CN104119433B - 一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。其制备方法是将全栝楼粉碎，加入蛋白提取液4℃搅拌过夜，随后加入预冷的丙酮低温沉淀蛋白，离心后用蛋白提取液溶解得到栝楼粗蛋白；采用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱对栝楼粗蛋白中抗肿瘤活性组分进行筛选、分离及纯化，得到栝楼抗肿瘤活性蛋白。该蛋白可明显抑制大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF‑7细胞、膀胱癌T24细胞和宫颈癌HeLa细胞的存活，可以在制备抗肿瘤药物中应用。

Description

一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物蛋白的制备和应用，具体属于一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)为葫芦科植物栝楼属多年生藤本植物。别名瓜篓、药瓜、吊瓜。栝楼适应性强，易成活，较耐寒，在我国主要分布于山东，河南，山西等省区。主要以果实和根部入药，在我国是历史悠久的常用中药材。
栝楼的药用部位主要包括瓜蒌、瓜蒌子和天花粉。瓜蒌为栝楼的干燥果实，属于常用中药材，始载于《神农本草经》，性甘、微苦，寒，归肺、胃、大肠经；瓜蒌具有清肺润燥、涤痰宽胸、利气开郁、涤痰散结、甘润解渴、润燥滑肠、清热消肿散结等功效。瓜蒌子又名瓜蒌仁，为栝楼的干燥成熟种子。瓜蒌子单用药最早见于《本草经集注》，性甘、寒，归肺、胃、大肠经。具有润肺化痰，滑肠通便之功效。天花粉为栝楼的块根，始载于《神农本草经》，性甘、微苦、微寒。归肺、胃经。具有清热生津，消肿派脓之功效。栝楼具有多种药理作用，且资源丰富，价格低廉。栝楼的深度开发和有效利用将会带来很高的经济和社会价值。
对现有技术的文献检索发现，目前国内外关于栝楼抗肿瘤活性蛋白的研究报道较少。报道的主要是以天花粉蛋白为代表的核糖体失活蛋白，但由于天花粉蛋白在临床上应用易引起过敏，发热等不良反应，因此其在临床上的应用逐渐减少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的一种栝楼抗肿瘤活性蛋白，通过包括如下步骤的方法制得：
第一步：取全栝楼，研磨粉碎后，加入蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌过夜，离心20分钟后取上清液，即为栝楼蛋白粗提液；离心后的滤渣可重复提取1-2次；所述的蛋白提取液为磷酸缓冲液(1升的磷酸缓冲液体系里含8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O,0.24gKH2PO4,pH7.4)；所述全栝楼和蛋白提取液的质量比为1:4-7，优选为1:5；
第二步：在栝楼蛋白提取液中加入1.5-2倍体积的-20℃预冷的丙酮，沉淀蛋白0.5-1小时，4℃离心，收集沉淀，在-20℃下放置约30-40min，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到栝楼粗蛋白；
第三步：将栝楼粗蛋白用pH7.4的磷酸缓冲液冰上溶解，离心后取上清液，按硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)先加入30％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30min，离心，收集上清液，再向上清液中加入60％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用PH7.4的磷酸缓冲液溶解、透析、浓缩即得到栝楼抗肿瘤粗蛋白；
第四步：将栝楼抗肿瘤粗蛋白用pH7.4的磷酸缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，收集穿透峰。
第五步：将上述穿透液过Sephacryl S-100凝胶凝胶层析柱，用pH7.4的磷酸缓冲液洗脱，收集得到栝楼抗肿瘤活性蛋白。
第一步、第三步、第四步、第五步均在0-4℃条件下进行。
采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量对比，栝楼抗肿瘤活性蛋白的分子量约为60kDa。
经体外抗肿瘤活性检测显示，该栝楼蛋白可明显的抑制大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、膀胱癌T24细胞和宫颈癌HeLa细胞的存活，且对正常细胞没有明显影响。该蛋白可以在制备抗肿瘤药物中应用。
与现有技术相比，本发明获得的抗肿瘤活性的栝楼蛋白经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗肿瘤细胞的活性，而对正常细胞没有明显毒副作用。
附图说明
图1栝楼抗肿瘤活性蛋白SDS-PAGE电泳图(经Sephacryl S-100凝胶层析柱纯化后所得纯蛋白样品，上样量为5μg；图中：G，目的蛋白；M，标准分子量)
图2栝楼抗肿瘤活性蛋白对细胞存活的影响
图3栝楼抗肿瘤活性蛋白的质谱鉴定
具体实施方式
实施例1：栝楼抗肿瘤活性蛋白的制备
(1)取20g全栝楼，研磨粉碎后，加入100mL蛋白提取液(pH7.4的磷酸缓冲液，1L缓冲液中含8g NaCl,0.2g KCl,3.63g Na2HPO4.12H2O,0.24g KH2PO4)，放在搅拌器上搅拌，于4℃冰箱中浸泡并搅拌12-16小时，4℃,11000rpm离心10min后取上清液，即为栝楼蛋白粗提液。
(2)将(1)中获得的栝楼蛋白粗提液中缓慢加入200mL的-20℃下预冷的丙酮，边加边搅拌，将其置于4℃冰箱放置40min沉淀，4℃，11000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，将沉淀置于-20℃中1h，使丙酮完全挥发，将沉淀冷冻干燥，获得栝楼粗蛋白。
(3)将(2)得到的栝楼粗蛋白用10mL pH7.4的磷酸缓冲液冰上溶解，离心(同上)后取上清液，向溶液中逐量缓慢加入1.64g硫酸铵粉末，饱和度达到30％度的静置30min，离心(同上)，收集上清液，再向上清液中缓慢加入1.81g硫酸铵粉末，饱和度达到60％，静置30min，离心(同上)，收集沉淀，用pH7.4的磷酸缓冲液溶解、透析、浓缩即得到栝楼抗肿瘤粗蛋白；
(4)将(3)中的栝楼抗肿瘤粗蛋白用pH7.4的磷酸缓冲液溶解，进行Q阴离子交换层析，用磷酸缓冲液洗脱，收集穿透峰。
(5)将(4)穿透液过Sephacryl S-100凝胶凝胶层析柱，用pH7.4的磷酸缓冲液洗脱,收集洗脱峰，浓缩得到栝楼抗肿瘤活性蛋白(见图1)。
步骤(1)、(3)、(4)、(5)均在0-4℃条件下进行。
实施例2：栝楼抗肿瘤活性蛋白对肿瘤细胞存活的影响
将对数生长期的DLD1、T24、MCF-7、HeLa、NCM460细胞，以3×103个/孔传入96孔培养板。37℃，含5％的CO2培养箱孵育24h后，分别加入实施例1的栝楼抗肿瘤活性蛋白,终浓度分别为5μg/mL，10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL，设六个复孔，并用含相同体积磷酸缓冲液的培养基作为对照。孵育24h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μL DMSO，振荡10min,使结晶物充分融解。在酶标仪上570nm波长处，测定各孔光吸收值。
本发明所得的栝楼抗肿瘤活性纯蛋白，对人几种癌细胞进行上述体外抗肿瘤活性检测，结果表明：该蛋白可明显抑制大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、膀胱癌T24细胞和宫颈癌HeLa细胞的存活，而对人正常肠上皮细胞NCM460生长基本无影响(如图2所示)。
实施例3：栝楼抗肿瘤活性蛋白的鉴定
将纯化出的栝楼抗肿瘤活性纯蛋白送往中国科学院上海生命科学研究院进行质谱鉴定。鉴定结果显示，该栝楼抗肿瘤蛋白跟罗汉果属中的黄瓜素同源性为100％(如图3所示)。

Claims (2)

1.一种栝楼抗肿瘤活性蛋白，其特征在于，通过由如下步骤组成的方法制得：
第一步：取全栝楼，研磨粉碎后，加入蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌过夜，离心20分钟后取上清液，即为栝楼蛋白粗提液；离心后的滤渣重复提取1-2次；所述的全栝楼和蛋白提取液的质量比为1:5；
所述的蛋白提取液为磷酸缓冲液，所述的磷酸缓冲液为pH7.4的1升的磷酸缓冲液体系里含8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O,0.24g KH2PO4；
第二步：在栝楼蛋白提取液中加入1.5-2倍体积的-20℃预冷的丙酮，沉淀蛋白0.5-1小时，4℃离心，收集沉淀，在-20℃下放置约30-40min，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到栝楼粗蛋白；
第三步：将栝楼粗蛋白用pH7.4磷酸缓冲液冰上溶解，离心后取上清液，按0℃条件下的硫酸铵溶液饱和度计算表，先加入30％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30min，离心，收集上清液，再向上清液中加入60％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用pH7.4的磷酸缓冲液溶解，然后将其装入透析袋中，置于4℃去离子水中透析48小时，浓缩即得到栝楼抗肿瘤粗蛋白；
第四步：将栝楼抗肿瘤粗蛋白用pH 7.4的磷酸缓冲液溶解，离心后取上清液，过Q阴离子交换层析柱，收集穿透峰；
第五步：将上述穿透液浓缩加入到Sephacryl S-100凝胶过滤柱中，然后用pH7.4的磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，冷冻干燥，纯化得到抗肿瘤活性蛋白。
2.如权利要求1所述的一种栝楼抗肿瘤活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
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