CN103908430A - 一种稳定的包裹紫杉醇固体蛋白纳米粒及其质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定的包裹紫杉醇药物的固体蛋白纳米粒及其质量控制方法，该纳米粒蛋白表面包裹表面活性剂，经过研究筛选白蛋白与表面稳定剂的比例以及表面稳定剂的种类，制备了可以稳定存放的紫杉醇纳米粒，该纳米粒可稳定存放12小时以上，极大的方便了临床使用，具有实际的应用价值。

Description

一种稳定的包裹紫杉醇固体蛋白纳米粒及其质量控制方法

技术领域

本发明涉及制药领域，具体涉及一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，该纳米粒包裹表面活性剂，通过筛选白蛋白载体的表面稳定剂，制备了可以稳定存放的紫杉醇纳米粒，该纳米粒可稳定存放12小时以上，极大的方便了临床使用，具有实际的应用价值。

背景技术

紫杉醇是一种天然的抗癌原料药，为白色结晶粉末、难溶于水及许多药用溶媒，水中溶解度仅为0.006mg/ml，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，紫杉醇是一个复杂的二萜类化合物，具有含氧四环的紫杉烷环及酯侧链，分子式为：C47H51NO14，分子量：853.90，在PH4～8范围内紫杉醇比较稳定，碱性条件下很快分解，酸性条件下比较稳定。

目前上市的紫杉醇静脉注射液最早由NCI于1978年研制，该药物由施贵宝药厂生产，现已进入我国市场。处方以CremophorEL50％(v/v增溶剂)，50％(v/v)无水乙醇为溶媒，紫杉醇浓度达6mg/ml，用5％右旋糖酐稀释或生理盐水稀释至0.3～1.2mg/m，紫杉醇理化性质可稳定12h以上。现FDA批准的给药方案是每21d静脉滴注一次，每次将总给药剂量的1/3用500ml5％右旋糖酐稀释后8h内滴完，连续滴注24h，最低给药剂量135mg/m2。该处方给药后数分钟，过敏反应发生率为39％，其中严重过敏反应发生率为2％，多数为I型变态反应，表现为支气管痉挛性呼吸困难、荨麻疹和低血压，部分病人出现药物性皮疹、呼吸急促、支气管痉挛、低血压等过敏反应。研究认为，这主要是处方中CremophorEL引起体内组胺释放造成。其在紫杉醇注射液中使用剂量明显高于所有已上市制剂，目前多采取在给药前数小时服用苯海拉明、地塞米松、氨茶碱等抗组胺剂防止过敏反应的发生。研究还发现，注射液中CremophorEL与聚氯乙烯塑料管和输液袋接触可浸提出大量的塑化剂邻苯二甲酸二乙基乙酯，因此专家建议临床使用玻璃、聚乙烯容器及内衬聚乙烯的硝化甘油管为输液器具。

如今注射用紫杉醇(白蛋白结合型)的上市引起了市场的广泛关注，我公司的研究人员对以白蛋白为载体包裹紫杉醇的药物进行了深入研究，经过研究发现，用非离子表面活性剂，使包裹紫杉醇的蛋白表面形成稳定膜，会使产品的稳定性大大加强，我们对各种表面活性剂进行了筛选，发现一定量的聚氧乙烯脂肪酸酯可以在白蛋白表面新成稳定的表面膜。

由于聚氧乙烯脂肪酸酯，很多文献报道聚氧乙烯脂肪酸酯尤其是吐温80，在静脉点滴时，用量超过1mg/mL会有产生致敏反应，为此我们经过了反复研究，限定了聚氧乙烯脂肪酸酯的用量，使其严格控制在0.04mg/ml以下，动物实验研究表明，该浓度范围的聚氧乙烯脂肪酸酯未产生致敏反应，此外，严格控制吐温80的质量标准也非常重要。

有研究报道致敏反应与吐温80的酸值、色度以及水分含量有关，其中过高的酸值高可能是由于存在未参与酯化反应的脂肪酸或是在生产贮存过程中发生了氧化反应，生成了醛类或酸类物质；较高色度可能是由于原料油酸中的杂质所造成；较高的水分含量可以加速产品的降解，生成游离脂肪酸，进而导致酸值升高。吐温80的脂肪酸链中除油酸外还含有亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸和硬脂酸等多种脂肪酸，由于组分复杂，对产品的安全性产生了较大的影响。

为此，我们对聚氧乙烯脂肪酸酯中的脂肪酸含量进行了研究，令人欣喜的发现油酸的含量对蛋白表面成膜使蛋白纳米粒保持稳定，显的至关重要！我们对不同油酸含量的聚氧乙烯脂肪酸酯进行了研究，经过了反复研究和筛选，终于筛选出了油酸含量最佳的聚氧乙烯脂肪酸酯，通过对聚氧乙烯脂肪酸酯的用量和其油酸中的含量进行了限定，很好的保证了产品的安全性。

人血白蛋白是通过低乙醇法或层析法从人体血液中提取的血浆蛋白制剂，但是血源产品的生产受到血源供应的限制，不可避免地会有周期性缺货发生，同时由于血液的来源不能完全得到控制，无法完全避免致病微生物的潜在威胁。日本首家研制成功了重组人血白蛋白并作为药用辅料用于疫苗产品的生产，国内如华北制药、浙江海正药业采用基因重组人血白蛋白项目采用现代生物技术，运用发酵生产重组人血清白蛋白的方案，大规模生产白蛋白产品，替代疫苗生产过程中作为培养基的血源白蛋白，降低血源产品的安全风险。

利用现代大规模生物发酵技术生产的重组人血白蛋白，同人血白蛋白相比具有纯度高、防污染、可量产等优点，专家分析认为药用辅料级及未来的药用级重组人血白蛋白市场潜质巨大，目前国内已有厂家在申报中。

因此，该项目中白蛋白可以选择人血来源，也可以选择重组人血白蛋白。

制备工艺中，考虑到白蛋白在有气泡和高剪切力的作用下容易变性，为避免制备过程中产生杂蛋白造成过敏反应，我们采用了较低的高压均化压力和挤压过滤相结合的工艺，尽可能使白蛋白损伤最小，使纳米粒的平均粒径控制在150nm以下，符合注射剂的要求。

综上所述，我们通过研究筛选非离子表面活性剂种类，严格控制其中的各项指标，采用温和的制备工艺，制备了有临床优势的可产业化的紫杉醇的固体蛋白纳米粒，具有非常现实的意义。

发明内容

本发明公开了一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，将紫杉醇溶解在适量有机溶剂中，充分分散在蛋白溶液中，使其结合在蛋白质的疏水区域，加入适量蛋白表面稳定剂，其中蛋白表面稳定剂选自非离子表面活性剂，与蛋白的重量比为：0.1-10∶1000，优选重量比为1-5∶1000，更优选0.5-3∶1000。

本发明公开的非离子表面活性剂选自聚氧乙烯脂肪酸酯，更优选聚氧乙烯油酸酯，其中油酸在聚氧乙烯油酸酯中的含量为10-50％，优选15-30％，其质量控制方法采用GC法。

本发明公开了一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其中白蛋白可以是人血白蛋白，也可以是通过基因工程方法得到的重组人血白蛋白。

本发明公开了一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其中制备方法为将紫杉醇溶解在5-20倍量的有机溶剂中，充分分散在蛋白质溶液中，加入处方量的表面活性剂，调节PH为3.0-6.0，分别通过0.45um和0.22um的滤膜挤压过滤即得，有机溶剂选自氯仿或二氯甲烷。

本发明公开了一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其中制备方法为将紫杉醇溶解在8-15倍量的有机溶剂中，充分分散在蛋白质溶液中，加入处方量的表面活性剂，调节PH为3.0-6.0，在200-600bar高压均化法，分别通过0.45um、0.22um的滤膜挤压过滤，除去有机溶剂，低温冷冻干燥即得。

本发明公开了一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其中还含有生物相容性酸及盐，所述生物相容性酸指盐酸、磷酸或其金属钠盐、柠檬酸或其金属钠盐、草酸或其金属纳盐、冰醋酸或其碱金属盐、氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钠中的一种或几种。

本发明聚氧乙烯脂肪酸酯(聚山梨酯80)中的聚氧乙基的含量测定方法如下：

本法系依据聚山梨酯80中的聚乙氧基(Polyethoxylated)和铵钴硫氰酸盐反应形成蓝色复合物，可溶于二氯甲烷，用比色法测定聚山梨酯80含量。

测定法：取供试品一瓶，用20ml去离子水溶解，取1.0ml于离心管中，加乙醇-氯化钠饱和溶液5mL，摇匀，每分钟3000转离心10分钟，取上清液，再用乙醇-氯化钠饱和溶液1.0mL小心冲洗管壁，洗液与上清液合并，每分钟3000转离心10分钟，上清液置55℃水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.1～0.5mL，加1mL水溶解。准确加入二氯甲烷4.0mL、硫氰钴铵溶液(称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200mL)3.0mL，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，弃上层液，照紫外-可见分光光度法(附录II A)，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。

精密量取聚山梨酯80对照品溶液(取聚山梨酯80约100mg，精密称定，加水溶解后置100mL量瓶中，加水稀释至刻度)0μL、25μL、50μL、100μL、200μL，加入预先加入1mL水的离心管中混匀，准确加入二氯甲烷4.0mL、硫氰钴铵溶液3.0mL，加塞，混匀，自“室温放置1.5小时”起，同法操作。

用上述聚山梨酯80系列浓度(μg/mL)与相应的吸光度作直线回归，相关系数应不低于0.98，将供试品吸光度代入回归方程，求得供试品聚山梨酯80含量(μg/mL)。样品中所含聚氧乙基与聚山梨酯80的换算方法为：

C(聚氧乙基)＝C(聚山梨酯80)×0.8053

每瓶中的聚氧乙基含量为

M(聚氧乙基)＝C(聚氧乙基)×20

油酸含量测定

①色谱条件：采用GC测定本品中油酸的含量

以丁二酸二乙二醇聚酯(PEGs)为固定相，涂布浓度为10％，柱温165℃，气化室215℃，检测器215℃，载气：高纯氮150KPa，氢气70KPa，空气50KPa，氢火焰离子化检测器(FID)。

②标准曲线溶液的配制：

取油酸对照品适量，精密称定，用氯仿稀释制成每1mL含1000、750、500、250、100μg的溶液，即得。

③供试品溶液的制备

取本品1瓶，加0.9％氯化钠溶液20mL使内容物分散后，加入2M的氢氧化钠溶液20mL，30℃水溶中磁力搅拌12h后，加入2M的盐酸溶液20mL中和，向其中加入20mL氯仿，涡旋30s，静置分层后，弃掉上部水层，60℃水浴中，用氮吹法将其浓缩至5mL，即得。

④测定方法

取标准品溶液与供试品溶液个5μL，分别注入GS记录色谱图，以浓度对峰面积进行线性回归计算，每瓶中所含油酸量为

M(油酸)＝C(油酸)×5

具体实施例：

具体实施例一：聚氧乙烯脂肪酸酯(吐温80)与白蛋白不同重量比固体纳米粒的制备

具体实施例一：

聚氧乙烯脂肪酸酯(吐温80)与白蛋白不同重量比固体纳米粒的制备

聚氧乙烯脂肪酸酯(吐温80)中聚氧乙基含量的测定：

测定法：取自制不同油酸含量的吐温80 1.5mg，分别用20ml去离子水溶解，取1.0ml于离心管中，加乙醇-氯化钠饱和溶液5mL，摇匀，每分钟3000转离心10分钟，取上清液，再用乙醇-氯化钠饱和溶液1.0mL小心冲洗管壁，洗液与上清液合并，每分钟3000转离心10分钟，上清液置55℃水浴中，用空气吹扫法将其浓缩至0.1～0.5mL，加1mL水溶解。准确加入二氯甲烷4.0mL、硫氰钴铵溶液(称取硝酸钴6.0g、硫氰酸铵40.0g，加水溶解并稀释至200mL)3.0mL，加塞，混匀，室温放置1.5小时，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，弃上层液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010版二部附录II A)，在波长620nm处测定下层二氯甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。

精密量取聚氧乙烯脂肪酸酯(吐温80)对照品溶液(取对照品约100mg，精密称定，加水溶解后置100mL量瓶中，加水稀释至刻度)0μL、25μL、50μL、100μL、200μL，加入预先加入1mL水的离心管中混匀，准确加入二氯甲烷4.0mL、硫氰钴铵溶液3.0mL，加塞，混匀，自“室温放置1.5小时”起，同法操作。

用上述吐温80系列浓度(μg/mL)与相应的吸光度作直线回归，相关系数应不低于0.98，将供试品吸光度代入回归方程，求得供试品吐温80含量(μg/mL)。样品中所含聚氧乙基与吐温80的换算方法为：

C(聚氧乙基)＝C(吐温80)×0.8053

每瓶中的聚氧乙基含量为

M(聚氧乙基)＝C(聚氧乙基)×20；

油酸含量测定

①色谱条件：采用GC测定本品中油酸的含量

以丁二酸二乙二醇聚酯(PEGs)为固定相，涂布浓度为10％，柱温165℃，气化室215℃，检测器215℃，载气：高纯氮150KPa，氢气70KPa，空气50KPa，氢火焰离子化检测器(FID)。

②标准曲线溶液的配制：

取油酸对照品适量，精密称定，用氯仿稀释制成每1mL含1000、750、500、250、100μg的溶液，即得。

③供试品溶液的制备

取本品1瓶，加0.9％氯化钠溶液20mL使内容物分散后，加入2M的氢氧化钠溶液20mL，30℃水溶中磁力搅拌12h后，加入2M的盐酸溶液20mL中和，向其中加入20mL氯仿，涡旋30s，静置分层后，弃掉上部水层，60℃水浴中，用氮吹法将其浓缩至5mL，即得。

④测定方法

取标准品溶液与供试品溶液5μL，分别注入GS记录色谱图，以浓度对峰面积进行线性回归计算，每瓶中所含油酸量为

M(油酸)＝C(油酸)×5

实验结果如下：

1.标准曲线

2.自制样品中聚氧乙基含量和油酸含量测定结果如下：

1、有机相配置：紫杉醇100mg溶解在1.5ml二氯甲烷中

2、水相配置：白蛋白1000mg溶解在20ml生理盐水中：

配方一：不加吐温80

配方二：加入吐温80(油酸含量为12％)1.5mg，调节PH值为3.5；

配方三：加入吐温80(油酸含量为15％)1.5mg，调节PH值为3.5；

配方四：加入吐温80(油酸含量为20％)1.5mg，调节PH值为3.5；

配方五：加入吐温80(油酸含量为30％)1.5mg，调节PH值为3.5；

配方六：加入吐温80(油酸含量为35％)1.5mg，调节PH值为3.5；

配方七：加入吐温80(油酸含量为45％)1.5mg，调节PH值为3.5；

将有机相加入水相不同的配方中，高压均质机600bar均质10遍，分别通过0.45um和0.22um滤膜挤压过滤，除去二氯甲烷调节PH即得，测试结果如下：

编号	50％粒径范围(nm)	90％粒径范围(nm)	放置12小时稳定性观察
				配方一	280	540	析出沉淀
配方二	145	230	少量沉淀、震荡既消失
				配方三	120	205	无沉淀析出
配方四	122	200	无沉淀析出
				配方五	133	210	无沉淀析出
配方六	145	295	微量沉淀、震荡既消失
				配方七	175	315	少量沉淀、震荡既消失

根据实验结果：优选配方三、四和五，既油酸在吐温80中的重量百分比为15％-30％。

具体实施例二：吐温80用量的考察

1、有机相配置：紫杉醇100mg溶解在1.5ml二氯甲烷中；

2、水相配置：白蛋白1000mg溶解在20ml生理盐水中，加入不同量的吐温80(油酸含量为20％)，调节PH值为4.0；

将有机相加入水相不同的配方中，高压均质机600bar均质10遍，分别通过0.45um和0.22um滤膜挤压过滤，除去二氯甲烷调节PH即得，测试结果如下：

根据实验结果：吐温80用量在0.5mg，产品的粒径范围就符合注射剂的要求，随着吐温80用量的增加，粒径没有显著的变化，鉴于安全性的考虑，选择1.0mg-2.5mg比较合适.

具体实施例三：油酸在吐温80中的重量百分比为15％和30％进行豚鼠全身主动过敏试验

分别取聚氧乙烯油酸酯(符合2010版中国药典注射级要求)中油酸的含量为15％和30％(按照本发明中GC实验方法测定)用生理盐水配成0.1％、0.5％溶液作为供试品A和B。

阳性对照：4％鸡蛋清(临用前用生理盐水注射液配制而成)。

豚鼠24只，普通级，体重298～332g，雌雄各半，饲养条件：温度：22±2℃；湿度：40-70％；光照：12小时明暗交替；每笼3只；喂以豚鼠专用颗粒饲料，辅以新鲜蔬菜。实验前动物饮水、进食正常，状态良好。

豚鼠24只，按体重、性别随机分为6组，每组4只，雌雄各半。阴性对照组给予生理盐水注射液1.0ml致敏，并以2.0ml该注射液进行激发；阳性对照组预先以4％鸡蛋清1.0ml致敏，并以2.0ml该试剂进行激发；供试品高、低剂量组分别以1.0ml致敏，并以2.0ml该药进行攻击。各组首先隔日腹腔注射药液1.0ml/只，共注射3次。末次腹腔注射后第14天由前肢静脉注射原试剂或配制后的原药液2.0ml/只。

按表1观察静脉注射后30分钟内每只豚鼠过敏反应症状，并按表2评分标准进行评分，计算过敏反应发生率。根据过敏反应发生率和发生程度进行综合判断。

表1过敏反应症状

表2全身致敏性评价标准

试验结果如下：

供试品聚氧乙烯油酸酯高、低剂量组末次致敏后用原药液进行激发均未发生过敏性反应；而阳性对照组豚鼠于注射后3分钟内出现呼吸困难，抽搐倒下，而后死亡，豚鼠死亡均发生在注射后1-5分钟内。另外，阴性对照组4只豚鼠均未发生过敏反应，结果见表3。

表3聚氧乙烯油酸酯中油酸的含量为20％给予豚鼠的全身主动过敏反应试验结果

试验结论：

本次试验条件下，聚氧乙烯油酸酯中油酸的含量为15％和30％对受试豚鼠无全身主动过敏作用。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种稳定的包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其特征在于紫杉醇溶解在有机溶剂中，与蛋白质的疏水区域结合，蛋白表面稳定剂结合在蛋白表面形成稳定的膜，其中蛋白表面稳定剂选自非离子表面活性剂，与蛋白的重量比为：0.1-10∶1000。

2.根据权利要求1所述的非离子表面活性剂，其特征在于选自聚氧乙烯脂肪酸酯，更优选聚氧乙烯油酸酯，其中油酸在聚氧乙烯油酸酯中的含量为12-50％。

3.根据权利要求1所述的非离子表面活性剂，其特征在于表面稳定剂蛋白的重量比优选为1-5∶1000，更优选为0.5-3∶1000。

4.根据权利要求1-2所述的非离子表面活性剂，其特征在于选自聚氧乙烯脂肪酸酯中油酸所占重量比优选15-30％，其质量控制方法采用GC法。

5.根据权利要求1中包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其特征在于可以是人血白蛋白，也可以是通过基因工程方法得到的重组人血白蛋白。

6.根据权利要求1中一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其特征在于制备方法为将紫杉醇溶解在5-20倍量的有机溶剂中，将紫杉醇有机溶剂溶液充分分散在蛋白质溶液中，加入处方量的表面活性剂，调节PH为3.0-6.0，在200-800bar高压均化法，分别通过0.45um、0.22um的滤膜挤压过滤，除去有机溶剂，低温冷冻干燥即得。

7.根据权利要求1中一种包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒，其特征在于制备方法为将紫杉醇溶解在8-15倍量的有机溶剂中，充分分散在蛋白质溶液中，加入处方量的表面活性剂，调节PH为3.0-6.0，在200-600bar高压均化法，分别通过0.45um、0.22um的滤膜挤压过滤，除去有机溶剂，低温冷冻干燥即得。

8.根据权利要求1或4所述的包裹紫杉醇的固体蛋白纳米粒制剂，其特征在于还含有生物相容性酸及盐，所述生物相容性酸指盐酸、磷酸或其金属钠盐、柠檬酸或其金属钠盐、草酸或其金属纳盐、冰醋酸或其碱金属盐、氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钠中的一种或几种。