CN103718955B - 一种千日红再生植株的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种千日红再生植株的诱导方法，包括无菌实生苗培育、接种、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖、再生芽诱导、再生根诱导、炼苗、移植等步骤。以千日红无菌实生苗的下胚轴作为外植体，不但可以成功的诱导出愈伤组织，并且，愈伤组织可以分化成再生苗，并进一步分化可以形成根从而形成完整的植株；愈伤组织可以继续不断的增殖，不用再耗用千日红外植体即可继续源源不断的为千日红提供丰富的种质资源。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种千日红再生植株的诱导方法。
背景技术
千日红（Gomphrenaglobosa）别名火球花、红光球、千年红，原产美洲巴西，巴拿马和危地马拉，我国长江以南普遍种植。千日红为一年生直立草本，高约20～60厘米，全株有白色硬毛；花期7～10月，花朵紫红色，排成顶生圆球形头状花序；苞片多为紫红色。
千日红花序及全草皆可入药，具有清肝、散结、止咳和定喘之效。千日红多用种子繁殖，由于其种子体积太小，采收不易，即使采收到的种子再进行播种繁殖也很难保证其具有母株原有的优良性状。因此，利用组培技术对千日红进行快繁，不仅可在短期内大量繁殖，加速推广应用，还可对其进行种质保存，是行之有效的途径。
目前，千日红的组织培养技术并不成熟，可借鉴的技术还处于初级摸索阶段，虽然中国专利CN102630568A公开了一种千里红试管花及其培养方法中应用了组织培养技术，但是，其主要目的是解决千日红试管难以开花的技术问题，开花率达到86%。目前缺乏对千日红完整组织培养技术的研究，也没有一套完整的千日红组织培养体系。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种千日红再生植株的诱导方法，建立完整的组织培养体系，为千日红人工栽培提供充足的种质资源。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种千日红再生植株的诱导方法，包括如下步骤：
（1）无菌实生苗培育：千日红种子清洗干净后，于体积浓度为75%的酒精消毒30s，再用体积浓度为3%的次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗3～5次后，接种到无菌苗培养基上；所述无菌苗培养基以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA3mg；
（2）接种：将实生苗从培养基中取出，无菌水冲洗干净后，以无菌实生苗的下胚轴作为外植体，将下胚轴切成长度为0.2～0.5cm的切段，将切段接种于愈伤组织诱导培养基上；
（3）愈伤组织诱导：培养条件为全黑暗培养、温度20～22℃，培养4-6周至愈伤组织形成；
（4）愈伤组织增殖：将步骤3中获得愈伤组织转移到增殖培养基中培养，培养条件为光强1000～2000Lx、光照时间12h、温度20～22℃，每周将愈伤组织转移到新的培养基中，共转移四次；
（5）再生芽诱导：将步骤4中第四次转移培养一周后的愈伤组织作为诱导再生芽的种源，无菌条件下，将愈伤组织接种于再生芽诱导培养基中，于光强2000～3000Lx、光照时间12h、温度20～22℃下诱导芽的形成；
（6）再生根的诱导：将步骤5中获得的再生芽用无菌水冲洗干净后接种于再生根培养基中，于光强1000～2000Lx、光照时间16h、温度20～22℃下诱导根的形成；
（7）炼苗、移植：将步骤6中获得再生植株转移到蛭石中，于室内培养7～10d后转移到大田培养。
进一步的，所述的愈伤组织诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、2,4-D1～4mg、IAA0.5～1.5mg、ZT0.5～2mg、KT0.5～2mg。
进一步的，所述的愈伤组织增殖培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖40g、琼脂6g、IAA0.1～0.5mg、ZT0.1～0.5mg、KT0.1～0.5mg、抗坏血酸20～30mg。
进一步的，所述的再生芽诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA1～4mg、IAA0.5～1.5mg、6-BA0.5～2mg。
进一步的，所述的再生根诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂7g、IAA1～3mg、ZT0.3～0.8mg、KT0.3～0.8mg。
本发明的有益效果是：以千日红无菌实生苗的下胚轴作为外植体，不但可以成功的诱导出愈伤组织，并且，愈伤组织可以分化成再生苗，并进一步分化可以形成根从而形成完整的植株；愈伤组织可以继续不断的增殖，不用再耗用千日红外植体即可继续源源不断的为千日红提供丰富的种质资源。
具体实施方式
以下通过实施例进一步阐述本发明的有益效果：
实施例1：
一种千日红再生植株的诱导方法，包括如下步骤：
（1）无菌实生苗培育：千日红种子清洗干净后，于体积浓度为75%的酒精消毒30s，再用体积浓度为3%的次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗3～5次后，接种到无菌苗培养基上；所述无菌苗培养基以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA3mg；
（2）接种：将实生苗从培养基中取出，无菌水冲洗干净后，以无菌实生苗的下胚轴作为外植体，将下胚轴切成长度为0.2～0.5cm的切段，将切段接种于愈伤组织诱导培养基上；愈伤组织诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、2,4-D1mg、IAA1mg、ZT0.5mg、KT0.5mg；
（3）愈伤组织诱导：培养条件为全黑暗培养、温度20～22℃，培养4-6周至愈伤组织形成；
（4）愈伤组织增殖：将步骤3中获得愈伤组织转移到增殖培养基中培养，培养条件为光强1000～2000Lx、光照时间12h、温度20～22℃，每周将愈伤组织转移到新的培养基中，共转移四次；组织增殖培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖40g、琼脂6g、IAA0.3mg、ZT0.2mg、KT0.2mg、抗坏血酸20mg；
（5）再生芽诱导：将步骤4中第四次转移培养一周后的愈伤组织作为诱导再生芽的种源，无菌条件下，将愈伤组织接种于再生芽诱导培养基中，于光强2000～3000Lx、光照时间12h、温度20～22℃下诱导芽的形成；再生芽诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA1mg、IAA1mg、6-BA1mg；
（6）再生根的诱导：将步骤5中获得的再生芽用无菌水冲洗干净后接种于再生根培养基中，于光强1000～2000Lx、光照时间16h、温度20～22℃下诱导根的形成；再生根诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂7g、IAA2mg、ZT0.5mg、KT0.5mg；
（7）炼苗、移植：将步骤6中获得再生植株转移到蛭石中，于室内培养7～10d后转移到大田培养。
共接种100块胚轴切段，其中81块形成愈伤组织；共接种100瓶愈伤组织进行芽诱导，其中有54瓶有芽形成，共形成芽102个，这102个芽中有89个形成了根；89株再生植株转移到大田培养4周后，有75株成活。
实施例2：
实施方法与实施例1相同，所不同的是：
所述的愈伤组织诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、2,4-D1.5mg、IAA1.5mg、ZT0.5mg、KT1mg。
所述的愈伤组织增殖培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖40g、琼脂6g、IAA0.2mg、ZT0.3mg、KT0.3mg、抗坏血酸30mg。
所述的再生芽诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA2mg、IAA1mg、6-BA1.5mg。
所述的再生根诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂7g、IAA1.5mg、ZT0.5mg、KT0.5mg。
共接种100块胚轴切段，其中78块形成愈伤组织；共接种100瓶愈伤组织进行芽诱导，其中有50瓶有芽形成，共形成芽88个，这88个芽中有69个形成了根；69株再生植株转移到大田培养4周后，有60株成活。
实施例3：
实施方法与实施例1相同，所不同的是：
所述的愈伤组织诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、2,4-D2mg、IAA1.5mg、ZT0.5mg、KT1mg。
所述的愈伤组织增殖培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖40g、琼脂6g、IAA0.5mg、ZT0.2mg、KT0.2mg、抗坏血酸30mg。
所述的再生芽诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA2mg、IAA1mg、6-BA2mg。
所述的再生根诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂7g、IAA2mg、ZT0.8mg、KT0.8mg。
共接种100块胚轴切段，其中70块形成愈伤组织；共接种100瓶愈伤组织进行芽诱导，其中有65瓶有芽形成，共形成芽94个，这94个芽中有77个形成了根；77株再生植株转移到大田培养4周后，有70株成活。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种千日红再生植株的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)无菌实生苗培育：千日红种子清洗干净后，于体积浓度为75%的酒精消毒30s，再用体积浓度为3%的次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗3～5次后，接种到无菌苗培养基上；所述无菌苗培养基以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA3mg；
(2)接种：将实生苗从培养基中取出，无菌水冲洗干净后，以无菌实生苗的下胚轴作为外植体，将下胚轴切成长度为0.2~0.5cm的切段，将切段接种于愈伤组织诱导培养基上；
(3)愈伤组织诱导：培养条件为全黑暗培养、温度20~22℃，培养4-6周至愈伤组织形成；
(4)愈伤组织增殖：将步骤3中获得愈伤组织转移到增殖培养基中培养，培养条件为光强1000~2000Lx、光照时间12h、温度20~22℃，每周将愈伤组织转移到新的培养基中，共转移四次；
(5)再生芽诱导：将步骤4中第四次转移培养一周后的愈伤组织作为诱导再生芽的种源，无菌条件下，将愈伤组织接种于再生芽诱导培养基中，于光强2000~3000Lx、光照时间12h、温度20~22℃下诱导芽的形成；
(6)再生根的诱导：将步骤5中获得的再生芽用无菌水冲洗干净后接种于再生根培养基中，于光强1000~2000Lx、光照时间16h、温度20~22℃下诱导根的形成；
(7)炼苗、移植：将步骤6中获得再生植株转移到蛭石中，于室内培养7～10d后转移到大田培养；
上述愈伤组织培养基的配方以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、2,4-D1mg、IAA1mg、ZT0.5mg、KT0.5mg；
上述愈伤组织增殖培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖40g、琼脂6g、IAA0.3mg、ZT0.2mg、KT0.2mg、抗坏血酸20mg；
上述再生芽诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA1mg、IAA1mg、6-BA1mg；
上述再生根诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂7g、IAA2mg、ZT0.5mg、KT0.5mg。
2.根据权利要求1所述的千日红再生植株的诱导方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、2,4-D1.5mg、IAA1.5mg、ZT0.5mg、KT1mg；所述愈伤组织增殖培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖40g、琼脂6g、IAA0.2mg、ZT0.3mg、KT0.3mg、抗坏血酸30mg；所述再生芽诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA2mg、IAA1mg、6-BA1.5mg；所述再生根诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂7g、IAA1.5mg、ZT0.5mg、KT0.5mg。
3.根据权利要求1所述的千日红再生植株的诱导方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、2,4-D2mg、IAA1.5mg、ZT0.5mg、KT1mg；所述愈伤组织增殖培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖40g、琼脂6g、IAA0.5mg、ZT0.2mg、KT0.2mg、抗坏血酸30mg；所述再生芽诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂6g、NAA2mg、IAA1mg、6-BA2mg；所述的再生根诱导培养基的配方为，以MS培养基为基础培养基，1L培养基中添加蔗糖30g、琼脂7g、IAA2mg、ZT0.8mg、KT0.8mg。
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