CN103908482A - 一种灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物乙酸乙酯提取物及其制备方法和应用，所述提取物由以下方法制备：灰毡毛忍冬用石油醚浸泡，然后用石油醚渗滤，回收残渣，挥干残渣中的溶剂，将残渣用乙醇回流提取，提取液浓缩，然后用乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物。经过体外试验，发现本发明提供的灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物可抑制EGFR激酶活性，效果明显，即可抗皮肤肿瘤、白血病、结肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤。

Description

一种灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药提取物，具体涉及一种灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物及其制备方法和应用。

背景技术

灰毡毛忍冬是忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz的干燥花蕾或带初开的花，2010年版中国药典将其与红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera Confusa DC.、黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花一同列入山银花项下。

灰毡毛忍冬具有清热解毒，疏散风热之功效，主要分布于我国贵州、四川、湖南、广西、福建等地。化学成分主要有酚酸类、黄酮类、皂苷类等。酚酸类化合物主要为咖啡酸(caffeic acid),绿原酸(chlorogenic acid)等；黄酮类化合物主要为木犀草素(luteolin)和槲皮素(quercetin)及其苷类；皂苷类主要为灰毡毛忍冬次皂苷乙(macranthoside B)和川续断皂苷乙(dipsacoside B)。具有抗菌、抗炎、调节免疫等药理作用。

关于灰毡毛忍冬的提取物方面，有如下报道：

CN200610046198.2公开了一种含忍冬藤提取物的药物的制备方法，具体为：取1000g忍冬藤药材，第一次加10－12倍量水煎煮1－2小时，第二次加6-8倍量水煎煮1小时，合并滤液，过滤，浓缩至每1ml相当于原生药量0.5-1.0g的提取液备用。2.纯化：取上述制备好的忍冬藤提取液用离心机高速离心，取离心液用聚酰胺柱吸附，先用水洗至流出液无色，再用3-6倍柱体积量50-80%乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，减压回收乙醇，加注射用水稀释至每1ml相当于原生药0.5-1.0g，用截留分子量1万-3万的超滤膜超滤，超滤液减压浓缩并干燥，得到忍冬藤纯化提取物。

CN200810235536.6公开了一种山银花提取物，该提取物的主要成分为灰毡毛忍冬次皂苷乙、灰毡毛忍冬次皂苷甲、3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基－常春藤皂苷元和3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-4)-β-D-吡喃葡萄糖基(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基－齐墩果酸。以及该类化合物的制备方法，和其在癌症方面的应用。该产品的制备方法是所述癌症为肝癌、肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、直肠癌、结肠癌、腹水癌、前列腺癌、骨癌或白血病等。

尚未见到灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物及其应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物。

本发明提供的一种灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物，由以下方法制备：灰毡毛忍冬用石油醚浸泡，然后用石油醚渗滤，回收残渣，挥干残渣中的溶剂，用乙醇回流提取，提取液浓缩，然后用乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物。

优选地，所述灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物由以下方法制备：取灰毡毛忍冬粉碎，用灰毡毛忍冬重量3-8倍体积的石油醚浸泡12-36h，用石油醚渗滤，得到灰毡毛忍冬重量3-7倍体积的渗滤液，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后将残渣用灰毡毛忍冬重量3-7倍量体积的浓度为60-90%的乙醇提取2次，每次1-2小时，合并两次提取液，浓缩至无醇味，得乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得乙酸乙酯提取物。

进一步优选，所述灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物由以下方法制备：取灰毡毛忍冬粉碎，用灰毡毛忍冬重量3-5倍体积的石油醚浸泡18-30h，用石油醚渗滤，得到灰毡毛忍冬重量5-7倍体积的渗滤液，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后将残渣用灰毡毛忍冬重量3-5倍量体积的浓度为70-85%的乙醇提取2次，每次1-2小时，合并两次提取液，浓缩至无醇味，得乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得乙酸乙酯提取物。

更进一步优选，所述灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物由以下方法制备：取灰毡毛忍冬粉碎，用灰毡毛忍冬重量3倍体积的石油醚浸泡24h，用石油醚渗滤，得到灰毡毛忍冬重量5倍体积的渗滤液，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后将残渣用灰毡毛忍冬重量3倍量体积的浓度为80%的乙醇提取2次，每次2小时，合并两次提取液，浓缩至无醇味，得乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得乙酸乙酯提取物。

本发明还提供了一种制备上述灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物的方法，该方法包括以下步骤：灰毡毛忍冬用石油醚浸泡，然后用石油醚渗滤，回收残渣，挥干残渣中的溶剂，将残渣用乙醇回流提取，提取液浓缩，然后用乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物。

本发明还提供了含上述灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物的制剂，由所述提取物单独制成或由该提取物和药学上可接受的载体组成。

所述制剂为散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。

所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。

所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；

所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、水、糊精、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；

所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；

所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁；

所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇；

所述润湿剂选自甘油、吐温-80、乙氧基氢化蓖麻油或卵磷脂；

所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等；

所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯（吐温）等；

所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、柠檬酸或糖精钠。

本发明还提供了灰毡毛忍冬的乙酸乙酯的检测方法，是用超高效液相色谱-四极杆联合飞行时间串联质谱分析方法（UPLC/Q-TOF-MS分析方法）以获得提取物的指纹图谱。其色谱分析条件为：WatersACQUITY UPLC^TMBEH C18Column(50mm×2.1mm.i d.,1.7μm)色谱柱；二元梯度洗脱，A相为0.4%甲酸水溶液，B相为乙腈，流速0.4mL/min；进样量3μL。质谱条件为电喷雾离子源，正离子模式检测。

优选地，所述色谱条件：Waters ACQUITY UPLC^TMBEH C18Column(50mm×2.1mm.i d.,1.7μm)柱；二元梯度洗脱见下表，其中A相为0.4%甲酸水溶液，B相为乙腈，流速0.4mL/min；进样量3μl，

所述质谱条件：ESI离子源，正离子模式检测；雾化器N₂压力50psi;干燥气N₂，流速15L/min;质量扫描范围50-1200；自动3级质谱；脱溶剂气流量为800L/h，脱溶剂气温为450℃，锥孔气流为50L/h，离子源温度为120℃，毛细管电压为3kV，锥孔电压为40V。

经液相色谱-质谱联机分析，灰毡毛忍冬提取物中的主要成分是黄酮及酚酸类，包括3,5-二咖啡酰奎尼酸、咖啡酸、柏黄酮等。

本发明还提供了灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物在制备治疗皮肤肿瘤、白血病、结肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌的药物中的应用。

本发明提供的灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物具有以下优点：

1、本发明首次提供了灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物，该提取物是由以下方法制备：灰毡毛忍冬石油醚浸泡，然后渗滤，得到的残渣用乙醇提取，提取液用乙酸乙酯萃取，即得。该方法与现有的溶剂如用乙醇提取，然后用乙酸乙酯萃取有明显区别。

2、应用UPLC-Ｑ-TOF-MS分析灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物，其主要成分为3，5-二咖啡酰奎尼酸、咖啡酸、扁柏黄酮。

3、经过试验证实，本发明提供的灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物具有抗肿瘤，尤其是皮肤肿瘤、白血病、结肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌，效果优于水提、醇提。

附图说明

图1：灰毡毛忍冬提取物UPLC-ESI-MS(+)分析总离子流色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

所述石油醚为60-90℃的石油醚。

如无特殊说明，本发明所述乙醇浓度为体积比。

实施例1：灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物

将灰毡毛忍冬粉碎，过35目筛（粒径为500μm），取粗粉500克，用1500ml的石油醚浸泡24小时，然后用石油醚渗滤，渗滤提取至提取液颜色浅（即得到灰毡毛忍冬重量5倍体积，约2500ml的渗滤液），回收残渣，挥干残渣中的溶剂，然后用浓度为80%乙醇回流提取两次，每次使用1500ml的乙醇，每次提取时间为2小时，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取2次，收集上层清液，合并清液浓缩至干，即得乙酸乙酯萃取物1.1g（收率为0.22%）。

实施例2：灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物

取灰毡毛忍冬粉碎，过20目筛（粒径为840μm），用1500ml的石油醚浸泡16h，用石油醚渗滤，得到3000ml的渗滤液和残渣，将残渣挥干石油醚，然后将残渣用2000ml浓度为70%的乙醇提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取2次，收集上层清液，合并清液浓缩至干，即得乙酸乙酯提取物1.16g（收率为0.232%）。

实施例3：灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物

取灰毡毛忍冬粉碎，过45目筛（粒径为350μm），用2500ml的石油醚浸泡36h，用石油醚渗滤，得到3500ml的渗滤液和残渣，将残渣挥干石油醚，然后将残渣用2500ml浓度为85%的乙醇提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压回收乙醇至无醇味，得到乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取2次，收集上层清液，合并清液浓缩至干，即得乙酸乙酯提取物1.275g（收率为0.255%）。

实施例4：含灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物的片剂

1、组成：灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物（实施例1提供）50g，淀粉15g，微晶纤维素20g，硬脂酸镁6g。

2、制备方法：按照配比称取各成分，混合均匀，直接压片。

实施例5：含灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物的片剂

1、组成：灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物（实施例2提供）50g、淀粉15g、糊精20g、硬脂酸镁6g。

2、制备方法：按照配比称取各成分，粉碎过100目筛，混合均匀，即为散剂。

实施例6：含灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物的胶囊剂

1、组成：灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物（实施例3提供）50g，淀粉15g，微晶纤维素20g，硬脂酸镁6g。2、制备方法：按照配比称取各成分，按照常规方法制粒、整理，填充入胶囊中，即为胶囊剂。

实验例1：效果试验

1、实验机理：应用高通量药物筛选技术，筛选发现具有EGFR激酶抑制活性的中药提取物，采用均相时间分辨荧光(HTRF)法测酶的活性，加入ATP后启动反应，激酶使底物发生磷酸化反应，将磷酸根连接在有生物素标记的底物上。在这个过程中EDTA终止了反应的进行，有铕元素标记抗磷酸化酪氨酸抗体靠近底物的磷酸根上，标记XL665的异藻蓝蛋白结合在底物的生物素标记上，两个荧光基团在互相靠近的过程中发生能量共振转移并在665nm处产生荧光，游离的TK antibody(标记铕离子)在620nm处发生荧光，此信号可作为背景信号，而游离的SA-XL665只产生短暂的荧光，通过延后检测时间即加入终止剂后1小时再进行检测，可将其忽略。最终仪器给出的信号值由下列公式进行计算：

Ratio=(665nm/620nm)×10⁴

2、实验分组：

分为阳性对照组（即EGFR激酶十字孢碱（Staurosporine）），实施例1-3组、灰毡毛忍冬的石油醚提取物（简称石油醚提取物）、灰毡毛忍冬的醇提物1（简称醇提物1）、灰毡毛忍冬的醇提物2（简称醇提物2）、灰毡毛忍冬的水提物（简称水提物），其中：

所述石油醚提取物由以下方法制备；将灰毡毛忍冬粉碎，过35目筛（粒径为500μm），取粗粉500克，用1500ml的石油醚浸泡24小时，然后用石油醚渗滤，渗滤提取至提取液颜色浅，得到灰毡毛忍冬重量5倍体积，约2500ml的渗滤液，浓缩渗滤液至干，即得石油醚提取物；

所述醇提物1参考CN200810235536.6，其由以下方法制备：灰毡毛忍冬花及花蕾，用8倍体积的浓度为60%的乙醇，在90℃提取，提取液回收溶剂至原体积的五分之一，降温至0℃，过滤得滤液，滤液加8%的氢氧化钾，在80℃水解10小时，冷却后用正丁醇萃取，正丁醇萃取液用正丁醇饱和的pH值为13的碱性水溶液反萃取、将反萃取后的正丁醇溶液调节pH值为7，回收正丁醇溶液，即得醇提物1；

所述醇提物2：将灰毡毛忍冬粉碎，过35目筛（粒径为500μm），取粗粉500克，用1500ml的石油醚浸泡24小时，然后用石油醚渗滤，渗滤提取至提取液颜色浅（即得到灰毡毛忍冬重量5倍体积，约2500ml的渗滤液），回收残渣，挥干残渣中的溶剂，然后用浓度为80%乙醇回流提取两次，每次使用1500ml的乙醇，每次提取时间为2小时，合并提取液，回收乙醇至提取液无醇味，浓缩至干，即得醇提物2；

所述水提物，由以下方法制备：将灰毡毛忍冬粉碎，过35目筛（粒径为500μm），取粗粉500克，用1500ml的石油醚浸泡24小时，然后用石油醚渗滤，渗滤提取至提取液颜色浅（即得到灰毡毛忍冬重量5倍体积，约2500ml的渗滤液），回收残渣，挥干残渣中的溶剂，然后用浓度为80%乙醇回流提取两次，每次使用1500ml的乙醇，每次提取时间为2小时，得到提取液和残渣，将残渣挥干乙醇，然后用1500ml水煎煮2次，煎煮时间为2小时，合并煎煮液，浓缩至干，得水提取液。

4、实验方法：在384孔板中进行，用PP-550MS移液器转移液体，在反应容器中每孔加入EGFR激酶溶液2μl，底物溶液(HTRFKinEASE-TK,3瓶*500mg,每瓶用蒸馏水稀释至500μM)2μl，缓冲液（MgCl₂、MnCl₂、DTT）或待筛化合物4μl，ATP2μl。反应1小时，每个板384孔。

每孔加入TK-Ab5μl，SA-XL6655μl，室温孵育1小时。利用Beckman Coulter检测平台HTRF模块进行检测。EGFR激酶非选择性抑制剂十字孢碱(Staurosporine)，以检验方法的可靠性。

初筛灰毡毛忍冬提取物，计算抑制率后对高活性样品进行复筛。复筛时每个样品依次稀释为5个浓度，实验重复三次，分别为50μg·mL^-1，5μg·mL^-1，0.5μg·mL^-1，0.05μg·mL^-1，0.005μg·mL^-1。

5、根据测定结果计算IC₅₀。

$\mathrm{Inh}\%=\frac{100\%\mathrm{Activity}-\mathrm{Sample}}{100\%\mathrm{Activity}-0\%\mathrm{Activity}}\×100\%$

6、试验结果：见表1

表1灰毡毛忍冬不同部位EGFR激酶抑制率和IC₅₀值

表1结果显示：石油醚提取物醇提取物、醇提物1、2、水提物的抑制率较低，而本发明提供的实施例1-3各组和阳性对照组的抑制率达到了90%以上。

结果表明：本发明提供的灰毡毛忍冬乙酸乙酯提取物具有抑制EGFR激酶的作用。

讨论：EGFR属于酪氨酸激酶Ⅰ型受体家族，是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，是原癌基因Cerb-1的表达产物。EGFR与配体表皮生长因子、转化生长因子结合后可激活受体酪氨酸激酶，导致受体本身及细胞内酪氨酸残基的磷酸化，从而引起细胞分裂增殖。研究表明抑制EGFR酪氨酸激酶活性，可抑制皮肤肿瘤、白血病、结肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤生长，抗EGFR酪氨酸激酶的药物能选择性地作用于细胞内的靶目标，阻断EGFR功能，抑制肿瘤进展，可单独应用或与传统抗癌方案联合来治疗肿瘤。

实施例2：质量控制方法

1、实验试剂

甲醇为色谱纯，美国Fisher公司;

超纯水，实验室ELGA PURELAB Classic-UVF纯水机进行超纯水制备，产地为英国；

其他试剂均为市售国产分析纯；

2、实验仪器与条件

美国Waters AcquityTM UPLC/Q-TOF Premier;MassL-ynxV4.1工作站。

色谱条件为：85%A相，逐渐减少A相比例，至14min时A相比例为0，保持2min，流速：0.4mL/min；进样量3μL。

质谱条件：ESI离子源，正离子V模式检测；雾化器N₂压力50psi;干燥气N₂，流速15L/min;质量扫描范围50-1200；锥孔气流为50L/h，脱溶剂气流量为800L/h，脱溶剂气温为450℃，离子源温度为120℃，毛细管电压为3kV，锥孔电压为40V，自动3级质谱。（自动选择最强离子进行源内诱导裂解）。

3、结果与分析：见图1

图1为灰毡毛忍冬提取物UPLC-ESI-MS(+)分析总离子流色谱图，对色谱中的指纹信息进行分析即的表2内容：

表2：灰毡毛忍冬提取物的总离子流色谱峰组分指纹信息

NO	保留时间tR/min	M/S	分子式	化合物
					1	0.91	365.0989	C21H16O6	-
2	1.66	181.1502	C9H8O4	咖啡酸
					3	3.17	163.0455	C9H6O3	七叶内酯
4	4.34	303.2325	C15H10O7	槲皮素

5	4.74	499.1216	C25H24O12	3,5-二咖啡酰奎尼酸
					6	6.10	539.0980	C30H18O10	扁柏黄酮
7	8.11	518.3229	C21H50O12	-
					8	9.07	355.3110	C16H18O9	绿原酸
9	9.75	415.6879	C29H50O	β-谷甾醇
					10	10.36	149.0143	C4H4O6	-
11	11.14	340.2562	C20H35O4	-

表2结果显示：Q-TOF/MS测定的相对分子质量及正离子信息鉴定灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物中11个化合物，其中：7个分别是咖啡酸（caffeic acid），七叶内酯(esculetin)，槲皮素（quercetin），3,5-二咖啡酰奎尼酸（3,5-O-dicaf feoylquinic acid），扁柏黄酮（hinokiflavone），绿原酸（chlorogenic acid），β-谷甾醇（β-sitosterol）；剩余4个成分未知。

结果表明：灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物中3,5-二咖啡酰奎尼酸（3,5-O-dicaf feoylquinic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、扁柏黄酮（hinoki flavone）为主要成分。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物，其特征在于，所述提取物由以下方法制备：灰毡毛忍冬用石油醚浸泡，然后用石油醚渗滤，回收残渣，挥干残渣中的溶剂，将残渣用乙醇回流提取，提取液浓缩，然后用乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，提取物由以下方法制备：取灰毡毛忍冬粉碎，用灰毡毛忍冬重量3-8倍体积的石油醚浸泡12-36h，用石油醚渗滤，得到灰毡毛忍冬重量3-7倍体积的渗滤液，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后将残渣用灰毡毛忍冬重量3-7倍量体积的浓度为60-90%的乙醇提取2次，每次1-2小时，合并两次提取液，浓缩至无醇味，得乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得乙酸乙酯提取物。

3.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述提取物由以下方法制备：取灰毡毛忍冬粉碎，用灰毡毛忍冬重量3-5倍体积的石油醚浸泡18-30h，用石油醚渗滤，得到灰毡毛忍冬重量5-7倍体积的渗滤液，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后将残渣用灰毡毛忍冬重量3-5倍量体积的浓度为70-85%的乙醇提取2次，每次1-2小时，合并两次提取液，浓缩至无醇味，得乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得乙酸乙酯提取物。

4.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物由以下方法制备：取灰毡毛忍冬粉碎，用灰毡毛忍冬重量3倍体积的石油醚浸泡24h，用石油醚渗滤，得到灰毡毛忍冬重量5倍体积的渗滤液，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，然后将残渣用灰毡毛忍冬重量3倍量体积的浓度为80%的乙醇提取2次，每次2小时，合并两次提取液，浓缩至无醇味，得乙醇浓缩液，然后用与浓缩液等体积的乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得乙酸乙酯提取物。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述的提取物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：灰毡毛忍冬用石油醚浸泡，然后用石油醚渗滤，回收残渣，挥干残渣中的溶剂，将残渣用乙醇回流提取，提取液浓缩，然后用乙酸乙酯萃取，收集上层清液，即得灰毡毛忍冬的乙酸乙酯提取物。

6.含权利要求1-4任一项所述的提取物的制剂，其特征在于，该制剂由所述提取物单独制成或由所述提取物和药学上可接受的载体组成。

7.权利要求1-4任一项所述的提取物的检测方法，其特征在于，该方法是用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析以获得提取物的指纹图谱。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，该方法的色谱分析条件为：Waters ACQUITY UPLC^TMBEH C18 Column(50mm×2.1mm.id.,1.7μm)色谱柱；二元梯度洗脱，A相为0.4%甲酸水溶液，B相为乙腈，流速0.4mL/min；进样量3μL；质谱条件为电喷雾离子源，采用正离子模式检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC^TMBEH C18 Column(50mm×2.1mm.id.,1.7μm)色谱柱；二元梯度洗脱见下表，A相为0.4%甲酸水溶液，B相为乙腈，流速0.4mL/min；进样量3μL，

质谱条件：ESI离子源，正离子V模式检测；雾化器N₂压力50psi;干燥气N₂，流速15L/min；质量扫描范围50-1200；自动3级质谱；脱溶剂气流量为800L/h，脱溶剂气温为450℃，锥孔气流为50L/h，离子源温度为120℃，毛细管电压为3kV，锥孔电压为40V。

10.权利要求1-4任一项所述的提取物或权利要求6所述制剂在制备皮肤肿瘤、白血病、结肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌的药物中的应用。