CN103875732A - 一种川贝母开放式组织培养用抑菌剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了川贝母开放式组织培养用抑菌剂及其使用方法，该抑菌剂包括抑菌剂I和抑菌剂II，具有广谱性杀菌能力且能保护植物正常生长，使川贝母种苗的规模化生产成为了可能；利用上述抑菌剂进行川贝母开放式组织培养的方法规避了在传统接种操作中因人为失误和环境而造成的污染问题，大大降低了污染率，使川贝母的培养成功率达到93％，并且组培成本节省60％左右，成本得到大大降低。

Description

一种川贝母开放式组织培养用抑菌剂及其使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种川贝母开放式组织培养用抑菌剂及利用该抑菌剂进行开放式组织培养的方法。

背景技术

川贝母为百合科，主要分布于我国青藏高原东南缘、四川西部、云南迪庆州、丽江地区、甘肃陇南地区、西藏东北部及南部和青海局部。川贝母是治疗外感风热咳嗽、肺虚久咳、痰少咽燥等症的良药；四川是川贝母的地道产区，优质川贝母主要分布在甘孜藏族自治州和阿坝藏族自治州，海拔3500-4500m高山高原地带，该区气候寒冷，以藏族等少数民族为主。

目前，川贝母商品主要来源于野生资源，由于其疗效卓著，药用需求量大，野生资源日渐枯竭，价格逐年上升；但是，人工栽培川贝母周期较长，技术难度大，尚未进入商品生产阶段，其中困难之一就是规模化培育种苗难度较大。在高原进行种子直播，当年出苗率低、秋季保存率更低，不到20％。因此，如何规模化提供川贝母商品生产的优质种苗已成为制约川贝母产业发展的首要瓶颈。

现有关川贝母的发明专利(申请)主要包括：川贝母种子的处理方法、以川贝母植株叶为外植体的鳞茎快速增殖方法、川贝母的种植方法、川贝母高原保护地育苗方法和川贝母的育秧盘或育秧袋式有性繁殖栽培方法等，以上技术方法分别涉及到川贝母的栽培与繁育的方法，从繁殖方式、种子处理、育苗选地、育苗环境调控、育苗方式上等多方面进行了研究与改进，在一定程度上提升了川贝母的生产水平，但是从川贝母的生产实践及目前的市场需求量上来考虑，就现有的技术还未达到理想效果；在生物技术突飞猛进发展的今天，在植物培育领域，植物组织培养技术已成为主要的技术方法，有资料也表明植物组织培养技术也已成功运用在川贝母的种苗培育中，给规模化培育川贝种苗提供了可行性。

植物组织培养始于20世纪初，是以德国植物学家G.Haberlandt的植物细胞具有全能性的理论发展起来的一项新技术。作为一种十分有效的植物快繁方式，植物组织培养具有普通繁殖方法无法比拟的技术和产量优势，在当前倡导高效现代化农业发展模式的形势下，通过植物组织培养技术生产高质量的种苗具有十分广阔的市场前景；但一直以来，植物组培产业流传着一句话就是：组培组培越组越赔，这其中的原因除了发展思路和经营不善之外，还有一个重要原因就是组培成本太高，无法满足市场对高质量组培苗低价位成本的需求。因此，如何降低组培成本是决定组培效益的关键所在，也是组培技术得以健康发展的首要条件。

植物开放式组织培养，简称开放组培，是在抗菌剂的作用下，使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，不需高压灭菌和超净工作台，在自然、开放的有菌环境中进行植物的组织培养，从根本上简化组培环节，降低组培成本；

传统组培过程中的污染，主要表现为培养基的污染。因此，只要将培养基改造成既可保证植物组织正常生长，又具有抗菌、杀菌功能的培养基，细菌和真菌等菌类一旦失去滋生场所，进行开放式组织培养是完全可能的，而改造培养基的关键是要找到一种或几种能够添加到培养基的广谱性抗菌剂，广谱抗菌剂的筛选一直是困扰植物组培专家的难题，常用抗生素、抗菌素、防腐剂在植物组培污染的防治方面有一定的作用，但是针对不同的植物品种要想找到一种合适的处理组合是比较困难的，往往是当培养基抗菌，而植物组织的生长却受到抑制；植物组织能正常生长，却无法获得满意的抗菌效果。

发明内容

本发明针对于现有技术中川贝母组织培养的高成本和低成活率的上述不足，提供了一种川贝母开放式组织培养用抑菌剂，该抑菌剂具有广谱性杀菌能力且能保护植物正常生长，使川贝母种苗的规模化生产成为了可能。

本发明的另一目的是利用上述抑菌剂进行川贝母开放式组织培养的方法，该方法大大提高了川贝母种苗成活率，降低成本。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

提供一种川贝母开放式组织培养用抑菌剂，包括抑菌剂I和抑菌剂II；

所述抑菌剂I由下述重量份的组分组成：丝瓜水50-70份、金银花提取液10-15份、艾叶提取液10-20份、黄柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10-15份、黄连提取液5-10份、蒲公英提取液10-15份、茵陈提取液10-15份、大青叶提取液10-15份、阿莫西林舒巴坦100-200份、PVP70-200份、二氧化氯0.7-7份以及维生素C35-50份；

所述抑菌剂II由下述重量份的组分组成：丝瓜水50-70份、金银花提取液10-15份、艾叶提取液10-20份、黄柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10-15份、黄连提取液5-10份、蒲公英提取液10-15份、茵陈提取液10-15份、大青叶提取液10-15份、阿莫西林舒巴坦150-300份、PVP-I150-500份以及二氧化氯7-70份。

优选地，所述抑菌剂I由下述重量份的组分组成：丝瓜水60份、金银花提取液13份、艾叶提取液15份、黄柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黄连提取液8份、蒲公英提取液13份、茵陈提取液13份、大青叶提取液12份、阿莫西林舒巴坦130份、PVP150份、二氧化氯4份以及维生素C40份；

所述抑菌剂II由下述重量份的组分组成：丝瓜水60份、金银花提取液13份、艾叶提取液15份、黄柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黄连提取液8份、蒲公英提取液13份、茵陈提取液13份、大青叶提取液12份、阿莫西林舒巴坦200份、PVP-I210份以及二氧化氯20份。

其中，所述金银花提取液、艾叶提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陈提取液和大青叶提取液由下述方法制备：分别取金银花、艾叶、紫草、蒲公英、茵陈和大青叶，放入纯水中在100℃下煮3-4次，每次煮到液体浓缩至1/4为止，过滤，取滤液，分别装入容器中备用；其中，每次的加水量为上次熬煮后液量的4-5倍；

所述丝瓜水、黄柏提取液、花椒提取液、黄连提取液由下述方法制备：取丝瓜、黄柏、花椒、黄连放入干燥箱中在160℃下烘烤至颜色变为深褐色，取出，各自研磨成粉；再将粉末置于体积分数为60％的乙醇溶液中浸泡10-20天，过滤，取滤液，分别装入容器中备用。

利用上述抑菌剂进行开放式组织培养川贝母的方法，包括以下步骤：

1)外植体消毒灭菌：选取川贝母的鳞茎、种子或叶片作为外植体，将外植体用水冲洗20分钟，放入体积分数为20％的抑菌剂II中浸泡10-15min，再用无菌水冲洗2-3次，滤干水分，用经抑菌剂II浸泡过的解剖刀对表面灭菌后的外植体进行切割，待接种；

2)接种操作：接种室内用臭氧发生机或紫外线进行空气灭菌，接种的器具用体积比75％的酒精消毒后，浸泡于体积分数为50-80％的抑菌剂II中灭菌1-2h；

3)组织培养：将步骤1)制得的外植体接种到诱导培养基上，培养20-30天后，转接到增殖继代培养基上进行培养；经过增殖继代培养后，再将其转接到生根培养基中进行生根培养；

其中，所述诱导培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.0-2.0mg·L^-1+NAA0.5-1.0mg·L^-1+GA0.5-1.5mg·L^-1+抑菌剂I15-25ml·L^-1；

所述增殖继代培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.5-2.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I10-15ml·L^-1；

所述生根培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+1/2MS+NAA0.5-1.0mg·L^-1+抑菌剂I10-15ml·L^-1；

4)移栽：将进行生根培养后的川贝母组培苗进行炼苗后移栽。

步骤2)中，所述抑菌剂II的体积分数为60％。

其中，所述诱导培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+GA1.5mg·L^-1+抑菌剂I15ml·L^-1；

所述增殖继代培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I10ml·L^-1；

所述生根培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+1/2MS+NAA0.8mg·L^-1+抑菌剂I13ml·L^-1。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1)本发明的抑菌剂是采用特定浓度的具有杀菌、抗菌性的天然植物配制而成，具有广谱性杀菌能力且能较好保护植物正常生长，并且在该抑菌剂的作用下，可以使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，不需高压灭菌和超净工作台，在自然、开放的有菌环境中进行植物的组织培养，从根本上简化组培环节，降低成本。

2)本发明利用抑菌剂进行开放式组织培养的方法解决了川贝母只能通过各种严格灭菌步骤才能完成的传统组织培养的问题，且规避了在传统接种操作中因人为失误和环境而造成的污染问题，大大降低了污染率，使川贝母的培养成功率达到93％，材料的分化也未受到任何影响；由于不需高压灭菌，培养基中的激素和营养元素损失较少，再加上培养容器透光性能较好，组培苗生长健壮，分化率得到提高。

3)本发明使用抑菌剂进行川贝母的开放式组织培养方法，组培成本节省60％左右，且由于抑菌剂的中药材料资源丰富，生产工艺简单，使川贝母种苗较低成本地规模化生产成为了可能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。

在开放式组培中，抑菌液的配制是制约成败的关键，一是因为还没有一种抗生素对所有的细菌都有效并且药效期短；二是有些抗菌素、防腐剂在有效浓度下，其杀菌、抗菌离子对植物组织直接产生伤害，有些则产生盐害；针对抗菌药剂筛选中的问题，只有选择与植物组织亲和、友好、药效期长(至少一个生长周期)、不产生盐害并具有杀菌、抗菌活性的物质才是可用有效的。为此，本发明针对川贝母的生长，特意利用具有杀菌、抗菌性的天然植物进行配制实验，并成功研制出了具有广谱性杀菌能力且能较好保护植物材料正常生长的抑菌剂成功解决了以上问题，并对其有效浓度和使用方法作了大量探索性试验。

抑菌剂的配制按照广普抗菌和对植物活体材料伤害程度最低的原则进行调配，既在使培养川贝母的环境不受杂菌污染侵害的同时，也使所接种的外植体不受到药害，影响到分化生长；此抑菌剂适用于川贝母鳞茎、叶片及种子的无菌播种。

实施例1

抑菌剂的配制：

抑菌剂I的组成成分及含量为：总体积为1000ml的抑菌剂I中含有：丝瓜水50mg、金银花提取液10mg、艾叶提取液10mg、黄柏提取液10mg、花椒提取液15mg、紫草提取液15mg、黄连提取液10mg、蒲公英提取液10mg、茵陈提取液15mg、大青叶提取液15mg、阿莫西林舒巴坦100mg、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)70mg、二氧化氯0.7mg以及维生素C35mg；

抑菌剂II的组成成分及含量为：总体积为1000ml的抑菌剂II中含有：丝瓜水50mg、金银花提取液10mg、艾叶提取液10mg、黄柏提取液15mg、花椒提取液15mg、紫草提取液10mg、黄连提取液5mg、蒲公英提取液10mg、茵陈提取液15mg、大青叶提取液15mg、阿莫西林舒巴坦150mg、PVP-I(聚维酮碘制剂)500mg以及二氧化氯70mg。

按照上述抑菌剂I和抑菌剂II的配方成分，称取相应量，分别倒入纯净水中，在常温下进行搅拌溶解；抑菌剂I在定容后将其pH调整到5.8-6之间；抑菌剂I和抑菌剂II配制好后，放入4℃低温中保存待用。

其中，金银花提取液、艾叶提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陈提取液和大青叶提取液由下述方法制备：分别取金银花、艾叶、紫草、蒲公英、茵陈和大青叶，各自放入纯水中反复熬煮3次，每次加入的纯水量按前一次熬煮后溶液的量的4倍进行掺兑；其中，熬煮温度为100℃，每次熬到液体浓缩到1/4即可，再经压力过滤，取滤液，分别装入容器中储存备用。

丝瓜水、黄柏提取液、花椒提取液、黄连提取液由下述方法制备：取丝瓜、黄柏、花椒、黄连放入干燥箱中在160℃下进行烘烤，等材料颜色接近于深褐色时取出，并分别研磨成粉末状；将磨好的粉末浸入体积分数为60％的乙醇溶液中，搅拌，浸泡10天后，经压力过滤，取滤液，分别装入容器中储存备用。

利用上述抑菌剂I和抑菌剂II进行川贝母的开放式组织培养：

(1)外植体消毒灭菌：选取川贝母的鳞茎、种子或叶片作为外植体，将外植体用水冲洗20分钟，放入体积分数为20％的抑菌剂II中浸泡10min，再用无菌水冲洗2次，滤干水分，用经抑菌剂II浸泡过的解剖刀对表面灭菌后的外植体进行切割，待接种；

(2)培养基制作：根据MS基本培养基成分及用量称取药品，使其充分溶解，并按相应浓度分别依次取用；先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液及有机成分。然后分别按诱导培养基、增殖继代培养基及生根培养基来加入激素及抑菌剂I，其分别添加为：

诱导培养基：

蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1+GA1.5mg·L^-1+抑菌剂I25ml·L^-1；

增殖继代培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.5mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I15ml·L^-1；

生根培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+1/2MS+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I10ml·L^-1；

溶化琼脂：称取琼脂和蔗糖，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全熔化后，把蔗糖及调配好的激素和抑菌剂加入，用pH试纸测pH值，并用0.1mol/L的氢氧化钠或盐酸调pH至5.8，最后加水定容至所需体积。

分装：将配好的培养基分装于培养瓶中，然后用封口膜或瓶盖封口，待用。

(3)接种操作：接种室内用臭氧发生机进行空气灭菌，接种的器具如剪子、镊子、刀片和接种盘等用体积比75％的酒精消毒后，浸泡于体积分数为50％的抑菌剂II中灭菌1h；

(4)组织培养：在接种台上将灭菌后的外植体接种到诱导培养基上，培养20天后，材料开始分化增殖，再转接到增殖继代培养基上进行培养；经过增殖继代培养后，再将其转接到生根培养基中进行生根培养；

(5)移栽：将进行生根培养后的川贝母组培苗进行炼苗后移栽。

实施例2

抑菌剂的配制：

抑菌剂I的组成成分及含量为：总体积为1000ml的抑菌剂I中含有：丝瓜水60mg、金银花提取液13mg、艾叶提取液15mg、黄柏提取液12mg、花椒提取液10mg、紫草提取液12mg、黄连提取液8mg、蒲公英提取液13mg、茵陈提取液13mg、大青叶提取液12mg、阿莫西林舒巴坦130mg、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)150mg、二氧化氯4mg以及维生素C40mg；

抑菌剂II的组成成分及含量为：总体积为1000ml的抑菌剂II中含有：丝瓜水60mg、金银花提取液13mg、艾叶提取液15mg、黄柏提取液12mg、花椒提取液10mg、紫草提取液12mg、黄连提取液8mg、蒲公英提取液13mg、茵陈提取液13mg、大青叶提取液12mg、阿莫西林舒巴坦200mg、PVP-I(聚维酮碘制剂)210mg以及二氧化氯20mg。

按照上述抑菌剂I和抑菌剂II的配方成分，称取相应量，分别倒入纯净水中，在常温下进行搅拌溶解；抑菌剂I在定容后将其pH调整到5.8-6之间；抑菌剂I和抑菌剂II配制好后，放入4℃低温中保存待用。

其中，金银花提取液、艾叶提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陈提取液和大青叶提取液由下述方法制备：分别取金银花、艾叶、紫草、蒲公英、茵陈和大青叶，各自放入纯水中反复熬煮4次，每次加入的纯水量按前一次熬煮后溶液量的5倍进行掺兑；其中，熬煮温度为100℃，每次熬到液体浓缩到1/4即可，再经压力过滤，取滤液，分别装入容器中储存备用。

丝瓜水、黄柏提取液、花椒提取液、黄连提取液由下述方法制备：取丝瓜、黄柏、花椒、黄连放入干燥箱中在160℃下进行烘烤，等材料颜色接近于深褐色时取出，并分别研磨成粉末状；将磨好的粉末浸入体积分数为60％的乙醇溶液中，搅拌，浸泡20天后，经压力过滤，取滤液，分别装入容器中储存备用。

利用上述抑菌剂I和抑菌剂II进行川贝母的开放式组织培养：

(1)外植体消毒灭菌：选取川贝母的鳞茎、种子或叶片作为外植体，将外植体用水冲洗20分钟，放入体积分数为20％的抑菌剂II中浸泡15min，再用无菌水冲洗3次，滤干水分，用经抑菌剂II浸泡过的解剖刀对表面灭菌后的外植体进行切割，待接种；

(2)培养基制作：根据MS基本培养基成分及用量称取药品，使其充分溶解，并按相应浓度分别依次取用；先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液及有机成分。然后分别按诱导培养基、增殖继代培养基及生根培养基来加入激素及抑菌剂I，其分别添加为：

诱导培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+GA1.5mg·L^-1+抑菌剂I15ml·L^-1；

增殖继代培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I10ml·L^-1；

生根培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+1/2MS+NAA0.8mg·L^-1+抑菌剂I13ml·L^-1。

溶化琼脂：称取琼脂和蔗糖，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全熔化后，把蔗糖及调配好的激素和抑菌剂加入，用pH试纸测pH值，并用0.1mol/L的氢氧化钠或盐酸调pH至5.8，最后加水定容至所需体积。

分装：将配好的培养基分装于培养瓶中，然后用封口膜或瓶盖封口，待用。

(3)接种操作：接种室内用紫外线进行空气灭菌，接种的器具如剪子、镊子、刀片和接种盘等用体积比75％的酒精消毒后，浸泡于体积分数为60％的抑菌剂II中灭菌1h；

(4)组织培养：在接种台上将灭菌后的外植体接种到诱导培养基上，培养30天后，材料开始分化增殖，再转接到增殖继代培养基上进行培养；经过增殖继代培养后，再将其转接到生根培养基中进行生根培养；

(5)移栽：将进行生根培养后的川贝母组培苗进行炼苗后移栽。

实施例3：

抑菌剂的配制：

抑菌剂I的组成成分及含量为：总体积为1000ml的抑菌剂I中含有：丝瓜水70mg、金银花提取液15mg、艾叶提取液20mg、黄柏提取液15mg、花椒提取液5mg、紫草提取液10mg、黄连提取液5mg、蒲公英提取液15mg、茵陈提取液10mg、大青叶提取液12mg、阿莫西林舒巴坦200mg、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)200mg、二氧化氯7mg以及维生素C50mg；

抑菌剂II的组成成分及含量为：总体积为1000ml的抑菌剂II中含有：丝瓜水70mg、金银花提取液15mg、艾叶提取液20mg、黄柏提取液10mg、花椒提取液5mg、紫草提取液15mg、黄连提取液10mg、蒲公英提取液15mg、茵陈提取液10mg、大青叶提取液10mg、阿莫西林舒巴坦300mg、PVP-I(聚维酮碘制剂)150mg以及二氧化氯7mg。

按照上述抑菌剂I和抑菌剂II的配方成分，称取相应量，分别倒入纯净水中，在常温下进行搅拌溶解；抑菌剂I在定容后将其pH调整到5.8-6之间；抑菌剂I和抑菌剂II配制好后，放入4℃低温中保存待用。

其中，金银花提取液、艾叶提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陈提取液和大青叶提取液由下述方法制备：分别取金银花、艾叶、紫草、蒲公英、茵陈和大青叶，各自放入纯水中反复熬煮4次，每次加入的纯水量按前一次熬煮后溶液量的5倍进行掺兑；其中，熬煮温度为100C，每次熬到液体浓缩到1/4即可，再经压力过滤，取滤液，分别装入容器中储存备用。

丝瓜水、黄柏提取液、花椒提取液、黄连提取液由下述方法制备：取丝瓜、黄柏、花椒、黄连放入干燥箱中在160℃下进行烘烤，等材料颜色接近于深褐色时取出，并分别研磨成粉末状；将磨好的粉末浸入体积分数为60％的乙醇溶液中，搅拌，浸泡15天后，经压力过滤，取滤液，分别装入容器中储存备用。

利用上述抑菌剂I和抑菌剂II进行川贝母的开放式组织培养：

(1)外植体消毒灭菌：选取川贝母的鳞茎、种子或叶片作为外植体，将外植体用水冲洗20分钟，放入体积分数为20％的抑菌剂II中浸泡13min，再用无菌水冲洗3次，滤干水分，用经抑菌剂II浸泡过的解剖刀对表面灭菌后的外植体进行切割，待接种；

(2)培养基制作：根据MS基本培养基成分及用量称取药品，使其充分溶解，并按相应浓度分别依次取用；先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液及有机成分。然后分别按诱导培养基、增殖继代培养基及生根培养基来加入激素及抑菌剂I，其分别添加为：

诱导培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.5mg·L^-1+NAA0.8mg·L^-1+GA0.5mg·L^-1+抑菌剂I10ml·L^-1；

增殖继代培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.8mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I12ml·L^-1；

生根培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+1/2MS+NAA1.0mg·L^-1+抑菌剂I15ml·L^-1。

溶化琼脂：称取琼脂和蔗糖，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全熔化后，把蔗糖及调配好的激素和抑菌剂加入，用pH试纸测pH值，并用0.1mol/L的氢氧化钠或盐酸调pH至5.8，最后加水定容至所需体积。

分装：将配好的培养基分装于培养瓶中，然后用封口膜或瓶盖封口，待用。

(3)接种操作：接种室内用臭氧发生机进行空气灭菌，接种的器具如剪子、镊子、刀片和接种盘等用体积比75％的酒精消毒后，浸泡于体积分数为80％的抑菌剂II中灭菌1.5h；

(4)组织培养：在接种台上将灭菌后的外植体接种到诱导培养基上，培养30天后，材料开始分化增殖，再转接到增殖继代培养基上进行培养；经过增殖继代培养后，再将其转接到生根培养基中进行生根培养；

(5)移栽：将进行生根培养后的川贝母组培苗进行炼苗后移栽。

虽然结合具体实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但并非是对本专利保护范围的限定。在权利要求书所限定的范围内，本领域的技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改或调整仍受本专利的保护。

Claims (6)

1.一种川贝母开放式组织培养用抑菌剂，其特征是：包括抑菌剂I和抑菌剂II；

所述抑菌剂I由下述重量份的组分组成：丝瓜水50-70份、金银花提取液10-15份、艾叶提取液10-20份、黄柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10-15份、黄连提取液5-10份、蒲公英提取液10-15份、茵陈提取液10-15份、大青叶提取液10-15份、阿莫西林舒巴坦100-200份、PVP70-200份、二氧化氯0.7-7份以及维生素C35-50份；

所述抑菌剂II由下述重量份的组分组成：丝瓜水50-70份、金银花提取液10-15份、艾叶提取液10-20份、黄柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10-15份、黄连提取液5-10份、蒲公英提取液10-15份、茵陈提取液10-15份、大青叶提取液10-15份、阿莫西林舒巴坦150-300份、PVP-I150-500份以及二氧化氯7-70份。

2.根据权利要求1所述的抑菌剂，其特征是：

所述抑菌剂I由下述重量份的组分组成：丝瓜水60份、金银花提取液13份、艾叶提取液15份、黄柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黄连提取液8份、蒲公英提取液13份、茵陈提取液13份、大青叶提取液12份、阿莫西林舒巴坦130份、PVP150份、二氧化氯4份以及维生素C40份；

所述抑菌剂II由下述重量份的组分组成：丝瓜水60份、金银花提取液13份、艾叶提取液15份、黄柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黄连提取液8份、蒲公英提取液13份、茵陈提取液13份、大青叶提取液12份、阿莫西林舒巴坦200份、PVP-I210份以及二氧化氯20份。

3.根据权利要求1或2所述的抑菌剂的制备方法，其特征是：所述金银花提取液、艾叶提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陈提取液和大青叶提取液由下述方法制备：

分别取金银花、艾叶、紫草、蒲公英、茵陈和大青叶，放入纯水中在100℃下煮3-4次，每次煮到液体浓缩至1/4为止，过滤，取滤液，分别装入容器中备用；其中，每次加水量为上次浓缩后溶液量的4-5倍；

所述丝瓜水、黄柏提取液、花椒提取液、黄连提取液由下述方法制备：取丝瓜、黄柏、花椒、黄连放入干燥箱中在160℃下烘烤至颜色变为深褐色，取出，各自研磨成粉；再将粉末置于体积分数为60％的乙醇溶液中浸泡10-20天，过滤，取滤液，分别装入容器中备用。

4.一种利用权利要求1或2所述的抑菌剂开放式培养川贝母的方法，包括：

1)外植体消毒灭菌：选取川贝母的鳞茎、种子或叶片作为外植体，将外植体用水冲洗20分钟，放入体积分数为20％的抑菌剂II中浸泡10-15min，再用无菌水冲洗2-3次，滤干水分，用经抑菌剂II浸泡过的解剖刀对表面灭菌后的外植体进行切割，待接种；

2)接种操作：接种室内用臭氧发生机或紫外线进行空气灭菌，接种的器具用体积比75％的酒精消毒后，浸泡于体积分数为50-80％的抑菌剂II中灭菌1-2h；

3)组织培养：将步骤1)制得的外植体接种到诱导培养基上，培养20-30天后，转接到增殖继代培养基上进行培养；经过增殖继代培养后，再将其转接到生根培养基中进行生根培养；

其中，所述诱导培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.0-2.0mg·L^-1+NAA0.5-1.0mg·L^-1+GA0.5-1.5mg·L^-1+抑菌剂I15-25ml·L^-1；

所述增殖继代培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.5-2.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I10-15ml·L^-1；

所述生根培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+1/2MS+NAA0.5-1.0mg·L^-1+抑菌剂I10-15ml·L^-1；

4)移栽：将进行生根培养后的川贝母组培苗进行炼苗后移栽。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：步骤2)中，所述抑菌剂II的体积分数为60％。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是：

所述诱导培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+GA1.5mg·L^-1+抑菌剂I15ml·L^-1；

所述增殖继代培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+抑菌剂I10ml·L^-1；

所述生根培养基为：蔗糖30g·L^-1+琼脂4g·L^-1+1/2MS+NAA0.8mg·L^-1+抑菌剂I13ml·L^-1。