CN103690534B

CN103690534B - 灵菌红素在防控家蚕核型多角体病毒病中的应用

Info

Publication number: CN103690534B
Application number: CN201310640377.9A
Authority: CN
Inventors: 周围; 张琳; 冯丽春; 敖翔; 李精华; 万永继
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-12-04
Also published as: CN103690534A

Abstract

本发明涉及一类小分子化合物灵菌红素（Prodiginine，PG）抑制BmNPV的作用，以及在防控家蚕核型多角体病毒病中的应用。细胞试验显示，PG在0.01-0.8μg/L浓度范围内可干扰BmNPV在细胞中的增殖，阻止病毒多角体形成；在1-300μg/L浓度范围内可选择性的导致感染BmNPV的家蚕细胞死亡，其死亡率超过97%；PG在上述使用范围内对家蚕正常细胞不表现出毒性。个体试验显示，灵菌红素在浓度范围1-10mg/只经口添饲家蚕，能使核型多角体病毒病病蚕停止进食并提前死亡，易于淘汰染病病蚕，同时对健康个体不表现出毒性。利用灵菌红素抑制BmNPV增殖及多角体的形成，同时具有加速核型多角体病毒病病蚕死亡的作用，防止并有效控制家蚕核型多角体病毒病的扩散。

Description

灵菌红素在防控家蚕核型多角体病毒病中的应用

技术领域

本发明涉及兽用药物领域，具体涉及灵菌红素在防控家蚕核型多角体病毒病中的应用。

背景技术

养蚕业作为我国传统养殖业，是多个地区农民的重要经济收入来源。2011年，我国蚕茧产量为63.74万吨，产值为218.7亿元，丝绸工业产值为2037.9亿元。家蚕密集饲养易感病，蚕病每年给养蚕业带来的损失约占蚕业生产总产值的20%，其中病毒性蚕病占总损失的八成左右，尤其以家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）造成的血液型脓病危害最为严重。基于14个省91个县1782个农户的调查显示，家蚕核型多角体病毒病近年来发生范围广，其中86.92%的农户在养蚕过程中曾遭遇此病并造成大量减收（李建琴等. 蚕业科学，2013，39（2）：355-364），甚至导致部分农户或一定养蚕区域绝产。

BmNPV属杆状病毒科，核型多角体病毒（NPV）属，其整个生活史可分为出芽型病毒（BV）和包涵型病毒（ODV），在感染末期的细胞核中可观察到包被ODV的多角体形成。不同于其它类型的动物病毒，NPV通过宿主细胞微丝骨架在细胞内或细胞间进行快速移动，病毒接种1h便可从细胞膜进入细胞核内，起始病毒基因的表达。其次，NPV采取不重复感染的策略进行快速传播，即有大量病毒感染同一个宿主细胞时，绝大部分病毒通过直接出芽的方式在细胞间大量扩散，转而感染相邻细胞（Ohkawa等. Journal of Cell Biology，2010，190（2）：187-195）。此外， NPV还能通过昆虫的血淋巴以及气管系统在宿主各组织间迅速传播。自然情况下，家蚕通过食下病毒多角体发生感染。NPV高效而迅速的感染特性使家蚕食入病毒多角体后在较短的时间内即可发展为全身感染。BmNPV增殖极快，具有当龄感染当龄发病的特征，家蚕感染后体内形成大量多角体，血液呈乳白色浓汁状，死亡时体壁破裂污染蚕座并成为传染源。由于BmNPV传染性极强，密集饲养过程中因为各种原因导致家蚕感染BmNPV，即使同一蚕座内仅有少量个体感染也容易引起大面积流行。如何去除传染源是家蚕核型多角体病毒病防控中最关键最棘手的问题。目前的应对措施主要是养蚕期间的体外消毒。但实际饲养过程中发生BmNPV感染后则无有效方法抑制病毒多角体形成，或有目的地淘汰患病个体。

灵菌红素（Prodigiosin，PG）是一类天然红色素的总称，属于沙雷氏菌等微生物产生的次生代谢产物，具有抗菌、抗肿瘤、抗原虫、免疫调节等多种生物学活性。但灵菌红素对病毒BmNPV的抑制作用即对家蚕核型多角体病毒病的防控作用尚无研究报道。

发明内容

本发明提供灵菌红素在防控家蚕核型多角体病毒病中的应用及使用方法。

本发明的目的第一是将小分子化合物灵菌红素作为家蚕核型多角体病毒的抑制剂。

所述的家蚕核型多角体病毒抑制剂包括含有灵菌红素的固态或液态制剂。

本发明涉及的灵菌红素在体外实验中，其浓度范围0.01-0.8 μg/L可干扰BmNPV在细胞中的正常增殖，阻止病毒多角体形成，多角体形成率低于1%。

本发明涉及的灵菌红素在体外实验中，其浓度范围1-300 μg/L可选择性的导致感染BmNPV的家蚕细胞死亡，其死亡率超过97%，但对正常细胞不表现出毒性。

本发明的目的第二是提供灵菌红素防控家蚕核型多角体病毒病的方法，应用方法包括步骤：将所述的灵菌红素与清水混合后均匀喷洒于桑叶或饲料上添饲家蚕，用量为 1-10 g灵菌红素添饲1000只家蚕。

动物实验发现，灵菌红素在浓度范围1-10 mg/只经口添饲家蚕，能使核型多角体病毒病病蚕停止进食并提前死亡，同时对健康家蚕不表现出毒性。

灵菌红素添饲核型多角体病毒病病蚕后，病蚕个体偏小，停止食桑直至死亡，显著区别于健康蚕体，易于淘汰。

灵菌红素添饲健康家蚕后，对核型多角体病毒病具有预防作用。

本发明的优点在于，利用灵菌红素抑制BmNPV增殖及多角体的形成，同时具有加速核型多角体病毒病病蚕死亡的作用，防止并有效控制家蚕核型多角体病毒病的扩散。

附图说明

图1为体外实验中，灵菌红素对正常家蚕细胞的安全浓度范围。当灵菌红素浓度为300 μg/L时，细胞存活率约为94.38%。在小于300 μg/L浓度范围内，灵菌红素对家蚕细胞不表现出毒性。

图2 为体外实验中，灵菌红素对BmNPV的抑制作用。A：正常家蚕细胞；B：感染BmNPV的家蚕细胞，细胞内出现大量多角体，5～6 d后细胞裂解，多角体释放；C：家蚕细胞感染BmNPV于24 h 内用灵菌红素(0.1μg/L)处理，5～6 d后细胞内仍未见多角体产生，细胞生长良好。D: 家蚕细胞感染BmNPV于24 h 内用灵菌红素(1 μg/L)处理，超过97%感染细胞于处理后8 h内死亡。

图3 为体外实验中，灵菌红素对家蚕感染细胞存活率及多角体形成的影响。家蚕细胞感染BmNPV于24 h 内用灵菌红素(Prodigiosin 1 μg/L)处理或不处理（Control），细胞存活率（Cell viability）几乎为0；相比之下，99%以上灵菌红素处理组细胞内未见有多角体（Polyhedron）形成，而不用灵菌红素处理的对照组，100%的细胞内均形成大量多角体。

图 4 为体内实验中，添饲灵菌红素对核型多角体病毒病病蚕死亡时间的影响。Prodigiosin Treatment：试验组病蚕，感染BmNPV后，添饲灵菌红素；Negative Control：阴性对照组健康蚕，不感染BmNPV，只添饲灵菌红素；Positive Control：阳性对照组病蚕，只感染BmNPV，不添饲灵菌红素。87.96%试验组病蚕较阳性对照组病蚕提前2～3 d 左右死亡，阴性对照组健康蚕则正常发育至上蔟。

具体实施方式

实施例一.灵菌红素的制备

该实施例采用的细菌为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、链霉菌（Streptomyces sp.）、糖多孢菌（Saccharopolyspora sp.）、交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）、马杜拉放线菌（Actinomadura sp.）。

1.菌种活化

将保藏的粘质沙雷氏菌接种于LB固体培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%NaCl，2%琼脂；蒸馏水；pH 7.0），30℃恒温培养48 h。同样条件下进行转接，使菌种活化。

将保藏的链霉菌接种于琼脂平板（3%酵母膏，3%蛋白胨，0.5%葡萄糖，0.4%麦芽糖，0.2% MgSO₄·7H₂O，2%琼脂；蒸馏水；pH 7.0），30℃恒温培养48 h。同样条件下进行转接，使菌种活化。

将保藏的糖多孢菌接种于琼脂平板（0.1%牛肉膏，1%葡萄糖，0.5%酵母膏，2%琼脂；蒸馏水；pH 7.0），28℃恒温培养3 d。同样条件下进行转接，使菌种活化。

将保藏的交替假单胞菌接种于琼脂平板（0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，0.001% FeSO₄，1% NaCl，0.25% MgSO₄·7H₂O，2%琼脂；蒸馏水；pH 6.5），25℃恒温培养3 d。同样条件下进行转接，使菌种活化。

将保藏的马杜拉放线菌接种于琼脂平板（2%可溶性淀粉，0.2%酵母膏，0.1 KNO₃，0.05% NaCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.05%K₂HPO₄，0.001% FeSO₄， 0. 1%色氨酸，2%琼脂；蒸馏水；pH 7.3），30℃恒温培养48 h。同样条件下进行转接，使菌种活化。

2.液体发酵

将已活化的粘质沙雷氏菌接种于LB液体培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%NaCl；蒸馏水；pH 7.0），30℃恒温，200～280 rpm连续震荡培养24 h，作为种子液。将种子液按照1：100的比例接种于发酵培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.5%NaCl，0.3%甘油；蒸馏水；pH 7.2），采用发酵罐30℃恒温，溶氧大于20%连续搅拌培养48h。粘质沙雷氏菌发酵液用于提取如下式所示的灵菌红素。

将已活化的链霉菌接种于液体培养基（3%酵母浸膏，3%蛋白胨，0.5%葡萄糖，0.4%麦芽糖，0.2% MgSO₄·7H₂O；蒸馏水；pH 7.0），30℃恒温，180～200 rpm连续震荡培养24 h，作为种子液。将种子液按照1：100的比例接种于发酵培养基（3%酪蛋白，0.5%酵母粉，4%甘油，1% MgSO₄·7H₂O，4% CaCl₂·2H₂O；蒸馏水；pH 7.0），采用发酵罐30℃恒温，溶氧大于20%连续搅拌培养48h。链霉菌发酵液用于提取如下式所示的灵菌红素。

将已活化的糖多孢菌接种于液体培养基（0.5%酵母膏，0.5%牛肉膏，0.1%葡萄糖；蒸馏水；pH 7.0），28℃恒温，150 rpm连续震荡培养48 h，作为种子液。将种子液按照1：100的比例接种于发酵培养基（0.5%酵母膏，0.5%牛肉膏，3%甘油；蒸馏水；pH7.0）采用发酵罐28℃恒温，溶氧大于20%连续搅拌培养5 d。糖多孢菌发酵液用于提取如下式所示的灵菌红素。

将已活化的交替假单胞菌接种于液体培养基（0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，0.5%葡萄糖，0.001% FeSO₄，1% NaCl，0.25% MgSO₄·7H₂O；蒸馏水；pH 6.5）25℃恒温，200 rpm连续震荡培养48 h，作为种子液。将种子液按照1：100的比例接种于发酵培养基（0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，3%甘油，0.001% FeSO₄，1% NaCl，0.25% MgSO₄·7H₂O；蒸馏水；pH 6.5）采用发酵罐25℃恒温，溶氧大于20%连续搅拌培养4 d。交替假单胞菌发酵液用于提取如下式所示的灵菌红素。

将已活化的马杜拉放线菌接种于液体培养基（1%蔗糖，1%甘油，0.2%酵母膏，0.1 KNO₃，0.05% NaCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.05%K₂HPO₄，0.001% FeSO₄， 0. 1%色氨酸；蒸馏水；pH 7.3）30℃恒温，220 rpm连续震荡培养48 h，作为种子液。将种子液按照1：100的比例接种于发酵培养基（2%甘油，0.2%酵母膏，0.1 KNO₃，0.05% NaCl，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.05%K₂HPO₄，0.001% FeSO₄， 0. 1%色氨酸；蒸馏水；pH 7.3）采用发酵罐30℃恒温，溶氧大于20%连续搅拌培养4d。马杜拉放线菌发酵液用于提取如下式所示的灵菌红素。

3.发酵产物萃取

将氯仿按照1：3的体积比加入至发酵液中，震荡5～10 min，静置2 h，收集氯仿相。依照同样步骤反复萃取两次，合并氯仿萃取液，利用真空旋转蒸发仪45℃减压浓缩，烘干去除氯仿成分，收集残余物，再加入少量氯仿提取，得灵菌红素粗体液。

4.发酵产物分离纯化

得到的灵菌红素粗体物可用硅胶柱层析的方法进一步纯化。分别将灵菌红素粗体液上硅胶柱后，以石油醚与乙酸乙酯混合液作为洗脱剂，室温25℃淋洗，收集洗脱液中红色部分，经减压浓缩，烘干去除有机溶剂，冷冻干燥后得前述5种纯化的灵菌红素。经过高效液相色谱串联质谱检测，其纯度高于95%。

实施例二. 灵菌红素对BmNPV的抑制作用试验

该实施例中核型多角体病毒来源于核型多角体病毒病病蚕血淋巴，收集纯化后于30天内进行实验。

1. BmNPV制备，细胞培养及相关试剂配置

BmNPV制备：利用Na₂CO₃溶液于28℃处理0.5 h裂解BmNPV多角体，3500 rpm离心20 min去除沉淀，收集上清液；再将收集的液体以12000 rpm离心30 min，去除上清，收集沉淀，病毒粒子存在于沉淀中。细胞株：家蚕卵巢细胞系（BmNS）。细胞培养基：TC-100昆虫细胞培养基（Gibco，美国），添加10%胎牛血清（Gibco，美国）及青链霉素混合液（100U/mL），pH 6.2。BmNS细胞置于装有5 mL培养基的细胞瓶中28℃恒温培养。以少量二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）配置灵菌红素溶液，经0.1 μm微孔滤膜过滤除菌后4℃避光保存。

2. 灵菌红素对家蚕细胞的毒性

将家蚕细胞BmNS加入96孔板中，培养过夜。用家蚕细胞培养基配置不同浓度的灵菌红素。去除培养板中的培养基，加入已配置的PG，培养9 d后采用MTT法检测，其主要步骤包括：加入MTT孵育4h，去除培养基，加入DMSO溶解，脱色摇床200 rpm匀速震荡10 min，酶标仪492nm波长检测。检测所得吸光值与细胞存活率成正比。灵菌红素在低于300 μg/L浓度时对家蚕细胞不表现出毒性（图1）。采用前述5种灵菌红素均获得类似的结果。

3. 灵菌红素对BmNPV的抑制作用。

用半数致死剂量100倍浓度的BmNPV感染家蚕细胞，孵育12 h，确保所有细胞均被感染。去除培养板中的培养基，加入已配置的PG，培养并观察，9 d后采用MTT法检测。灵菌红素在0.01-0.8 μg/L 浓度范围内，可干扰BmNPV在细胞中的增殖，阻止病毒多角体形成（图2），维持细胞存活，免于被病毒裂解；灵菌红素在1-300 μg/L浓度范围内可导致感染BmNPV的家蚕细胞死亡，其死亡率超过97%且不形成多角体（图2，3）。上述研究表明，在特定浓度的灵菌红素作用下，感染BmNPV的家蚕细胞几乎不会形成多角体。采用前述5种灵菌红素均获得类似的结果。

实施例三. 灵菌红素对家蚕核型多角体病毒病的防控作用试验

1. 灵菌红素对家蚕个体的毒性

将灵菌红素DMSO溶液与蒸馏水混匀配置为不同剂量，喷洒桑叶于五龄起蚕时添饲家蚕，每日一次直至上蔟，统计家蚕存活率。结果显示当灵菌红素不高于10 mg/只时，对家蚕不表现出显著毒性。灵菌红素浓度为10 mg/只添饲时，家蚕肠道以及部分组织呈现红色，但不影响家蚕正常食桑与发育。采用前述5种灵菌红素均获得类似的结果。

2. 灵菌红素对核型多角体病毒病病蚕的防控

五龄起蚕时接种高浓度BmNPV，24 h后分别用不同浓度灵菌红素添饲。试验分为3组：1）不添饲灵菌红素感染病毒组，2）不感染病毒只添饲灵菌红素组，3）添饲灵菌红素感染病毒组。每组30只家蚕，设重复区三区。

1）不添饲灵菌红素感染病毒组，病蚕于接种病毒7日后100%死亡；

2）不感染病毒只添饲灵菌红素组，家蚕正常发育至上蔟；

3）添饲灵菌红素感染病毒组，接种病毒后24h后添饲灵菌红素，剂量为1 mg/只，87%的蚕不表现出环节肿胀狂躁爬行等典型核型多角体病毒病病征，并且70%的蚕停止食桑，与对照组相比提前2～3 d死亡（图4）。

采用前述5种灵菌红素均获得类似的结果。

3. 灵菌红素对核型多角体病毒病病蚕的预防

五龄起蚕时添饲灵菌红素，灵菌红素浓度范围为0.05～0.2mg/只，再接种病毒，病毒浓度为1X10⁷/mL。试验分为2组，1）添饲清水感染病毒组，2）添饲灵菌红素感染病毒组。每组30只家蚕，设重复区三区。

1）添饲清水感染病毒组，病蚕100%死亡；

2）添饲灵菌红素感染病毒组，20%-30%的病蚕死亡。

采用前述5种灵菌红素均获得类似的结果。

实施例四. 灵菌红素固体制剂和液体制剂的配置（均为质量百分含量）

1. 灵菌红素的固体制剂配置

在一优选例中，灵菌红素固体制剂的具体成分包括：灵菌红素1%，海藻酸钠8%，柠檬酸钠5%，羧甲基纤维素35%，玉米淀粉51%。

2. 灵菌红素的液体制剂配置

在一优选例中，灵菌红素液体制剂的具体成分包括：灵菌红素1%，二甲基亚砜15%，聚山梨酯0.2%，甘油83.8%。

Claims

1.灵菌红素在制备防控家蚕核型多角体病毒病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的灵菌红素在制备防控家蚕核型多角体病毒病药物中的应用，其特征在于，所述的防控家蚕核型多角体病毒病药物为含有灵菌红素的液态或固态制剂。

3.如权利要求2所述的灵菌红素在制备防控家蚕核型多角体病毒病药物中的应用，其特征在于含有灵菌红素的液态制剂的组分及各组分的质量百分含量为：灵菌红素1%，二甲基亚砜15%，聚山梨酯0.2%，甘油83.8%。

4.如权利要求2所述的灵菌红素在制备防控家蚕核型多角体病毒病药物中的应用，其特征在于含有灵菌红素的固态制剂的组分及各组分的质量百分含量为：灵菌红素1%，海藻酸钠8%，柠檬酸钠5%，羧甲基纤维素35%，玉米淀粉51%。