CN103804193B - 从杜仲皮中提取绿原酸和松脂素的方法 - Google Patents

从杜仲皮中提取绿原酸和松脂素的方法 Download PDF

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Abstract

针对松脂素提取过程中易分解现象，严重影响了松脂素的规模化生产，本发明采用乙醇提取、升膜浓缩、柱层析和色谱分离法逐步对松脂素和绿原酸进行分离纯化，达到规模化生产松脂素和绿原酸的要求，有效提高杜仲叶中松脂素收率，同时纯化出高含量绿原酸。

Description

从杜仲皮中提取绿原酸和松脂素的方法
技术领域
本发明属于天然产物加工领域，涉及了一种提取绿原酸和松脂素的方法，更具体地说是涉及了一种从杜仲皮中提取绿原酸和松脂醇二葡萄糖甙的方法。
背景技术
杜仲是一种具有多种药用功能的木本落叶植物，具有极高的药用价值，入药已有二千多年历史，《申农本草经》将其列入“上品”，名为“思仙”。杜仲的化学成分主要是木脂素类、环烯醚菇甙类、酚类、挥发油、多糖、氨基酸、有机酸、幽醇、磷脂、黄酮、维生素、微量元素以及杜仲胶等。其中，木脂素类有松脂醇二葡萄糖甙、丁香脂醇二葡萄糖甙、橄榄脂素和杜仲素A、B等。松脂醇二葡萄糖甙和丁香脂醇二葡萄糖甙，对动物血压具有双向调节功能，丁香脂醇二葡萄糖甙还具有增强记忆能力、增强动物耐久力、安定镇静、抗氧化、降低胆固醇及中性脂肪等功效：环烯醚菇甙类的都楠子酸具有促进胆汁分泌以及暂时性的降压作用：松脂素具有较强的抗菌作用和明显的利尿作用：车叶草甙和紫丁香甙为血管紧张素和环腺昔酸(cAMP)的抑制剂；绿原酸具有强烈的抗菌作用和肾上腺素的类似作用；杜仲各部分均含有丰富的维生素。和β一胡萝卜素，有延缓衰老、增强机体免疫力的作用：杜仲多糖A和B具有与酵母多糖相同的对网状内皮系统的激活活性；杜仲皮叶中检出17种游离氨基酸，还分离出具有明显促进DNA、蛋白质合成和降压作用的三个结晶，即丁香脂素醇双糖甙、京尼平甙酸和松脂醇二葡萄糖甙。
公开号为CN103102252A的中国专利公开了一种从大青叶中分离纯化(+)-异落叶松树脂醇和(-)-落叶松脂素的方法，其步骤如下：A.匀浆破碎酶解：新鲜或干燥大青叶按质量体积比加入4~10倍原料质量的水进行匀浆破碎3~10min，用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调节浆液pH为4.0~5.5，加入纤维素酶、果胶酶或两者组成的复合酶使酶浓度为350~750U/mL，然后在35~55°C条件下酶解1~5h，过滤，收集滤液、滤渣；B.负压空化强化提取：上述滤渣按质量体积比加入8~25倍滤渣质量的甲醇、乙醇或醇水混合溶液进行负压空化强化提取，提取温度为室温至50°C，提取压力为-0.05~-0.09MPa，提取2~4次，每次20min~60min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压回收除去溶剂，得到大青叶浸膏；C.树脂富集：上述大青叶浸膏按质量体积比分散于10~30倍浸膏质量的20%乙醇中后，上样进入大孔吸附树脂柱（AB-8、X-5、H1020、D101、HPD826、HPD600、ADS-5、NKA-9），上样体积为3~15倍柱体积，然后先用30%~35%乙醇充分洗脱，弃去洗脱液，再用50%~60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集物；D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析，其中，层析柱填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/12~1/6；梯度洗脱依次选用的洗脱剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(+)-异落叶松树脂醇和(-)-落叶松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(+)-异落叶松树脂醇和(-)-落叶松脂素粗品；E.结晶：(+)-异落叶松树脂醇和(-)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度均大于95%的(+)-异落叶松树脂醇和(-)-落叶松脂素。此法采用酶解对松脂素等易降解的物质影响很大，同时采用减压回收除去溶剂也会对目标物有一定的影响。
京尼平甙酸、绿原酸和松脂醇二葡萄糖甙在高温条件下易氧化分解，由于绿原酸在杜仲皮中含量较高，采用常规方法还能得到部分绿原酸，但是松脂醇二葡萄糖甙和京尼平甙酸等含量较少的物质很难通过常规方法得到。
发明内容
本发明的目的在于针对松脂素提取过程中易分解现象，严重影响了松脂素的规模化生产，公开一种利用杜仲皮中规模化生产松脂素和绿原酸，有效提高杜仲叶中松脂素收率，同时纯化出高含量绿原酸。
因此，本发明提供从杜仲皮中提取绿原酸和松脂素的方法，其具体步骤如下：
(1)采用炮制后的杜仲皮进行粉碎至10目以下，加入55%甲醇水溶液在45-55℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，滤渣再重复提取一次，合并两次滤液得滤液Ⅰ；
(2)滤渣再加入20%乙醇水溶液进行混合提取45-55℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液Ⅱ；
(3)将滤液Ⅰ、Ⅱ分别在50℃进行在升膜浓缩器中55℃浓缩至原有体积的1/5-1/10；
(4)滤液Ⅰ经浓缩后上DM301大孔树脂吸附，30%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ，70%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅱ；
(5)滤液Ⅱ经浓缩后上D101大孔树脂吸附，50%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅲ；
(6)将洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅲ合并，再经50℃减压浓缩至原有体积的1/3-1/8，室温过夜结晶重结晶得到绿原酸纯品；
(7)将洗脱液Ⅱ在升膜浓缩器中55℃浓缩至原有体积的1/15-1/20，再上反相液相色谱柱C18制备柱，60%乙醇进行洗脱，得到洗脱液在40℃下真空浓缩，75%乙醇低温条件下结晶重结晶获得松脂素纯品。
在一个实施方案中，步骤(1)中所述加入60%乙醇水溶液的量，按体积(L)/ 杜仲皮重量(kg)比为4-6:1；60%乙醇水溶液中含有抗坏血酸，其浓度为10-100mmol/L。
在一个实施方案中，步骤(2)中所述加入20%乙醇水溶液的量，按体积(L)/ 杜仲皮重量(kg)比为2-4:1；20%乙醇水溶液中含有盐酸，其浓度为0.001-0.01mol/L。
在一个实施方案中，步骤(7)中所述低温条件是指-5--9℃。
技术效果
1、本发明方法中所用的原料、设备均为常见的普通原料、设备，避免了工业化生产过程中对于昂贵原材料、仪器的依赖，大大地降低了生产成本。
2、本方法能大大提高了杜仲皮的利用效率，提高杜仲皮的附加值，完全缓解了市场对杜仲皮的大量需求。
3、本发明方法操作简单，仅使用萃取、树脂层析过滤、结晶再结晶技术，也不需要精密仪器或自动化设备，可在杜仲资源丰富的乡镇企业进行生产，这极大地降低了松脂素的生产成本，简化了生产过程，确保规模化生产松脂素和绿原酸。
附图说明
图1：从杜仲叶中提取松脂素的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
图2：松脂素标准品的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施实例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限制本发明。
实施例1
采用炮制后的杜仲皮100kg进行粉碎至10目以下，加入250L的55%甲醇水溶液（其中抗坏血酸的浓度为50mmol/L）在50℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，滤渣再加入同样的提取液再重复提取一次，合并两次滤液得滤液Ⅰ420L；滤渣再加入200L的20%乙醇水溶液（其中盐酸浓度为0.01mol/L）进行混合提取50℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液Ⅱ160L；将滤液Ⅰ、Ⅱ分别在50℃进行在升膜浓缩器(杭州惠合机械设备有限公司)中55℃至50L、20L；滤液Ⅰ经浓缩后上DM301大孔树脂吸附，30%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ200L，70%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅱ150L；滤液Ⅱ经浓缩后上D101大孔树脂吸附，50%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅲ130L；将洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅲ合并，再经50℃减压浓缩至原有体积的60L，室温过夜结晶重结晶得到绿原酸纯品2.45kg；将洗脱液Ⅱ在升膜浓缩器中55℃浓缩至8L，再上反相液相色谱柱C18制备柱，60%乙醇进行洗脱，得到洗脱液在40℃下真空浓缩，75%乙醇低温条件下结晶重结晶获得松脂素纯品315g。检测设备为Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱为Hypersil ODS (150mm×4.6mm，5μ)，松脂素的检测条件∶流动相为25%甲醇水溶液(25∶75，V/V) 、 检测波长为228 nm、流速0.5 mL/ min 、柱温30 ℃、进样量为20μL，检测结晶样品的含量为98.82%的松脂素；绿原酸的检测条件∶流动相为水：甲醇： 磷酸=75：25：0.4 (V/V) 、 检测波长为328 nm、流速0.5 mL/ min 、柱温30 ℃、进样量为20μL，检测结晶样品的含量为98.56%的绿原酸。
实施例2
采用炮制后的杜仲皮200kg进行粉碎至10目以下，加入500L的55%甲醇水溶液（其中抗坏血酸的浓度为40mmol/L）在50℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，滤渣再加入同样的提取液再重复提取一次，合并两次滤液得滤液Ⅰ860L；滤渣再加入400L的20%乙醇水溶液（其中盐酸浓度为0.01mol/L）进行混合提取50℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液Ⅱ350L；将滤液Ⅰ、Ⅱ分别在50℃进行在升膜浓缩器(杭州惠合机械设备有限公司)中55℃至100L、45L；滤液Ⅰ经浓缩后上DM301大孔树脂吸附，30%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ350L，70%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅱ250L；滤液Ⅱ经浓缩后上D101大孔树脂吸附，50%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅲ250L；将洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅲ合并，再经50℃减压浓缩至原有体积的80L，室温过夜结晶重结晶得到绿原酸纯品5.04kg；将洗脱液Ⅱ在升膜浓缩器中55℃浓缩至15L，再上反相液相色谱柱C18制备柱，60%乙醇进行洗脱，得到洗脱液在40℃下真空浓缩，75%乙醇低温条件下结晶重结晶获得松脂素纯品856g。并按实例1进行检测，样品中松脂素的含量为99.04%，结晶样品的含量为98.34%的绿原酸。
实施例3
采用炮制后的杜仲皮400kg进行粉碎至10目以下，加入1000L的55%甲醇水溶液（其中抗坏血酸的浓度为60mmol/L）在50℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，滤渣再加入同样的提取液再重复提取一次，合并两次滤液得滤液Ⅰ1500L；滤渣再加入800L的20%乙醇水溶液（其中盐酸浓度为0.005mol/L）进行混合提取50℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液Ⅱ720L；将滤液Ⅰ、Ⅱ分别在50℃进行在升膜浓缩器(杭州惠合机械设备有限公司)中55℃至180L、80L；滤液Ⅰ经浓缩后上DM301大孔树脂吸附，30%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ700L，70%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅱ500L；滤液Ⅱ经浓缩后上D101大孔树脂吸附，50%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅲ500L；将洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅲ合并，再经50℃减压浓缩至原有体积的160L，室温过夜结晶重结晶得到绿原酸纯品10.24kg；将洗脱液Ⅱ在升膜浓缩器中55℃浓缩至35L，再上反相液相色谱柱C18制备柱，60%乙醇进行洗脱，得到洗脱液在40℃下真空浓缩，75%乙醇低温条件下结晶重结晶获得松脂素纯品1.75kg。并按实例1进行检测，样品中松脂素的含量为99.12%，结晶样品的含量为98.78%的绿原酸。

Claims (2)

1. 一种从杜仲皮中提取绿原酸和松脂素的方法，其具体步骤如下：
(1)采用炮制后的杜仲皮进行粉碎至10目以下，加入55%甲醇水溶液在45-55℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，滤渣再重复提取一次，合并两次滤液得滤液Ⅰ；其中加入55%甲醇水溶液的量/杜仲皮重量比为4L-6L:1kg，55%甲醇水溶液中含有抗坏血酸，其浓度为10-100mmol/L；
(2)滤渣再加入20%乙醇水溶液进行混合提取，45-55℃提取60min，陶瓷膜过滤一次，得滤液Ⅱ，其中加入20%乙醇水溶液的量/杜仲皮重量比为2L-4L:1kg，20%乙醇水溶液中含有盐酸，其浓度为0.001-0.01mol/L；
(3)将滤液Ⅰ、Ⅱ分别在50℃升膜浓缩器中进行浓缩至原有体积的1/5-1/10；
(4)滤液Ⅰ经浓缩后上DM301大孔树脂吸附，30%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅰ，70%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅱ；
(5)滤液Ⅱ经浓缩后上D101大孔树脂吸附，50%乙醇溶液进行洗脱得到洗脱液Ⅲ；
(6)将洗脱液Ⅰ和洗脱液Ⅲ合并，再经50℃减压浓缩至原有体积的1/3-1/8，室温过夜结晶重结晶得到绿原酸纯品；
(7)将洗脱液Ⅱ在升膜浓缩器中55℃浓缩至原有体积的1/15-1/20，再上反相液相色谱柱C18制备柱，60%乙醇进行洗脱，得到洗脱液在40℃下真空浓缩，75%乙醇低温条件下结晶重结晶获得松脂素纯品。
2.根据权利要求1的方法，步骤(7)中所述低温条件是指-5--9℃。
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