CN102093449B - 一种自决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法 - Google Patents
一种自决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种自决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法。其特征在于决明子用乙醇加热回流提取得决明子提取物浸膏；浸膏用甲醇回流提取得甲醇提取物；甲醇提取物采用硅胶干柱色谱法分离得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品；粗品采用硅胶干柱色谱法、C18反相色谱柱纯化得到红镰霉素龙胆二糖苷黄色粉末。经高效液相色谱法测定其纯度大于98％。
Description
技术领域
本发明属中药技术领域，涉及一种中药化学成分的提取分离纯化方法，特别是涉及自中药决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法。
背景技术
决明子为豆科植物决明Cassia obtuse folia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，为常用中药。具有清肝明目、润肠通便的功效。用于目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明，大便秘结。现代医学研究表明决明子不仅具保肝明目、降血压、降血脂等作用，还具有增强机体免疫力、抗衰老等多方面作用。决明子无论在药用、保健等方面都具有广泛的研究、利用和开发前景。红镰霉素龙胆二糖苷为决明子中主要的萘骈吡喃酮类成分，具有降血脂、保肝、抗突变、抗雌激素、抑制高级糖基化终末化产物(AGEs)生成等作用，为决明子主要药效成分之一，目前未见有关自中药决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷方法的报道和专利申请。
技术方案
本发明的目的在于提供一种从决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
1.决明子提取物的制备
取决明子药材，加入按药材质量计6～14倍体积份的20～50％乙醇，加热回流提取0.5～2.5小时，静置，过滤；药渣用同样方法再提取1～3次，合并提取液，60～70℃水浴减压回收溶剂，得决明子提取物浸膏。
2.红镰霉素龙胆二糖苷粗品的分离
红镰霉素龙胆二糖苷粗品的分离采用硅胶干柱层析方法。
取决明子提取物浸膏，加入按浸膏质量计60～120倍体积份的甲醇，回流提取6～10次，每次提取30～100分钟，过滤，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物；残渣采用硅胶薄层色谱法进行检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G薄层板，展开剂为体积比为7.5∶2.5∶0.3的氯仿-甲醇-水混合溶液，10％硫酸乙醇溶液显色，提取至残渣中无红镰霉素龙胆二糖苷(相应Rf值处无黄色斑点)。
取甲醇提取物，加入按甲醇提取物质量计5～10倍体积份的甲醇溶解，按甲醇提取物与硅胶质量比1∶1～3拌入200～300目的硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶，另按甲醇提取物与硅胶质量比1∶60～150取200～300目的硅胶，干法装柱，色谱柱径高比1∶5～10；将拌样硅胶装于柱顶，以体积比为9∶1∶0.1～7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，下行法进行干柱层析，洗脱1～3倍柱体积，置阴凉避光处挥干展开剂，自柱头而底部平均切割为15～25份，各份用甲醇洗脱，甲醇洗脱液用硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷的6～10至11～15份甲醇洗脱液，回收溶剂，得红镰霉素龙胆二糖苷粗品。
3.红镰霉素龙胆二糖苷的纯化
取红镰霉素龙胆二糖苷粗品用少量甲醇溶解，按红镰霉素龙胆二糖苷粗品与硅胶的质量比1∶1～3拌入200～300目的硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶，另按红镰霉素龙胆二糖苷粗品与硅胶质量比1∶50～120取200～300目的硅胶，干法装柱，色谱柱径高比1∶5～10；将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为9∶1∶0.1～7∶3∶0.5的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，下行法进行干柱层析，分份收集，洗脱液用硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷的流份，回收溶剂，得红镰霉素龙胆二糖苷粗品。用按红镰霉素龙胆二糖苷粗品质量计为2～4体积份的20～40％甲醇溶解，采用C18反相色谱柱纯化，径高比1∶8～15，以10％～40％甲醇洗脱，采用硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷的流份，回收溶剂得黄色粉末，即为红镰霉素龙胆二糖苷。
4.纯度检查
高效液相色谱法(HPLC)检查纯度。仪器：美国Waters公司Waters1525高效液相色谱仪，Waters2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站，Waters公司25μL可调进样器。色谱柱：SunFire C18色谱柱，规格为150mm×4.6mm，填料粒径5μm；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液，比例为15∶85～25～75，流速：0.8～1.2mL/min；检测波长：278nm；柱温：30～40℃，运行时间12min，进样量为0.5～5μg。峰面积归一化法测定红镰霉素龙胆二糖苷纯度均大于98.00％。
5.结构测定
红镰霉素龙胆二糖苷为黄色粉末(甲醇)，分子式：C27H32O15，分子量：596，熔点：259～261℃。
UVλmax(nm)：278nm
ESI-MS：m/z597[M+1]+，619[M+Na]+，273[M+1-2glc]+。
1H-NMR(DMSO，400MHz)：δ7.18(1H，s，H-10)，6-92(1H，s，H-9)，6-79(1H，s，H-7)，6-18(1H，s，H-3)，5-43(1H，br，s，5-OH)，5.01(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)，4.18(1H，d，J＝7.6Hz，H-1″)，5.16-2.98为糖镰上的21个质子信号，3.87(3H，s，8-OCH3)，2.40(3H，s，2-CH3)。
13C-NMR(DMSO，400MHz)：δ183.8(C4)，168.8(C2)，161.9(C5)，161.1(C6)，157.6(C8)，152.4(C10a)，140.3(C9a)，107.7(C5a)，106.7(C10)，103.6(C7或C4a)，101.1(C3或C1′)，100.7(G1")，99.7(C9)，76.9(C3′)，76.6(C3″)，75.5(C5′)，76.4(C5″)，73.5(C2′或C2″)，70.1(C4′)，69.6(C4")，68.7(C6′)，61.0(C6")，55.4(8-OCH3)，20.2(2-CH3)。
红镰霉素龙胆二糖苷结构式如下：
附图说明：
图1220nm下红链霉素龙胆二糖苷HPLC图谱
图2254nm下红链霉素龙胆二糖苷HPLC图谱
图3278nm下红链霉素龙胆二糖苷HPLC图谱
实施例1：
取决明子药材100g，用1000mL30％乙醇回流提取3次，每次100分钟。合并3次提取液，水浴(60℃)减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏20g。
决明子提取物浸膏20g，加入1600mL甲醇回流8次，每次提取80分钟，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物；残渣采用硅胶薄层色谱法进行检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为体积比为7.5∶2.5∶0.3的氯仿-甲醇-水混合溶液，10％硫酸乙醇溶液显色，提取至残渣中无红镰霉素龙胆二糖苷(相应Rf值处无黄色斑点)。得甲醇提取物分别为14g。
取甲醇提取物14g，加入80mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶20g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目的硅胶1-2kg，干法装柱，色谱柱径高比1∶7，将拌样硅胶加于柱顶，以3000mL体积比为8∶2∶0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份。各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并8-13份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品637mg。
红镰霉素龙胆二糖苷粗品637mg，用少量甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶1g，自然干燥；另取200-300目的硅胶60g，干法装柱，色谱柱径高比1∶7，将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为8.5∶1.5∶0.1的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得粗品188mg。
取红镰霉素龙胆二糖苷粗品188mg，加0.6mL30％甲醇溶解，采用C18反相色谱柱(径高比1∶12)纯化，以30％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得黄色粉末101mg，即为红镰霉素龙胆二糖苷。高效液相色谱法测定其纯度大于98％。
实施例2：
取决明子药材100g，用1200mL40％乙醇提取3次，每次1.5小时。合并3次提取液，水浴(60℃)减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏22g。
决明子提取物浸膏22g，加入2000mL甲醇回流10次，每次提取1.5小时，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物；残渣采用硅胶薄层色谱法进行检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为体积比为7.5∶2.5∶0.3的氯仿-甲醇-水混合溶液，10％硫酸乙醇溶液显色，提取至残渣中无红镰霉素龙胆二糖苷(相应Rf值处无黄色斑点)。得甲醇提取物分别为15g。
取甲醇提取物15g，加入100mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶30g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目硅胶1.4kg，干法装柱，色谱柱径高比1∶8，将拌样硅胶加于柱顶，以2800mL体积比为8∶2∶0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份。各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并7-14份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品650mg。
红镰霉素龙胆二糖苷粗品650mg，用少量甲醇溶解，拌入200-300目硅胶1.5g，自然干燥；另取200-300目的硅胶65g，干法装柱，色谱柱径高比1∶9，将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为8.5∶1.5∶0.1的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶，得粗品180mg。
取红镰霉素龙胆二糖苷粗品180mg，加0.5mL25％甲醇溶解，采用C18反相色谱柱(径高比1∶12)纯化，以40％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖昔流份，回收溶剂，得黄色粉末110mg，即为红镰霉素龙胆二糖苷。高效液相色谱法测定其纯度大于98％。
实施例3：
取决明子药材500g，30％乙醇提取2次，每次提取1小时。溶剂用量第一次为6L，第二次为5L。合并2次提取液，水浴(60℃)减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏110g。
决明子提取物浸膏110g，加入8000mL甲醇回流8次，每次提取40分钟，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物；残渣采用硅胶薄层色谱法进行检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为体积比为7.5∶2.5∶0.3的氯仿-甲醇-水混合溶液，10％硫酸乙醇溶液显色，提取至残渣中无红镰霉素龙胆二糖苷(相应Rf值处无黄色斑点)。得甲醇提取物分别为70g。
取甲醇提取物70g，加入450mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶150g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目的硅胶7kg，干法装柱，色谱柱径高比1∶8，将拌样硅胶加于柱顶，以12L体积比为8∶2∶0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份。各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并7-14份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品3.2g。
红镰霉素龙胆二糖苷粗品3.2g，用少量甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶8g，自然干燥；另取200-300目的硅胶300g，干法装柱，色谱柱径高比1∶7，将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为8.5∶1.5∶0.1的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶，得粗品900mg。
取红镰霉素龙胆二糖苷粗品900mg，加3mL25％甲醇溶解，采用C18反相色谱柱(径高比1∶14)纯化，以30％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得黄色粉末530mg，即为红镰霉素龙胆二糖苷。高效液相色谱法测定其纯度大于98％。
实施例4：
取决明子药材2kg，用20L30％乙醇提取3次，每次2.0小时。合并3次提取液，水浴(60℃)减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏400g。
决明子提取物浸膏400g，加入30L甲醇回流8次，每次提取1小时，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物；残渣采用硅胶薄层色谱法进行检识，薄层色谱条件：吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为体积比为7.5∶2.5∶0.3的氯仿-甲醇-水混合溶液，10％硫酸乙醇溶液显色，提取至残渣中无红镰霉素龙胆二糖苷(相应Rf值处无黄色斑点)。得甲醇提取物分别为280g。
取甲醇提取物280g，加入1600mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶400g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目的硅胶25kg，干法装柱，色谱柱径高比1∶7，将拌样硅胶加于柱顶，以40L体积比为8∶2∶0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份。各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并7-15份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品13g。
红镰霉素龙胆二糖苷粗品13g，用少量甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶22g，自然干燥；另取200-300目的硅胶1.2kg，干法装柱，色谱柱径高比1∶7，将拌样硅胶加于柱顶，以.体积比为85∶1.5∶0.1的氯仿-甲醇-混合溶剂洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶，得粗品3.8g。
取红镰霉素龙胆二糖苷粗品3.8g，加10mL30％甲醇溶解，采用C18反相色谱柱(径高比1∶12)纯化，以30％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得黄色粉末2g，即为红镰霉素龙胆二糖苷。高效液相色谱法测定其纯度大于98％。
Claims (5)
1.一种自决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法，其特征在于该方法为：
步骤1：取决明子药材，加入按药材质量计6～14倍体积份的20～50％乙醇，加热回流提取0.5～2.5小时，静置，过滤；药渣用同样方法再提取1～3次，合并提取液，60～70℃水浴减压回收溶剂，得决明子提取物浸膏；
步骤2：取决明子提取物浸膏，加入按浸膏质量计60～120倍体积份的甲醇，回流提取6～10次，每次提取30～100分钟，过滤，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物；
步骤3：取甲醇提取物，加入按甲醇提取物质量计5～10倍体积份的甲醇溶解，按甲醇提取物与硅胶质量比1：1～3拌入200～300目的硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶，另按甲醇提取物与硅胶质量比1：60～150取200～300目的硅胶，干法装柱，色谱柱径高比1：5～10；将拌样硅胶装于柱顶，以体积比为9：1：0.1～7：3：0.5的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，下行法进行干柱层析，洗脱1～3倍柱体积，置阴凉避光处挥干展开剂，自柱头而底部平均切割为15～25份，各切割份用甲醇洗脱，甲醇洗脱液用硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷的6～10至11～15份甲醇洗脱液，回收溶剂，得红镰霉素龙胆二糖苷粗品；
步骤4：取红镰霉素龙胆二糖苷粗品用甲醇溶解，按红镰霉素龙胆二糖苷粗品与硅胶的质量比1：1～3拌入200～300目的硅胶，自然干燥，得到拌样硅胶，另按红镰霉素龙胆二糖苷粗品与硅胶质量比1：50～120取200～300目的硅胶，干法装柱，色谱柱径高比1：5～10；将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为9：1：0.1～7：3：0.5的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，下行法进行干柱层析，分份收集，洗脱液用硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷的流份，回收溶剂，得红镰霉素龙胆二糖苷粗品；
步骤5：取步骤4中红镰霉素龙胆二糖苷粗品，用按红镰霉素龙胆二糖苷粗品质量计为2～4体积份的20～40％甲醇溶解，采用C18反相色谱柱纯化，径高比1：8～15，以10％～40％甲醇洗脱，采用硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷的流份，回收溶剂得黄色粉末，即为红镰霉素龙胆二糖苷。
2.如权利要求1所述的自决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法，其特征在于该方法为：取决明子药材100g，用1000mL30％乙醇回流提取3次，每次100分钟，合并3次提取液，60℃水浴减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏20g；取决明子提取物浸膏20g，加入1600mL甲醇回流8次，每次提取80分钟，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物14g；取甲醇提取物14g，加入80mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶20g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目的硅胶1.2kg，干法装柱，色谱柱径高比1：7，将拌样硅胶加于柱顶，以3000mL体积比为8：2：0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份，各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并8-13份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品637mg；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品637mg，用甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶1g，自然干燥；另取200-300目的硅胶60g，干法装柱，色谱柱径高比1：7，将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为8.5：1.5：0.1的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得粗品188mg；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品188mg，加0.6mL30％甲醇溶解，采用径高比为1：12的C18反相色谱柱纯化，以30％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得黄色粉末101mg，即为红镰霉素龙胆二糖苷。
3.如权利要求1所述的自决明子中分离制各红镰霉素龙胆二糖苷的方法，其特征在于该方法为：取决明子药材100g，用1200mL40％乙醇提取3次，每次1.5小时，合并3次提取液，60℃水浴减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏22g；取决明子提取物浸膏22g，加入2000mL甲醇回流10次，每次提取1.5小时，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物15g；取甲醇提取物15g，加入100mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶30g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目硅胶1.4kg，干法装柱，色谱柱径高比1：8，将拌样硅胶加于柱顶，以2800mL体积比为8：2：0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份；各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并7-14份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品650mg；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品650mg，用甲醇溶解，拌入200-300目硅胶1.5g，自然干燥；另取200-300目的硅胶65g，干法装柱，色谱柱径高比1：9，将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为8.5：1.5：0.1的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得粗品180mg；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品180mg，加0.5mL25％甲醇溶解，采用径高比为1：12的C18反相色谱柱纯化，以40％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得黄色粉末110mg，即为红镰霉素龙胆二糖苷。
4.如权利要求1所述的自决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法，其特征在于该方法为：取决明子药材500g，30％乙醇提取2次，每次提取1小时，溶剂用量第一次为6L，第二次为5L，合并2次提取液，60℃水浴减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏110g；取决明子提取物浸膏110g，加入8000mL甲醇回流8次，每次提取40分钟，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物70g；取甲醇提取物70g，加入450mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶150g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目的硅胶7kg，干法装柱，色谱柱径高比1：8，将拌样硅胶加于柱顶，以12L体积比为8：2：0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份，各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并7-14份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品3.2g；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品3.2g，用甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶8g，自然干燥；另取200-300目的硅胶300g，干法装柱，色谱柱径高比1：7，将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为8.5：1.5：0.1的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得粗品900mg；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品900mg，加3mL25％甲醇溶解，采用径高比为1：14的C18反相色谱柱纯化，以30％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得黄色粉末530mg，即为红镰霉素龙胆二糖苷。
5.如权利要求1所述的自决明子中分离制备红镰霉素龙胆二糖苷的方法，其特征在于该方法为：取决明子药材2kg，用20L30％乙醇提取3次，每次2.0小时，合并3次提取液，60℃水浴减压回收溶剂至无醇味，得决明子提取物浸膏400g；取决明子提取物浸膏400g，加入30L甲醇回流8次，每次提取1小时，取上清液，回收溶剂得甲醇提取物280g；取甲醇提取物280g，加入1600mL甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶400g，自然干燥，得到拌样硅胶；另取200-300目的硅胶25kg，干法装柱，色谱柱径高比1：7，将拌样硅胶加于柱顶，以40L体积比为8：2：0.2的氯仿-甲醇-水混合溶液洗脱，置阴凉避光处挥干洗脱剂，自柱头向底部平均切割成20份，各切割份分别用甲醇洗脱，薄层色谱法检识，合并7-15份甲醇洗脱液，回收溶剂，得到红镰霉素龙胆二糖苷粗品13g；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品13g，用甲醇溶解，拌入200-300目的硅胶22g，自然干燥；另取200-300目的硅胶1.2kg，干法装柱，色谱柱径高比1：7，将拌样硅胶加于柱顶，以体积比为8.5：1.5：0.1的氯仿-甲醇-水混合溶剂洗脱，薄层色谱法检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得粗品3.8g；取红镰霉素龙胆二糖苷粗品3.8g，加10mL30％甲醇溶解，采用径高比为1：12的C18反相色谱柱纯化，以30％甲醇洗脱，硅胶薄层色谱检识，合并含有红镰霉素龙胆二糖苷流份，回收溶剂，得黄色粉末2g，即为红镰霉素龙胆二糖苷。
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