CN105566476A - 一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法 - Google Patents

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马晓东
李重九
万飞飞
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Abstract

本发明公开了属于生物技术领域的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法。所述制备方法的步骤为：林蛙油干品的泡发，林蛙油中粗蛋白的提取，林蛙油粗蛋白的沉淀和林蛙油中抗氧化蛋白的分离。所述的制备方法简单、高效、安全而且重复性好；用该方法获得的抗氧化蛋白溶液，具有安全、高效、活性高的特点，用邻苯三酚法测定的其抑制率在45×10-2以上，用胰蛋白酶对其进一步酶解后获得了三种抗氧化活性蛋白，分别为Q6DDC2、F6UKQ6和Q28E35；将获得的抗氧化蛋白直接包装或经过冷冻干燥后得到林蛙油蛋白成品，可广泛用于食品、保健品和食品添加剂中。

Description

一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法。
背景技术
林蛙是集食、药、补等多方面用途于一体的珍贵经济蛙种，在我国主要分布在东北、华北及西部地区。林蛙雌蛙的输卵管经采制干燥即为林蛙油，俗称雪蛤膏、哈蟆油，在我国有上千年的历史，医学上素有“软黄金”、“动物人参”之美誉。林蛙油的成分较为复杂，包括蛋白质、脂肪酸类、激素类、磷脂类、固醇类、维生素类、核酸类物质以及多种微量元素等，其中主要成分为蛋白质，占总量的56.13％。
林蛙油具有比较广泛的药用功效，至今已有许多关于林蛙油药理活性的研究。在林蛙油的抗氧化药理研究方面主要得到以下结论：林蛙油具有体外抑制小鼠肝匀浆内过氧化脂质生产，延长果蝇的平均寿命且使果蝇在低温下的存活率提高，使小白鼠肝、脑过氧化脂质含量下降，血浆超氧化物歧化酶(SOD)的活性增高等作用。对林蛙油也做过小鼠活体实验，用其对急性衰老的小鼠进行灌胃后，小鼠血清中的SOD、GSH-PX的活性有所提高，肝组织中MAD的量降低。
所以林蛙油具有极高的营养和保健价值，对林蛙油中的抗氧化活蛋白的提取方法亟待开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，所述的制备方法为：将泡发后的林蛙油用液氮研磨成粉，加入裂解液裂解后并进一步采用超声裂解，然后加入磷酸缓冲液、蛋白酶抑制剂和核酸酶，浸泡后离心，收集上清液；在上清液中加入硫酸铵，充分沉淀后，离心，收集沉淀；将沉淀用磷酸缓冲液溶解后，通过葡聚糖凝胶G-100柱层析分离，收集分离组分，得到具有林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。
所述制备方法的具体步骤如下：
(1)林蛙油干品的泡发：在林蛙油干品中加入纯净水，于2-6℃下泡发8-16h，获得泡发后的林蛙油；
(2)林蛙油中粗蛋白的提取：泡发后的林蛙油在液氮中研磨至粉末，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上孵育20-40min，然后采用超声法对其进一步裂解，获得林蛙油裂解液；向林蛙油裂解液中加入磷酸缓冲液、蛋白酶抑制剂和核酸酶，在温度为2-6℃下，浸泡8-16h后，离心收集上清，获得林蛙油粗蛋白提取液；
首先用液氮研磨使泡发后的林蛙油组织块分散；其次使用裂解液处理，裂解液中的表面活性剂破坏脂质双分子层，破裂细胞并溶解蛋白，裂解液中含有的蛋白酶抑制剂能抑制蛋白酶活性；最后用超声粉碎进一步破碎，使细胞器及细胞核内的蛋白释放出来；超声粉碎时会产生大量热量，导致蛋白变性断裂，因此超声不宜过于剧烈，并在冰浴条件下超声；若超声时管壁发热，则冰浴冷却后再继续超声
(3)林蛙油粗蛋白的沉淀：向林蛙油粗蛋白提取液中加入硫酸铵固体，使硫酸铵的终浓度为20-30％，并搅拌使酸铵固体完全溶解后，于2-6℃下静置8-16h，离心收集沉淀，获得林蛙油粗蛋白；
(4)林蛙油中抗氧化蛋白的分离：将林蛙油粗蛋白用磷酸缓冲液溶解后，采用葡聚糖凝胶G-100柱层析分离，收集柱流出物为150-200mL部分的液体，得到林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。
步骤(2)中所述超声法裂解的条件为：超声功率为250-350W，超声模式为间隔2-3s超声2-3s，累计超声时间为2-3min。
所述磷酸缓冲液的浓度为10-100mmol/L，pH为7。
步骤(2)与步骤(3)中所述离心的转速为8000-12000rpm/min，离心15-25min。
所述葡聚糖凝胶G-100柱层析分离的条件为：层析柱的规格为1.6×100cm，洗脱液为纯水，洗脱液流速为8-12cm/h。
所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法所制备的抗氧化蛋白溶液，其特征在于，所述的抗氧化蛋白溶液用邻苯三酚法测定，抑制率大于45×10-2。
所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法所制备的抗氧化蛋白溶液，其特征在于，所述的抗氧化蛋白溶液用胰蛋白酶解后获得了三种抗氧化活性蛋白，分别为Q6DDC2、F6UKQ6和Q28E35。
本发明的有益效果为：所述的制备方法简单、高效、安全而且重复性好；用该方法获得的抗氧化蛋白溶液，具有活性高的特点，用邻苯三酚法测定的抑制率在45×10-2以上，用胰蛋白酶对其进一步酶解后获得了三种抗氧化活性蛋白，分别为Q6DDC2、F6UKQ6和Q28E35，将获得的抗氧化蛋白直接包装或经过冷冻干燥后得到林蛙油蛋白成品，可广泛用于食品、保健品和食品添加剂中。
附图说明
图1为林蛙油中抗氧化活性蛋白Q6DDC2的二级质谱图。
图2为林蛙油中抗氧化活性蛋白F6UKQ6的二级质谱图。
图3为林蛙油中抗氧化活性蛋白Q28E35的二级质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的胰蛋白酶购于西格玛奥德里奇贸易有限公司。
实施例1：林蛙油中抗氧化蛋白溶液的提取及活性鉴定
(1)林蛙油干品的泡发
取1g林蛙油干品，加入200mL纯净水，于4℃下泡发过夜，获得泡发后的林硅油；经泡发后的林蛙油色泽偏白，肉厚，带有清淡的鱼腥味，体积为干品的40-60倍。
(2)林蛙油中粗蛋白的提取
取泡发后的林硅油放入研钵中，加入液氮研磨至粉末，加入100mL裂解液和1mL蛋白酶抑制剂，冰上孵育30min，然后采用超声法对其进一步裂解，超声功率为300W，超声模式为间隔2s超声2s，累计超声时间为2min，获得林蛙油裂解液；
向林蛙油裂解液加入200mL10mmol/L磷酸缓冲液(pH＝7)，配制成林蛙油组织悬浊液，然后加入1mL蛋白酶抑制剂和50μL核酸酶混匀，4℃下静置过夜，10000rpm/min离心20min，弃去沉淀，收集上清液，获得林蛙油粗蛋白提取液。
(3)林蛙油粗蛋白的沉淀
向林蛙油粗蛋白提取液中加入硫酸铵固体，使其浓度为25％，搅拌使硫酸铵完全溶解，4℃下静置过夜，10000rpm/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀，获得林蛙油粗蛋白。
(4)林蛙油中抗氧化蛋白的分离
在规格为1.6×100cm的层析柱中填充葡聚糖凝胶G-100，以纯水作为洗脱液，用恒流泵调节其流速为10cm/h；将林蛙油粗蛋白用10mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7)溶解后，将其加入到层析柱后，收集柱流出物150-200mL部分的液体，得到林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。
(5)林蛙油中抗氧化蛋白溶液活性的测定
获得的林蛙油中抗氧化蛋白溶液用邻苯三酚法测定其抗氧化活性，测得的抑制率为47.35×10-2。
获得的林蛙油中抗氧化蛋白溶液经胰蛋白酶液酶解后，用高效液相色谱-质谱联用检测。高效液相色谱条件中，流动相A为0.1％甲酸的水溶液，B为含有0.08％甲酸的80％的乙腈水溶液，梯度洗脱。样品经过高效液相色谱分离后，再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片；其中，碰撞能量为35.0V，碰撞方式为CID，然后经过质谱仪中IonTrap质量分析器检测得到质谱图。扫描模式为Top-speed，cycletime3s，动态排除60s，扫描范围为350.0-1800.0m/z。通过检索蛋白数据库分析质谱图，发现了三种活性蛋白，分别为Q6DDC2、F6UKQ6和Q28E35，三种活性蛋白的氨基酸序列见表1，二级质谱图见图1-3。
表1：三种活性蛋白(Q6DDC2、F6UKQ6、Q28E35)的氨基酸序列

Claims (8)

1.一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为：将泡发后的林蛙油用液氮研磨成粉，加入裂解液裂解后并进一步采用超声裂解；然后加入磷酸缓冲液、蛋白酶抑制剂和核酸酶，浸泡后离心，收集上清液；在上清液中加入硫酸铵，充分沉淀后，离心，收集沉淀；将沉淀用磷酸缓冲液溶解后，通过葡聚糖凝胶G-100柱层析分离，收集分离组分，得到具有林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
(1)林蛙油干品的泡发：在林蛙油干品中加入纯净水，于2-6℃下泡发8-16h，获得泡发后的林蛙油；
(2)林蛙油中粗蛋白的提取：泡发后的林蛙油在液氮中研磨至粉末，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上孵育20-40min，然后采用超声法对其进一步裂解，获得林蛙油裂解液；向林蛙油裂解液中加入磷酸缓冲液、蛋白酶抑制剂和核酸酶，在温度为2-6℃下，浸泡8-16h后，离心收集上清，获得林蛙油粗蛋白提取液；
(3)林蛙油粗蛋白的沉淀：向林蛙油粗蛋白提取液中加入硫酸铵固体，使硫酸铵的终浓度为20-30％，并搅拌使酸铵固体完全溶解后，于2-6℃下静置8-16h，离心收集沉淀，获得林蛙油粗蛋白；
(4)林蛙油中抗氧化蛋白的分离：将林蛙油粗蛋白用磷酸缓冲液溶解后，采用葡聚糖凝胶G-100柱层析分离，收集柱流出物为150-200mL部分的液体，得到林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。
3.根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述超声法裂解的条件为：超声功率为250-350W，超声模式为间隔2-3s超声2-3s，累计超声时间为2-3min。
4.根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的浓度为10-100mmol/L，pH为7。
5.根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)与步骤(3)中所述离心的转速为8000-12000rpm/min，离心15-25min。
6.根据权利要求2所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶G-100柱层析分离的条件为：层析柱的规格为1.6×100cm，洗脱液为纯水，洗脱液流速为8-12cm/h。
7.权利要求1-6任一项所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法所制备的抗氧化蛋白溶液，其特征在于，所述的抗氧化蛋白溶液用邻苯三酚法测定，抑制率大于45×10-2。
8.权利要求1-6任一项所述的一种林蛙油中抗氧化蛋白的制备方法所制备的抗氧化蛋白溶液，其特征在于，所述的抗氧化蛋白溶液用胰蛋白酶解后获得了三种抗氧化活性蛋白，分别为Q6DDC2、F6UKQ6和Q28E35。
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