CN115073278A - 一种从雷公藤中提取雷公藤对醌b的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药天然提取物领域，具体公开一种从雷公藤药材中提取雷公藤对醌B的方法，该方法以雷公藤药材为原料，经粉碎，回流提取，大孔树脂除杂，萃取，正相硅胶柱层析，UPLC‑Q‑TOF‑MS分析确定，反相中压C18柱层析等步骤得到雷公藤对醌B单体。本方法简单、快速，得到的雷公藤对醌B纯度高（99.14%），得率可达到0.004%，是一种可大量提取雷公藤对醌B的有效方法。

Description

一种从雷公藤中提取雷公藤对醌B的方法
技术领域
本发明涉及中药天然提取物领域，具体涉及一种从雷公藤药材分离提取雷公藤对醌B的方法。
背景技术
雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook f.）系卫矛科雷公藤属植物，又名黄藤根、黄药、水莽草、断肠草、菜虫药、南蛇根、三棱花等。主要分布于我国贵州、福建、江苏、浙江、四川、湖北、湖南、广西等地。雷公藤是传统的雷公藤，性苦、寒，具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血等功效，用于治疗类风湿性关节炎、肾炎、红斑狼疮、血小板减少性紫癜等。
雷公藤对醌B是雷公藤中微量的活性成分之一，前期研究表明：雷公藤对醌B具有较好的抗炎、免疫调节等生理活性，能够显著降低高糖诱导型HK2细胞上清中TGF-β1及TNF-α的含量，并能显著提升C5b-9诱导后的MPC-5细胞内Nephrin和Podocin蛋白表达水平。但其含量很低，据报道其含量在百万分之一到百万分之五左右。由于其含量很低，目前还没有较好的提取方法，为了得到高纯度的雷公藤对醌B，有必要开发一种简单、快速、高效的雷公藤对醌B的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从雷公藤药材提取雷公藤对醌B的方法，该方法提取效率高，试剂用量较少，所得到的雷公藤对醌B的纯度高，为雷公藤对醌B的对照品制备和生产提供基础。
为实现上述目的，本发明包括以下步骤：
步骤S10：将200kg雷公藤药材粉碎，过50～60目药筛，得到雷公藤药材粉末，加入其10～30倍质量的75%乙醇溶液，75～95℃加热回流提取2～4h，过滤得到雷公藤提取液；
步骤S20：对步骤S10中雷公藤提取液减压浓缩处理至无醇味，上样置于大孔树脂，纯水洗脱除去大极性杂质，再以95%洗脱，回收乙醇溶液后，得到雷公藤浸膏；
步骤S30：将雷公藤浸膏加入5L水溶解分散混悬后，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收乙酸乙酯，得到雷公藤乙酸乙酯萃取物；
步骤S40：将步骤S30中雷公藤乙酸乙酯萃取物加适量甲醇溶解后，用3kg的100～200目硅胶进行干法拌样，另取10kg的100～200目硅胶加适量石油醚进行湿法装柱，以石油醚:乙酸乙酯（V/V=20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1）洗脱，每个比例洗脱2个柱体积，得到10个流分（LF1～LF10）；
步骤S50：将步骤S40中得到的10个流分采用UPLC-Q-TOF-MS进行流分成分分析，在流分LF5中检测提取到雷公藤对醌B的准分子离子峰，对LF5流分上反相中压C18柱层析进行富集，以20%～50%乙腈梯度洗脱，每10%增加一个梯度，每个梯度洗脱4个柱体积，对洗脱流分进行检测合并浓缩，雷公藤对醌B被富集到LF5-3中；
步骤S60：将步骤S50得到的流分LF5-3进行高压制备纯化，以流动相乙腈-水（11:9）等度洗脱，洗脱流分浓缩、冻干获得雷公藤对醌B。
所得雷公藤对醌B的结构式如下：
Figure 543865DEST_PATH_IMAGE002
雷公藤对醌B（Triptoquinone B），白色粉末，分子式: C20H26O4; HR-ESI-MS m/z329.1760 [M-H]-; 1H NMR (500 MHz, CHCl3) δ H: 6.36 (1H, d, J = 1.2 Hz), 4.03(1H, d, J = 10.0 Hz), 3.45 (1H, t, J = 10.0 Hz), 3.21 (1H, d, J = 10.0 Hz),2.98 (1H, m), 2.82 (2H, m), 2.67 (1H, m), 2.46 (1H, m), 2.28 (1H, m), 1.99(1H, dd, J = 12.5, 2.0), 1.84 (2H, m), 1.43 (1H, m), 1.33 (3H, s), 1.27 (3H,s), 1.10 (3H, d, J = 6.5 Hz), 1.09 (3H, d, J = 6.5 Hz); 13C NMR (125 MHz,CHCl3) δ C: 220.7, 187.7, 187.5, 153.5, 147.7, 142.7, 132.0 65.7, 51.8, 50.5,37.2, 34.6, 34.4, 26.6, 25.7, 22.7, 21.5, 21.4, 21.2, 18.0；
进一步，所述步骤S10加入75％的乙醇的量为10倍，加热回流提取条件如下：提取温度为80～85℃；回流提取时间为2～3h。
进一步，所述步骤S40中所用100～200目硅胶重量为雷公藤乙酸乙酯萃取物的10倍。
进一步，所述预处理装置包括传送带、磁铁和机架；所述传送带转动设置在机架上，所述磁铁固定在机架上，且磁铁位于传送带的上方，还包括机架上的风机和受风板，所述风机固定在机架上，风机的出风口位于传送带的上方，且风机的出风口与磁铁交错设置；所述受风板通过弹性件固定在机架上，且位于传送带中间，所述受风板呈弧形，且与受风板与风机的出风口对应设置，所述受风板的一端位于传送带内，另一端伸出传送带外。
雷公藤药材在破碎前，一般都是加工成块状的，有些了在干燥后就会弯曲。由于加工或者采摘过程中，往往会有些铁制的杂质混入雷公藤药材里面，比如铁丝等，再粉碎前必要要及时的去掉。
通过设置预处理装置，当雷公藤药材传送带移动至磁铁下方时，在磁力的作用下，雷公藤药材中的铁质杂质则会被吸引到磁铁上，完成除杂的挑拣过程。同时风机启动，被铁质杂质带着一起向上移动的雷公藤药材则会被风吹散，使得杂质和雷公藤药材分离，仅仅让铁质杂质吸到磁铁上。风机启动时，还会吹动受风板向下移动，一方面可以改变风的方向，从下方继续吹到传送带上，可以对雷公藤药材进行搅动，更有利于铁质杂质的去除；另一方面，一旦风机停止，则在弹性件的作用下，受风板则会来回的撞击传送带，进一步的起到搅动的效果。
与传统的通过人工来挑选相比，本方案可有效地搅动雷公藤药材，使得铁质杂质完全的吸到磁铁上，去除效果好。另外，风机的设置有效地避免了片状雷公藤药材随着铁质杂质一起吸在磁铁上，保证了磁铁的磁性和除杂效果。
进一步，所述预处理装置包括传送带、磁铁和机架；所述传送带转动设置在机架上，所述磁铁固定在机架上，且磁铁位于传送带的上方，还包括机架上的风机和受风板，所述风机固定在机架上，风机的出风口位于传送带的上方，且风机的出风口与磁铁交错设置；所述受风板通过弹性件固定在机架上，且位于传送带中间，所述受风板呈弧形，且与受风板与风机的出风口对应设置，所述受风板的一端位于传送带内，另一端伸出传送带外。
进一步，所述受风板内设有通风通道，所述通风通道的进风口位于风机的出风口的正下方，通风通道的出风孔对准传送带，所述传送带上设有滤孔。相对于弧形板，通过设置通风通道，可更加稳定的将风重新传入到传送到上，起到更好的搅拌作用。
本发明的有益效果在于：本制备方法为首次对雷公藤对醌B进行回流提取，大孔树脂除杂，并使用UPLC-Q-TOF-MS技术对流分成分进行跟踪，中高压色谱分离技术，该方法提取效率高，节约试剂，所得雷公藤对醌B纯度高（99.14%）。
附图说明
图1为硅胶柱流分LF5的BPC图和目标化合物的XIC图；
图2为雷公藤对醌B的HPLC色谱图；
图3为雷公藤对醌B的MS1谱图；
图4为雷公藤对醌B的MS2谱图；
图5为雷公藤对醌B的1H-NMR谱图；
图6为雷公藤对醌B的13C-NMR谱图；
图7为雷公藤对醌B分离纯化过程图；
图8为本实施例中预处理装置的结构示意图。
具体实施方式
说明书附图中的附图标记包括：机架10、传送带20、磁铁30、出风口40、受风板50、进风口501、出风孔502、弹簧60、收集箱70。
一种从雷公藤药材中提取雷公藤对醌B的方法，本发明包括以下实施例：
实施例1：将200kg通过预处理装置进行除杂，然后将雷公藤药材粉碎，过50目药筛，得到雷公藤药材粉末，加入其10倍质量的75%乙醇溶液，75℃加热回流提取2h，过滤得到雷公藤提取液；将雷公藤提取液进行减压浓缩处理至无醇味，上样置于大孔树脂，纯水洗脱除去大极性杂质，再以95%洗脱，回收乙醇溶液后，得到雷公藤浸膏为2.63kg。
实施例2：将200kg通过预处理装置进行除杂，然后将雷公藤药材粉碎，过50目药筛，得到雷公藤药材粉末，加入其10倍质量的75%乙醇溶液，85℃加热回流提取3h，过滤得到雷公藤提取液；将雷公藤提取液进行减压浓缩处理至无醇味，上样置于大孔树脂，纯水洗脱除去大极性杂质，再以95%洗脱，回收乙醇溶液后，得到雷公藤浸膏为2.71kg。
实施例3：将200kg通过预处理装置进行除杂，然后将雷公藤药材粉碎，过60目药筛，得到雷公藤药材粉末，加入其10倍质量的75%乙醇溶液，90℃加热回流提取4h，过滤得到雷公藤提取液；将雷公藤提取液进行减压浓缩处理至无醇味，上样置于大孔树脂，纯水洗脱除去大极性杂质，再以95%洗脱，回收乙醇溶液后，得到雷公藤浸膏为2.68kg。
取雷公藤浸膏2.7kg，加水5L溶解分散混悬后，用5L乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收乙酸乙酯，得到雷公藤乙酸乙酯萃取物 。
取雷公藤乙酸乙酯萃取物加适量甲醇溶解后，用3kg的100～200目硅胶进行干法拌样，另取10kg的100～200目硅胶加适量石油醚进行湿法装柱，以石油醚:乙酸乙酯（V/V=20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1）洗脱，每个比例洗脱2个柱体积，得到10个流分（LF1：0.224kg、LF2：0.162kg、LF3：0.0782kg、LF4：0.147kg、LF5：0.180kg、LF16、LF17：0.660kg、LF18：0.774kg、LF19和LF20）。
将流分LF1～LF10采用UPLC-Q-TOF-MS进行流分成分分析（分析条件如下表1、2），在流分LF5中检测提取到雷公藤对醌B的准分子离子峰（见图1），对LF5流分上反相中压C18柱层析进行富集，以20%～50%乙腈梯度洗脱，每10%增加一个梯度，每个梯度洗脱4个柱体积，对洗脱流分进行检测合并浓缩，雷公藤对醌B被富集到LF5-3中；
表1.色谱分析条件
Figure 257743DEST_PATH_IMAGE004
表2.质谱分析条件
Figure 319372DEST_PATH_IMAGE006
将得到的流分LF5-3进行高压制备纯化，以流动相乙腈-水（11:9）等度洗脱，洗脱流分浓缩、冻干获得雷公藤对醌B。
所述的拌样步骤中所用的100～200目硅胶重量为雷公藤乙酸乙酯萃取物的10倍。
本发明的有益效果在于：本制备方法为首次对雷公藤对醌B进行回流提取，大孔树脂除杂，并使用UPLC-Q-TOF-MS技术对流分成分进行跟踪，中高压色谱分离技术，该方法提取效率高，节约试剂，所得雷公藤对醌B纯度较高（99.14%）。
实施例中用到的预处理装置，如图8所示，最上方的为磁铁30和风机，风机的出风口40和磁铁30交错设置，即一排磁铁30一排风机的出风口40。磁铁30采用电磁铁30，如果省成本，可以换成永磁铁30。电磁铁30的表面包覆一层塑料膜，这样在断电时，磁吸在电磁铁30上的杂质就可以方便的去除。
磁铁30的下方则是传送带20，传送带20上设置有滤孔，且两边设置有挡板，可以有效地避免中草药从两边滑落。传送带20是通过转轴转动设置在机架10上的，另外还同轴连接有一个电机，用于驱动其转动。上下两层的传送带20之间设有受风板50，受风板50采用弧形的，其下方还通过弹簧60安装在机架10上。
需要注意的是，要将受风板50的位置向外移动，要保证受风板50的一部分是位于传送带20内的，另一部分则是位于传送带20外的。在受风板50内部设置一个风道，风道的进风端则是设置在位于传送带20外的部分，出口端则是设置于传送带20内的部分。对应的，将风机的出风口40和受风板50的进风口501对应，要保证风能从进风口501进入，然后经过通风通道从出风孔502出来，吹动传送带上的雷公藤，使得筛选效果更好。同时，要保证出风孔位于传送带之间，不要伸出传送带外。另外，在位于传送带内的受风板的一端上可拆卸的设置有垫块，垫块采用硬度较低的垫块，方便更换且不会损伤传送带。
最下方则是收集箱70，收集箱70倾斜设置，这样除杂后的雷公藤就可以进入到收集箱70中，方便收集。而倾斜设计，也不容易使得中药堆积。
本设备在使用前，先经过预处理机构进行筛选，必要的时候，适当增加人工手动粗选，这样，可更好的保证挑拣的效果。同时，可以将收集箱70中挑拣后的药材多次经过传送带进行拣选除杂，以确保挑选的效果。
最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种从雷公藤药材中提取雷公藤对醌B的方法，步骤包括如下：
步骤S10：对雷公藤药材通过预处理装置进行除铁处理，将200kg雷公藤药材粉碎，过50～60目药筛，得到雷公藤药材粉末，加入其10～30倍质量的75%乙醇溶液，75～95℃加热回流提取2～4h，过滤得到雷公藤提取液；
步骤S20：对步骤S10中雷公藤提取液减压浓缩处理至无醇味，上样置于大孔树脂，纯水洗脱除去大极性杂质，再以95%洗脱，回收乙醇溶液后，得到雷公藤浸膏；
步骤S30：将雷公藤浸膏加入5L水溶解分散混悬后，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收乙酸乙酯，得到雷公藤乙酸乙酯萃取物；
步骤S40：将步骤S30中雷公藤乙酸乙酯萃取物加适量甲醇溶解后，用3kg的100～200目硅胶进行干法拌样，另取10kg的100～200目硅胶加适量石油醚进行湿法装柱，以石油醚:乙酸乙酯（V/V=20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1）洗脱，每个比例洗脱2个柱体积，得到10个流分（LF1～LF10）；
步骤S50：将步骤S40中得到的10个流分采用UPLC-Q-TOF-MS进行流分成分分析，在流分LF5中检测提取到雷公藤对醌B的准分子离子峰，对LF5流分上反相中压C18柱层析进行富集，以20%～50%乙腈梯度洗脱，每10%增加一个梯度，每个梯度洗脱4个柱体积，对洗脱流分进行检测合并浓缩，雷公藤对醌B被富集到LF5-3中；
步骤S60：将步骤S50得到的流分LF5-3进行高压制备纯化，以流动相乙腈-水（11:9）等度洗脱，洗脱流分浓缩、冻干获得雷公藤对醌B。
2.如权利要求1所述从雷公藤药材中提取雷公藤对醌B的方法，其特征在于：所述步骤S10加入75％的乙醇的量为10倍，加热回流提取条件如下：提取温度为80～85℃；回流提取时间为2～3h。
3.如权利要求1或2所述从雷公藤药材中提取雷公藤对醌B的方法，其特征在于：所述步骤S40中所用100～200目硅胶重量为雷公藤乙酸乙酯萃取物的10倍。
4.如权利要求1所述从雷公藤药材中提取雷公藤对醌B的方法，其特征在于，所述预处理装置包括传送带、磁铁和机架；所述传送带转动设置在机架上，所述磁铁固定在机架上，且磁铁位于传送带的上方，还包括机架上的风机和受风板，所述风机固定在机架上，风机的出风口位于传送带的上方，且风机的出风口与磁铁交错设置；所述受风板通过弹性件固定在机架上，且位于传送带中间，所述受风板呈弧形，且与受风板与风机的出风口对应设置，所述受风板的一端位于传送带内，另一端伸出传送带外。
5.如权利要求4所述从雷公藤药材中提取雷公藤对醌B的方法，其特征在于，所述受风板内设有通风通道，所述通风通道的进风口位于风机的出风口的正下方，通风通道的出风孔对准传送带，所述传送带上设有滤孔。
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