиц при помощи удара, скалывания или растирания.

В настоящем изобретении термин образец применяется в широком смысле, включая образцы или культуры, полученные из любого источника, а также биологические образцы или пробы окружающей среды. Биологические образцы могут быть получены из животных (включая человека) и охватывают жидкости, твердые вещества, ткани и газы. Биологические образцы включают препараты крови, такие как плазма, сыворотка и др. Пробы окружающей среды включают экологические материалы типа поверхностного вещества, почвы, воды, кристаллов и промышленных образцов.

Раскрытие сущности изобретения

Настоящее изобретение касается композиций, содержащих водоросли с высоким содержанием липидов, и способов их получения и применения. В частности, изобретение касается биомассы водорослей с высоким содержанием липидов и полученных из неё липидных материалов, способов их получения, а также биотоплива (например, дизельного биотоплива) и пищевых композиций (например, кормов для животных), содержащих или произведенных из них. Композиции и способы изобретения находят применение в различных приложениях, включая биотопливо, пищевое применение (например, для человека и для животных), терапевтическое применение, а также в научных исследованиях.

Соответственно, в одном аспекте изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей с высоким содержанием (например, по весу) общего жира. Например, как описано здесь, в некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей с требуемым высоким содержанием общего жира (например, более 60% общего жира), в отличие от традиционных способов получения, в которых биомасса водорослей содержит значительно меньший уровень общего жира (например, 60% общего жира или меньше). Большой проблемой получения биотоплива (например, дизельного биотоплива) из водорослей является то, чтобы биомасса производилась не за счет большего количества энергии, чем то, что содержится в конечном топливном продукте. Соответственно, в некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей, содержащей более 65% общего жира. В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей, содержащей более 66% общего жира. В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей, содержащей более 67% общего жира. В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей, содержащей более 68% общего жира. В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей, содержащей более 69% общего жира. В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей, содержащей более 70% общего жира. В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей, содержащей более 70% (например, более 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90% или больше) общего жира по весу. В некоторых воплощениях способа используется система закрытого биореактора (например, ферментера), хотя изобретение этим не ограничивается (например, в некоторых воплощениях можно использовать открытые биореакторы). В предпочтительном воплощении выращивание биомассы водорослей по изобретению проводится в асептических условиях. В другом предпочтительном воплощении водоросли выращивают (например, для получения биомассы водорослей с высоким содержанием жира, например, более 67% жира) в режиме процесса с подпиткой.

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ культивирования водорослей для получения биомассы водорослей с требуемым высоким содержанием общего жира (например, 67% общего жира или больше), как описано в примерах 1 и 2.

Например, в некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ культивирования водорослей, включающий культивирование водорослей поэтапно с тем, чтобы получить биомассу водорослей с требуемым высоким содержанием общего жира (например, 67% общего жира или больше). В некоторых

- 8 027917 воплощениях поэтапный процесс культивирования водорослей включает оттаивание хранящегося штамма водорослей и добавление (например, асептически) оттаявших водорослей в колбу на 1 л для встряхивания, содержащую среду, включающую источник углерода (например, сахар типа глюкозы), дрожжевой экстракт и морскую соль. В некоторых воплощениях источник углерода присутствует в концентрации 50 г/л, дрожжевой экстракт присутствует в концентрации 10 г/л и/или морская соль присутствует в концентрации 4 г/л. В некоторых воплощениях колба на 1 л, содержащая водоросли и среду, содержится при температуре 30°С со встряхиванием (например, при 100-400 об/мин) до тех пор, пока водоросли не войдут в экспоненциальную фазу роста, но еще не полностью израсходуют источник углерода (например, сахар типа глюкозы). Эксперименты, проведенные во время разработки воплощений изобретения, установили, что водоросли входят в экспоненциальную фазу роста, но еще не полностью расходуют источник углерода (например, сахар типа глюкозы) в период времени между 72-144 ч. Так, в некоторых воплощениях водоросли, культивированные в колбе на 1 л при 30°С в течение 72-144 ч при 100-400 об/мин (например, 250 об/мин) в среде, содержащей источник углерода (например, сахар типа глюкозы), дрожжевой экстракт и морскую соль, используют для инокуляции культуры первой стадии посева (например, в большем сосуде, например, сосуде на 40, 27 или 18 л). В некоторых воплощениях культуральная среда, используемая на первой стадии посева, содержит источник углерода (например, сахар типа глюкозы), дрожжевой экстракт, сульфат магния, хлорид кальция и/или хлорид магния. В предпочтительном воплощении культуральная среда, используемая на первой стадии посева, содержит 50 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и/или 0,15 г/л хлорида магния. В некоторых воплощениях культивирование на первой стадии посева проводится при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял 7-15% (например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%), хотя можно использовать и меньший или больший уровень растворенного кислорода. В предпочтительном воплощении культивирование на первой стадии посева проводится при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял примерно 10%. В некоторых воплощениях культура из первой стадии посева, содержащая водоросли и среду, содержится при 30°С и культивируется до тех пор, пока водоросли не войдут в экспоненциальную фазу роста и израсходуют по меньшей мере 20 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), но источник углерода еще не будет полностью израсходован. Эксперименты, проведенные во время разработки воплощений изобретения, установили, что водоросли входят в экспоненциальную фазу и расходуют по меньшей мере 20 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), но еще не полностью израсходуют источник углерода (например, сахар типа глюкозы) в период времени между 24-48 ч после инокуляции культуры на первой стадии посева. В некоторых воплощениях водоросли, культивированные на первой стадии посева при 30°С в течение 24-48 ч в среде, содержащей источник углерода (например, сахар типа глюкозы), дрожжевой экстракт, сульфат магния, хлорид кальция и хлорид магния, используют для инокуляции культуры на второй стадии в ещё большей ёмкости (например, сосуде на 2000 л). В некоторых воплощениях культуральная среда, используемая при культивировании на второй стадии посева, содержит источник углерода (например, сахар типа глюкозы), дрожжевой экстракт, сульфат магния, хлорид кальция и/или хлорид магния. В предпочтительном воплощении культуральная среда, используемая при культивировании на второй стадии посева, содержит 50 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и/или 0,15 г/л хлорида магния. В некоторых воплощениях культивирование на второй стадии посева проводится при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял 7-15% (например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%), хотя можно использовать и меньший или больший уровень растворенного кислорода. В предпочтительном воплощении культивирование на второй стадии посева проводится при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял примерно 10%. В некоторых воплощениях культура на второй стадии посева, содержащая водоросли и среду, содержится при 30°С и культивируется до тех пор, пока водоросли не войдут в экспоненциальную фазу роста и израсходуют по меньшей мере 20 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), но источник углерода еще не будет полностью израсходован. Эксперименты, проведенные при разработке воплощений изобретения, установили, что водоросли входят в экспоненциальную фазу и расходуют по меньшей мере 20 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), но еще не полностью израсходуют источник углерода (например, сахар типа глюкозы) в период времени между 24-48 ч после инокуляции культуры на второй стадии посева. В некоторых воплощениях водоросли, культивированные на второй стадии посева при 30°С в течение 24-48 ч в среде, содержащей источник углерода (например, сахар типа глюкозы), дрожжевой экстракт, сульфат магния, хлорид кальция и хлорид магния, используют для инокуляции очень большой ёмкости (например, сосуда на 70000 л, 120000 л, 220000 л или больше, например, основного ферментера), содержащей среду, используемую для дальнейшего культивирования/ферментации водорослей. В некоторых воплощениях после переноса культуры из второй стадии посева в очень крупный сосуд (например, основной ферментер) культуральная среда (например, порционная среда), присутствующая в очень крупном сосуде (например, в основном ферментере), содержит источник углерода (например, сахар типа глюкозы), дрожжевой экстракт, сульфат магния, мочевину, хлорид кальция, хлорид магния и/или одно- 9 027917 замещенный фосфат калия. В предпочтительном воплощении культуральная среда, используемая при крупномасштабном культивировании (например, в сосуде на 70000 л, 120000 л, 220000 л или больше, например, в основном ферментере), содержит 50 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 4,0 г/л сульфата магния, 1 г/л мочевины, 2 г/л хлорида кальция, 2 г/л хлорида магния и/или 0,25 г/л однозамещенного фосфата калия. В некоторых воплощениях крупномасштабное культивирование проводится при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял 7-15% (например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14%), хотя можно использовать и меньший или больший уровень растворенного кислорода. В предпочтительном воплощении крупномасштабное культивирование проводится при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял примерно 10%. В предпочтительном воплощении источник углерода (например, сахар типа глюкозы) поддерживается на уровне 10 г/л в течение какого-то периода времени (например, 1 или несколько дней, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или больше дней) (например, с использованием подпитки). Например, в некоторых воплощениях, после того, как водоросли в крупном сосуде израсходуют требуемое количество глюкозы (например, после того, как водоросли в крупном сосуде израсходуют 20-30 г/л глюкозы, например, израсходуют 30 г/л глюкозы), начинается подпитка глюкозой. Эксперименты, проведенные при разработке воплощений изобретения., установили, что подпитку нужно добавлять в течение примерно 34 ч, хотя можно использовать и более короткие (например, 32, 28, 24, 20 ч или меньше), и более длинные (например, 36, 38, 42, 46, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 ч или больше) промежутки времени. В других предпочтительных воплощениях по завершении процесса подпитки культивирование водорослей в крупных сосудах продолжают до тех пор, пока не будут израсходованы все питательные вещества из среды. Эксперименты, проведенные при разработке воплощений изобретения, установили, что питательные вещества истощаются из среды примерно через 12-24 ч после прекращения процесса подпитки. В некоторых воплощениях биомассу водорослей собирают из культуральной среды/бульона крупномасштабной культуры и используют, как описано здесь. В некоторых воплощениях бульон из крупномасштабной культуры центрифугируют, чтобы получить биомассу водорослей. В некоторых воплощениях бульон из крупномасштабной культуры охлаждают перед центрифугированием. Несмотря на то что для практики данного изобретения не требуется понимание механизма и данное изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом действия, в некоторых воплощениях охлаждение культурального бульона повышает плотность биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира (например, липидов/масел) и позволяет извлекать больше биомассы, чем без охлаждения культурального бульона (например, см. пример 3). Настоящее изобретение не налагает ограничений на температуру, до которой охлаждается крупномасштабная культура перед центрифугированием. В некоторых воплощениях крупномасштабная культура охлаждается до температуры 0-50°С, 5-40°С, 5-25°С, 5-15°С или 5-10°С.

Итак, в изобретении при культивировании водорослей используется как периодический режим, так и режим с подпиткой (например, сам по себе и/или после первой и/или второй стадии посева) для выращивания биомассы водорослей с требуемым содержанием жира (например, содержанием жира более 67%). Изобретение не налагает ограничений на индивидуальные компоненты, присутствующие в среде, используемой в периодическом режиме или с подпиткой. В некоторых воплощениях культуральная среда, присутствующая во время инокуляции основного ферментера (например, в сосуде на 70000 л, 120000 л, 220000 л), включает среду с исходным соотношением азот:фосфор:калий (Ν:Ρ:Κ)=46:13:8,5. В предпочтительном воплощении соотношение Ν:Ρ:Κ одинаково при культивировании в периодическом режиме и с подпиткой. В некоторых воплощениях соотношение магний:кальций (Мд:Са) составляет 3:1 в культуральной среде, используемой в периодическом режиме и с подпиткой. В другом воплощении соотношение хлорид:сульфат (С1₂:§О₄) составляет 1:1 в культуральной среде, используемой в периодическом режиме и с подпиткой. В некоторых воплощениях соотношение сульфат:фосфат (§О₄:РО₄) в среде во время инокуляции основного ферментера (например, сосуда на 70000 л, 120000 л, 220000 л) составляет 16:1. В некоторых воплощениях общее соотношение сульфат:фосфат (§О₄:РО₄), которое подавалось и входило в подпитку, по окончании полного культивирования (например, включая инокулят, первую стадию посева, вторую стадию посева и культивирование в главном ферментере) с образованием биомассы водорослей, имеющей требуемое содержание жира (например, более 67% жира), составляет 5,3:1. В некоторых воплощениях соотношение хлорид:фосфат (С1₂:РО₄) в среде во время инокуляции главного ферментера (например, сосуда на 70000, 120000, 256000 л) составляет 16:1. В некоторых воплощениях общее соотношение хлорид:фосфат (С1₂:РО₄) которое подавалось и входило в подпитку, по окончании полного культивирования (например, включая инокулят, первую стадию посева, вторую стадию посева и культивирование в главном ферментере) с образованием биомассы водорослей, имеющей требуемое содержание жира (например, более 67% жира), составляет 5,3:1.

Как описано ниже в примере 2, изобретением также предусмотрены композиции, включающие биомассу водорослей (например, сухую биомассу водорослей, например, полученную в соответствии с описанным здесь способом), содержащую требуемое количество общего жира и/или других компонентов. Например, в некоторых воплощениях изобретения предусмотрена биомасса водорослей (например, сухая биомасса), содержащая более 67% общего жира (например, более 68% общего жира, более 69%

- 10 027917 общего жира, более 70% общего жира, более 71% общего жира, более 72% общего жира, более 73% общего жира, более 74% общего жира, более 75% общего жира, более 76% общего жира, более 77% общего жира, более 78% общего жира). В некоторых воплощениях биомасса водорослей (например, содержащая более 67% общего жира) подвергается сушке таким образом, чтобы влажность биомассы составляла менее 5% (например, менее 4,5%, менее 4%, менее 3,5%, менее 3%, менее 2,5%, менее 2% или менее 1,5%). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит 170-250 мг/г или больше докозагексаеновой кислоты (ΌΗΑ) (например, 170180 мг/г ΌΗΑ, 180-190 мг/г ΌΗΑ, 190-200 мг/г ΌΗΑ, 200-210 мг/г ΌΗΑ, 210-220 мг/г ΌΗΑ, 220-230 мг/г ΌΗΑ, 230-240 мг/г ΌΗΑ, 240-250 мг/г ΌΗΑ или более 250 мг/г ΌΗΑ). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит 150-400 мг/г или больше пальмитиновой кислоты (название по ΐυΡΑΟ: гексадекановая кислота) (например, 150200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 300-325, 325-350, 350-375, 375-400 или более 400 мг/г). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит 300-600 мг/г или больше всех жирных кислот (например, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600 или более 600 мг/г жирных кислот). В некоторых воплощениях биомасса водорослей по изобретению (например, сухая биомасса с влажностью менее 5%) содержит менее 15% белка (например, менее 14% белка, менее 13% белка, менее 12% белка, менее 11% белка, менее 10% белка, менее 9% белка или менее 8% белка).

Изобретение не налагает ограничений на штаммы или виды водорослей, используемых в описанных здесь способах и композициях. Так, в изобретении находят применение различные водоросли, в том числе один или несколько видов из рода ТЬгаи81осЬу1гшт. В некоторых воплощениях водоросли представлены видами из рода СЫоге11а. В некоторых воплощениях водоросли представлены видами из рода 5>с1й/ос11у1пит. В некоторых воплощениях водоросли представлены видами из рода СгурИесобшшт. В некоторых воплощениях водоросли представлены ТНгаиШосНуПзит 51па1ит. ТНгаиШосНуПзит гокеит, ТЬгаи81осЬу1гшт аигеит, СгурИесобшшт соЬпи и/или ЛигапИосНуШит 5р. В предпочтительном воплощении в описанных здесь способах и композициях используется 5>с1и/ос11у1пит Нтасшит. Изобретение не налагает ограничений на типы липидов, вырабатываемых в изложенном здесь способе получения биомассы водорослей с повышенным уровнем липидов. В некоторых воплощениях липиды, образующиеся в способе изобретения, включают, без ограничения, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, докозапентаеновую кислоту (ΌΡΑ), докозагексаеновую кислоту (ΌΗΑ) и стеариновую кислоту. Эти липиды полезны для здоровья и животных, и человека, применяются для профилактики различных заболеваний типа сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний и в детском питании для правильного развития мозга и сетчатки глаз у детей.

В другом воплощении изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей с повышенным уровнем (например, более 67%) общего жира из различных видов водорослей (например, 5>с1и/осНуШит Нтастит), при этом способ включает культивирование водорослей в сосуде для первого посева, содержащем среду (например, содержащую 50 г/л источника углерода, например, сахара типа глюкозы, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и/или 0,15 г/л хлорида магния), перенос (например, асептически) культуры первого посева в культуральную среду для второго посева (например, содержащую 50 г/л источника углерода, например, сахара типа глюкозы, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и/или 0,15 г/л хлорида магния), перенос (например, асептически) культуры второго посева в сосуд для крупномасштабного культивирования, содержащий среду (например, в основной ферментер, например, сосуд на 70000 л, 120000 л, 220000 л, содержащий, к примеру, среду, содержащую 50 г/л источника углерода (например, сахара типа глюкозы), 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 4,0 г/л сульфата магния, 1 г/л мочевины, 2 г/л хлорида кальция, 2 г/л хлорида магния и/или 0,25 г/л однозамещенного фосфата калия), при этом уровень глюкозы в сосуде для крупномасштабного культивирования поддерживается на уровне 10 г/л в процессе подпитки, при этом клетки водорослей из крупномасштабной культуры собирают через 12-24 ч после прекращения процесса подпитки после того, как все питательные вещества из среды будут удалены/израсходованы.

В другом воплощении изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей с повышенным уровнем (например, более 67%) общего жира из различных видов водорослей (например, 5>с1и/осНуШит Нтастит), при этом культуральная среда (например, на каждой стадии ферментации, например, на стадии первого посева, на стадии второго посева и/или порционного культивирования с подпиткой) содержит источник углерода (например, сахар), дрожжевой экстракт, источник фосфата (например, однозамещенный фосфат калия), сульфат магния и/или сульфат цинка, источник азота (например, мочевину), хлорид магния и/или хлорид кальция. В предпочтительном воплощении изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей с повышенным уровнем (например, более 67%) общего жира из какого-либо штамма водорослей, при этом культуральная среда (например, на каждой стадии ферментации, например, на стадии первого посева, на стадии второго посева и/или порционного культивирования с подпиткой) содержит сахар, дрожжевой экстракт, однозамещенный фосфат калия, сульфат магния, сульфат цинка, мочевину, хлорид магния и/или хлорид кальция. Однако изобретение не налагает ограничений на тип питательных веществ, используемых в культуральной среде, в которой выравнива- 11 027917 ются водоросли. В некоторых воплощениях в среду добавляется один или несколько источников углерода. Примеры источников углерода включают, без ограничения, такие углеводы, как глюкоза, фруктоза, ксилоза, сахароза, мальтоза или растворимый крахмал, а также олеиновую кислоту, жиры типа соевого масла, мелассу, глицерин, маннитол и ацетат натрия, хлопковую муку, глицерин, патоку и кукурузный экстракт. В некоторых воплощениях в среду добавляется один или несколько источников азота. Примеры источников азота включают, без ограничения, природные источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, мясной экстракт, казеиновые аминокислоты и кукурузный экстракт, органические источники азота, такие как глутамат натрия и мочевина, или неорганические источники азота, такие как ацетат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, нитрат аммония, и сульфат натрия. В некоторых воплощениях в среду добавляется один или несколько источников фосфата. Примеры источников фосфата включают, без ограничения, фосфат калия и однозамещенный фосфат калия, неорганические соли, такие как сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат магния, сульфат железа, сульфат цинка и сульфат меди. В некоторых воплощениях в культуральную среду включают хлорид магния, хлорид кальция и/или витамины.

Изобретение не налагает ограничений на количество (например, концентрации) каждого из этих компонентов в культуральной среде. В некоторых воплощениях используется такое количество, которое не наносит вреда росту водорослей. В предпочтительном воплощении количество (например, концентрация и/или соотношение) каждого ингредиента в среде устанавливается на таком уровне (например, на каждой стадии ферментации, например, на стадии первого посева, на стадии второго посева и/или порционного культивирования с подпиткой), который способствует формированию водорослей с высоким содержанием жира (например, биомасса водорослей содержит 67% или больше жира). В некоторых воплощениях источник углерода (например, сахар) присутствует в культуральной среде в количестве от 20 до 120 г на 1 л среды. В других воплощениях источник углерода (например, сахар) присутствует в культуральной среде в количестве 30-70 г на 1 л среды. В еще других воплощениях источник углерода (например, сахар) присутствует в культуральной среде в количестве от 40 до 60 г на 1 л среды. В предпочтительном воплощении источник углерода (например, сахар) присутствует в культуральной среде в количестве примерно 50 г на 1 л среды. В некоторых воплощениях соотношение мочевины к однозамещенному фосфату калия (мочевина:КН₂РО₄) составляет примерно 5:0,1 (например, 4,5:0,1; 4:0,25; 3:0,25; 4:0,3; 5:0,3; 5:0,5; 4:0,5; 3:0,5; 2:0,5; или 1:0,5); хотя можно использовать и большие, и меньшие соотношения (например, 1:1, 1:2, 1:3 и т.д.). В предпочтительном воплощении соотношение мочевины к однозамещенному фосфату калия в культуральной среде составляет 4:1. В некоторых воплощениях культуральная среда не содержит хлорида натрия. В других воплощениях культуральная среда содержит хлорид натрия. В некоторых воплощениях соотношение сульфат магния:хлорид кальция (Мд§О₄:СаС1₂) составляет 1:1. В некоторых воплощениях соотношение сульфат магния:хлорид кальция (Мд§О₄:СаС1₂) составляет 1:2. Так, можно использовать различные соотношения сульфат магния:хлорид кальция (Мд8О₄:СаС1₂), в том числе 1:1; 1:1,125; 1:1,5; 1:1,75; 1:2; 1:2,125; 1:2,25; 1:2,5; 2,5:1; 2,25:1; 2,125:1; 2:1; 1,75:1; 1,5:1; 1,25:1 или 1,125:1. В предпочтительном воплощении соотношение сульфат магния:хлорид кальция (Мд§О₄:СаС1₂) в культуральной среде для первого посева составляет 1:1. В другом предпочтительном воплощении соотношение сульфат магния:хлорид кальция (Мд§О₄:СаС1₂) в культуральной среде для второго посева составляет 1:1. В еще одном предпочтительном воплощении соотношение сульфат магния:хлорид кальция (Мд§О₄:СаС1₂) в среде для крупномасштабного культивирования (например, в основном ферментере, например, в сосуде на 70000, 120000, 220000 л), которая также именуется здесь третьей культуральной средой, составляет 1:2.

В другом предпочтительном воплощении после приготовления среды в ней не нужно доводить рН. Например, при поэтапном процессе ферментации по изобретению не нужно доводить рН культуральной среды, в которой выращиваются водоросли. Хотя для практического применения изобретения не требуется понимания механизма и изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, в некоторых воплощениях стерильные и/или асептические условия поэтапного процесса ферментации по изобретению не нуждаются в доведении рН культуральной среды во время ферментации. В некоторых воплощениях рН культуральной среды находится между 4,0 и 6,5. Культивирование водорослей в процессе поэтапной ферментации по изобретению может проводиться при температуре между 10 и 40°С, предпочтительно от 17 до 35°С и наиболее предпочтительно примерно 30°С. Культивирование может осуществляться в культуре с аэрированием и перемешиванием, на качалке, в стационарной культуре и т.д. В предпочтительном воплощении водоросли культивируются в таких условиях, чтобы уровень растворенного кислорода составлял 10% или чуть больше.

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрены продукты, корма, пищевые или терапевтические добавки, содержащие всю биомассу водорослей или её часть (например, высушенную биомассу, описанную здесь и/или полученную в соответствии с описанными здесь способами и композициями) с повышенным уровнем (например, более 67%) общего жира. Например, в некоторых воплощениях изобретения предусмотрены продукты, корма, пищевые или терапевтические добавки, содержащие высушенную распылением биомассу водорослей с повышенным уровнем (например, более 67%) общего жира. В других воплощениях изобретения предусмотрены продукты, корма, пищевые или терапевтические

- 12 027917 добавки, содержащие липиды, экстрагированные и/или выделенные из биомассы водорослей с повышенным уровнем (например, более 67%) общего жира. Изобретение не налагает ограничений на тип липидов, экстрагированных и/или выделенных из биомассы водорослей с повышенным уровнем (например, более 67%) общего жира. В некоторых воплощениях липиды включают миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, α-линоленовую кислоту (ЛЬЛ), стеаридоновую кислоту (8ΌΆ), эйкозатриеновую кислоту, эйкозатетраеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), докозапентаеновую кислоту (ЭРА), клупанодоновую кислоту, докозагексаеновую кислоту (ОНА), тетракозапентаеновую кислоту и/или тетракозагексаеновую кислоту. В предпочтительном воплощении липиды содержат ИНА и/или пальмитиновую кислоту.

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения липидов (например, приведенных здесь, например, докозагексаеновой кислоты), включающий: культивирование штамма водорослей (например, δοϊιίζοοίινίπιιιη йтаешит) в первой культуральной среде (например, содержащей 50 г/л источника углерода, например, сахара типа глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта и 4 г/л морской соли) и инкубацию культуры при температуре 25-35°С на протяжении примерно 72-144 ч; перенос культуры во вторую культуральную среду (например, содержащую 50 г/л источника углерода, например, сахара типа глюкозы, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и/или 0,15 г/л хлорида магния) и инкубацию культуры при температуре 25-35°С на протяжении примерно 24-48 ч; перенос культуры в третью культуральную среду (например, содержащую 50 г/л источника углерода, например, сахара типа глюкозы, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и/или 0,15 г/л хлорида магния) и инкубацию культуры при температуре 25-35°С на протяжении примерно 24-48 ч; перенос культуры в четвертую культуральную среду (например, содержащую 50 г/л источника углерода, например, сахара типа глюкозы, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 4,0 г/л сульфата магния, 1 г/л мочевины, 2 г/л хлорида кальция, 2 г/л хлорида магния и/или 0,25 г/л однозамещенного фосфата калия) и инкубацию культуры при температуре 25-35°С (например, 30°С) на протяжении примерно 24-192 ч (например, примерно 36, примерно 38, примерно 42, примерно 46, примерно 60, примерно 72, примерно 84, примерно 96, примерно 108, примерно 120, примерно 132, примерно 144, примерно 156, примерно 168, примерно 180 или 192 ч); отделение клеточной биомассы от культуры; и экстрагирование липидов из биомассы.

В некоторых воплощениях культуры водорослей (например, выращиваемых для получения биомассы водорослей) выращивают в подходящих объемах и сосудах, начиная от 100 мл до сотен тысяч литров, в колбах или больших ферментерах, используя различные питательные среды, как описано здесь.

В другом аспекте изобретения отделение клеточной биомассы, содержащей липиды, осуществляется при помощи центрифугирования, фильтрации и/или флокуляции или т.п. методов. В предпочтительном воплощении биомассу водорослей выделяют из культуры при помощи центрифугирования. В другом предпочтительном воплощении центрифугирование проводится после охлаждения культуры клеток (например, чтобы облегчить извлечение клеток с повышенным уровнем липидов). В некоторых воплощениях полученную биомассу водорослей подвергают сушке распылением и используют (например, используют непосредственно в кормах для животных или для получения биотоплива).

В одном воплощении водоросли представляют собой смесь различных видов водорослей (например, одного или нескольких видов водорослей, описанных здесь). В некоторых воплощениях в биомассу водорослей с повышенным уровнем общего жира и/или в липиды, экстрагированные из биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира, добавляют липиды (например, полиненасыщенные жирные кислоты) из других источников, в том числе растительных источников.

В некоторых воплощениях биомасса водорослей с повышенным уровнем общего жира содержит липиды в диапазоне концентраций (вес./вес.) примерно 60-90% (например, 65-90, 66-89, 67-88, 68-87, 6886, 69-85 или 70-80%). Так, биомасса водорослей с повышенным уровнем липидов может содержать липиды в концентрации 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90% и т.д. В одном воплощении биомасса водорослей с повышенным уровнем общего жира содержит липиды в концентрации не менее 67%.

В некоторых воплощениях в состав биомассы водорослей по изобретению входит ИНА в диапазоне от 1 до 75% от общих липидов/жирных кислот. Таким образом, ИНА может входить в состав общих жирных кислот в количестве 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75% и т.д. В других воплощениях ИНА может входить в состав общих жирных кислот в количестве от 1 до 5%, от 1 до 10%, от 1 до 15%, от 1 до 20%, от 1 до 25%, от 1 до 30%, от 5 до 10%, от 5 до 15%, от 5 до 20%, от 5 до 25%, от 5 до 30%, от 10 до 15%, от 10 до 20%, от 10 до 25%, от 10 до 30%, от 15 до 20%, от 15 до 25%, от 15 до 30%, от 20 до 25%, от 20 до 30%, от 25 до 30%, от 30 до 35%, от 35 до 40%, от 40 до 45%, от 45 до 50%, от 50 до 55%, от 55 до 60%, от 60 до 65%, от 65 до 70%, от 70 до 75% и т.д.

В некоторых воплощениях в состав биомассы водорослей по изобретению входит пальмитиновая кислота в диапазоне от 1 до 75% от общих липидов/жирных кислот. Таким образом, пальмитиновая кислота может входить в состав общих жирных кислот в количестве 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55,

- 13 027917 около 60, около 65, около 70, около 75% и т.д. В других воплощениях пальмитиновая кислота может входить в состав общих жирных кислот в количестве от 1 до 5%, от 1 до 10%, от 1 до 15%, от 1 до 20%, от 1 до 25%, от 1 до 30%, от 5 до 10%, от 5 до 15%, от 5 до 20%, от 5 до 25%, от 5 до 30%, от 10 до 15%, от 10 до 20%, от 10 до 25%, от 10 до 30%, от 15 до 20%, от 15 до 25%, от 15 до 30%, от 20 до 25%, от 20 до 30%, от 25 до 30%, от 30 до 35%, от 35 до 40%, от 40 до 45%, от 45 до 50%, от 50 до 55%, от 55 до 60%, от 60 до 65%, от 65 до 70%, от 70 до 75% и т.д.

Дополнительные воплощения настоящего изобретения включают в себя способы изготовления кормовых добавок для животных. Так, один аспект настоящего изобретения составляет способ изготовления кормовых добавок для животных, содержащих липиды из водорослей (например, биомассы водорослей), который включает: культивирование водорослей для получения биомассы водорослей с требуемым повышенным уровнем общего жира (например, более 67% общего жира); и экстрагирование липидов из биомассы водорослей для получения масла из водорослей; и/или удаление воды из биомассы водорослей для получения биомассы водорослей с содержанием твердого вещества от 5 до 100 мас.%; при этом кормовая добавка для животных содержит липиды из водорослей. В некоторых воплощениях жирные кислоты, выделенные из водорослей, представлены омега-3 жирными кислотами с короткой, средней или длинной цепью. В других воплощениях липиды водорослей, экстрагированные из биомассы водорослей, комбинируют с биомассой водорослей с содержанием твердых веществ от 5 до 100 мас.%.

Кормовые добавки в соответствии с изобретением можно комбинировать с другими пищевыми компонентами для получения обработанных пищевых или кормовых продуктов (например, пищевых продуктов для животных и/или человека). Такие другие пищевые компоненты включают одну или несколько ферментных добавок, витаминных пищевых добавок и минеральных пищевых добавок. Полученные (комбинированные) пищевые добавки можно смешивать в соответствующем количестве с другими пищевыми компонентами, такими как зерновые и растительные белки, получая обработанные пищевые продукты. Введение этих компонентов в обработанный пищевой продукт может осуществляться с помощью любых стандартных обрабатывающих устройств. Кормовые/ пищевые добавки настоящего изобретения можно использовать в качестве добавки в пищу/корм сами по себе, с добавлением витаминов, минералов, других пищевых ферментов, побочных продуктов сельского хозяйства (например, отрубей или клейковины) либо в сочетании с ними.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения животных и/или людей с повышенным содержанием в тканях омега-3 жирных кислот, который включает кормление животных/человека кормовой добавкой, содержащей липиды/жирные кислоты, выделенные из водорослей, причем кормовая добавка дополнительно включает (а) липиды из водорослей, экстрагированные из культивированной биомассы водорослей, и/или (Ь) биомассу водорослей из культивированных водорослей, из которой удалена вода до содержания твердых веществ от 5 до 100 мас.%, при этом животное/человек проявляет повышенное содержание в тканях омега-3 жирных кислот. Изобретение не налагает ограничений на тех млекопитающих (например, животных или человека), которые могут получить пользу от композиции по изобретению. Так, животные по изобретению включают, без ограничения, любых животных, чьи яйца, мясо, молоко или другие продукты потребляются людьми или другими животными. Таким образом, животные по изобретению включают, без ограничения, рыб, птиц (кур, индеек, уток и др.), свиней, овец, коз, кроликов, мясной и молочный скот.

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний млекопитающих у нуждающихся в этом субъектов путем введения субъекту терапевтически эффективного количества композиции по изобретению. В некоторых воплощениях заболевания млекопитающих, которые подлежат лечению, включают, без ограничения, сердечно-сосудистые заболевания, воспалительное заболевание и различные раковые заболевания. В других воплощениях сердечно-сосудистые заболевания, которые подлежат лечению, включают, без ограничения, гипертриглицеридемию, ишемическую болезнь сердца, инсульт, острый инфаркт миокарда и атеросклероз. В других воплощениях воспалительные заболевания, которые подлежат лечению, включают, без ограничения, астму, артрит, аллергический ринит, псориаз, атопический дерматит, воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона и аллергический риноконъюнктивит. В других воплощениях раковые заболевания, которые подлежат лечению, включают, без ограничения, рак предстательной железы, рак молочной железы и рак толстой кишки. В других воплощениях заболевания млекопитающих, которые подлежат лечению, включают психиатрические заболевания. Психиатрические заболевания включают, без ограничения, депрессию, биполярные расстройства, шизофрению. Кроме того, композиции по изобретению могут применяться для поддержания и/или усиления когнитивной функции.

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ лечения заболеваний млекопитающих у нуждающихся в этом субъектов путем введения субъекту терапевтически эффективного количества липидной композиции, представленной и/или полученной из биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира (например, более 67% общего жира). Субъекты, которым лечение может пойти на пользу, включают, без ограничения, птиц и млекопитающих. Млекопитающие по настоящему изобретению включают, без ограничения, собак, кошек, крупный рогатый скот, коз, лошадей, овец, свиней, грызунов (например, крыс и мышей), зайцеобразных, приматов (кроме человека), людей и др., а также мле- 14 027917 копитающих в утробе. Подходят любые млекопитающие, нуждающиеся в лечении по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях настоящего изобретения млекопитающие представлены любыми млекопитающими, кроме человека. В некоторых воплощениях млекопитающие представлены человеком. По настоящему изобретению можно лечить млекопитающих обоих полов на любой стадии развития (например, новорожденных, грудных детей, подростков, недорослей, взрослых). Примеры птиц по настоящему изобретению включают кур, уток, индеек, гусей, перепелов, фазанов, бескилевых (например, страусов), домашних птиц (например, попугаев и канареек) и птиц в яйце.

Водоросли

В способах, композициях, пищевых добавках, биотопливе и/или предшественниках биотоплива и/или кормовых добавках по изобретению можно использовать любые водоросли, способные давать, по описанным здесь способам, повышенный уровень общего жира или биомассу водорослей с повышенным уровнем общего жира. Так, в некоторых воплощениях водоросли настоящего изобретения выбираются из числа ТЬгаик1осЬу1гшт, ПшорЬуссас, Стур1орЬуссас, ТгсЪоихюрЬуссас, РтдшорЬуссас и их комбинаций. В других воплощениях водоросли по изобретению выбираются из числа ТИгаикЮсНуМит к0та1ит, ТНгаикЮсНуЦшт гоксит, ТЪтаикЮсЬуЦтит аигсит, СгурШссобшшт соЬпи, РапсЮсЫопк крр., РНоботопак крр., Сгур1отоиак крр., РапсЮсЫопк 8рр., НспиксНЫк крр., РогрНугЫЫт крр., С1оккотакйх крр. и их комбинаций. В других воплощениях водоросли по изобретению выбираются из числа РапсЮсЫопк такс, КЬоботоиак ка1ша, Нст1кс1т1к Ътпскссик, РогрНугЫЫт сгисШит и С1оккотакйх сЬгукор1ак1а и их комбинаций. В других воплощениях водоросли по изобретению представлены БсЫ/осНуЦщт Нтасшиш.

В некоторых воплощениях изобретения водоросли представляют собой смесь различных видов водорослей. В других воплощениях водоросли представлены одним видом водорослей. В некоторых воплощениях настоящего изобретения липиды/жирные кислоты водорослей предоставляются в виде масла водорослей. В других воплощениях липиды/жирные кислоты водорослей предоставляются в виде биомассы водорослей (например, высушенной, например, порошкообразной биомассы).

Кроме того, водоросли по изобретению включают, без ограничения, водоросли дикого типа, мутантные (естественным путем или индуцированные) или генетически сконструированные водоросли. В предпочтительном воплощении водоросли, которые используются в способах, композициях, пищевых добавках, биотопливе или предшественниках биотоплива и/или кормовых добавках по изобретению, не являются генетически модифицированными организмами. В настоящем изобретении термины генетически модифицированный вариант и генетически модифицированный организм относятся к таким штаммам водорослей, у которых геном подвергался модификациям (например, мутациям, заменам) от своей нормальной формы (например, дикого типа, встречающегося в природе) с тем, чтобы получить требуемый результат.

Кроме того, водоросли по изобретению включают такие водоросли, у которых клетки имеют меньшую толщину клеточной стенки по сравнению с клетками водорослей дикого типа, причем уменьшение толщины клеточной стенки улучшает экстрагируемость и/или биодоступность липидной фракции водорослей (например, способствует перевариванию водорослей и экстрагированию липидов/жирных кислот из клеток биомассы водорослей). Водоросли, у которых клетки имеют меньшую толщину клеточной стенки по сравнению с клетками водорослей дикого типа, могут быть природными, мутантными и/или генетически сконструированными так, чтобы толщина клеточной стенки уменьшилась по сравнению со штаммами дикого типа. Так, в одном воплощении изобретения водоросли представлены водорослями с меньшей толщиной клеточной стенки по сравнению с водорослями дикого типа, причем уменьшение толщины клеточной стенки улучшает экстрагируемость и/или биодоступность липидной фракции водорослей. Способы получения водорослей с меньшей толщиной клеточной стенки включают те, что приведены в \νϋ 2006/107736 А1, включенной сюда в виде ссылки во всей полноте. Так, водоросли могут быть подвергнуты мутагенезу с помощью мутагенов, известных специалистам, включая, без ограничения, химические вещества или радиацию. В определенных воплощениях химические мутагены включают, без ограничения, этилметансульфонат (ЕМ§), метилметансульфонат (ММ§), Ы-этил-Ы-нитрозомочевину (ΕΝυ), триэтилмеламин (ТЕМ), Ы-метил-Ы-нитрозомочевину (ΜΝϋ), прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамид, диэтилсульфат, мономер акриламида, мелфалан, производные иприта, винкристин, диметилнитрозамин, Ы-метил-Ы'-нитро-нитрозогуанидин (ΜΝΝΟ), нитрозогуанидин, 2-аминопурин, 7,12диметил-бенз(а)антрацен (ΌΜΒΑ), этиленоксид, гексаметилфосфорамид, бисульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан (ΌΕΘ), диэпоксибутан (ВЕВ) и др.), 2-метокси-6-хлор-9-(3-этил-2-хлор-оэтиламинопропиламино)акридин дигидрохлорид (1СК-170), формальдегид и др. Методы радиационного мутагенеза включают, без ограничения, рентгеновские лучи, гамма-излучение, ультрафиолетовый свет и др.

Мутанты клеточной стенки могут быть отобраны по повышенной чувствительности к детергентам или путем наблюдения под микроскопом изменений толщины клеточной стенки (например, см. νθ 2006/107736 А1) или любым другим методом, известным в данной области, для обнаружения уменьшения толщины клеточной стенки или снижения целостности клеточной стенки.

Водоросли по изобретению можно культивировать в соответствии с методиками, описанными в примерах 1-3.

- 15 027917

Соответственно, в некоторых воплощениях водоросли культивируют при температуре в пределах от 10 до 35°С. Так, водоросли можно культивировать при температуре 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34°С и т.д. В других воплощениях водоросли можно выращивать в пределах от 20 до 35°С, хотя можно использовать и более холодные (например, менее 20°С), и более теплые (например, более 35°С) условия. В предпочтительном воплощении водоросли выращивают при температуре около 30°С.

В некоторых воплощениях после выращивания водоросли собирают. В некоторых воплощениях сбор водорослей осуществляется по стандартным методикам, известным специалистам, включая, без ограничения, центрифугирование, флокуляцию или фильтрование. В предпочтительном воплощении перед сбором культуру водорослей охлаждают, что способствует успешному сбору клеток водорослей с повышенным уровнем общего жира. Собранные клетки водорослей или биомассу водорослей можно затем непосредственно использовать в качестве источника липидов/жирных кислот или подвергнуть экстрагированию для получения масла водорослей, содержащего липиды/жирные кислоты. В некоторых воплощениях, в которых непосредственно используется биомасса водорослей, из неё удаляется вода до содержания твердых веществ от 5 до 100 мас.%. В дополнительных воплощениях биомасса водорослей, которая используется непосредственно, состоит из таких клеток водорослей, у которых клеточная стенка по крайней мере частично разрушена для повышения эктрагируемости и/или биодоступности масла водорослей в клетках. Разрушение клеток водорослей может осуществляться известными методами, включая, без ограничения, обработку клеток кипящей водой или путем механического разрушения типа измельчения, растирания, обработки ультразвуком, прессом Френча или любым другим методом, известным рядовым специалистам.

Когда биомасса водорослей используется непосредственно, то из биомассы водорослей удаляется вода до содержания твердых веществ от 5 до 100%. Соответственно, в некоторых воплощениях из биомассы водорослей удаляется вода до содержания твердых веществ в 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% и т.д. В дополнительных воплощениях из биомассы водорослей удаляется вода до содержания твердых веществ в пределах от 5 до 50%, от 5 до 60%, от 5 до 70%, от 5 до 80%, от 5 до 90%, от 5 до 95%, от 10 до 30%, от 10 до 40%, от 10 до 50%, от 10 до 60%, от 10 до 65%, от 10 до 70%, от 10 до 75%, от 10 до 80%, от 10 до 85%, от 10 до 90%, от 10 до 95%, от 10 до 100%, от 15 до 40%, от 15 до 50%, от 15 до 60%, от 15 до 65%, от 15 до 70%, от 15 до 75%, от 15 до 80%, от 15 до 85%, от 15 до 90%, от 15 до 95%, от 15 до 100%, от 20 до 50%, от 20 до 60%, от 20 до 65%, от 20 до 70%, от 20 до 75%, от 20 до 80%, от 20 до 85%, от 20 до 90%, от 20 до 95%, от 20 до 100%, от 25 до 50%, от 25 до 60%, от 25 до 70%, от 25 до 75%, от 25 до 80%, от 25 до 85%, от 25 до 90%, от 25 до 95%, от 25 до 100%, от 30 до 50%, от 30 до 60%, от 30 до 70%, от 30 до 75%, от 30 до 80%, от 30 до 85%, от 30 до 90%, от 30 до 95%, от 45 до 100%, от 50 до 70%, от 50 до 75%, от 50 до 80%, от 50 до 85%, от 50 до 90%, от 50 до 95%, от 50 до 100%, от 55 до 75%, от 55 до 80%, от 55 до 85%, от 55 до 90%, от 55 до 95%, от 55 до 100%, от 60 до 75%, от 60 до 80%, от 60 до 85%, от 60 до 90%, от 60 до 95%, от 60 до 100%, от 70 до 80%, от 70 до 85%, от 70 до 90%, от 70 до 95%, от 70 до 100%, от 75 до 85%, от 75 до 90%, от 75 до 95%, от 75 до 100%, от 80 до 85%, от 80 до 90%, от 80 до 95%, от 80 до 100%, от 85 до 90%, от 85 до 95%, от 85 до 100%, от 90 до 95%, от 95 до 100% и т.д.

В некоторых воплощениях клетки биомассы водорослей разрушают или подвергают лизису и экстрагируют липиды водорослей. Клетки водорослей могут быть экстрагированы во влажном или сухом состоянии стандартными методами с получением композиции, содержащей липиды/жирные кислоты. Разрушение или лизис клеток водорослей может осуществляться стандартными методами, включая, без ограничения, обработку клеток кипящей водой или путем механического разрушения типа измельчения, растирания, обработки ультразвуком, прессом Френча или любым другим известным методом. Экстракция липидов/жирных кислот из лизированных клеток проводится по стандартным методикам, которые известны для водорослей и других организмов, включая, без ограничения, отделение жидкой фазы от твердой фазы после лизиса клеток, экстракцию липидов/жирных кислот в жидкой фазе путем добавления растворителя, выпаривание растворителя и извлечение липидов/жирных кислот из жидкой фазы лизированных клеток.

Настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным растворителем, используемым для экстракции. Растворители включают, без ограничения, гексан, хлороформ, этанол, метанол, изопропанол, диэтиловый эфир, диоксан, изопропиловый эфир, дихлорметан, тетрагидрофуран, петролейный эфир и их комбинации.

В некоторых воплощениях липиды/жирные кислоты, полученные из биомассы водорослей по изобретению, представлены в виде свободных жирных кислот, эфиров холестерина, солей эфиров, эфиров жирных кислот, моноглицеридов, диглицеридов, триглицеридов, диацилглицеридов, моноглицеридов, сфингофосфолипидов, сфингогликолипидов или любых комбинаций из них (например, для использования в способах, композициях, биотопливе, продуктах питания, пищевых добавках, кормовых добавках или других описанных здесь композициях).

- 16 027917

Способ получения биомассы водорослей

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира (например, более 67% липидов), который включает: культивирование водорослей в условиях, достаточных для получения биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира (например, более 67% липидов), при этом биомассу водорослей собирают по окончании логарифмической фазы роста водорослей (например, см. примеры 1 и 2). В настоящем изобретении термин логарифмическая фаза роста относится к такой стадии культивирования, которая характеризуется экспоненциальным возрастанием числа клеток водорослей. В общем, в системе культивирования наблюдается характерный паттерн роста после инокуляции, который включает лаг-фазу, экспоненциальную или логарифмическую фазу роста, фазу отрицательного ускорения роста и плато или стационарную фазу. Например, в логарифмической фазе роста, по мере продолжения роста водорослей, клетки могут достичь своей максимальной скорости деления, и количество клеток увеличивается в логарифмической зависимости от времени. Через какое-то время после начала логарифмической фазы скорость деления клеток начинает снижаться, и некоторые клетки могут отмирать. На кривой роста это отражается постепенным уплощением линии. В конечном счете, скорость гибели клеток становится практически равной скорости деления клеток, и общая жизнеспособная популяция может оставаться одинаковой в течение какого-то времени. Это известно как стационарная фаза или плато, и на кривой роста она выглядит как выравнивание линии, при этом наклон приближается к нулю. В предпочтительном воплощении биомасса водорослей культивируется в асептических условиях (например, чтобы предотвратить загрязнение и/или рост загрязняющих микроорганизмов, например, дрожжей, бактерий, вирусов и пр. в культуре).

В некоторых воплощениях условия культивирования достаточны для того, чтобы водоросли вырабатывали повышенный уровень общего жира (например, более 67 мас.%). Условия культивирования включают культуральную среду, подходящую для роста водорослей, при этом вырабатывается биомасса водорослей с повышенным уровнем общего жира (например, более 67 мас.%). Подходящие культуральные среды описаны здесь. Среда также может содержать соли, витамины, минералы, металлы и другие питательные вещества. Предпочтительно условия культивирования являются достаточными для того, чтобы обеспечить подходящее количество питательных веществ и подходящую температуру для роста водорослей в условиях, при которых образуется биомасса водорослей с повышенным уровнем общего жира.

В некоторых воплощениях культивирование включает ограничение питательных веществ (например, азота, фосфора) в течение какого-то времени для повышения содержания общего жира. Например, культура может быть лишена определенного питательного вещества или перенесена в отдельную культуральную среду без определенного питательного вещества (например, лишенную фосфора или азота среду либо культуральную среду с меньшим уровнем питательного вещества). В некоторых воплощениях культуральная среда имеет такое начальное содержание питательного вещества, что оно иссякнет в более позднее время, во время экспоненциального роста, но до истощения других питательных веществ. В некоторых воплощениях культивирование не включает ограничения питательных веществ (например, азота, фосфора) в процессе культивирования. В некоторых воплощениях культивирование одной биомассы водорослей происходит в двух или нескольких типах среды в последовательном порядке. В некоторых воплощениях культивирование одной биомассы водорослей происходит в трех или нескольких типах среды в последовательном порядке. Точно так же культивирование одной биомассы водорослей может иметь место в двух или нескольких сосудах, при этом первый сосуд используется для инокуляции следующего сосуда, а следующий сосуд используется для инокуляции другого последующего сосуда и т.д. Хотя для практического применения изобретения и не требуется понимание механизма и изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, однако в некоторых воплощениях последовательное культивирование одной биомассы водорослей в нескольких сосудах способствует тому, что биомасса водорослей растет таким образом, что содержание общего жира в биомассе возрастает по сравнению с биомассой водорослей (например, одних и тех же видов водорослей), выращенной в одном сосуде и/или одной среде роста.

Культивирование водорослей может проводиться в стандартном биореакторе, подходящем для культивирования водорослей и получения биомассы водорослей. Например, водоросли можно культивировать таким способом, который включает, без ограничения, периодический режим, с подпиткой, повторный цикл и непрерывную ферментацию. В предпочтительном воплощении водоросли культивируют в режиме процесса с подпиткой.

Изобретение не ограничивается каким-либо конкретным способом или образом сбора водорослей из культуральной среды. Для сбора клеток водорослей из культуральной среды могут применяться различные способы. В одном воплощении сбор включает извлечение биомассы водорослей из культуральной среды посредством отделения, например, фильтрования (например, ленточного фильтрования, барабанного фильтрования) и/или центрифугирования. Если нужно, собранные клетки водорослей можно затем промыть, заморозить, лиофилизировать, высушить распылением и/или хранить в атмосфере неокисляющегося газа (например, СО₂, Ν₂), чтобы уменьшить или устранить присутствие О₂. Необязательно к собранным клеткам также можно добавлять синтетические и/или природные антиоксиданты. вклю- 17 027917 чая, без ограничения, бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), бутилированный гидроксианизол (ВНА), трет-бутилгидрохинон (ΤΒΗΟ), этоксиквин, бета-каротин, витамин Е и витамин С.

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира, который включает: культивирование водорослей в условиях, достаточных для получения биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира, и сбор биомассы водорослей.

Биомасса микроводорослей

Изобретением в некоторых воплощениях предусмотрена биомасса водорослей и/или её фракция и/или экстракт (например, для использования при производстве биотоплива и/или в качестве пищевого или кормового продукта).

В некоторых воплощениях в составе биомассы водорослей омега-3 жирные кислоты составляют по меньшей мере 10% от сухого веса биомассы, к примеру, от 10 до 50%, от 10 до 40%, от 10 до 30%, от 10 до 20% сухого веса биомассы. В одном воплощении биомассу водорослей получают в соответствии со способами по изобретению. Например, в некоторых воплощениях биомассу водорослей получают способом, включающим: культивирование водорослей в условиях, достаточных для получения биомассы водорослей с повышенным уровнем общего жира (например, более 67 мас.%), при этом биомассу водорослей собирают в фазе отрицательного ускорения роста или в стационарной фазе. В другом воплощении биомассу водорослей собирают из культуры во время экспоненциальной, логарифмической фазы роста.

Липидные композиции, получаемые из биомассы водорослей

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения экстракта липидов, жирных кислот (например, липидной/жирно-кислотной композиции) из биомассы водорослей, выращенной в таких условиях, чтобы у них был повышенный уровень общего жира, который включает получение липидов из биомассы водорослей, культивируемых в условиях, достаточных для получения биомассы водорослей с повышенным содержанием общего жира (например, содержанием общего жира более 67% от биомассы), при этом биомассу водорослей собирают в фазе отрицательного ускорения роста или в стационарной фазе. В другом воплощении биомассу водорослей собирают во время логарифмической фазы роста водорослей.

Методы получения липидной композиция из биомассы водорослей по изобретению включают, без ограничения, экстракцию, нагревание, давление, омыление, обработку ультразвуком, замораживание, измельчение, ионный обмен, хроматографию, мембранное разделение, электродиализ, обратный осмос, дистилляцию, химическую дериватизацию, кристаллизацию и др. Например, липиды водорослей можно экстрагировать из клеток водорослей любым подходящим способом, включая, без ограничения, экстракцию растворителями, включая, без ограничения, этанол, этилацетат, изопропиловый спирт, метанол, этилацетат, гексан, метиленхлорид, метанол, нефть, хлороформ и т.п., или находящимися под давлением жидкими углеводородами, такими как бутан, пентан, пропан и другие (с сорастворителями или без них), либо посредством экстракции сверхкритической жидкостью (с сорастворителями или без них). Необязательно масло из экстрагированных липидов/жирных кислот упаривают при пониженном давлении, чтобы уменьшить или удалить растворитель и/или получить образец концентрированного липидного материала. В других воплощениях клетки разрушают или лизируют, чтобы получить липидную композицию, например, в виде масла (например, для использования в качестве биотоплива или предшественника биотоплива). В некоторых воплощениях экстрагированное масло подвергают переработке. Настоящее изобретение не налагает ограничений на тип очистки. В некоторых воплощениях экстрагированное масло очищают химическим способом. В некоторых воплощениях экстрагированное масло очищают физическим способом. В некоторых воплощениях экстрагированное масло очищают и химическим, и физическим способом. Экстрагированное масло (например, из биомассы водорослей, выращенных в условиях, дающих повышенное содержание общего жира в клетках водорослей, например, более 67%) можно очистить любым стандартным методом очистки. Процесс очистки может удалить некоторые или все загрязнения из экстрагированных липидов/жирных кислот/масел. В некоторых воплощениях процесс очистки включает одну или несколько операций дегуммирования, отбеливания, фильтрования, дезодорации и/или доочистки экстрагированных липидов/жирных кислот/масел.

В некоторых воплощениях липиды/жирные кислоты/масла, содержащиеся в экстрагированной липидной композиции, концентрируют путем гидролиза липидов, чтобы сконцентрировать липидную фракцию, используя такие методы, как, например, образование аддуктов с мочевиной, фракционная перегонка, колоночная хроматография и/или фракционирование в сверхкритической жидкости.

Соответственно, в одном воплощении стадия получения липидной композиции из биомассы водорослей по изобретению включает экстрагирование липидной композиции из биомассы. В другом воплощении стадия получения липидной композиции из биомассы водорослей по изобретению включает обработку биомассы полярным растворителем.

Например, в некоторых воплощениях липиды/жирные кислоты/масла экстрагируют из биомассы водорослей для получения липидной композиции с помощью растворителя в условиях экстракции, достаточных для экстрагирования липидов и/или жирных кислот, но недостаточных для экстракции соединений, нерастворимых в растворителе. В одном воплощении композицию липидов/жирных кислот экст- 18 027917 рагируют из биомассы водорослей по изобретению, при этом обломки клеток и/или осажденные нерастворимые соединения отделяют от фракции, содержащей липиды/жирные кислоты и растворитель. В другом воплощении способ дополнительно включает отделение обломков клеток и осажденных соединений таким методом разделения, как фильтрация, центрифугирование и/или их комбинации. В некоторых воплощениях обломки клеток и/или осажденные нерастворимые соединения (например, та часть биомассы водорослей, которая не растворяется в растворителе, например, белки, волокна и т.п.) извлекают и используют (например, в пищевых или кормовых продуктах).

В некоторых воплощениях растворитель представлен полярным растворителем. Примеры полярных растворителей включают, без ограничения, этанол, этилацетат, изопропиловый спирт, метанол, этилацетат и их смеси. В одном воплощении полярным растворителем является этанол. Экстракцию липидной композиции растворителем можно проводить различным образом. Например, экстракция может представлять собой периодический процесс, непрерывный процесс или непрерывный противоточный процесс. В непрерывном противоточном процессе при контакте растворителя с микроводорослями масло вымывается в растворитель, давая гораздо большую фракцию растворитель-масло. После экстракции растворитель может быть удален известными методами. Например, для удаления растворителя можно использовать дистилляцию, выпаривание в роторном испарителе или испарителе с восходящей пленкой жидкости при обработке паром или в любом подходящем испарителе.

В одном воплощении экстрагированные липиды/жирные кислоты подвергаются процессу абсорбции (например, отбеливания) для удаления одного или нескольких нежелательных соединений, таких, к примеру, как цветные включения и/или фосфатиды, которые могут присутствовать. В некоторых воплощениях процесс абсорбции является процессом отбеливания, который включает обработку экстракта липидов/жирных кислот отбеливающим материалом (например, нейтральной глиной типа природной глины или сукновальной глины, кислотно-активированной глиной, активированным углем, активированной глиной, силикатами или их комбинацией). Изобретение не налагает ограничений на количество используемого отбеливающего материала.

В одном воплощении экстрагированные липиды/жирные кислоты подвергаются операции дегуммирования. Способы дегуммирования известны и включают, к примеру, дегуммирование водой, дегуммирование кислотой, энзиматическое дегуммирование и мембранное дегуммирование. В некоторых воплощениях экстракт липидов/жирных кислот подвергается дегуммированию (например, после процесса абсорбции), при этом дегуммирование включает контактирование экстракта липидов/жирных кислот со смесью водных растворов кислот в таком количестве, которое эффективно осаждает смолы и/или соединения типа хлорофилла, которые могут присутствовать в составе экстракта липидов/жирных кислот. Изобретение не налагает ограничений на тип или количество используемых водных растворов кислот. В одном воплощении смесь водных растворов кислот включает серную кислоту и/или фосфорную кислоту. В другом воплощении равные количества водных растворов кислот смешивают с липидной композицией. В предпочтительном воплощении при смешивании с маслом водные растворы кислот представлены в количестве, достаточным для получения кислого рН. Осадки, которые образуются после смешивания с кислотами, можно удалить из липидной композиции, например, с помощью центрифугирования и/или фильтрования (например, мембранного фильтрования). В некоторых воплощениях дегуммированная композиция экстракта липидов/жирных кислот подвергается сушке (например, чтобы уменьшить влагосодержание композиции). Изобретение не налагает ограничений на условия сушки (например, условия времени, температуры и/или вакуума). Как описано здесь, в некоторых воплощениях влагосодержание высушенной композиции липидов/жирных кислот составляет менее 10 мас.%, (например, менее 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 или 0,01 мас.%).

Липидные композиции

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрены липидные композиции, полученные из биомассы водорослей по изобретению. В некоторых воплощениях липидные композиции получают в соответствии со способом настоящего изобретения. Например, в некоторых воплощениях липидные композиции представляют собой биомассу водорослей или её часть/фракцию из водорослей рода ТНгаи8Ιοοίινίπιιιη. В некоторых воплощениях биомасса водорослей включает водоросли, выбранные из ΌίηοрНусеае, СгурЮрНусеае, ΤΐΌ0οιιχίορ1ΐΥίχ;·^. Ρ^ηди^οрЬусеае и/или их комбинаций. В других воплощениях биомасса водорослей включает водоросли, выбранные из числа ТНгаи8ЮсНу1г1ит ЧпаЦпп, ТНгаи8ЮсНу1пит Го8еит, ТНгаи8ЮсНу1г1ит аигеит, ί'.’ΓγρΙΐΒ^ο6ίηίιιιη Μΐιηίί, Ρа^^еΐοсЫο^^8 8рр., ΡΗοάοιηοη;·ΐ8 8рр., СгурΙοιηοη;·ΐ8 8рр., Ρа^^еΐοсЫο^^8 8рр., Нет18еЪт8 8рр., Ροη}!.^!.!!!'! 8рр., Ο1ο88οта8ΐ^x 8рр. и/или их комбинаций. В других воплощениях биомасса водорослей включает водоросли, выбранные из Ρ;·ιι®1οθι1οπ8 1пс18е, Ρ1ιοάοιηοη;·ΐ8 8аПпа, Нет18еЪт8 Ъпте8сеп8, Ρο^рЬу^^ά^ит сгиеШит и Ο1ο88οта8ί^x сЬ^у8οр1а8ΐа и их комбинаций. В предпочтительном воплощении биомасса водорослей включает δΟιίζοΟιγΙπιιιη йтасшит.

Продукты питания и кормовые добавки

В некоторых воплощениях биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт используется для потребления (например, млекопитающими, например, для потребления человеком или животными) или в качестве пищевой добавки (например, для повышения содержания липидов и/или питательных компонентов пищи). Например, в некоторых воплощениях, при использовании в качестве

- 19 027917 корма для животных (например, корма для мясного скота, корма для молочного скота, корма для аквакультуры, корма для птиц и т.п.), липиды/жирные кислоты, производимые биомассой водорослей по изобретению, включаются в пищевой продукт (например, корм для животных). В некоторых воплощениях биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт используется для фармацевтических или пищевых целей и/или для промышленного применения.

Биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт может быть представлена в любой разновидности форм/композиций, подходящих для определенного применения или использования. В некоторых воплощениях представлена сама биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт. В другом воплощении биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт представлены в виде порошка или в виде свободного масла в жидком виде (например, липидной композиции или её фракции или концентрата). Биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт может использоваться для потребления человеком и/или животными. Например, в некоторых воплощениях биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт предоставляется в качестве или включается в корма, пищевые добавки, продукты питания, фармацевтические композиции, молочные продукты и/или в детское питание.

Например, в одном воплощении биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт подвергается сушке (например, сушке распылением, туннельной сушке, вакуумной сушке) и используется в качестве корма или пищевой добавки для таких животных или организмов аквакультуры (например, рыб, креветок, крабов, омаров и др.), мясо и/или продукты которых потребляются человеком или животными (например, домашними питомцами, домашним скотом). В другом воплощении биомасса из целых клеток водорослей, её фракция и/или экстракт смешивается с сухим влагопоглощающим средством (например, размолотым зерном типа размельченной кукурузы).

Описанные здесь композиции могут применяться в качестве полноценного пищевого продукта, в качестве компонента пищевого продукта, в качестве пищевой добавки или части пищевой добавки, в качестве кормовой добавки и могут быть в жидком, полутвердом или твердом виде. Композиции по изобретению также могут иметь вид фармацевтической композиции. Композиции, пищевые добавки, продукты питания, детское питание, кормовые добавки и/или фармацевтические композиции по изобретению могут использоваться в способах укрепления здоровья индивида. Композиции могут быть в жидком, полутвердом или твердом виде. Например, композиции можно вводить в виде таблеток, гелевых пакетов, капсул, желатиновых капсул, ароматизированных напитков, в виде порошка, из которого можно получить такой напиток, в виде растительного масла, салатного масла или заправки, соуса, сиропа, майонеза, маргарина и т.п. Кроме того, пищевые продукты, пищевые добавки и т.п. настоящего изобретения могут включать, без ограничения, молочные продукты, детское питание, напитки, батончики, порошки, наслойки, напитки, хлопья, мороженое, конфеты, закуски, выпечки и жареные пищевые продукты. Напитки по изобретению включают, без ограничения, энергетические напитки, нутрацевтические коктейли, фруктовые коктейли, спортивные напитки, апельсиновый сок и другие фруктовые напитки. Батончики по настоящему изобретению включают, без ограничения, готовые закуски, питательные батончики, закусочные и энергетические батончики и прессованные изделия и т.п. Молочные продукты по изобретению включают, без ограничения, йогурты, кефирные напитки, сыр и молоко. Композиции, предназначенные для приема внутрь, могут быть получены в соответствии с любым известным методом производства пищевых добавок или фармацевтических препаратов, причем такие композиции могут включать по меньшей мере одну добавку, выбранную из группы, состоящей из улучшающих вкус субстанций, таких как подсластители и ароматизаторы, стабилизаторы, эмульгаторы, красители и консерванты с тем, чтобы получить диетически или фармацевтически приемлемые препараты. В композиции по изобретению также могут входить витамины, минералы и микроэлементы из любых физиологически приемлемых источников.

В некоторых воплощениях фармацевтические композиции по изобретению включают композиции по изобретению в терапевтически эффективном количестве. Композиции по изобретению могут быть изготовлены для применения в соответствии с известными фармацевтическими методами. Например, см. РепипдЮп. ТЬе §аепсе апб Ртасйсе οί РЬагтасу (9ЬЪ Еб., 1995). При производстве фармацевтических композиций по изобретению липидную композицию (включая её физиологически приемлемые соли) обычно смешивают, среди прочего, с приемлемым носителем. Носитель должен быть совместимым с любыми другими ингредиентами композиции и не должен быть вредным для субъекта.

Биотопливо

Многие из существующих технологий производства биотоплива из водорослей являются дорогостоящими, неэффективными и неустойчивыми при работе в масштабе, который необходим для вытеснения какой-либо значимой доли нефтяного топлива на рынке. Поставки и затраты энергии для сбора и обработки водорослей зачастую недооцениваются. Для получения дизельного биотоплива из водорослей традиционным способом водоросли обычно собирают из культуры при концентрации примерно 0,2 г/л в воде. Собранные водоросли затем обезвоживают, при этом концентрация водорослей возрастает до образования пасты из водорослей, содержащей примерно 15% твердого вещества. Затем пасту полностью высушивают, выпаривая воду. Затем из высушенных водорослей экстрагируют масло с помощью орга- 20 027917 нического растворителя типа гексана, который удаляется из масла водорослей путем перегонки. Этот обычный способ получения дизельного биотоплива из водорослей является слишком дорогим.

Например, когда водоросли растут в природном водоеме, биомасса водорослей будет относительно разбавленной, учитывая объем воды. Для получения галлона масла необходимо обработать от 20000 до 40000 галлонов воды. Затраты энергии на транспортировку и переработку такого большого объема воды высоки. Для примера: можно получить 2500 галлонов масла из 1 акра в год, если получать водоросли с содержанием липидов в 25 мас.% по 25 г/м² в день. При этом нужно обработать 50 млн галлонов воды для получения 2500 галлонов масла. Стандартный подход - закачивание воды в централизованную систему для обезвоживания является слишком энергоемким и непомерно затратным. Для примера: относительно небольшое предприятие для получения масла из водорослей, которое производит 20 миллионов галлонов в год, будет расходовать больше энергии на откачку воды из пруда в центральную систему, чем её содержится в масляном продукте, что дает отрицательное сальдо баланса энергии.

Соответственно, в некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения биомассы водорослей и/или экстракта липидов/жирных кислот (например, композиции липидов/жирных кислот) из биомассы водорослей, выращенных в таких условиях, чтобы они содержали повышенный уровень общего жира, который включает получение липидов из биомассы водорослей, культивированных в условиях, достаточных для получения биомассы водорослей с повышенным содержанием общего жира (например, общий жир составляет более 67% биомассы), при этом биомассу водорослей собирают в фазе отрицательного ускорения роста водорослей или в стационарной фазе. В другом воплощении биомассу водорослей собирают во время логарифмической фазы роста водорослей. Способы получения липидной композиции из биомассы водорослей по изобретению описаны здесь.

Соответственно, в некоторых воплощениях изобретения предусмотрено сырье для биотоплива или биотопливо, содержащее липиды, углеводороды или то и другое, полученные из культуры водорослей и/или биомассы водорослей, полученной в соответствии со способами изобретения. В некоторых воплощениях липиды или содержащие их композиции из водорослей подразделяются по полярности на нейтральные липиды и полярные липиды. Основными нейтральными липидами являются триглицериды и свободные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты. Основными полярными липидами являются ацилированные липиды, такие как гликолипиды и фосфолипиды. В некоторых воплощениях описаны композиции, содержащие липиды и углеводороды по изобретению, которые отличаются по типу и относительному количеству жирных кислот и/или углеводородов, присутствующих в композиции. В некоторых воплощениях углеводороды, присутствующие в композиции из водорослей по изобретению, в основном представлены алканами и алкенами с линейной цепью и могут включать парафины и др., содержащие до 36 атомов углерода.

В некоторых воплощениях изобретения предусмотрен способ получения жидкого топлива, который включает переработку липидов, полученных из культуры водорослей и/или биомассы водорослей или их липидной фракции, описанной здесь. Продукты по изобретению, полученные при переработке происходящего из водорослей сырья для биотоплива, могут быть включены или использованы в различных видах жидкого топлива, включая, без ограничения, дизельное, биодизельное, керосин, реактивное топливо, бензин, ЭР-1, 1Р-4. ЭР-5, ЭР-6, ЭР-7, ЭР-8, термически стабильное реактивное топливо (ЭРТ8), жидкости р15сЬет-Тгор5сб, топливо на основе спирта, включая этанолсодержащее топливо для транспортных средств, другие виды жидкого топлива на основе биомассы, включая топливо для транспортных средств на основе целлюлозной биомассы.

В некоторых воплощениях триацилглицериды в масле водорослей преобразуются в метиловые эфиры жирных кислот (РАМЕ или биодизель), к примеру, с помощью процесса катализируемой основаниями трансэстерификации (например, см. обзор К. Збаше Тувой, 1о5ерН Βοζе11, КоЬей Зайасе, Еидепе Ре1ег5еп, апб Ьис Моепв, Вюта55 Об Апа1у515: КевеатсЬ №еб5 апб Кесоттепбабоп5, NКЕ^/ТΡ-51034796, .Типе 2004, включенный сюда в виде ссылки во всей полноте). В некоторых воплощениях триацилглицериды подвергают реакции с метанолом в присутствии №ОН при 60°С в течение 2 ч, получая метиловые эфиры жирных кислот (биодизель) и глицерин. В других воплощениях полученные продукты - биодизель и глицерин - не смешиваются и обычно отделяются друг от друга путем декантации или центрифугирования с последующим промыванием и очисткой. Свободные жирные кислоты (РРА5) являются естественным продуктом гидролиза триглицеридов и образуются при реакции триацилглицеридов с водой. В некоторых воплощениях способы изобретения дополнительно включат стадию быстрого и существенного высушивания масла водорослей при помощи известных методов, чтобы ограничить образование свободных жирных кислот, предпочтительно до уровня менее 1%. В другом воплощении изобретения способы могут дополнительно включать стадию преобразования или удаления свободных жирных кислот известными в данной области методами.

В некоторых воплощениях триацилглицериды в масле водорослей преобразуются в метиловые эфиры жирных кислот (РАМЕ или биодизель) посредством катализируемой кислотами трансэстерификации, катализируемой ферментами трансэстерификации или трансэстерификации сверхкритическим метанолом. Трансэстерификация сверхкритическим метанолом не требует катализатора (например, см. Ки5б1апа Ό. апб Зака 8., ЕГГесЬ оГ \\а1ег оп Ьюб1е5е1 Гие1 ртобисбоп Ьу 5ирегспбса1 те(апо1 (геаНпет,

- 21 027917

Вюгезоигсе Тесйпо1оду 91 (2004), 289-295; КизШапа Ό. апб 8ака 8., Ктейсз о£ !гапзез!епйсабоп ΐη гарезееб ой 1о ЪюЙ1езе1 Гие1 аз !геа!ей ΐη зирегспйса1 ше!апо1, Рие1 80 (2001), 693-698; 8ака 8. апб КизШапа Ό., Вюй1езе1 Гие1 йот гарезеей ой аз ргерагей ΐη зирегспйса1 ше!апо1, Рие1 80 (2001), 225-231). Проведение реакции в сверхкритическом метаноле уменьшает время реакции с 2 ч до 5 мин. Кроме того, отсутствие катализатора-основания КаОН сильно упрощает последующую очистку, снижает стоимость сырьевого материала и устраняет проблему омыления свободных жирных кислот. Вместо того, чтобы представлять проблемы, свободные жирные кислоты становятся ценным сырьем, которое преобразуется в дизельное биотопливо в сверхкритическом метаноле следующим образом.

В некоторых воплощениях триацилглицериды восстанавливают водородом с образованием парафинов, пропана, двуокиси углерода и воды, и такой продукт в общем известен как зеленый дизель. Парафины можно либо подвергнуть изомеризации для получения дизельного топлива, либо смешать непосредственно с дизельным топливом. В некоторых воплощениях гидрогенизация дает преимущества перед стандартной катализируемой основаниями трансэстерификацией. Например, процесс гидрогенизации (который также именуется гидрокрекингом) является термохимическим, поэтому он гораздо более устойчив к загрязнениям в сырье, чем биохимические процессы (например, гидрокрекинг относительно нечувствителен к свободным жирным кислотам и воде). Свободные жирные кислоты легко превращаются в парафины, а вода просто снижает общую тепловую эффективность процесса, но существенно не изменяет его химизм. В другом неограничивающем примере парафиновый продукт представлен чистым углеводородом, поэтому он неотличим от углеводородов из нефти. В отличие от биодизеля, у которого энергоёмкость на 15% ниже и который может замерзнуть в холодную погоду, зеленый дизель имеет такую же энергоёмкость и такие же реологические характеристики (например, вязкость), что и дизельное топливо на основе нефти. В различных воплощениях способы изобретения охватывают стадии гидрокрекинга и изомеризации, которые хорошо известны в области получения жидкого топлива, такого как реактивное топливо, дизельное, керосин, бензин, ΙΡ-1, ΊΡ-4, ΙΡ-5, ΙΡ-6, ΙΡ-7, ΊΡ-8 и 1РТ8.

Примеры

Нижеследующие примеры представлены для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать некоторые предпочтительные воплощения и аспекты настоящего изобретения, и не должны восприниматься, как ограничивающие его объем.

Пример 1. Выращивание биомассы водорослей с высоким уровнем жира.

Эксперименты проводились при разработке воплощений настоящего изобретения для того, чтобы охарактеризовать и установить методы получения гетеротрофных водорослей, в частности, методы культивирования водорослей для получения биомассы водорослей с высоким уровнем жира/липидов. Проводили ряд стандартных опытов по выращиванию гетеротрофных водорослей, которое проводилось в периодическом режиме.

Культуры 8сЫ7осйу!пиш йшастиш получали и хранили в криопробирках на 1,5 мл при -80°С. Для каждого эксперимента процесс начинали с оттаивания криопробирок и асептического внесения в качалочные колбы на 1,0 л со средой. Среда в колбах на 1 л содержала 50 г/л сахара, 10 г/л дрожжевого экстракта и 4 г/л морской соли. Использовали 3 л 3-6-дневной качалочной культуры для инокуляции сосуда на 250 л, содержащего среду, подращивали в течение 24-48 ч, а затем переносили в основной сосуд (от 17000 до 28000 л) и культивировали в периодическом режиме в течение 36-72 ч. Температуру в периодическом режиме поддерживали между 25 и 30°С. Диапазон температур был таким большим из-за отсутствия точного контроля в системе. При посеве (250 л) и в периодическом режиме (от 17000 до 28000 л) использовали следующие среды.

Таблица 1А

Среды при периодическом культивировании и при посеве

Ингредиент	В среде
Сахар	50	г/л
Дрожжевой экстракт	7,5	г/л
М§804	0,1538	г/л
Мочевина	2	г/л
СаС12	0,1538	г/л
МёС12	0,1538	г/л
Противопенная добавка	0,3	мл

Общее содержание жира в биомассе водорослей из периодических культур определяли методами газовой хроматографии (см. гравиметрический метод 922.06 по АОАС), кислотного гидролиза (см. Общий жир при кислотном гидролизе, метод 1 по Апкош ТесЬпо1о§у, 02-10-09) и экстракции растворителем при высокой температуре (см. метод 2 по Апкош Тесйпо1о§у, 01-30-09, и метод 5-04 по АОС8). Вкратце, типичная процедура анализа ферментационного бульона была следующей. Образцы бульона концентрировали центрифугированием. После декантации образец высушивали методом сушки с замораживанием в течение 24 ч, при этом влагосодержание составляло менее 1%. Перед кислотным гидролизом образцы взвешивали, промывали и сушили в печи. За этим следовал процесс экстракции в условиях градиента температуры с помощью петролейного эфира. Процессы гидролиза и экстракции осуществляли с помо- 22 027917 щью автоматизированных приборов. После дополнительной сушки определяли результаты на основе потери массы.

Как видно из приведенной ниже табл. 1В, общий уровень жира/липидов (мас.) при культивировании в периодическом режиме при температуре в пределах 25-30°С составлял 8-38%.

Таблица 1В

Общее содержание жира в биомассе водорослей, выращенных в периодическом режиме при температуре 25-30°С

№ партии	Общий жир (%)
А-1-10	33,75
А-2-10	38,59
А-3-10	27,30
А-4-10	38,51
А-5-10	7,82
А-7-10	33,33
А-8-10	34,85
А-9-10	27,21

Предпринимались усилия для повышения содержания жира/липидов, так как эти показатели посчитали слишком низкими, чтобы быть полезными, поэтому проводились дополнительные эксперименты в целях повышения уровня липидов, продуцируемых культивируемыми водорослями.

В процессе разработки воплощений изобретения проводились эксперименты для того, чтобы определить, может ли изменение ингредиентов и/или их количества или их соотношения в среде обеспечить другие характеристики роста водорослей. Кроме того, проводились эксперименты с тем, чтобы определить, будут ли изменяться характеристики роста водорослей при модификации системы культивирования водорослей. В частности, модифицировали количества и соотношения Мд8О₄, мочевины, СаС1₂, МдС1₂ и КН₂РО₄ в целях повышения уровня липидов, продуцируемых культивируемыми водорослями.

Результаты ферментации, полученные в объеме 10 л, представлены ниже.

Таблица 2

Условия и результаты ферментации в объеме 10 л

Ингредиент/ № партии	ΝΒ4-030311	ΝΒ6-030311	ΝΒ4-032311	ΝΒ6-032311	ΝΒ3-032811	ΝΒ4-032811
(г/л)
Сахар	50	50	50	50	50	50
Дрожжевой экстракт	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5
Μ§δΟ4	0,1538	0,1538	0,1538	0,1538	0,5	1
14аС1	0	0	0	0	0	0
Мочевина	2	2	2	2	1	1
ΖπδΟφ	0,1538	0,1538	0,1538	0,1538	0,1538	0,1538
СаС1	0,1538	0,1538	0,1538	0,1538	1	2
М§С12	0,1538	0,1538	0,1538	0,1538	0,5	1
КН2РО4	-	-	1,5	1,5	0,5	1
Микроэлементы (жидк.) - мл	10	10	10	10	10	10
РеС13
ΖηδΟ4
ΜηδΟ4
Борная кислота
Си8О4
Подпитка
Мочевина: КН2РО4	мочевина 200 г/л	мочевина 200 г/л	2:1	2:1,5	2:0,5	2:0,5
Температура	30	30	30	30	30	30
Жир (%)	8,13	6,89	88,98	84,28	56,1	64,3
Примечания	сильный запах ΝΗ3	Сильный запах ΝΗ3
	проблемы с рН	проблемы с РН
	вытекает пена	Вытекает пена

- 23 027917

Таблица 3

Дополнительные условия и результаты ферментации в объеме 10 л

Ингредиент/ № партии	ΝΒ6- 032811	ΝΒ3- 040711	ΝΒ4- 040711	ΝΒ6- 040711	ΝΒ3- 041911	ΝΒ4- 041911	ΝΒ6- 041911
(г/л)
Сахар	50	50	50	50	50	50	50
Дрожжевой экстракт	7,5	7,5	7,5	5	7,5	7,5	6,25
М§304	2	2	2	2	2	2	2
N301	0	0	0	0	0
Мочевина	1	1	1	1	1	1	1
ΖηδΟ4	0,1538	0,1538	0,1538	0,1538	0	0	0
СаС1	4	4	4	4	4	4	4
МёС12	2	2	2	2	2	2	2
КН2РО4	2	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Микроэлементы (жидк.) - мл	20	20	20	20	20	20	20
РеС13
ΖηδΟ4
МпЗО4
Борная кислота
СиЗО4
Подпитка
Мочевина:КН2РО4	2:0,5	2:0,5	2:0,5	2:0,5
Температура	30	30	30	30	30
Жир (%)	73,70	71,16	73,49	73,88	68,69	76,56	72,56

Таблица 4

Дополнительные условия и результаты ферментации в объеме 10 л

Ингредиент/ № партии	ΝΒ3- 061411	ΝΒ4- 061411	ΝΒ6- 061411	ΝΒ3- 062111	ΝΒ4- 062111	ΝΒ6- 062111	ΝΒ3- 062811	ΝΒ4- 062811	ΝΒ6- 062811
(г/л)
Сахар	50	50	50	50	50	50	50	50	50
Дрожжевой экстракт	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5
М§804	0,1538	2	2	2	2	2	0,1538	2	2
№С1	0	0	0	4	8	0	0	0	0
Мочевина	2	1	1	1	1
ΖηδΟ4	0,1538	0,1538	0	0	0	0	0	0	0
СаС1	0,1538	4	4	4	4	4	4	0,1538	4
МёС12	0,1538	2	2	2	2	2	2	2	0,1538
КН2РО4	2	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Микроэлементы (жидк.) - мл	10	10	0	0	0	0	0	0	0
РеС13
ΖηδΟ4
МпЗО4
Борная кислота
СиЗО4
Подпитка
Мочевина: КН2РО4	2:0,5	2:0,5	2:0,5	2:0,5	2:0,5	2:0,5	2:0,5	2:0,5	2:0,5
Температура	30	30
Жир (%)	46,52	65,04	67,61	61,28	62,95	68,53	49,25	54,41	64,97
	Проверка состава	Влияние №С1	Эффект соотношения солей

Эти эксперименты, проведенные при разработке воплощений изобретения, показали, что определенные количества/соотношения субстратов, присутствующих в среде, оказывали прямое влияние на характеристики роста водорослей (например, общую полученную биомассу, а также на количество жира и/или содержание других компонентов в самой биомассе). Параметры, обеспечивающие биомассу с высоким содержанием жира при выращивании в объеме 10 л, были затем использованы для проверки того, будут ли они успешными при крупномасштабном производстве биомассы с высоким содержанием жира.

Пример 2. Крупномасштабное получение биомассы водорослей с высоким содержанием жира.

В первоначальных опытах по получению биомассы гетеротрофных водорослей, описанных выше в примере 1, применялись методики на основе процессов ферментации дрожжей. Эти процессы выполнялись в периодическом режиме из-за ограниченных производственных мощностей (№ейо1а8уШе, ΚΥ) и того, что температура контролировалась только в пределах между 25 и 30°С. Диапазон температур был таким большим из-за отсутствия точного контроля в системе. Как видно из приведенной выше табл. 1, уровень жира, достигнутый на заводе в №ейо1а8уШе, ΚΥ, составлял 8-38%. Однако, как указано выше, при разработке воплощений изобретения проводились дополнительные эксперименты, которые позволи- 24 027917 ли установить определенные соотношения/количества субстратов, которые использовались при получении биомассы гетеротрофных водорослей с тем, чтобы изменить показатели роста водорослей и продукции биомассы. Были установлены и изучены такие модификации уровней и соотношений в среде (например, Мд§О₄, мочевина, СаС1₂, МдС1₂ и КН₂РО₄) во время ферментации, которые изменяют рост водорослей и дают биомассу с существенно другими свойствами (например, биомассу со значительно более высоким содержанием жира). Как описано ниже, процесс (в том числе среды, содержащие установленные соотношения/количества субстратов, эффективные при получении биомассы водорослей с высоким содержанием жира, например, с содержанием жира более 67%) был далее испытан и запущен в крупном масштабе, а также в режиме с подпиткой (что позволяло модифицировать и контролировать количество азота, фосфора, калия и углерода во время процесса).

Культуру §с1и/ос11\'1пнт Ншастиш получали и хранили в криопробирках на 1,5 мл при -80°С. Для каждой культуры оттаивали криопробирку и асептически вносили в качалочную колбу на 1,0 л со средой. Среда в колбах на 1 л содержала компоненты, приведенные в табл. 5.

Таблица 5

Среда для культур в объеме 1,0 л

Ингредиент	В среде	Производитель
Сахар	50 г/л	СащШ - Наттопф ΙΝ, ЫЗА
Дрожжевой экстракт	10 г/л	8епз1еп1 - ЬкИапароНз, ΙΝ, ЫЗА
Морская соль	4 г/л	81§та-А1<1пс11 - 81. Ьошз, МО, ЫЗА

Температура в качалочных колбах, содержащих §сН|/осНу1г1нш Ншастиш в среде, поддерживалась при 30°С со встряхиванием при 250 об/мин до тех пор, пока водоросли не входили в логарифмическую/экспоненциальную фазу роста, но еще до истощения глюкозы в среде (обычно 72-144 ч).

Затем содержимое колб на 1 л с культурой асептически переносили в аспираторные бутыли на 2,0 л со стерильными коннекторами, которые использовали для подсоединения к более крупным сосудам (на 40, или 27, или 18 л). Таким образом, культуры из колб на 1 л использовали в качестве инокулята и асептически вносили в сосуды для посева (на 40, или 27, или 18 л), содержащие среды, описанные ниже в табл. 6.

Таблица 6

Среда для культур первого посева в объеме 18 л или 27 л

Ингредиент	В среде	Производитель
Сахар	50 г/л	Сагщ11 - Наттопф ΙΝ, ЫЗА
Дрожжевой экстракт	7,5 г/л	8епз1еп1 - ЬкНапароНз, ΙΝ, иЗА
М§304	0,1538 г/л	1Чогкет Ытйей -- КЩаНуа, Тигкеу
СаС12	0,1538 г/л	Осс1Йеп1а1 СЬеписа1 Сотрапу - Оа11аз, ТХ
М§С12	0,1538 г/л	ΝογΙΙι Атепсап 8а11 Сотрапу - Оуег1апс1 Рагк, К8

Стадию первого посева (40/18/27 л) проводили при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял 10% или больше до тех пор, пока не будет потреблено по меньшей мере 20 г/л глюкозы. При выращивании в стерильных условиях не требуется контролировать рН. Впрочем, рН остается в пределах здорового диапазона в течение всего процесса ферментации. Стадия первого посева (40/18/27 л) считалась завершенной, когда рост водорослей был в пределах лог/экспоненциальной фазы роста, глюкоза еще не была истощена в среде, но было израсходовано по меньшей мере 20 г/л глюкозы (обычно это происходило примерно между 24-48 ч). Для культуры из стадии первого посева готовили более крупный сосуд (на 4000/2000 л) (например, его наполняли средой и доводили до 30°С в стерильных условиях).

По завершении культуры первого посева содержимое сосуда с культурой из стадии первого посева (40/18/27 л) асептически переносили в сосуд по меньшей мере с 2000 л среды, описанной ниже в табл. 7.

Таблица 7

Среда для культур второго посева в объеме 4000/2000 л

Ингредиент	В среде	Производитель
Сахар	50 г/л	СагщИ - Наттопф ΙΝ, ЫЗА
Дрожжевой экстракт	7,5 г/л	8епз1еп1 - ГпсИапароНз, ΙΝ, ЫЗА
М§304	0,1538 г/л	Хогкет ЫтНей - Кшайуа, Тигкеу
СаС12	0,1538 г/л	Осс1Йеп1а1 СНегтса1 Сотрапу - Оа11аз, ТХ
МёС12	0,1538 г/л	ΝογΙΗ Атепсап 8а11 Сотрапу - Оуегкпй Рагк, КЗ

Культивирование на стадии второго посева (4000/2000 л) проводили при 30°С с подачей воздуха и со встряхиванием так, чтобы уровень растворенного кислорода составлял 10% или больше до тех пор, пока не будет потреблено по меньшей мере 20 г/л глюкозы. При выращивании в стерильных условиях не требуется контролировать рН. Впрочем, рН остается в пределах здорового диапазона в течение всего процесса ферментации. Стадия второго посева (40/18/27 л) считалась завершенной, когда рост водорослей был в пределах лог/экспоненциальной фазы роста, глюкоза еще не была истощена в среде, но было израсходовано по меньшей мере 20 г/л глюкозы (обычно это происходило примерно между 24-48 ч).

По завершении культуры второго посева (4000/2000 л) содержимое с культурой из второго посева

- 25 027917 асептически переносили в сосуд для третьей культуры объемом между 70000 л и 220000 л со стерильной средой при 30°С, как описано ниже в табл. 8.

Таблица 8

Среда для третьей культуры в объеме 70000/220000 л

Ингредиент	В среде	Производитель
Сахар	50 г/л	Саг§Ш - Наттош!, ΙΝ, иЗА
Дрожжевой экстракт	7,5 г/л	Зепзгеп! - ПкИапароИз, ΙΝ, иЗА
М§804	4 г/л	Ыогкет 1лтйе<1 - КлЛаЬуа, Тигкеу
Мочевина	1 г/л	РС8 8а1ез - ХоНЬЬгоок, 1Ь
СаС12	2 г/л	ОссЫеп1а1 СЬепнса1 Сотрапу - Оа11аз, ТХ
МёС12	2 г/л	ΝοτΐΗ Атепсап ЗаИ Сотрапу - Оуег1апЗ Рагк, К8
КН2РО4	0,25 г/л	ЬЫосЬет - Наг1е1, N1

После того, как водоросли в сосуде для третьей культуры (на 70000-220000 л) израсходовали 30 г/л глюкозы, начинали подачу глюкозы и подпитки. Глюкозу поддерживали на уровне 10 г/л при крупномасштабном культивирования водорослей в сосуде для третьей культуры (на 70000-220000 л). В процессе культивирования с подпиткой использовали подпитку, описанную ниже в табл. 9.

Таблица 9

Подпитка для процесса культивирования с подпиткой

Ингредиент	В среде	Производитель
Мочевина	2 г/л	РС8 8а1ез - ХоПЬЬгоок, 1Ь
КН2РО4	0,5 г/л	Ыбоскет - Наг1е1, N1

Подпитка добавлялась на протяжении 34 ч. Хотя для практического применения настоящего изобретения не требуется понимание механизма и хотя изобретение не ограничивается каким-то конкретным механизмом действия, в некоторых воплощениях этот период времени был установлен на основании того, что для начала подачи подпитки требуется ~20 ч (чтобы водоросли, находящиеся в сосуде для третьей культуры, израсходовали 30 г/л глюкозы). Затем подпитку прекращали (например, через 54 ч процесса) для того, чтобы все питательные вещества были удалены (израсходованы) из среды. Сбор биомассы водорослей происходил по окончании экспоненциального роста, что обычно происходило между 66-76 ч процесса.

Культуральный бульон без шлама центрифугировали при таких условиях, чтобы получить 15-30% твердых веществ, а этот концентрат подвергали сушке распылением, чтобы удалить воду до конечного влагосодержания менее 5%.

Результаты нескольких независимых крупномасштабных культур представлены на фиг. 1 и ниже в табл. 10-12.

Таблица 10

Результаты по продуктивности крупномасштабных культур

Номер партии	Жир в % (сырой образец)	Выход биомассы (г/л)	Выход в % после центрифуги	Жир в % (сухой продукт)	Белок в % (сухой продукт)	Влажность в % (сухой продукт)
Р1-2-11	60,70’	86,2		75,70	11,66	Г47
Р1-3-11	69,64	86,4	55	70,25	16,47	1,37
Р1-4-11	74,76	66,5	67	71,56	15,92	2,11
Р1-5-11	73,12	70,8	68	65,65	17,14	2,43
Р1-6-11	62,77	45,7	89	54,80	13,35	2,14
Р2-1-11	72,59	50,9	87	65,89	17,64	2,72
Р2-2-11	70,81	59,5	52	66,49	15,29	2,15

* Плохой образец.

** Проблемы с контролированием процесса в этой партии.

Р1-2-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 93700 л.

Р1-3-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 84000 л.

Р1-4-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 92300 л.

Р1-5-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 82300 л.

Р1-6-11.

Исходный объем - 80000 л, конечный объем - 83600 л.

Р2-1-11.

Исходный объем - 110000 л, конечный объем - 113000 л.

Р2-2-11.

Исходный объем - 110000 л, конечный объем - 125600 л.

Изучали характеристики биомассы, полученной из каждой крупномасштабной культуры с подпит- 26 027917 кой, включая анализ содержания общего жира (насыщенный и ненасыщенный жир); влажность, содержание докозагексаеновой кислоты (ΌΗΑ), содержание пальмитиновой кислоты, общее содержание белка и зольность (например, см. содержание жира и влаги - ΑΟС8 Αт 5-04 Быстрое определение масла/жира с помощью экстракции растворителем при высокой температуре ν. 3/31/10; ΌΗΑ/пальмитиновая кислота - метод ΑΟС8 Се 1Б-89 и метод анализа АОАС 991.39; белок - АОАС 990.03; зольность - АОАС 942.05; выход биомассы по объему (г/л) - 81оие е! а1., Эгу \\νΐβ1ιΙ теазигетеп! о£ тюгоЫа1 Ыотазз апй теазигетеп! \-аг1аЫ1пу апа1уз1з. Бю!ееЬпо1од;у Теейтдиез, νо1. 6: 207-212).

Таблица 11

Характеристики крупномасштабных культур

Номер партии	Общий жир в % (конечный)	Влажность (%) макс. 6%	ϋΗΑ (мг/г)	Пальмитиновая кислота (мг/г)	Общий белок (%)	Зольность макс. 10%
8Ь-Р1-1-11	72,70	1,39	191,80	379,00	14,96	3,50
8Ь-Р1-3-11	69,64	1,37	181,10	366,20	16,47	3,08
8Ь-Р1-4-11	73,71	2,11	185,80	373,80	15,92	3,11
8Ь-Р1-5-11	73,12	2,43	176,80	351,30	17,14	0,0373
8Е-Р2-1-11	72,59	2,72	252,40	360,90	17,64	0,0363
8ЬР2-2-11	70,81	2,15	247,20	365,00	15,29	0,0410
8Ь-Р2-3-11	72,86	2,50	197,36	269,40	11,58	3,29
8Ь-Р2-4-11	69,03	3,07	177,90	133,65	18,23	3,90
8Б-Р2-5-11	70,10	2,12	203,24	193,99	10,93	0,0342
8ЬР2-6-11	73,55	2,61	203,99	206,67	12,01	3,34
8Ь-Р2-8-11	70,86	1,91	190,31	287,79	12,71	3,30
8Ь-Р2-9-11	76,89	1,68	191,69	227,52	9,62	3,00
8Ь-Р1-8-11	76,31	1,55	191,41	318,00	10,71	3,80
5Ь-Р2-10- 11	72,15	1,75	186,24	256,13	13,37	4,81
8Ь-Р2-11-	73,64	2,49	184,34	299,77	11,45	4,42
11
8Ь-Р1-9-11	75,57	1,28	202,51	250,01	10,02	3,48
8Ь-Р2-13- 11	70,95	1,66	182,82	326,94	12,39	4,59
8Б-Р2-14- 11	69,13	1,42	196,00	253,11	14,79	3,65
8Ь-Р1-13- 11	67,56	1,73	184,66	212,92	15,10	3,97
8Б-Р1-14- 11	68,57	1,23	170,16	89,35	11,86	4,22
8Б-РЗ-4-11	68,80	1,56	203,25	183,65	15,31	3,84
8Ь-Р1-15- 11	70,58	1,14	175,58	147,37	9,80	3,56
ЗЬ-Р1-16- 11	72,72	1,31	175,28	91,40	10,43	4,06
ЗЬ-РЗ-8-11	71,75	1,80	207,95	138,37	14,32	3,65
8Ь-Р5-5-11	68,70	1,23	189,07	119,72	11,68	3,42
8Ь-Р1-25- 11	74,80	1,54			9,16	3,68
ЗЬ-РЗ-14- 11	76,24	1,90			8,41	3,08
8Ь-РЗ-15- 11	75,80	1,08			7,30	3,26
8Ь-Р1-1-12	70,24				8,30	3,51

- 27 027917

Характеристики крупномасштабных культур

Таблица 12

Номер партии	Общий жир в % (конечный)	Влажность (%) макс. 6%	ϋΗΑ (мг/г)	Пальмитиновая кислота (мг/г)	Общий белок (%)	Зольность макс. 10%
8Ь-Р1-25- 11	74,80	1,54	170,63	355,60	9,16	3,68
8Ь-РЗ-14- 11	76,24	1,90	179,85	346,41	8,41	3,08
ЗЬ-РЗ-15- 11	75,80	1,08	182,81	367,01	7,30	3,26
8Ь-Р1-1-12	70,24	1,81	160,84	336,77	8,30	-
8Ь-Р4-1-12	68,53	1,71	189,06	332,29	10,26	3,56
8Ь-Р6-2-12	69,13	1,73	169,44	351,39	7,75	з,п
8Ь-Р5-2-12	75,00	1,84	175,05	371,57	6,89	3,50
8Б-Р4-2-12	69,10	1,84	198,24	341,94	8,85	3,88
5Ь-Р6-3-12	69,34	1,80	175,42	340,86	10,44	3,62
8Ь-Р5-3-12	67,28	3,61	176,61	360,01	10,19	3,56
8Б-Р1-2-12	71,09	1,72	154,22	371,31	12,56	3,78
ЗЬ-Р1-4-12	68,42	1,66	159,54	375,98	12,88	3,81
8Б-Р4-5-12	70,89	1,88	171,73	397,13	12,38	3,10
ЗЬ-Р6-6-12	70,38	1,80	155,05	377,11	12,56	3,71
8Ь-Р5-6-12	68,17	1,75	155,73	389,31	10,56	3,80
ЗЬ-РЗ-З-12	73,64	1,94	156,25	393,08	12,13	3,52
8Б-Р1-7-12	71,97	1,58	164,05	362,40	8,75	3,98
ЗЬ-РЗ-4-12	70,93	2,37	183,88	366,83	10,13	2,23
ЗЬР6-7-12	70,95	2,66	176,68	366,29	10,56	4,31
8Ь-Р1-8-12	72,08	1,94	172,91	407,20	9,00	3,62
ЗЬ-РЗ-6-12	72,15	1,85			10,56	7,56
ЗЬ-РЗ-7-12	69,63	2,42			10,57	3,67
ЗЬ-РЗ-8-12	71,77	1,78
ЗЬ-РЗ-9-12	69,18	1,74

Кроме того, изучали жирно-кислотный профиль биомассы. Как видно из фиг. 2, жирно-кислотный профиль каждой полученной биомассы водорослей был очень похож, независимо от общего содержания жира в биомассе. Сводный жирно-кислотный профиль, с учетом общих профилей всех проанализированных образцов, представлен на фиг. 3.

Также определяли глицеридный профиль у каждой биомассы водорослей. Из общего содержания глицеридов в биомассе примерно 4-8% составляли диглицериды, менее 1% глицерина, 3-7% моноглицеридов и 84-88% триглицеридов.

Пример 3. Сбор биомассы.

Эксперименты, проведенные при разработке воплощений изобретения, установили, что повышенный уровень общего жира в биомассе вызывает значительные проблемы в отношении центрифугирования биомассы водорослей. Выход содержимого биомассы после центрифугирования составлял лишь 4585% от общего веса биомассы. Это видно, к примеру, из приведенной ниже табл. 13.

Таблица 13

Сравнение выхода жира и белка из свежесобранных образцов и высушенных распылением продуктов

Номер партии	Жир в % (сырой образец)	Выход биомассы (г/л)	Выход в % после центрифуги	Жир в % (сухой продукт)	Белок в % (сухой продукт)	Влажность в % (сухой продукт)
Р1-2-11	60,70'	86,2		75,70	11,66	1,47
Р1-3-11	69,64	86,4	55	70,25	16,47	1,37
Р1-4-11	74,76	66,5	67	71,56	15,92	2,11
Р1-5-11	73,12	70,8	68	65,65	17,14	2,43
Р1-6-11	62,77	45,7	89	54,80	13,35	2,14
Р2-1-11	72,59	50,9	87	65,89	17,64	2,72
Р2-2-11	70,81	59,5	52	66,49	15,29	2,15

* Плохой образец.

** Проблемы с контролированием процесса в этой партии. Р1-2-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 93700 л.

Р1-3-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 84000 л.

Р1-4-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 92300 л.

Р1-5-11.

Исходный объем - 70000 л, конечный объем - 82300 л.

- 28 027917

Р1-6-11.

Исходный объем - 80000 л, конечный объем - 83600 л.

Р2-1-11.

Исходный объем - 110000 л, конечный объем - 113000 л.

Р2-2-11.

Исходный объем - 110000 л, конечный объем - 125600 л.

Было установлено, что проблемы с выходом объясняются увеличением количества липидов/масла с низкой плотностью в биомассе. Поэтому при разработке воплощений изобретения проводились эксперименты с тем, чтобы решить эту проблему.

Один из подходов, отражающий способность повысить выход биомассы, заключается в охлаждении культуры, содержащей биомассу водорослей, перед центрифугированием. Хотя для практического применения изобретения не требуется понимания механизма и изобретение не ограничивается каким-то конкретным механизмом действия, в некоторых воплощениях охлаждение культуры повышало плотность липидов/масла и позволяло увеличить выход биомассы.

Проводились эксперименты с целью определения эффектов охлаждения биомассы перед центрифугированием.

Опыт № 1. Собирали 2 галлона бульона и хранили при 7-8°С в течение чуть больше 16 ч. Отбирали 8 центрифужных пробирок на 50 мл и ставили на водяную баню, чтобы достичь заданной температуры, приведенной ниже в табл. 14. Все образцы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин.

Таблица 14

Температура культур и результаты центрифугирования в опыте № 1

Температура (°С)	Визуальное наблюдение
10	отличное разделение без плавающих клеток; прозрачный супернатант
20	хорошее разделение без плавающих клеток; большая мутность, чем при 10°С
25	то же, что и при 20°С; усиление мутности
30	хорошее разделение без плавающих клеток; усиление мутности
35	хорошее разделение без плавающих клеток; очень сильная мутность
40	есть разделение; есть плавающие клетки; супернатант как молоко
45	плохое разделение
50	Почти нет разделения; множество плавающих клеток

Опыт № 2. Отбирали свежие образцы бульона и тестировали в диапазоне температур 10-30°С. Их не замораживали на ночь, как в опыте № 1. Все образцы оставляли на ледяной/водяной бане до достижения температуры. Затем образцы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин.

Таблица 15

Температура культур и результаты центрифугирования в опыте № 2

Температура (°С)	Визуальное наблюдение	Плотность (г/мл)
10	отличное разделение без плавают,их клеток; прозрачный супернатант	1,01967
15	хорошее разделение без плавающих клеток; очень мутный супернатант
20	есть разделение образца; видны хлопья
25	почти то же, что и при 20°С; усиление мутности
30	довольно хорошее разделение; усиление мутности	1,02915

Как описано в примере 2 и на фиг. 1, при крупномасштабном производстве охлаждение биомассы перед выделением (центрифугированием) дает существенное увеличение общего выхода биомассы. Проводилось много крупномасштабных ферментации с общим выходом примерно в 95%.

Все публикации и патенты, указанные в вышеприведенной спецификации, включены сюда в виде ссылки. Специалистам должны быть очевидны различные модификации и варианты описанных композиций и способов по изобретению, не выходящие за рамки и не отходящие от сути настоящего изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с определенными предпочтительными воплощениями, следует иметь в виду, что изобретение в том виде, как оно заявлено, не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными воплощениями. При этом различные модификации описанных способов применения изобретения, которые очевидны специалистам в соответствующих областях, должны находиться в пределах объема настоящего изобретения.

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения биомассы водорослей, содержащей по меньшей мере 67% общего жира, включающий последовательное культивирование водорослей в двух или более типах культуральных сред, где указанное культивирование включает:

   а) культивирование водорослей в среде, содержащей источник углерода, дрожжевой экстракт, по меньшей мере одну соль магния и по меньшей мере одну соль кальция, где источник углерода выбран из углевода, олеиновой кислоты, жира, глицерина, маннита, ацетата натрия, хлопковой муки, патоки, кукурузного экстракта и их комбинации; и далее

   б) культивирование водорослей в среде, содержащей источник углерода, дрожжевой экстракт, источник азота, источник фосфата, выбранный из фосфата металла или дигидрофосфата металла, по меньшей мере одну соль магния, по меньшей мере одну соль кальция и 4 г/л или менее хлорида натрия, где источник углерода выбран из углевода, олеиновой кислоты, жира, глицерина, маннита, ацетата натрия, хлопковой муки, патоки и кукурузного экстракта или их комбинации, а источник азота выбран из мочевины, пептона, солодового экстракта, мясного экстракта, казаминокислоты, жидкого кукурузного экстракта, глутамата натрия, ацетата аммония, сульфата аммония, хлорида аммония или нитрата аммония, причем азот и фосфат находятся в соотношении 50:1 к 4:1; и

   в) сбор биомассы водорослей, где водоросли выбраны из группы, включающей ТЬгаи81осЬу1гшт, δοϊιίζοοίινίπιιιη и АигайюсБуйгит.
2. 2. Способ по п.1, где культуральная среда на этапе а) содержит 50 г/л источника углерода, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 0,15 г/л сульфата магния, 0,15 г/л хлорида кальция и 0,15 г/л хлорида магния.
3. 3. Способ по п.2, где источником углерода является сахар.
4. 4. Способ по п.3, где сахар представляет собой глюкозу.
5. 5. Способ по п.1, где культуральная среда на этапе б) содержит 50 г/л источника углерода, 7,5 г/л дрожжевого экстракта, 4,0 г/л сульфата магния, 1 г/л мочевины, 2 г/л хлорида кальция, 2 г/л хлорида магния и 0,25 г/л однозамещенного фосфата калия.
6. 6. Способ по п.5, где источником углерода является сахар.
7. 7. Способ по п.1, где источником углерода на этапах а) и б) является сахар.
8. 8. Способ по п.7, где сахар представляет собой глюкозу.
9. 9. Способ по п.1, где культуральная среда на этапе б) пополняется с помощью подпитки.
10. 10. Способ по п.9, где подпитка включает мочевину и однозамещенный фосфат калия.
11. 11. Способ по п.9, где биомассу водорослей собирают из культуральной среды через 12-24 ч после прекращения подпитки.
12. 12. Способ по п.11, где биомассу водорослей собирают из культуральной среды после удаления/израсходования всех питательных веществ из среды.
13. 13. Способ по п.11, где биомассу водорослей собирают путем центрифугирования культуральной среды б).
14. 14. Способ по п.13, где культуральную среду б) охлаждают до 5-25°С перед сбором биомассы водорослей.
15. 15. Способ по п.1, где водоросли представляют собой δΟιίζοΟινΙπιιιη 1утасшит.
16. 16. Способ по п.1, где водоросли культивируют при 30°С и при таких условиях подачи воздуха и перемешивания, чтобы уровень растворенного кислорода составлял 10%.
17. 17. Способ по п.1, где водоросли культивируют в стерильных условиях.
18. 18. Способ по п.1, где культуральная среда на этапах а) и б) содержит магний и кальций в соотношении от 4,5:1 до 1:1.