CN103705569A - 一种鸡血藤的乙酸乙酯提取物及其制备、检测方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鸡血藤提取物及其制备方法和应用，具体涉一种鸡血藤的乙酸乙酯提取物及其制备方法和应用，通过石油醚过滤取渣、醇提取、浓缩提取液、乙酸乙酯萃取等步骤得到所述的提取物，本发明的提取物能够用于制备抑制EGFR活性药物，经过体外试验，发现本发明提供的鸡血藤的乙酸乙酯提取物抑制EGFR活性效果明显。

Description

一种鸡血藤的乙酸乙酯提取物及其制备、检测方法和用途

[技术领域]

本发明涉及鸡血藤提取物及其制备、检测方法和应用，具体涉一种鸡血藤的乙酸乙酯提取物及其制备、检测方法和应用。

[背景技术]

表皮生长因子受体(EGFR)是EGFR酪氨酸激酶家族的成员之一，它包含有一个细胞外配体结合区、单一的跨膜区和一个含酪氨酸激酶结构的胞内区。EGFR与配体结合导致重要的构象变化，暴露受体中的二聚环结构，引发自身磷酸化，转导下游信号，调节细胞的增殖、凋亡、迁移、存活和一系列复杂的过程。EGRF在肿瘤细胞中常处于过度激活状态，使细胞周期失去调控，导致肿瘤细胞无限制生长,如神经胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等。EGFR是目前抗肿瘤分子靶向治疗中，最成功也是最受关注的治疗靶点之一。FDA已批准两种靶向EGFR的小分子抑制剂，gefitinib(吉非替尼，易瑞沙)和erlotinib(厄洛替尼，特罗凯)，随着时间的推移，在治疗中出现了耐药现象。而国内迄今为止，尚未有特异性EGFR抑制剂出现。

鸡血藤，来源于豆科植物密花豆Spatholobus suberctus Dunn的干藤茎，具有补血活血作用：

1、对血液系统的影响：鸡血藤水提液能明显恢复模型小鼠骨髓的造血组织容量、血窦容量及巨核细胞数，抑制脂肪组织容量的增加；鸡血藤乙醇提取物可升高白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞容积和血小板。

2、对心血管系统的作用：鸡血藤乙醇提取物具有扩血管作用；鸡血藤的热水提取物有强的血小板聚集抑制作用。

3、对免疫系统的作用：鸡血藤提取物对异常免疫功能显示双向调节作用。

4、抗肿瘤的作用：鸡血藤水提物对六种肿瘤细胞均有一定生长抑制作用；鸡血藤水煎醇提液具有直接抗肿瘤作用。

5、抗病毒的作用：鸡血藤水提物具有极强的抑制HIV-RT活性作用，同时对肠道病毒具有明显的抑制作用。

6、抗氧化的作用：鸡血藤总黄酮提取液对Fenton体系产生的·OH自由基有很好的清除作用；鸡血藤水提取液能抑制肝匀浆MDA的生成，抑制蛋白质的糖基化作用。

7.其它作用：鸡血藤醇提物对衰老小鼠一氧化氮合酶（NOS）活力有显著升高作用；鸡血藤的乙醇提取物对酪氨酸酶具有混合性激活作用；鸡血藤可促进肝细胞再生，恢复肝功能的作用。

迄今为止，尚未有关于鸡血藤的乙酸乙酯提取物及其相关应用的报道。

[发明内容]

为了弥补现有技术尚无用鸡血藤乙酸乙酯提取物用于制造抑制EGFR活性的药物的空白，本发明提供了鸡血藤的乙酸乙酯提取物及其制备方法、检测方法和用途。

为实现上述目的，设计一种鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，该方法由以下步骤组成：

a.将鸡血藤加入到石油醚中浸泡12～48小时，每100g鸡血藤需要300～500毫升的石油醚，然后渗滤回收残渣，；

b.所述的残渣用浓度为60%～90的乙醇分2～3次提取，每100克残渣每次需要300～500毫升的乙醇，每次提取的时间是1～3小时，收集得到提取液；

c.所述的提取液进行浓缩得到浓缩液；

d.用等体积的乙酸乙酯对所述的浓缩液进行萃取，收集乙酸乙酯的萃取液；

e.蒸干所述的萃取液得到提取物。

本发明还具有如下优化方案

每100g鸡血藤优选添加300毫升的石油醚。石油醚的温度为60～90℃。

所述的浸泡时间优选为18～36小时。更优选为24小时。

所述的乙醇浓度为70～90%。更优选为80%。

每100克残渣每次提取优选需要300毫升的乙醇。

步骤（b）中的提取，优选次数为2次。

本发明还包括一种用上述方法提取的鸡血藤的乙酸乙酯提取物，该提取物含有主要成分：儿茶素-儿茶素、阿福豆素-儿茶素、杨梅素-3’-O-β-D吡喃木糖苷、芒柄花苷、芒柄花黄素、阿弗罗莫辛、表没食子儿茶素、催吐萝芙木醇-9-O-木糖-(1→6)葡萄糖苷、木犀草苷和没食子儿茶素-儿茶素。

本发明还包括一种药物制剂，由上述的鸡血藤的乙酸乙酯提取物和药学上可接受的载体组成。

所述制剂为片剂、胶囊、颗粒或丸剂。

所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；

所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、糊精、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；

所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；

所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁；

所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇；

所述润湿剂选自甘油、吐温-80、乙氧基氢化蓖麻油或卵磷脂；

所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等；

所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯（吐温）等；

所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、柠檬酸或糖精钠。

本发明的鸡血藤的乙酸乙酯提取物还可以用于制备抑制EGFR活性药物。

本发明还包括一种检测所述鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，用超高效液相色谱-电喷雾串联质仪对所述鸡血藤提取物进行分析，以获得乙酸乙酯提取物的UPLC-Q-TOF-MS图谱，其中

a.质谱条件为：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N₂压力为50psi；干燥气N₂流速为15L/min；质量扫描范围50--1200；自动3级质谱；

b.色谱分析条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC ^TM BEH C18Column(50mm×2.1mm.i d.,1.7μm)；二元梯度洗脱，A相为0.1%甲酸水溶液；B相为乙腈，流速为0.35mL/min，梯度洗脱的程序如下：

本发明提供的鸡血藤的乙酸乙酯提取物具有以下优点：

1、本发明提供了一种鸡血藤的乙酸乙酯提取物，该提取物是鸡血藤经过石油醚浸泡，然后渗滤，回收的残渣经过醇提，乙酸乙酯萃取得到的，经过检测，其含有儿茶素-儿茶素，阿福豆素-儿茶素，杨梅素-3-O-β-D吡喃木糖苷，芒柄花苷，芒柄花黄素，Afrormosin，表没食子儿茶素，催吐萝芙木醇-9-O-木糖-(1→6)葡萄糖苷，木犀草苷，没食子儿茶素-儿茶素。

2、本发明应用超高效液相色谱-质谱联机分析技术及结果构建鸡血藤提取物指纹图谱的方法。该方法包括鸡血藤的乙酸乙酯提取物的UPLC-MS分析条件。色谱峰的特征、色谱组分的质谱提供的化合物结果信息等。本发明公开的指纹图谱及其技术可用于鸡血藤的品种鉴别及鸡血藤提取物的质量监控。

3、本发明首次提供了鸡血藤的乙酸乙酯提取物在制备抗EGRF的药物中的应用，经过体外试验，发现本发明提供的鸡血藤的乙酸乙酯提取物可抑制EGFR，效果明显。

[附图说明]

图1为鸡血藤的乙酸乙酯提取物的UPLC色谱图；

图2为鸡血藤的乙酸乙酯提取物的UPLC-Q-TOF-MS正源总离子色；

图3为鸡血藤乙酸乙酯提取物中活性组分分析图。

[具体实施方式]

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所使用的石油醚为60-90°的石油醚；

实施例1：

鸡血藤的乙酸乙酯提取物

鸡血藤粉碎成粗粉，过35目筛，称取500g鸡血藤粗粉，然后用1500ml的石油醚浸泡24h，然后用石油醚渗滤，至渗漉液颜色变浅（约收取渗滤液2500ml），回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后用80%乙醇回流提取2次，每次乙醇的用量为2500ml，每次提取时间为2小时，合并提取液，将其减压浓缩至无醇味，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，蒸干得乙酸乙酯提取物0.99g（收率为0.2%）。

实施例2：

鸡血藤的乙酸乙酯提取物

鸡血藤粉碎成粗粉，过20目筛，称取500g鸡血藤粗粉，然后用2500ml的石油醚浸泡48h，然后用石油醚渗漉至渗漉液颜色变浅（约收取渗滤液3000ml），回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后用75%乙醇回流提取2次，每次用2000ml的乙醇，每次提取时间为2小时，合并提取液，然后浓缩至无醇味，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，蒸干得乙酸乙酯提取物1.95g（收率为0.39%）。

实施例3：

鸡血藤的乙酸乙酯提取物

鸡血藤粉碎成粗粉，过25目筛，称取500g鸡血藤粗粉，然后用2000ml的石油醚浸泡24h，然后用石油醚渗漉，至渗漉液颜色变浅（约收取渗滤液5000ml），回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后用70%的乙醇回流提取2次，每次用1500ml的乙醇，每次提取时间为2小时，合并提取液，然后浓缩至无醇味，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，蒸干得乙酸乙酯提取物0.8g（收率为0.16%）。

实施例4：

鸡血藤的乙酸乙酯提取物

鸡血藤粉碎成粗粉，过30目筛，称取500g鸡血藤粗粉，然后用2500ml的石油醚浸泡36h，然后用石油醚渗漉，至渗漉液颜色变浅（约收取渗滤液3500ml），回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后用90%乙醇回流提取2次，每次用2500ml的乙醇，每次提取时间为2小时，合并提取液，然后浓缩至无醇味，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，蒸干得乙酸乙酯提取物1.5g（收率为0.3%）。

实施例5：

鸡血藤的乙酸乙酯提取物

鸡血藤粉碎成粗粉，过20目筛，称取500g鸡血藤粗粉，然后用2000ml的石油醚浸泡48h，然后用石油醚渗漉，至渗漉液颜色变浅（约收取渗滤液3000ml），回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后用60%乙醇回流提取2次，每次用2000ml的乙醇，每次提取时间为2小时，合并提取液，然后浓缩至无醇味，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，蒸干得乙酸乙酯提取物0.64g（收率为0.13%）。

实施例6：

含鸡血藤的乙酸乙酯提取物的胶囊

1、组成：鸡血藤的石油醚提取物（实施例1的方法制备）50g，淀粉15g，硬脂酸镁5g。

2、制备方法：按照配比称取原辅料，混合均匀，分装胶囊。

实施例7：

含鸡血藤的乙酸乙酯提取物的片剂

1、组成：鸡血藤的乙醇提取物（实施例2的方法制备）50g，淀粉25g，微晶纤维素20g，硬脂酸镁5g。

2、制备方法：按照配比称取原辅料，混合均匀，分装胶囊。

实施例8：

含鸡血藤的乙酸乙酯提取物的颗粒剂

1、组成：鸡血藤的乙酸乙酯提取物（实施例3的方法制备）50g，淀粉15g，微晶纤维素20g，硬脂酸镁6g。

2、制备方法：按照配比称取原辅料，按照等量递加法混合均匀，直接压片。

实验例9：

药效实验

1、实验材料：

EGFR激酶(Invitrogen,USA);HTRF KinEASE-TK(Cisbio,USA);ATP、MgCl₂、MnCl₂、DTT(国产)。

鸡血藤的乙酸乙酯提取物溶液：将实施例1制备得到的鸡血藤乙酸乙酯提取物用蒸馏水溶解，浓度为10ug/mL；

阳性对照药：Staurosporine（十字孢碱），其浓度为10ug/mL。

2、实验分组：

阳性对照组：十字孢碱，浓度为10μg/mL；

实验组：实施例1-5组，浓度为10μg/mL。

3、实验模型：

以384孔板为实验容器每孔加入20μL缓冲液，10μL反应底物，10μLVEGFR-2激酶，10μL ATP。在37℃孵箱中孵育30min。然后，依次加入25μL链激酶素标记的XL-665及25μL EuK标记的抗磷酸化的酪氨酸激酶抗体，室温反应用60min。用X检测荧光信号参数设置如下：Em=670nm,Ex1=670nm.Ex2=612nm,lag time=150s,integration time=500s,gain=150。反应设3复孔，检测时每孔读数10次设阴性对照及空白对照。抑制率计算:抑制率/%=(A标准-A样品)/(A标准-A空白)3100。EGRF对照组用去离子水代替待评价样品，空白对照组用去离子水代替评价样品并且用反应缓冲液代替EGRF。

4、实验结果：见表2，表3

表2鸡血藤各提取部位对BuChE的抑制率及IC₅₀值(ｎ＝3)

表3：半数抑制浓度IC50LogCon（ug/mL）

表2结果显示：半数抑制浓度越低，其抗体的灵敏度越高，表1中实施例1的IC50为2.341，为五个实例中IC50最小的一种，说明其抗HINI流感病毒实施例效果较好）。

实验例10：

鸡血藤的乙酸乙酯提取物超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用分析系统（即UPLC-Ｑ-TOF-MS）分析

1、实验部分

1.1试剂与样品

乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；

超纯水，实验室ELGA PURELAB Classic-UVF纯水机，英国；

其他试剂均为市售国产分析纯。

1.2样品处理

鸡血藤粉碎成粗粉，过35目筛，称取500g鸡血藤粗粉，然后用1500ml的石油醚浸泡24h，用石油醚渗滤至渗漉液颜色变浅（约收取渗滤液2500ml），回收残渣，将残渣挥干石油醚，然后用80%乙醇回流提取2次，每次乙醇的用量为2500ml，每次提取时间为2小时，合并两次醇提液，将其减压浓缩至无醇味，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层提取液，蒸干得乙酸乙酯提取物。

1.3仪器与条件

美国Waters Acquity^TM UPLC/Q-TOF Premier；MassL-ynxV4.1工作站。

色谱条件同表1：

表1：

质谱条件：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N₂压力50psi;干燥气N₂，流速15L/min;质量扫描范围50--1200；自动3级质谱。（自动选择最强离子进行源内诱导裂解）。

2、结果与分析：结果见图1-3

针对图2即鸡血藤的乙酸乙酯提取物的UPLC-Q-TOF-MS（﹢）分析的总离子流图，分析其色谱峰组分指纹信息，结果见图3。

图3内容显示：经查阅中外文献，分析鉴定出鸡血藤乙酸乙酯提取物中的16个色谱峰，其中：1为儿茶素-儿茶素，2和9为杨梅素-3’-O-β-D吡喃木糖苷，3.阿福豆素-儿茶素，6.芒柄花苷，7.芒柄花黄素，8.阿弗罗莫辛（Afrormosin），10为表没食子儿茶素，11为催吐萝芙木醇-9-O-木糖-(1→6)葡萄糖苷，14为木犀草苷，16为没食子儿茶素-儿茶素，4、5、12、13和15为未知成分。

结果表明：鸡血藤的乙酸乙酯提取物含有黄酮类化合物，也是抗EGFR活性的主要成分。

Claims (9)

1.一种鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：

a.将鸡血藤加入到石油醚中浸泡12～48小时，每100g鸡血藤需要300～500毫升的石油醚，然后渗滤回收残渣；

b.所述的残渣用浓度为60%～90%的乙醇分2～3次提取，每100克残渣每次需要300～500毫升的乙醇，每次提取的时间是1～3小时，收集得到提取液；

c.所述的提取液进行浓缩得到浓缩液；

d.用与浓缩液等体积的乙酸乙酯对所述的浓缩液进行萃取，收集乙酸乙酯的萃取液；

e.蒸干所述的萃取液得到提取物。

2.如权利要求1所述的鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，其特征在于每100g鸡血藤需要300毫升的石油醚浸泡。

3.如权利要求1所述的鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，其特征在于所述的浸泡时间为18～36小时。

4.如权利要求1所述的鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，其特征在于所述的乙醇浓度为70～90%。

5.如权利要求1所述的鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，其特征在于所述的浸泡时间为24小时，每100克残渣每次需要300毫升的乙醇，所述的乙醇浓度为80%，所述的步骤（b）中的提取次数为2次。

6.一种用权利要求1所述方法提取的鸡血藤的乙酸乙酯提取物，其特征在于该提取物含有主要成分：儿茶素-儿茶素、阿福豆素-儿茶素、杨梅素-3’-O-β-D吡喃木糖苷、芒柄花苷、芒柄花黄素、阿弗罗莫辛、表没食子儿茶素、催吐萝芙木醇-9-O-木糖-(1→6)葡萄糖苷、木犀草苷和没食子儿茶素-儿茶素。

7.一种药物制剂，由权利要求6所述的鸡血藤的乙酸乙酯提取物和药学上可接受的载体组成。

8.权利要求6所述鸡血藤的乙酸乙酯提取物在制备抑制EGFR活性药物中的应用。

9.一种检测权利要求6所述鸡血藤的乙酸乙酯提取物的方法，用超高效液相色谱-电喷雾串联质仪对所述鸡血藤提取物进行分析，以获得乙酸乙酯提取物的UPLC-Q-TOF-MS图谱，其特征在于：

a.质谱条件为：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N₂压力为50psi；干燥气N₂流速为15L/min；质量扫描范围50--1200；自动3级质谱；

b.色谱分析条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC ^TM BEH C18Column(50mm×2.1mm.i d.,1.7μm)；二元梯度洗脱，A相为0.1%甲酸水溶液；B相为乙腈，流速为0.35mL/min，梯度洗脱的程序如下：

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