CN103913507B - 氨基寡糖素原药的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，具体地涉及氨基寡糖素原药的定性定量检测方法，其特征在于包括氨基寡糖素质量分数的检测、聚合度的检测、pH值的检测、水不溶物的检测、灰分的检测、水分的检测。氨基寡糖素原药以虾蟹虾壳为原料，经去钙、去蛋白、脱色、脱乙酰、分检、粉碎制成的工业级氨基寡糖素，鉴别方法采用质谱法、红外光谱法和离子色谱法进行。氨基寡糖素原药聚合度测定采用样品的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF‑MS)法进行检测，氨基寡糖素含量的检测方法包括淋洗液制备、标样溶液配制、样品溶液配制和计算。该测定方法有效保证氨基寡糖素原药产品质量，维护生产、销售和消费者三方的权益。本发明的检测方法，准确度、灵敏度高，便于管理部门和用户对氨基寡糖素原药的质量进行监督和控制。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体地涉及氨基寡糖素原药的检测方法。
背景技术
氨基寡糖素作为一类重要的植物诱导抗病剂，来源于植物的寡聚糖的研究，是当今糖生物学的一个重要领域，研究表明，氨基寡糖素在抵御病原菌侵蚀的过程中，能诱导激发植物产生一系列的防御反应：1、产生一些合成抗毒素的蛋白酶，并积累对病原菌起拮抗作用的低分子量的次生物代谢产物，如植保素；2、诱导一些具有抗性的水解酶类和病程相关蛋白，这些蛋白直接抑制病原物生长或释放一些寡聚糖素（具有活性的寡聚糖）；3、积累一些特殊的，作为结构组分的蛋白，结构蛋白结合在细胞表面并参与对病原物的限制作用。这些防御反应协同作用阻止病原菌的传播和入侵，达到防病治病的作用。同时，氨基寡糖素也是一类新的植物激素，具有调节和控制植物生长发育等作用，它能发出调节特定植物功能的信息，这些功能包括促生长、抗寒、抗旱等。
本检测方法可有效保证产品质量，维护生产、销售和消费者三方的权益，便于管理部门和用户对氨基寡糖素原药的质量进行监督和控制。
发明内容
为有效保证氨基寡糖素原药产品质量，维护生产、销售和消费者三方的权益，本发明提供了氨基寡糖素原药检测方法，准确度、灵敏度高，便于管理部门和用户对氨基寡糖素原药的质量进行监督和控制。氨基寡糖素原药的检测方法，其特征在于包括氨基寡糖素聚合度的检测、质量分数的检测、pH值的检测、水不溶物的检测、灰分的检测、水分的检测。
本发明的氨基寡糖素原药的检测方法，其特征在于氨基寡糖素原药以虾蟹壳为原料，经去钙、去蛋白、脱色、脱乙酰、分检、粉碎制成的工业级氨基寡糖素。
本发明的检测方法，其特征在于氨基寡糖素的鉴别采用质谱法、红外光谱法和离子色谱法进行。
本发明的检测方法，其特征在于聚合度的测定采用样品基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法进行检测，通过质谱仪自带Bruker PolyTools数据处理软件，进行样品数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）、多分散性（pd）和平均聚合度（DP）统计分析。
本发明的的检测方法，其特征在于，氨基寡糖素质量分数的检测方法包括试材：离子色谱仪、含醋酸钠溶液作淋洗液、D-盐酸氨基葡萄糖作标样。
本发明的检测方法，其特征在于离子色谱法中，色谱仪为ICS-3000离子色谱仪，包含在线脱气装置的四元梯度泵、柱温箱、ED3000电化学检测器、淋洗液自动发生器、Chromeleon6.80色谱工作站。离子色谱法中的色谱条件为，分析柱为CarboPacTMPA10,保护柱为CarboPacTMPA10BioLCTM；采用ED3000脉冲安培检测，Au工作电极，Ag/AgCl参比电极模式，糖标准四电位，淋洗液为100mM NaOH和NaAc/H2O=10:90，流速为1.0mL/min。
离子色谱法的测定步骤如下：
1、淋洗液制备方法：在2L塑料试剂瓶中加入约1mL经过0.4μm尼龙滤膜过滤的超纯水，加入无水NaAc16.4g，再移入50%NaOH溶液10.5mL至水面以下，然后加入超纯水至2L，通氮气保护后摇匀备用；
2、标样溶液配制方法：准确称取D-盐酸氨基葡萄糖标样2.8mg，置于10mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，用超纯水对上述标样液进行准确稀释，配制系列浓度标样溶液，做为样品水解后氨基葡萄糖含量检测定量线绘制溶液；
3、样品溶液配制方法：取10mL带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的厚壁耐压管1支，准确称取氨基寡糖原药样品约25mg加入其中，然后用移液管加入6.0mol/L盐酸3.0mL，充分混匀后在管子里充入高纯度氮气并将管子密封，然后100℃油浴下搅拌水解24h。冷却到室温后打开螺旋盖，将水解液转移到蒸发皿中，用6mL蒸馏水分3次洗涤水解管的内壁，合并到相应蒸发皿中，在70℃烘箱中挥发至干。加5.0mL双蒸水将蒸发皿中的固体溶解，并转移到50mL容量瓶中，用5mL双蒸水洗涤蒸发皿，液体并入到相应的容量瓶中，再重复此步骤2次，用双蒸水定容到50mL，稀释100倍，得到待测氨基寡糖素水解溶液。
样品溶液的计算方法，其特征在于，待仪器充分稳定后，连续进样数针D-盐酸氨基葡萄糖标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，进行标样溶液的检测，绘制标准曲线做为氨基寡糖素含量检测定量线，当线性相关系数R2≥0.995，即进行样品溶液检测。
氨基寡糖素样品水解后溶液中氨基葡萄糖的浓度用方程1进行计算：
方程1：C氨基葡萄糖=（峰面积-b）/a
其中：C氨基葡萄糖：样品溶液中氨基葡萄糖的浓度；
峰面积：样品溶液中氨基葡萄糖平行检测峰面积的平均值；
a：氨基寡糖素含量检测定量线的斜率；
b：氨基寡糖素含量检测定量线的截距；
样品中氨基寡糖素的质量百分含量X（%）用方程2进行计算：
方程2：
其中：C氨基葡萄糖:样品溶液中氨基葡萄糖的浓度；
C样品溶液：样品溶液浓度；
K：原药含量检测校正因子，即D-盐酸氨基葡萄糖标样在相同水解条件下的回收率。
本发明的有益效果为，采用本氨基寡糖素原药检测的方法可实现氨基寡糖素元原药的批量检测，灵敏度、灵敏度高，节省时间。
附图说明
图1氨基寡糖素标样质谱图
图2氨基寡糖素标样红外光谱图
图3氨基寡糖素标样的离子色谱
图4氨基寡糖素线性线性关系图
具体实施方式
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明，但不限制本发明。
实施例1
一、鉴别试验
质谱法：本鉴别试验可与氨基寡糖素聚合度的测定同时进行，通过样品的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析，利用质谱仪自带Bruker PolyTools数据处理软件，进行样品数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）、多分散性（pd）和平均聚合度（DP）统计分析。氨基寡糖素试样与标样的质谱响应无明显差异，标样的质谱图见图1。
红外光谱法：试样与标样在4000cm-1-400cm-1范围内的红外吸收光谱应无明显差异。氨基寡糖素标样的红外光谱见图2。
离子色谱法：本鉴别试验可与氨基寡糖素含量的测定同时进行。在相同色谱条件下，试样溶液中D-盐酸氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖的色谱峰的保留时间与标样中溶液中氨基寡糖素的色谱峰的保留时间，其相对差值应在1.5%以内。氨基寡糖素标样的离子色谱见图3。
二、氨基寡糖素原药的检测
（一）、氨基寡糖素原药含量的检测方法
氨基寡糖素原药含量测定有两种方法，方法一是间接测定法，即将氨基寡糖素原药在酸性条件下水解为氨基葡萄糖，以氢氧化钠溶液为流动相，使用DionexCarbopacTMPA10色谱柱和电化学检测器，利用标准曲线进行原药水解后氨基葡萄糖定量测定，再折算成原药含量；方法二是直接测定法，即利用各壳寡糖标准品为参照，直接测定各单一壳寡糖含量，再把各单一壳寡糖含量相加即为原药含量。本测定采用方 法一实施。
1、材料与条件
（1）、试剂和溶液
①氢氧化钠溶液；②无水乙酸钠；③超纯水；④D-盐酸氨基葡萄糖标准品；
（2）、仪器
离子色谱：ICS-3000离子色谱仪（美国Dionex公司），包含在线脱气装置的四元梯度泵、柱温箱、ED3000电化学检测器（Au工作电极，pH/Ag/AgCl复合参比电极）、淋洗液自动发生器、Chromeleon6.80色谱工作站；
带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的厚壁耐压管。
（3）、色谱条件
分析柱：CarboPacTMPA10(i.d.4×250mm),保护柱：CarboPacTMPA10BioLCTM(i.d.4×250mm)；
ED3000脉冲安培检测，Au工作电极，Ag/AgCl参比电极模式，糖标准四电位；
淋洗液：100mM NaOH和NaAc/H2O=10:90；
流速：1.0mL/min；
进样方式：手动进样；
进样体积：25μL；
柱温：30℃
实验中各淋洗液上方均施加0.4MPa的氮气进行保护，防止淋洗液吸收空气中的二氧化碳。
2、检测步骤
（1）、淋洗液制备
100mM NaOH和NaAc溶液：在2L塑料试剂瓶中加入约1mL经过0.4μm尼龙滤膜过滤的超纯水，加入无水NaAc16.4g，再移入50%NaOH溶液10.5mL至水面以下，然后加入超纯水至2L刻度，通氮气保护后摇匀备用。
（2）、标样溶液配制
准确称取D-盐酸氨基葡萄糖标样2.8mg（精确至0.0002g），置于10mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，作为标样储备液。
用超纯水对上述标样储备液进行准确稀释，配制系列浓度标样溶液，做为样品水解后氨基葡萄糖含量检测定量线绘制溶液。
（3）、样品溶液配制
取10mL带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的厚壁耐压管1支，准确称取氨基寡糖原药样品约25mg加入其中，然后用移液管加入6.0mol/L盐酸3.0mL，充分混匀后在管子里充入高纯度氮气并将管子密封，然后100℃油浴下搅拌水解24h。冷却到室温后打开螺旋盖，将水解液转移到蒸发皿中，用6mL蒸馏水分3次洗涤水解管的内壁，合并到相应蒸发皿中，在70℃烘箱中挥发至干。加5.0mL双蒸水将蒸发皿中的固体溶解，并转移到50mL容量瓶中。用5mL双蒸水洗涤蒸发皿，液体并入到相应的容量瓶中，再重复此步骤2次，用双蒸水定容到50mL，稀释100倍，得到待测氨基寡糖素水解溶液。
D-盐酸氨基葡萄糖标样水解：操作步骤同上，计算回收率，作为原药含量检测的校正因子K。
(4)、含量检测
在上述操作条件下，待仪器充分稳定后，连续进样数针D-盐酸氨基葡萄糖标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，进行标样溶液的检测，绘制标准曲线做为氨基寡糖素含量检测定量线，当线性相关系数R2≥0.995，即进行样品溶液检测。
（5）、计算
氨基寡糖素样品水解后溶液中氨基葡萄糖的浓度用方程式1进行计算：
方程1：C氨基葡萄糖=（峰面积-b）/a
其中：C氨基葡萄糖：样品溶液中氨基葡萄糖的浓度；
峰面积：样品溶液中氨基葡萄糖平行检测峰面积的平均值；
a：氨基寡糖素含量检测定量线的斜率；
b：氨基寡糖素含量检测定量线的截距。
样品中氨基寡糖素的质量百分含量X（%）用方程式2进行计算：
方程2：
其中：C氨基葡萄糖:样品溶液中氨基葡萄糖的浓度；
C样品溶液：样品溶液浓度；
K：原药含量检测校正因子，即D-盐酸氨基葡萄糖标样在相同水解条件下的回收率
（二）、聚合度的检测
采用样品的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法进行检测，通过质谱仪自带Bruker PolyTools数据处理软件，进行样品数均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）、多分散性（pd）和平均聚合度（DP）统计分析。
（三）、pH值的检测
按照GB/T1601-2001中的PH计法进行。
（四）、水不溶物的检测
按照GB/T28136-2011中的规定检测。
（五）、灰分
按GB/T5009.4规定检测。
（六）、水分
按GB/T5009.3规定检测。
二、检测方法线性范围
采用倍数稀释法，用超纯水稀释D-盐酸氨基葡萄标样储备液，在0.004-14.541mg/L(浓度以氨基葡萄糖计)范围内准确配制D-盐酸氨基葡萄糖标样系列浓度溶液，在规定色谱条件下进行方法线性范围检测。检测结果见表2，标准曲线见图4。结果表明：氨基葡萄糖在0.004-14.541mg/L范围内，具有良好的线性关系，其色谱峰面积对浓度的回归方程为y=6.8225x+0.0758，R2=0.9997，符合要求。
表2氨基寡糖素线性范围试验数据
| 序号 | 标准工作溶液浓度（mg/L） | 峰面积（mAu*S） |
| 1 | 0.004 | 0.02 |
| 2 | 0.007 | 0.06 |
| 3 | 0.014 | 0.07 |
| 4 | 0.028 | 0.21 |
| 5 | 0.057 | 0.32 |
| 6 | 0.114 | 0.81 |
| 7 | 0.227 | 1.79 |
| 8 | 0.454 | 3.50 |
| 9 | 0.909 | 6.30 |
| 10 | 1.818 | 12.40 |
| 11 | 3.635 | 24.10 |
| 12 | 7.270 | 50.94 |
| 13 | 14.541 | 98.84 |
三、精密度试验
对同一样品进行多次检测，其结果如表3所示：
表3氨基寡糖素原药精密度试验结果
由上表可知氨基寡糖素变异系数（%RSD）为1.23小于Horwitz公式计算出的变异系数（1.38）。方法精密度好。
四、准确度试验
为验证本方法的准确性，分别向一组质量分数均已知的试样加入已知质量分数的氨基寡糖素标样，然后对其进行检测，其结果如表4所示。
表4氨基寡糖素原药准确度试验结果
| 序号 | 理论值（%） | 实测值（%） | 误差 | 回收率（%） |
| 1 | 85.12 | 85.25 | +0.13 | 100.16 |
| 2 | 85.15 | 85.30 | +0.15 | 100.18 |
| 3 | 85.16 | 85.33 | +0.17 | 101.20 |
| 4 | 85.09 | 84.82 | -0.27 | 99.68 |
| 5 | 85.20 | 85.06 | -0.14 | 99.83 |
| 平均值 | 84.144 | 85.152 | 0.008 | 100.21 |
由上表可知分析氨基寡糖素的添加回收率为99.68%～100.20%之间，平均回收率为100.21%，检测方法的准确度较高。
五、生产抽检结果
为验证本标准的合理性，对生产样品随机抽取5批进行全项检测，其结果如表5所示：
表5氨基寡糖素原药实测数据
| 编号 | 含量（%） | 水分（%） | 灰分（%） | pH值 | 不溶物(%) | 聚合度（2～10） |
| 1 | 85.62 | 6.3 | 0.3 | 5.6 | 0.1 | 5 |
| 2 | 85.35 | 6.2 | 0.3 | 5.7 | 0.1 | 6 |
| 3 | 85.45 | 6.2 | 0.3 | 5.6 | 0.1 | 6 |
| 4 | 85.39 | 6.2 | 0.2 | 5.7 | 0.1 | 8 |
| 5 | 85.34 | 6.3 | 0.3 | 5.8 | 0.1 | 7 |
由表5可知，随机抽检，产品各项指标均为合格，这证明本标准中各项指标是合理可行的。本标准方法准确可靠，能够指导正常生产。
Claims (6)
1.氨基寡糖素原药的检测方法，包括氨基寡糖素聚合度的检测、质量分数的检测、pH值的检测、水不溶物的检测、灰分的检测、水分的检测，氨基寡糖素的鉴别采用质谱法、红外光谱法和离子色谱法进行，聚合度的测定采用样品基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法进行检测，通过质谱仪自带Bruker PolyTools数据处理软件，进行样品数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、多分散性(pd)和平均聚合度(DP)统计分析，氨基寡糖素质量分数的检测方法包括试材：离子色谱仪、含醋酸钠溶液作淋洗液、D-盐酸氨基葡萄糖作标样。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于离子色谱法中，色谱仪为ICS-3000离子色谱仪，包含在线脱气装置的四元梯度泵、柱温箱、ED3000电化学检测器、淋洗液自动发生器、Chromeleon 6.80色谱工作站。
3.根据权利要求2的检测方法，其特征在于离子色谱法中的色谱条件为，分析柱为CarboPacTMPA10,保护柱为CarboPacTMPA10BioLCTM；采用ED3000脉冲安培检测，Au工作电极，Ag/AgCl参比电极模式，糖标准四电位，淋洗液为100mM NaOH和NaAc/H2O＝10:90，流速为1.0mL/min。
4.根据权利要求3的检测方法，其特征在于步骤如下：
淋洗液制备方法：在2L塑料试剂瓶中加入1mL经过0.4μm尼龙滤膜过滤的超纯水，加入无水NaAc16.4g，再移入50％NaOH溶液10.5mL至水面以下，然后加入超纯水至2L，通氮气保护后摇匀备用；
标样溶液配制方法：准确称取D-盐酸氨基葡萄糖标样2.8mg，置于10mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，用超纯水对上述标样液进行准确稀释，配制系列浓度标样溶液，做为样品水解后氨基葡萄糖含量检测定量线绘制溶液；
样品溶液配制方法：取10mL带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的厚壁耐压管1支，准确称取氨基寡糖原药样品25mg加入其中，然后用移液管加入6.0mol/L盐酸3.0mL，充分混匀后在管子里充入高纯度氮气并将管子密封，然后100℃油浴下搅拌水解24h；冷却到室温后打开螺旋盖，将水解液转移到蒸发皿中，用6mL蒸馏水分3次洗涤水解管的内壁，合并到相应蒸发皿中，在70℃烘箱中挥发至干；加5.0mL双蒸水将蒸发皿中的固体溶解，并转移到50mL容量瓶中，用5mL双蒸水洗涤蒸发皿，液体并入到相应的容量瓶中，再重复此步骤2次，用双蒸水定容到50mL，稀释100倍，得到待测氨基寡糖素水解溶液。
5.根据权利要求3或4的检测方法，其特征在于，待仪器充分稳定后，连续进样数针D-盐酸氨基葡萄糖标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5％，进行标样溶液的检测，绘制标准曲线做为氨基寡糖素含量检测定量线，当线性相关系数R2≥0.995，即进行样品溶液检测。
6.根据权利要求5的检测方法，其特征在于，氨基寡糖素质量分数的计算方法如下：
样品溶液计算方法：制备D-盐酸氨基葡萄糖标样，计算回收率，作为原药含量检测的校正因子K；在前述操作条件下，待仪器充分稳定后，连续进样数针D-盐酸氨基葡萄糖标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5％，进行标样溶液的检测，绘制标准曲线做为氨基寡糖素含量检测定量线，当线性相关系数R2≥0.995，即进行样品溶液检测；
氨基寡糖素样品水解后溶液中氨基葡萄糖的浓度用方程1进行计算：
方程1：C氨基葡萄糖＝(峰面积-b)/a
其中：C氨基葡萄糖：样品溶液中氨基葡萄糖的浓度；
峰面积：样品溶液中氨基葡萄糖平行检测峰面积的平均值；
a：氨基寡糖素含量检测定量线的斜率；
b：氨基寡糖素含量检测定量线的截距；
样品中氨基寡糖素的质量百分含量X(％)用方程2进行计算：
方程2：
其中：C氨基葡萄糖:样品溶液中氨基葡萄糖的浓度；
C样品溶液：样品溶液浓度；
K：原药含量检测校正因子，即D-盐酸氨基葡萄糖标样在相同水解条件下的回收率。
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